نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه تبریز
2 دانشگاه شهید مدنی آذربایجان
3 دانشگاه زنجان
چکیده
ویروسهای گیاهی از عوامل محدود کننده در کشاورزی به شمار میروند. تاکنون 63 عامل ویروسی آلوده کننده مو در دنیا شناسایی شده است که یکی از مخربترین آنها ویروس برگ بادبزنی مو (Grape Fan Leaf Virus: GFLV) می باشد. برای کنترل ویروسها از روشهای سنتی مثل تناوب گیاهی، تشخیص زودهنگام و حذف گیاهان آلوده، ریشه کنی گیاهان منبع آلودگی، حفاظت تقاطعی، اصلاح برای مقاومت و کنترل شیمیایی ناقلین آنها استفاده شده است. مقاومت به واسطه RNA Silencing یک روش جدید و کارا برای ایجاد ارقام مقاوم به ویروسهاست. در این تحقیق امکان القای مقاومت نسبت به ویروس برگ بادبزنی مو (GFLV) با استفاده از ترادف نوکلئوتیدی بخشی از ژن RNA پلیمراز وابسته به RNA (RdRP) این ویروس بررسی شد. به این منظور یک سازه سنجاق سری حاوی اینترون با استفاده از ترادفی از ژن RdRP ساخته شد. جهت تراریختی توتون از آگروباکتریوم استفاده شد. پس از ایجاد 40 لاین از گیاهان توتون تراریخت، تأیید تراریختی با استفاده از آزمون PCR انجام شد. گیاهان تراریخته به منظور ارزیابی مقاومت آنها نسبت به GFLV، با این ویروس مایهزنی مکانیکی شدند. نتایج آزمون الایزا و نیز علایم ظاهری گیاهان نشان داد که به ترتیب 5/27 و 40 درصد از گیاهان تراریخت نسبت به ویروس مقاوم بوده و یا در بروز علایم و آلودگی تأخیر داشتند. نتایج این تحقیق ضمن ایجاد گیاهان تراریخت توتون متحمل به GFLV نشان داد که سازه بکار رفته برای ایجاد مقاومت کارایی دارد و میتوان از آن برای ایجاد مقاومت در مو و سایر میزبانهای ویروس استفاده کرد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Induction of Resistance to Grapevine fanleaf Virus (GFLV) by RNA Silencing Method
نویسندگان [English]
2 Azarbaijan Shahid Madani University
چکیده [English]
Plant viruses have been the limiting factor in agriculture. To date, 63 viral agents infecting grapes have been identified around the world. One of the most destructive of these agents is GFLV. To control these pathogens, traditional methods, such as crop rotation, early detection and elimination of infected plants, eradication of the infection source plants, cross protection, genetically modified plants for resistance and chemical control of vectors, have been used. The most efficient method to control viruses is the use of resistant plant varieties and the RNA Silencing-based resistance is the best way to establish the resistance to viruses in plants. In this study, the possibility of induction of resistance to GFLV using a partial GFLV RdRP gene sequence was evaluated. For this purpose, a hairpin construct containing intron and a partial RdRP gene sequence was developed. Agrobacterium tumefaciens was used for N. benthamiana transformation. 40 lines of transgenic N. benthamiana plants were created and confirmed by PCR reactions. The transgenic plants were mechanically inoculated with GFLV in order to evaluate their resistance to GFLV. The results of ELISA testing and plant symptoms showed that 27.5% of transgenic plants were resistant to GFLV and 40% of them showed the symptom and infection with delay. In this research, in addition to produce transgenic N. benthamiana plants resistant to GFLV, the results showed that the used hairpin construct is efficient to establish resistance to this virus and it could apply to produce resistance in grape and other host plants.
کلیدواژهها [English]
القای مقاومت به روش RNA Silencing نسبت به ویروس برگ بادبزنی مو (GFLV)
سمیرا پاکباز1، مقصود پژوهنده2*، امید عینی گندمانی3 و نعمت سخندان1
1 تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده کشاورزی، گروه گیاهپزشکی
2 تبریز،دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، دانشکده کشاورزی،گروه بیوتکنولوژی
3 زنجان، دانشگاه زنجان، دانشکده کشاورزی، گروه گیاهپزشکی
تاریخ دریافت: 27/2/95 تاریخ پذیرش: 21/6/95
چکیده
ویروسهای گیاهی از عوامل محدود کننده در کشاورزی به شمار میروند. تاکنون 64 عامل ویروسی آلودهکننده مو در دنیا شناسایی شده است که یکی از مخربترین آنها ویروس برگ بادبزنی مو(Grapevine fanleaf virus, GFLV) میباشد. برای کنترل ویروسها از روشهای سنتی مثل تناوب گیاهی، تشخیص زودهنگام و حذف گیاهان آلوده، ریشهکنی گیاهان منبع آلودگی، حفاظت تقاطعی، اصلاح برای مقاومت و کنترل شیمیایی ناقلین آنها استفاده شده است. استفاده از ارقام مقاوم گیاهان بهترین راه برای کنترل عوامل ویروسی بوده و مقاومت به واسطه RNA Silencing یک روش جدید و کارآمد برای ایجاد ارقام مقاوم به ویروسها میباشد. در این تحقیق امکان القای مقاومت نسبت به ویروس برگ بادبزنی مو (GFLV) با استفاده از ترادف نوکلئوتیدی بخشی از ژن RNA پلیمراز وابسته به RNA (RdRP) این ویروس بررسی شد. به این منظور یک سازه سنجاق سری حاوی اینترون با استفاده از ترادفی از ژن RdRP ساخته شد. جهت تراریختی گیاهان Nicotiana benthamiana از Agrobacterium tumefaciens استفاده شد. پس از ایجاد 40 دودمان از گیاهان توتون تراریخت، تأیید تراریختی با استفاده از آزمون PCR انجام شد. گیاهان تراریخته به منظور ارزیابی مقاومت آنها نسبت به GFLV، با این ویروس مایهزنی مکانیکی شدند. نتایج آزمون الایزا و نیز علائم ظاهری گیاهان نشان داد که به ترتیب 5/27 و 40 درصد از گیاهان تراریخت نسبت به ویروس مقاوم بوده و یا در بروز علائم و آلودگی تأخیر داشتند. نتایج این تحقیق ضمن ایجاد تعدادی گیاه تراریخت توتون متحمل به GFLV نشان داد که توالی نوکلئوتیدی بخشی از ژن 1EPol که جهت ساخت سازه سنجاقسری در این تحقیق استفاده شد، فعالیتی مشابه با ژن مهار کننده خاموشی رمز شونده توسط ویروس ندارد و مقاومت القاء شده توسط این سازه در گیاه، به وسیله ژن ناشناخته مهار کننده خاموشی در این ویروس شکسته شده و سبب بروز واکنش حساسیت در گیاهان تراریخت می شود.
واژههای کلیدی: خاموشی ژن، تراریخت، مقاومت، ویروس برگ بادبزنی مو
* نویسنده مسئول، تلفن: 04134327572 ، پست الکترونیکی: pazhouhandeh@gmail.com
مقدمه
بیماری برگ بادبزنی مو قدیمیترین بیماری ویروسی شناخته شده در گیاه Vitis viniferaمیباشد (9). تاکنون 64 عامل ویروسی آلودهکننده مو در سراسر دنیا شناسایی شدهاند که یکی از مخربترین آنها ویروس برگ بادبزنی مو Grapevine fanleaf virus (GFLV) میباشد (21). موزاییک و ابلقی شدن برگ و نواحی بین رگبرگها و در نهایت زردی کامل برگ از علائم بیماری است. در صورت شدت بیماری، خوشهها به ندرت تشکیل شده و در صورت وجود نیز حبههای بسیار کمی داشته و یا اصلاً محصولی تولید نمیشود (22). ویروس برگ بادبزنی مو به طور طبیعی تنها از طریق نماتد اکتوپارازیت Xiphinema index انتقال مییابد (3). حمل و نقل مواد تکثیری به ویژه ارقام حساس مو نیز نقش مهمی در گسترش این ویروس دارد (23). ویروس GFLV یک عضو دو پیکرهای با ژنوم دو قسمتی از جنس Nepovirus، زیرخانواده Comovirinae، خانواده Secoviridae و راسته Picornavirales میباشد (28). ژنوم ویروس از دو قطعه RNA تک رشتهای با قطبیت مثبت تشکیل شده است (+ssRNA) که در انتهای '5 دارای پروتئین متصل به ژنوم (VPg) و در انتهای '3 به صورت پلیآدنینی (Poly A) میباشند. هر قطعه محتوی یک چارچوب خواندنی باز است و یک پلیپروتئین را رمز میکند (P1 و P2) (26). پلیپروتئین رمزشونده توسط RNA1 (P1) به پنج پروتئین شکسته میشود که در تکثیر ویروس نقش دارند و به ترتیب شامل یک کوفاکتور پروتئیناز فرضی، هلیکاز فرضی، پروتئین متصل به ژنوم ویروس (VPg)، پروتئیناز سیستئین و RNA پلیمراز وابسته به RNA (RdRP) (1EPol) میباشد (25). RNA2 پلی پروتئین P2 را رمز میکند که با فعالیت پروتئولیتیکی به ترتیب به سه پروتئین شامل 2AHP که برای تکثیر RNA2 مورد نیاز است و میتواند به عنوان پروتئین خانگی عمل کند (10)، پروتئین حرکتی 2BMP که پروتئین اصلی مشاهده شده در پلاسمودسماتاست (27) و پروتئین پوششی 2CCP (30) شکسته میشود. هر دو RNA ژنومی برای آلودگی سیستمیک گیاه ضروری هستند (35 و 36).
ویروسهای گیاهی از عوامل محدود کننده در کشت محصولات کشاورزی در دنیا به شمار میروند. برای کنترل این بیمارگرها از روشهای سنتی مثل تناوب گیاهی و تکنیکهای دیگر کشت، تشخیص زودهنگام و حذف گیاهان آلوده، ریشهکنی گیاهان منبع آلودگی، حفاظت تقاطعی، اصلاح برای مقاومت و کنترل شیمیایی ناقلین آنها استفاده شده است. افزایش دانش بشر در ژنتیک مولکولی ویروسهای گیاهی و سیستمهای دفاعی طبیعی گیاه میزبان، راههای تازهای برای کنترل بیماریهای ویروسی در گیاه ایجاد کرده است (14). مقاومت وابسته به بیمارگر اولین بار به وسیله Johnston و Sanford در سال 1985 پیشنهاد شد (37) و از قسمتی از مواد ژنتیکی بیمارگر برای دفاع میزبان بر علیه همان بیمارگر استفاده شد. گفته شده که بیان ژنهای مشخصی از بیمارگر در میزبان باعث به هم ریختن تعادل عادی ویروس و بنابراین به هم ریختن چرخه همانند سازی بیمارگر میشود (29). از آنجاییکه ویروسها ژنوم کوچک و تعداد محدودی ژن دارند که در مدت همانندسازی ویروس روشن میشود، این پاتوژنها برای مقاومت منشأ گرفته از بیمارگر مناسب میباشند (4). مقاومت به واسطه پروتئین پوششی ویروس، بیان یک منطقه کد کننده در رپلیکاز، استفاده از آنتیسنس RNA و استفاده از RNA های ماهوارهای مواردی از استفادههای موفق بر اساس روش PDR میباشد (6). یک مکانیسم مهم در PDR خاموشی RNA نامیده میشود. مشخص شده است که بسیاری از واکنشهای مقاومت نیاز به سنتز پروتئین ندارند و به واسطه RNA وساطت میشوند (5). شناسایی این روش زمانی اتفاق افتاد که ژن رپلیکاز ویروس موزاییک توتون (TMV) جهت ایجاد مقاومت به گیاه توتون منتقل شد و مقاومت بالایی در توتون تراریخت مشاهده شد، در حالی که بیان شدن پروتئین رپلیکاز مشاهده نشد (12). مقاومت به واسطه RNA یک حالت از خاموشی ژن در سطح پس از نسخهبرداری میباشد (33). از تکنیک خاموشی ژن پس از نسخه برداری (PTGS) برای ایجاد مقاومت گیاهان نسبت به بیمارگرهای گیاهی استفاده شده است (18). سازههای مختلف به منظور افزایش کارآیی این سازوکار و ایجاد مقاومت مؤثر معرفی شده اند که سازههای سنجاق سری دارای اینترون از عملکرد مناسبی برخوردار بودهاند (31). در تحقیق حاضر امکان ایجاد مقاومت به ویروس برگ بادبزنی مو (GFLV) به کمک ترادف نوکلئوتیدی بخشی از ژن پلیمراز و نیز ارزیابی سطوح مقاومت توتون نسبت به این ویروس که توسط سازه تکرار معکوس حاوی اینترون القاء شده بود مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
ساخت سازه سنجاقسری GFLV: طراحی آغازگر (Primer): ابتدا توالی نوکلئوتیدی کاملRNA1 مربوط به 9 جدایه از GFLV که در NCBI موجود است، با استفاده از نرم افزار Bioedit زیر هم چینی شد و یک ناحیه حفاظت شده از ژن RdRP (1EPol) به اندازه 116 جفت باز جهت ساخت سازه سنجاقسری انتخاب شد. طراحی آغازگرهای رفت و برگشت برای ناحیه حفاظت شده در دو جهت سنس و آنتی سنس و بر اساس جایگاه آنزیمهای برشی (جدول 1) در نقشه ژنتیکی ناقل pEPT8MCS2 (34) (شکل1) انجام پذیرفت. همچنین از توالی نوکلئوتیدی اینترون دوم گیاه سیب زمینی که در ناقل pBin19-Gus-Intron همسانهسازی شده بود (32) به عنوان جداکننده در ساختار تکرار معکوس استفاده شد. این ناقل نوترکیب توسط آزمایشگاه ویروس شناسی گیاهی دانشگاه کرنل امریکا در اختیار این تحقیق قرار گرفت. طراحی همه آغازگرها به کمک نرم افزار Primer Premier 5 صورت گرفت.
آزمون RT-PCR: استخراج RNA با استفاده از کیت استخراج RNA کل شرکت Omega (Biotek) و از برگ2های گیاه Chenopodium quinoa آلوده به GFLV انجام شد. تکثیر رشتههای سنس و آنتیسنس با استفاده از آغازگرهای اختصاصی طراحی شده و نیز کیت یک مرحلهای RT-PCR شرکت کیاژن انجام شد. این آزمون مطابق با دستورالعمل شرکت و طی برنامهای شامل 30 دقیقه جهت نسخهبرداری معکوس در 50 درجه سانتیگراد، 15 دقیقه جهت فعال سازی اولیه PCR در 95 درجه سانتیگراد، 30 چرخه دمایی شامل 30 ثانیه واسرشت سازی اولیه در 94 درجه، یک دقیقه جهت اتصال آغازگرها در 58 درجه و یک دقیقه جهت گسترش توالی در 72 درجه و در نهایت 10 دقیقه جهت گسترش نهایی در 72 درجه سانتیگراد صورت گرفت. جهت مشاهده محصولات تکثیر شده، از ژل آگارز 5/1 درصد و نشانگر مولکولی 100 جفت باز استفاده شد.
آزمون PCR: جهت تکثیر قطعه اینترون ابتدا استخراج پلاسمید از ناقلpBin19-Gus-Intron توسط کیت استخراج پلاسمید Omega صورت گرفت. سپس آزمونPCR با استفاده از آغازگرهای طراحی شده و کیتQ5 Hot start High-Fidelity DNA polymerase (شرکت New England Biolabs) روی DNA استخراج شده انجام شد. برنامه دمایی آزمون PCR مطابق با دستورالعمل شرکت و به صورت 30 ثانیه واسرشت سازی اولیه در 98 درجه،30 چرخه دمایی شامل 10 ثانیه واسرشت سازی اولیه در 98 درجه، 20 ثانیه جهت اتصال آغازگرها در 58 درجه و 30 ثانیه جهت گسترش توالی در 72 درجه و در نهایت 2 دقیقه جهت گسترش نهایی در 72 درجه سانتیگراد اعمال شد.
همسانهسازی قطعات: جهت ساخت سازه تکرار معکوس، از ناقل pEPT8MCS2 که دارای جایگاه چندگانه همسانه سازی میباشد استفاده شد. این ناقل با دارا بودن جایگاه چندین آنریم برشی، امکان همسانهسازی چند ژن را در کنار هم فراهم میکند و در نتیجه برای ساخت سازه تکرار معکوس مناسب میباشد. این ناقل همچنین دارای ناحیه پیش برنده و خاتمه دهنده 35SCaMV میباشد. جهت ساخت سازه، ابتدا محصول تکثیر یافته اینترون و نیز پلاسمید pEPT8MCS2 با استفاده از آنزیمهای KpnIو SalI هضم شدند. اینترون برش یافته پس از خالص سازی با استفاده از کیت خالص سازی Enzyme Clean Up (Omega) توسط آنزیم T4DNA Ligase (BioLabs) به ناقل هضم شده متصل شد. سپس این همسانه به باکتری
E. coli سویه DH5α انتقال داده شد.
جدول 1- ترادف آغازگرها و جایگاه برشی در نظر گرفته شده در آنها
اندازه قطعه |
جایگاه برشی |
ترادف آغازگر و محل اثر آنزیم برشی |
جهت |
* نام آغازگر |
211bp
|
KpnI |
5' GCTGTGGTACCGTTTGTTTCTGCTTCTACCTTTG 3' |
- |
Int.For |
SalI |
5' AATGCGTCGACCTAAACATCACCATGTTTTGGTC 3' |
- |
Int.Rev |
|
138bp |
NcoI |
5' TACCACCATGGGTTTTCTGTGGTGCCCTTGGCATAC 3' |
Sense |
1E.For
|
KpnI |
5' GATGTGGTACCAAGGATTGATGCCTACTTGAC 3' |
Sense |
1E.Rev
|
|
138bp |
BamHI |
5' AGTGAGGATCCGTTTTCTGTGGTGCCCTTGGCATAC 3' |
Antisense |
1E.For
|
SalI |
5' AATGCGTCGACAAGGATTGATGCCTACTTGAC 3' |
Antisense |
1E.Rev
|
*: نام آغازگرها به طور مخفف در جدول آمده است که Int بیانگر اینترون، For بیانگر آغازگر رفت و Rev بیانگر آغازگر برگشت میباشد.
شکل 1- نقشه ژنتیکی ناقل pEPT8MCS2
باکتریهای حامل این همسانه در محیط جامد LBحاوی100 میلیگرم در لیتر آمپی سیلین انتخاب شدند. به منظور یافتن کلونی حاوی پلاسمید نوترکیب از روش Colony PCRاستفاده شد. پس از استخراج پلاسمید وجود قطعه مورد نظر با استفاده از هضم آنزیمی با آنزیمهای نامبرده تأیید شد. پلاسمید کلونیهایی که برای دریافت اینترون مثبت ارزیابی شدند، جهت دریافت قطعه در جهت سنس انتخاب شدند. این پلاسمید و نیز قطعه سنس تکثیر یافته ژن پلیمراز با آنزیمهای برشی NcoI و KpnI هضم شدند. پس از خالصسازی محصول برش، همسانهسازی و انتقال به میزبان E. coli مشابه قطعه اینترون انجام شد و برای تأیید حضور قطعه سنس از روش Colony PCR و نیز واکنش هضم آنزیمی با آنزیمهای NcoI و KpnI استفاده شد.پلاسمید کلونیهایی که علاوه بر اینترون، قطعه سنس را نیز دریافت کرده بودند این بار برای دریافت قطعه در جهت آنتیسنس استفاده شدند. این پلاسمیدها و نیز قطعه آنتی سنس تکثیر شده ژن پلیمراز با استفاده از آنزیمهای برشی SalI و BamHI برش یافتند و پس از همسانهسازی و انتقال به میزبان E. coli، جهت تأیید حضور قطعه آنتیسنس، واکنش برش با استفاده از این دو آنزیم انجام شد. پلاسمیدهای نوترکیب حاوی سازه سنجاق سری جهت اطمینان با آنزیم HindIII برش داده شدند. با انجام این واکنش انتظار می رود سازه تکرار معکوس به همراه ناحیه پیش برنده و خاتمه دهنده 35SCaMV با طول 1323 جفت باز از پلاسمید جدا شود. در تمام مراحل همسانهسازی، جهت بررسی و مشاهده محصولات برش از ژل آگارز 5/1 درصد و نشانگر مولکولی 100 جفت بازی و نیز یک کیلوبازی استفاده شد.
انتقال کاست ژنی به ناقل pGA482G: جهت انتقال سازه مورد نظر به گیاه از ناقل دوگانه pGA482G استفاده شد که دارای ژن گزینشگر نئومایسین فسفوترانسفراز II (nptII) میباشد. این ناقل همچنین دارای مناطق مرزی چپ و راست میباشد که در انتقال T-DNA از Agrobacterium tumefaciens به سلول گیاهی نقش دارد (20). تکثیر کاست ژنی 35SPro.1ESense.Int.1EAntisense.35STer با استفاده از آغازگرهای ناحیه 35SCaMV (جدول2) که دارای جایگاه آنزیمهای برشی منطبق با نقشه ژنتیکی ناقل دوگانه pGA482G بودند انجام شد. سپس واکنش برش با آنزیمهای HindIII و HpaI روی محصول تکثیر یافته و نیز ناقل pGA482G انجام شد. کاست ژنی 1EPol برش یافته، روی ژل آگارزی که درصد خلوص بیشتری داشته و برای خالصسازی اسید نوکلئیک از ژل مناسب میباشد الکتروفورز و با استفاده از کیت خالصسازی Omega از ژل جداسازی شد. سپس با استفاده از آنزیم T4DNA Ligase واکنش اتصال و همسانهسازی در ناقل pGA482G انجام شد و انتقال به میزبان E.coli صورت گرفت. حضور کاست مورد نظر با استفاده از واکنش برش آنزیمی با آنزیمهای HindIIIو HpaI روی پلاسمید استخراج شده تأیید شد. پلاسمید نوترکیب pGA482G حاوی کاست ساخته شده با استفاده از روش شوک الکتریکی در سلولهای مستعد A. tumefaciens سویه C58Z707 همسانهسازی شد. سویه نامبرده توسط آزمایشگاه ویروسشناسی گیاهی دانشگاه کرنل امریکا در اختیار این پژوهش قرار گرفت.
جدول2 - ترادف آغازگرها و جایگاه برشی در نظر گرفته شده در آنها
آنزیم برشی |
ترادف آغازگر و محل اثر آنزیم برشی |
*نام آغازگر |
HindIII |
5' CGT GCG AGC TCT GAG ACT TTT CAA CAA AGG G 3' |
35S-Pro |
HpaI |
5' GCA CCG TTAACG ATT TTG GTT TTA GGA ATT AG 3' |
35S-Ter |
*: نام آغازگرها به طور مخفف در جدول آمده است که 35S-Pro بیانگر آغازگر مربوط به ناحیه پیشبر 35SCaMV و 35S-Ter بیانگر آغازگر مربوط به ناحیه خاتمه دهنده 35SCaMV می باشد.
تراریزش توتون Nicotiana benthamiana: جهت تراریختی از تیپ وحشی گیاه N. benthamiana استفاده شد. بذرها در شرایط استریل بر روی محیط کشت جامد حاوی نصف غلظت نمکهایMS تکمیل شده (24) کشت شدند و ریزنمونههای برگی سترون از گیاهان رشد یافته از این بذور تهیه شدند.ریز نمونهها به مدت 15 دقیقه در محیط تهیه شده از MS حاوی سوسپانسیون A. tumefaciens سویه C58Z707 (8/0-6/ : OD600) حامل سازه مورد نظر فرو برده شدند و سپس روی کاغذ صافی آب اضافی آنها گرفته شد. ریز نمونهها به محیط کشت MSجامد حاوی هورمونهای BAP با غلظت دو میلیگرم در لیتر وNAA با غلظت 1/0 میلیگرم در لیتر به طوری که سطح فوقانی نمونهها روی محیط کشت قرار بگیرد، منتقل و نمونهها در شرایط تاریکی و در دمای 25 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. 48 ساعت پس از طی دوره همکشتی، ریزنمونهها به محیط کشت گزینشگر حاوی 50 میلیگرم در لیتر آنتیبیوتیک کانامایسین و 250 میلیگرم در لیتر سفوتاکسیم منتقل شدند و به مدت 6-4 هفته در اتاقک رشد با دمای 25 درجه سانتی گراد و شرایط نوری 8:16 (نور: تاریکی) جهت باززایی و القای جوانه نگهداری شدند. در طول این مدت نمونههای باززا شده هفتهای یک بار در محیط تازه تجدید کشت شدند. جهت انتخاب گیاهچههای تراریخت احتمالی، از محیط MS حاوی کانامایسین با غلظتهای 75 و 100 میلیگرم در لیتر استفاده شد. این روند فرصتی را به نوساقههای تراریخت میدهد تا به آرامی با غلظتهای بالاتر کانامایسین سازگار شوند و نوساقههای غیر تراریخت در غلظت نهایی کانامایسین سفید خواهند شد. نوساقههای رشد یافته به محیط کشت ریشهزایی منتقل شدند. محیط ریشهزایی با افزودن دو میلیگرم در لیتر هورمون IBA به همراه آنتیبیوتیکهای کانامایسین و سفوتاکسیم به محیط کشت پایه MS حاوی یک درصد ساکاروز و 7/0 درصد آگار بدست آمد. گیاهچههای ریشهدار در ظروف مخصوص محتوی خاک استریل حاوی ورمیکولایت، پیت و پرلایت (به نسبت 2:2:1) کشت و با محلول غذایی MS مایع نصف غلظت محلولپاشی شدند. گیاهچهها جهت سازگاری با دما و رطوبت محیط به مدت دو هفته در شرایط اتاقک رشد و پس از آن در گلخانه نگهداری شدند.
بررسی مولکولی گیاهان تراریخته احتمالی: جهت تأیید حضور سازه و تراریختی گیاهان، استخراج DNA از برگهای جوان گیاهان تراریخته احتمالی نسل T0 با استفاده از کیت استخراج DNA گیاهی Omegaصورت گرفت. سپس واکنش زنجیرهای پلیمراز با استفاده از کیت (Biolabs) Hot start High-Fidelity DNA polymeraseو آغازگرهای ژن گزینشگر nptII ناقل pGA482G انجام شد. محصولات تکثیر شده بر روی ژل آگارز 5/1 درصد الکتروفورز شدند. گیاهانی که حضور سازه در آنها تأیید شد، برای مایهزنی با ویروس انتخاب شدند.
مایهزنی گیاهان تراریخته و ارزیابی میزان مقاومت: برگهای C. quinoa آلوده به GFLV با استفاده از بافر فسفات 1/0 مولار (4/7pH: ) عصارهگیری شدند. سپس مایه زنی مکانیکی (مالش روی برگ) با استفاده از عصاره گیاهی حاوی ویروس و به کمک کمی پودر کاربوراندوم روی برگهای 40 گیاه مستقل که تراریختی آنها تأیید شده بود و در مرحله 5-4 برگی بودند صورت گرفت. همچنین 5 گیاه از تیپ وحشی و غیرتراریخت گیاه
N. benthamiana نیز به عنوان کنترل منفی در نظر گرفته شد و مایهزنی با GFLV روی آنها انجام شد. هفت روز پس از مایهزنی، علائم تظاهر یافته احتمالی در گیاهان تراریخت بررسی و تا روز دهم پس از مایهزنی ادامه داشت. همچنین جهت اندازهگیری غلظت ویروس، آزمون سرولوژیکی الایز (DAS– ELISA) با استفاده از آنتیبادی پلیکلونال و اختصاصی پروتئین پوششی GFLV (کیت شرکت Bioreba) و نیز بافرهای این کیت انجام شد. این آزمون در روز نهم پس از مایهزنی مکانیکی روی برگهای نوظهور و مایهزنی نشده گیاهان تراریخت انجام گرفت. در مرحله آخر آزمون پس از افزودن ماده زمینه، میزان تغییر رنگ چاهکها در طول موج 405 نانومتر با استفاده از دستگاه الایزا خوان Synergy2 (شرکت Biotek) و نرم افزار Gen5 اندازهگیری شد.
نتایج و بحث
این تحقیق به منظور ایجاد گیاهان تراریخت توتون مقاوم به GFLV و تست کارآیی سازه سنجاقسری برای ایجاد مقاومتبراساس RNA Silencing انجام شد.
ساخت سازه سنجاقسری: آزمون RT-PCRبا استفاده از آغازگرهای اختصاصی طراحی شده توانست دو قطعه به اندازه 138 جفت باز برای رشته سنس و آنتی سنس ژن 1EPol تکثیر کند. همچنین آزمون PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی طراحی شده از توالی نوکلئوتیدی اینترون دوم گیاه سیب زمینی، توانست قطعهای به اندازه 211 جفت باز برای اینترون تکثیر کند. پس از همسانهسازی این قطعات، واکنش هضم آنزیمی توسط ترکیب آنزیمی موجود بر روی سازه، حضور سازه سنجاقسری را در ناقل pEPT8MCS2 (شکل 2- الف) تأیید کرد. واکنش برش آنزیمی با استفاده از آنزیم HindIII نیز توانست قطعهای به اندازه 1323 جفت باز را از پلاسمید نوترکیب pEPT8MCS2 جدا کند. این قطعه حامل سازه سنجاقسری 1EPol همراه با پیشبر 35SCaMV میباشد (شکل 2- ب). پس از همسانهسازی این قطعه در ناقل دوگانه pGA482G، حضور قطعه 1323 جفت بازی با استفاده از واکنش هضم آنزیمی به کمک آنزیمهای HindIII و HpaI در این ناقل تأیید شد (شکل 3).
شکل 2- محصول واکنش برش آنزیمی پلاسمید نوترکیب pEPT8MSC2 حامل سازه تکرار معکوس 1EPol. الف- چاهک 1- نشانگر مولکولی 100 جفت بازی. چاهک 2- قطعه سنس 1EPol. ناقل هضم شده با آنزیمهای NcoI و KpnI. چاهک 3- قطعه اینترون. ناقل هضم شده با آنزیمهای KpnI و SalI. چاهک 4- قطعه آنتی سنس 1EPol. ناقل هضم شده با آنزیمهای SalI و BamHI. چاهک 5- ناقل فاقد قطعه و هضم شده با آنزیمهای NcoI و BamHI به عنوان کنترل. چاهک 6- نشانگر مولکولی یک کیلو بازی. ب –چاهک 1- نشانگر مولکولی یک کیلو بازی. چاهک 2-4- ناقل حامل سازه تکرار معکوس 1EPol هضم شده با آنزیم HindIII. چاهک 5- ناقل فاقد قطعه و هضم شده با آنزیم HindIII به عنوان کنترل که ناحیه 35SCaMV به طول 916 جفت باز از پلاسمید جدا شده است. چاهک 6- نشانگر مولکولی 100 جفت بازی.
شکل 3- محصول واکنش برش آنزیمی ناقل pGA482G با استفاده از آنزیمهای HindIII و HpaI. چاهک 1- نشانگر مولکولی یک کیلوبازی. چاهک 2- ناقل فاقد قطعه. چاهک 3- ناقل نوترکیب حامل سازه تکرار معکوس 1EPol.
قطعات برگ توتون N. benthamiana برای تراریزش استفاده شد و پس از کالوسزایی، جوانه زنی و ریشه دهی تعداد 40 دودمان (لاین) تراریخت مستقل ایجاد و تکثیر یافت.
تعیینتراریختیبوتهها: واکنش زنجیرهای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای ژن گزینشگر nptII رویDNA گیاهان تراریخت احتمالی، توانست قطعهای به طول 1105 جفت باز را تکثیر کند (شکل 4). این در حالی بود که این قطعه در گیاهان غیر تراریخت تکثیر نشد. در نتیجه تکثیر این ناحیه حاکی از تراریختی گیاهان با سازه سنجاق سری حامل بخشی از ژن پلیمراز بود.
شکل 4- نمونهای از تأیید تراریختی گیاهان N. benthamiana با استفاده از آغازگرهای ژن nptII. چاهک 1- نشانگر مولکولی یک کیلو بازی. چاهک 13-2- قطعه 1105 جفت بازی تکثیر یافته از ژن nptII در گیاهان تراریخت شده با سازه تکرار معکوس 1EPol. چاهک 14- گیاه غیر تراریخت. چاهک 15- کنترل منفی آزمون PCR.
پس از تأیید تراریختی گیاهان، 40 دودمان گیاه تراریخت جهت بررسی میزان مقاومت ایجاد شده نسبت به GFLV با این ویروس مایهزنی شدند. علاوه بر بررسی علائم ظهور یافته از روز هفتم تا دهم پس از مایهزنی، آزمون الایزا نیز جهت تعیین حضور یا عدم حضور GFLV در گیاهان تراریخت در روز نهم پس از مایهزنی انجام و توسط دستگاه الایزا خوان میزان غلظت ویروس در طول موج 405 نانومتر اندازهگیری شد. در روزهای هفتم تا دهم پس از مایهزنی، علائم بیماری در تعدادی از گیاهان تراریخت شده با سازه 1EPol به طور واضحی قابل مشاهده بود. این آلودگی با آزمون الایزا نیز تأیید شد و این گیاهان در مجموع حساس به GFLV ارزیابی شدند (شکل 5- ه). واکنش این گیاهان به مایهزنی، کاملاً مشابه گیاهان توتون غیرتراریخت و مایهزنی شده با GFLV بود که به عنوان کنترل مثبت در این تحقیق استفاده شدند (شکل 5- الف). در تعدادی از گیاهان تراریخت علائم بیماری با شدت کمتری نسبت به گیاه غیرتراریخت و حساس ایجاد شد. علاوه بر این، علائم در این گیاهان با تأخیر و حدود 3 تا 4 هفته بعد ظاهر شد (شکل 5- د). تعدادی از گیاهان تراریخت حتی پس از یک ماه نیز علایمی از آلودگی به GFLV نشان ندادند. آزمون الایزا نیز عدم حضور ویروس را در این گیاهان تأیید کرد و این گیاهان در مجموع مقاوم (شکل 5- ج) و مشابه با گیاهان غیرتراریخت و مایهزنی نشده با ویروس که به عنوان کنترل منفی در این تحقیق استفاده شدند (شکل 5- ب)، ارزیابی شدند. بر اساس نتایج علائم شناسی و نیز آزمون الایزا 5/27 درصد از گیاهان تراریخت، مقاوم به ویروس بوده و 5/32 درصد از آنها مشابه گیاهان غیرتراریخت حساسیت نشان دادند. همچنین 40 درصد از گیاهان تراریخت در حالی در آزمون الایزا مثبت ارزیابی شدند که هنوز علائم آلودگی را نشان نداده بودند و علائم ویروسی روی این گیاهان با تأخیر ظاهر شد (جدول 3).
در پژوهش حاضر تراریختی گیاهان توتون مورد مطالعه با استفاده از A. tumefaciens حامل سازه سنجاقسری با موفقیت انجام شد. همچنان که در مطالعهای،
A. tumefaciens حامل پلاسمید pZM1047 به گیاه داتوره منتقل و جهت تعیین تراریختی گیاهان از آزمونPCR و آغازگرهای ژن nptIIاستفاده شد. نرخ تراریختی حاصل از قطعات برگی در این آزمایش 13 درصد گزارش شد که در مقایسه با نرخ 78 درصدی حاصل از آزمایش مشابه روی گیاهان توتون نشان داد که گیاه توتون از لحاظ ژنتیکی نسبت به دریافت T-DNA بسیار خوب و مستعدتر از گیاه داتوره عمل می کند. البته شرایط محیطی مانند دما، حضور مواد فنلی و بعضی از آنزیمها در محیط کشت میتواند بر روی انجام موفق تراریختی اثر گذار باشد (2).
جدول 3- واکنش گیاهان تراریخت با سازه 1EPol و غیرتراریخت نسبت به GFLV بر اساس علایم، آزمون الایزا و PCR.
آزمون PCR با آغازگر nptII |
آزمون الایزا |
ظهور علائم (روز پس از مایهزنی) |
واکنش گیاه |
تعداد کل/گیاه آلوده |
- |
+ |
- + + |
بدون علایم 30-25 10-7 |
مقاومت تأخیر حساسیت* |
40/ 11 (5/27%) 40/ 16 (40%) 40/ 13 (5/32) |
گیاهان تراریخت |
- |
+ |
10-7 |
حساسیت |
5/5 |
گیاهان غیرتراریخت |
*: یک هفته پس از مایهزنی، ظهور علائم موزاییک و زردی در گیاهان حساس ظاهر شد.
شکل 5- واکنش گیاهان N. benthamiana تراریخت با سازه تکرار معکوس 1EPol و غیرتراریخت به GFLV. الف- گیاه غیرتراریخت و مایهزنی شده به عنوان کنترل مثبت. ب- گیاه غیرتراریخت بدون مایهزنی به عنوان کنترل منفی. ج- نمونه ای از گیاه مقاوم تراریخت با سازه 1EPol. د- گیاه تراریخت با سازه 1EPol ه- گیاه تراریخت با سازه 1EPol.
تعیینکنندههایی که تاکنون در مورد اعضاء خانواده Secoviridae شناسایی شده و سبب بروز علائم میشدند، پروتئینهای درگیر در تکثیر و پلیپروتئین بالغ مثل هلیکاز نوع III و پروتئیناز سیستئین شبه 3C بودند (7 و 13). در آزمایشات Vigne و همکاران، وجود دومینهای اختصاصی نژاد، روی ژن RNA پلیمراز وابسته به RNA (RdRP) ویروس GFLV تأیید و مشخص شد که این دومینها وظیفه تنظیم عوامل تعیینکننده علائم را دارند. برای شناسایی این تعیینکنندهها، کلونهای عفونی cDNA مربوط به RNA1 و RNA2 نژاد GHu و F13 ویروس GFLV تهیه و با استفاده از رویکرد ژنتیک معکوس مشخص شد که در نژاد GHu، تعیینکنندههای علائم روی RNA1 خصوصاً در 408 نوکلئوتید انتهای '3 RdRP (1EPol) قرار دارند، اما به نظر نمیرسد این ناحیه به عنوان مهارکننده خاموشی عمل کند. این محققین در آزمایش دیگری نشان دادند که ژن 1EPol در مهار خاموشی EGFP در N. benthamiana تراریخته بیان کننده EGFP موفق عمل نکرد. این آزمایش بار دیگر با استفاده از رقم وحشیN. benthamiana انجام شد، اما پروتئین 1EPol در هیچ کدام از دو نژاد F13 و GHu برخلاف CMV- 2b قادر به افزایش بیان GFP نبود. این در حالی بود که پروتئین 1EPol در قسمتهای اگرواینفیلتر شده به آسانی توسط آزمون وسترن بلاتینگ ردیابی شد. نتایج این آزمایشات، هیچگونه فعالیت مهارکنندگی خاموشی قابل ردیابی در ارتباط با پروتئین 1EPol در دو نژاد GHu و F13 ویروس GFLV نشان نداد (34). نتایج به دست آمده از پژوهش حاضر با نتایج این محققین مطابقت دارد. همچنان که توالی نوکلئوتیدی بخشی از ژن 1EPol که در ساخت سازه سنجاقسری در این پژوهش به کار برده شد، کارآیی لازم جهت القای مقاومت نسبت به GFLV را نداشت و نتیجه به دست آمده بیانگر این است که ژن یا ژنهای دیگری در این ویروس مسئولیت بیماریزایی و مهار خاموشی ژن (VSRs) را بر عهده دارند و این ژن یا ژنها علیرغم حضور یک سازه تکرار معکوس که بیان کننده یک RNA دو رشته ای ((dsRNA بوده و القاءکننده مکانیسم خاموشی ژن در گیاه است، میتوانند بر مقاومت ایجاد شده ناشی از این سازه غلبه کنند و سبب بروز واکنش حساسیت در گیاهان تراریخت شده با این سازه شوند. در سال 1998 مشخص شد که ویروسها پروتئینهایی رمز میکنند که مهارکننده خاموشی ژن (VSRs) می باشند. این یافته علاوه بر حمایت از این ایده که خاموشی RNA به عنوان یک مکانیسم دفاعی طبیعی بر علیه ویروس است، همچنین ابزار قابل دسترسی برای توصیف مسیرهای خاموشی ژن می باشد (36). دانش موجود از تعیین کنندههای علائم و مهارکنندههای خاموشی ویروسهای جنس Nepovirus خیلی محدود است (34 و 35) و تاکنون تلاشهای زیادی در این زمینه صورت گرفته است. در مطالعهای در سال 2009 سازهای بر اساس توالیهای GFLV برای ایجاد موهای تراریخت که خاموشی اختصاصی GFLV را القاء میکرد، طراحی شد. سازه تکرار معکوس با استفاده از قطعاتی از ناحیه حفاظت شده ژن پروتئین حرکتی یک جدایه GFLV از تونس همراه با کاستهای محتوی نئومایسین فسفوترانسفراز ΙΙ یا ژن bar به عنوان گزینشگر طراحی شد. این سازه از طریق tumefaciensA. به N. benthamiana منتقل شد. مدتی بعد از مایهزنی گیاهان تراریخته با GFLV ایجاد مقاومت، بهبودی، به تعویق افتادن آلودگی و حساسیت در این گیاهان مشاهده شد. تجزیه و تحلیل آزمون لکه گذاری نورترن (Northern blotting) که در آن یک توالی با منشأ ویروسی (پروتئین حرکتی) به عنوان کاوشگر استفاده شد، توانست RNA های کوچک مداخله کننده (siRNA) اختصاصی ژن انتقال یافته به گیاه N. benthamiana تراریخته بعد از مایهزنی را ردیابی کند. همچنین سازه تکرار معکوس از طریق A. tumefaciens به سلولهای جنینی مو (V. vinifera) منتقل شد. 67/66 درصد گیاهان تراریخته مو به ویروس مقاوم شدند. آزمون الایزا مقاومت را در گیاهان تراریخته تأیید کرد و همچنین تجزیه و تحلیل آزمون لکه گذاری نورترن، سطوح متفاوتی از نسخههای تکرار معکوس را در دودمانهای مستقل مو تراریخته، که خاموشی ژن پس از نسخهرداری را نشان میدادند، ردیابی کرد. تفاوت در برابر مایهزنی با GFLV در گیاهان وحشی و N. benthamiana تراریخته حاوی ساختار تکرار معکوس، تصور وقوع خاموشی اختصاصی GFLV در گیاهان تراریخته را افزایش میدهد و نشان دهنده عملکرد ساختار تکرار معکوس است که یک استراتژی مؤثر برای ایجاد گیاهان مقاوم به GFLV میباشد (16). در تحقیق حاضر نیز مشابه آزمایشات Jardak و همکاران تفاوت در واکنش تیپ وحشی گیاهان N. benthamiana و نیز گیاهان تراریخت مقاوم به مایهزنی با GFLV، بیانگر وقوع خاموشی ژن در گیاهان تراریخت بوده و کارآیی سازه ساخته شده را نشان میدهد. اگرچه پیشنهاد شده است که خاموشی ژن در درختان چوبی نسبتاً نادر است (7) اما در مطالعهای دیگر توسط Gambino و همکاران در سال 2009، خاموشی ژن در درختچههای تراریخت با ژن پروتئین پوششی GFLV مشاهده شد و با اینکه احتمال خاموشی ژن در سطح نسخه برداری (TGS) نمیتوانست به طور کامل رد شود، خاموشی ژن پس از نسخهبرداری (PTGS) در پنج دودمان از هشت دودمان تراریخته القاء شد و میزان بیان ژن پروتئین پوششی GFLV در هشت دودمان تراریخته مو توسط آزمون لکهگذاری نورترن ارزیابی گردید (11). همچنین در نتایج Gambino و همکاران حساسیت و تأخیر در آلودگی در
N. benthamiana تراریخت بیان کننده ژن پروتئین پوششی GFLV پس از مایهزنی با این ویروس مشاهده شد که این نتایج با نتایج به دست آمده در پژوهش حاضر مطابقت دارد (11). کاربرد ترادفهای تکرار معکوس (IR) منشاء گرفته از دو قطعه ژنومی ویروس به عنوان روشی به منظور دستیابی به مقاومت بر علیه MV در سطوح بالا بوده است. نتایج نشان میدهد که سازههای سنجاقسری میتوانند مقاومت در سطح بالایی را ایجاد نمایند (36). در مطالعه ای روی گیاهان تراریخت N. tabacum cv Samsunکه ژن RDR1 (RNA-Directed-RNA Polymerase-1) در آنها توسط ساختارهای ساقه - حلقه دارای مشابهت ژنتیکی با ژن RDR1 خاموش شده بود، میزان پایداری خاموشی ژن بررسی شد. بدین منظور میزان حساسیت به آلودگی سیستمیک ویروس (Potato virus Y strain o) PVY° و نیز میزان بیان ژنهای RDR1 و RDR6یک هفته پس از مایهزنی نسلهای دوم (T2)و سوم(T3) توتونهای تراریخت بررسی شد. نتایج نشان داد که نسل دوم این گیاهان نسبت به نسل بعدی از میزان بیان کمتر ژن RDR1برخوردار می باشد. همچنین لاینهای نسل دوم در مقایسه با نسل سوم از حساسیت بیشتر به ویروس PVY° برخوردار بود. در مجموع نتایج نشان داد کارآیی ساختار ساقه - حلقه در خاموشی ژنRDR1 در نسل بعد کاهش یافته است. از آنجایی که ژن RDR6 تحت تأثیر ژن RDR1 بوده و برای انتقال پیام خاموشی در طول گیاه و افزایش مقاومت گیاهان به آلودگی ویروسی لازم میباشد، پیشنهاد شد که سرکوب ژن RDR1 در توتونهای تراریخت موجب جلوگیری از بیان ژن RDR1 و در نهایت موجب کاهش انتقال عمودی ساختارهای ساقه - حلقه خاموش کننده به نسل بعد شده است (1).
همچنین ایجاد مقاومت به ویروس پژمردگی لکهای گوجهفرنگی (TSWV) و PVY نشان داد که نسبتی بین بیان ژن منتقل شده و مقاومت ایجاد شده وجود ندارد (17). مشخص شده است که علاوه بر سازههای قابل ترجمه، سازههای غیر قابل ترجمه نیز قادر به ایجاد مقاومت هستند (19). همچنان که در تحقیق حاضر بیان یک ترادف نوکلئوتیدی غیر قابل ترجمه قادر به ایجاد گیاه تراریخت مقاوم به ویروس بود. به دست آمدن نتایج متفاوت در رابطه با گیاهان تراریخت جهت ایجاد مقاومت نشان دهنده پیچیده بودن واکنش بین گیاه و ویروس میباشد (8 و 15). علاوه براین به دست آمدن گیاهان تراریختی که علائم را با تأخیر نشان میدادند میتواند مربوط به میزان تولید siRNA در این گیاهان باشد و احتمالاً این گیاهان دارای سطوح پایینتر siRNA نسبت به گیاهان مقاوم تراریخت میباشند. بنابراین بررسی سطوح siRNA در گیاهان تراریخت ضروری میباشد. در مجموع با توجه به کارآیی بالای سازه های تکرار معکوس حاوی اینترون در ایجاد مقاومت و نتایج به دست آمده در این تحقیق و ایجاد تنها تعدادی گیاه تراریخت مقاوم به GFLV، بررسی بیشتر ترادف نوکلئوتیدی ژنوم ویروس برگ بادبزنی مو (GFLV) جهت یافتن ناحیه مسئول مهارکنندگی خاموشی ژن (VSR) در این ویروس ضروری به نظر میرسد. Vigne و همکاران در سال 2013 گزارش کردند که اگرچه مهارکنندههای خاموشی (VSRs) در بیشتر جنسهای ویروسهای گیاهی به خوبی توصیف شدهاند، اما شناسایی آنها در اعضاء Nepovirus به تعویق افتاده است (34). بنابراین انجام آزمایشات بیشتر جهت یافتن ژن مهارکننده خاموشی این ویروس و ساخت سازه القاءکنندهای مبتنی بر آن، میتواند در رسیدن به مقاومت کاملی علیه این ویروس بسیار کمک کننده باشد، زیرا در غیر این صورت استفاده از هر ناحیه از ترادف نوکلئوتیدی این ویروس، کارآیی لازم برای القای مقاومت به این ویروس در گیاه را نخواهد داشت.
سپاسگزاری
از آقای دکتر مارک فیوکس به خاطر در اختیار گذاشتن مواد و امکانات مورد نیاز جهت انجام این پژوهش در آزمایشگاه ویروس شناسی گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه کرنل امریکا (ایستگاه تحقیقاتی کشاورزی در ایالت نیویورک) صمیمانه تشکر و قدردانی می شود.