بررسی خاصیت آنتاگونیستی وتنوع ژنتیکی جدایه های استرپتومایسس استخراج شده از خاکهای استان کرمان جهت کنترل بیولوژیک قارچ بیمارگرSclerotinia sclerotiorum 

فاطمه بنی اسدی¹، امین باقی زاده^2* و غلامحسین شهیدی بنجار¹ 

¹ کرمان، دانشگاه شهید باهنر کرمان، دانشکده کشاورزی 

² کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی 

تاریخ دریافت: 11/9/94                تاریخ پذیرش: 19/1/96 

چکیده 

در تحقیق حاضر برای تعیین جدایه های مناسب استرپتومایسس، اثرات آنتاگونیستی 30 جدایه استخراج شده از خاکهای استان کرمان علیه قارچ بیمارگر Sclerotinia sclerotiorumمورد بررسی قرار گرفت. از مجموع این جدایه ها ، 10 جدایه استرپتومایسس در روش Dual Culture از خود خاصیت آنتاگونیستی نشان دادند که بیشترین آن به استرپتومایسس جدایهUK  363 مربوط بوده است. آنگاه به منظور بررسی رابطه فیلوژنی و تنوع ژنتیکی 30 جدایه مذکور، استخراج DNA از آنها به روش CTAB صورت گرفت و از 10 آغازگر RAPD جهت انجام PCR استفاده شد. پس از انجام الکتروفورز 128 باند قوی و واضح در محدوده bp250 تا bp2800  تشخیص داده شد. اطلاعات به دست آمده توسط نرم افزار NTSYS و به روش UPGMA با ضریب تشابه دایس آنالیز شدند. درختچه به دست آمده، 30 جدایه استرپتومایسس را در خط برش 58 درصد ، در  دو  گروه کلی قرار داد. در گروه اول 10 جدایه دارای خاصیت آنتاگونیستی و در گروه دوم 20 جدایه فاقد خاصیت قرار گرفتند. گروه بندی جدایه ها با استفاده از روش تجزیه به مؤلفه های اصلی نیز انجام شد و پلاتهای دو بعدی و سه بعدی مربوطه رسم گردید و جدایه ها به هشت گروه مختلف تقسیم شدند.

واژه های کلیدی: استرپتومایسس، Sclerotinia sclerotiorum، تنوع ژنتیکی، نشانگر RAPD

* نویسنده مسئول، تلفن:09131414156 ، پست الکترونیکی: amin_4156@yahoo.com

مقدمه

قارچ  Sclerotinia sclerotiorumیک پاتوژن گیاهی است که عامل اصلی بیماریهای مهمی مانند کپک سفید، پژمردگی اسکلروتینیایی و پوسیدگی ساقه و طوقه در دامنه وسیعی از گیاهان است، به طوری که به بیش از 400 گونه گیاهی از 64 خانواده و 225 جنس حمله می کند (25). مبارزه شیمیایی با عامل مذکور خطر ظهور جدایه های مقاوم به قارچکشها و در عین حال آلودگی محیط پیرامونی را به همراه دارد. اما مبارزه بیولوژیک را می توان به دلیل ایمنی بیشتر و خطرات کمتر مورد توجه قرار داد. این موارد محققان را بر آن داشت که از متابولیتهای میکروبی برای یافتن داروهای جدید و به حداقل رساندن اثرات زیان بار قارچکشهای سنتزی استفاده کنند(25). اکتینومیست ها به دلیل رفتار رشدی خاص، توانایی استقرار بر سطح ریشه گیاه، اثرات بازدارندگی روی میکروبها و تولید متابولیتهای ثانویه متنوع از لحاظ شیمیایی، به عنوان عوامل مقتدر کنترل بیولوژیکی علیه بسیاری از عوامل بیماریزای مهم گیاهی به شمار می روند. در میان اکتینومیست ها Streptomyces spp. به عنوان تولید کننده اصلی ترکیبات متنوع فعال زیستی شناخته شده اند (17و18 ). برای استفاده بهینه از این باکتریها به عنوان عوامل بیوکنترل، توسعه روشهای مولکولی برای تشخیص این گونه ها  اهمیت فراوانی دارد. نشانگرهای مولکولی ابزارهای بسیار مهم و قوی در ارزیابی روابط خویشاوندی ژنتیکی، انتخاب گونه های برتر و بررسی شباهت  و تفاوت بین نمونه های مختلف می باشند. این نشانگرها از نظر درجه چند شکلی، غالب یا همبارز بودن، توزیع در سطح کروموزوم، تکرارپذیری، نیاز یا عدم نیاز به توالی یابی DNA و غیره با هم تفاوت دارند. انتخاب بهترین سیستم نشانگری به هدف تحقیق و سطح پلوئیدی موجود مورد مطالعه بستگی دارد (26). تا کنون مطالعات اندکی برای مطالعه استرپتومایسس ها با استفاده از نشانگرهای مولکولی صورت گرفته است. در یک مطالعه از نشانگر RAPD جهت تعیین تنوع ژنتیکی 73 جدایه استرپتومایسس تولید کننده آنتی بیوتیک جدا شده از خاکهای اردن استفاده شده است که کلاستر بندی به روش UPGMA، جدایه ها را در دو گروه اصلی بزرگ قرار داد. همچنین نتایج بررسی ژنتیکی با تفاوتهای ظاهری و فنوتیپی جدایه ها همخوانی داشت (7). جهت بررسی تنوع ژنتیکی و حذف جدایه های استرپتومایسس مشابه در برنامه غربالگری میکروبی در ژاپن از نشانگر RAPD استفاده شد(2). اوشی در سال 2004 و کینگ چاو در سال 2008 از نشانگر AFLP جهت بررسی تنوع ژنتیکی اکتینومیست ها استفاده کردند (15و16). از نشانگر RAPD جهت شناسایی و طبقه بندی استرپتومایسس ها در فرانسه استفاده شد و نتایج نشان داد که RAPD یک نشانگر مؤثر و کارا در تعیین تنوع ژنتیکی جدایه های استرپتومایسس می باشد(14). در ایران نیز مطالعات اندکی در این زمینه صورت گرفته است از جمله جرجندی و همکاران در سال 2011 اثرات آنتاگونیستی آکتنومیست های خاکزی استان کرمان علیه قارچ بیمارگر Butrytisalli   ، عامل پوسیدگی خاکستری پیاز و تنوع ژنتیکی جدایه های استرپتومایسس به وسیله نشانگر مولکولی RAPD  رامورد بررسی قرار دادند و نتایج نشان داد که با استفاده از نشانگر RAPD می توان جدایه های مؤثر و غیرمؤثر بر قارچ بیمارگر Butrytis alli را از یکدیگر تمیز داد (9). بهارلویی و همکاران در سال 2011 اثرات آنتاگونیستی110 جدایه آکتنومیست خاکزی استان کرمان علیه قارچ بیمارگر Sclerotinia sclerotiorum را مورد بررسی قراردادند. نتایج نشان داد استرپتومایسس جدایه422  بیشترین خاصیت آنتاگونیستی را دارا می باشد(3). هدف از تحقیق حاضر بررسی تنوع ژنتیکی جدایه های استرپتومایسس بومی خاکهای استان کرمان با استفاده از نشانگر مولکولی RAPD تعریف شد، تا بتوان از نتایج آن در اهداف آتی کنترل بیولوژیک قارچهای بیمارگر بهره برد.

مواد و روشها

تهیه نمونه های خاک: به منظور جدا سازی اکتینومیست های خاکزی، از خاک نواحی و زمینهای کشاورزی متفاوت در شهرستانهای کرمان ، زرند، رفسنجان، راور، بافت، جیرفت ، بم ، سیرجان، بردسیر و انار در استان کرمان نمونه برداری به عمل آمد. از هر شهرستان سه نمونه تهیه گردید. برای تهیه هرنمونه، برداشت خاک با اوگر از عمق 10 سانتیمتری خاک انجام گردید، برای هر نمونه به میزان دو اوگر، خاک برداشته شد. نمونه ها در کیسه های پلی اتیلن تمیز قرار داده شدند و سپس کاملاً مخلوط شده و از غربال با مش دو میلی متر عبور داده شدند و تا زمان استفاده درون یخچال نگهداری شدند. به هنگام استفاده، 10 گرم نمونه خاک مورد نظر، در 100 میلی لیتر آب مقطر استریل به صورت سوسپانسیون در آورده شد و روی شیکر دوار به مدت 30  دقیقه و با  سرعت 130 دور در دقیقه قرار داده شد. پس از آن، از غلظت ^1- 10 اولیه، رقتهای متوالی ^2-10،^3-10، ^4-10، ^5-10 و ^6-10 تهیه گردید (11و19). سپس 1 میلی لیتر از رقتهای متوالی  ^3-10، ^4-10، ^5-10 و ^6-10  به دست آمده را ‌در پلیت ریخته و مقدار 25-20 میلی لیتر از محیط کشت CGA را با آن مخلوط کرده و بر روی میز کار آزمایشگاه به صورت عدد هشت انگلیسی به حرکت در آورده شد. آنگاه نمونه ها در دمای 28  درجه سانتی گراد نگهداری شدند (20و21).

خالص سازی نمونه ها: پس از 10-7 روز انکوباسیون، پرگنه های اکتینومیست ها و همچنین برخی قارچها و باکتریها ظاهر شدند. از هر پرگنه اکتینومیست، کشت خطی بر روی محیط کشت CGA تهیه شد و نمونه های خالص انتخابی بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی، فیزیکی و شیمیایی(30 نمونه) در دمای 28 درجه سانتی گراد انکوبه شدند(22).

تهیه گونه خالص قارچ: قارچ بیماریزای گیاهی Sclerotinia sclerotiorum، از دانشکده کشاورزی کرج- دانشگاه تهران، به صورت کشت خالص تهیه گردید. محیط کشت مناسب جهت رشد این قارچ PDA (Potato Dextrose Agar) بود.

غربالگری جدایه های استرپتومایسس به منظور تعیین فعالیت ضد قارچی: به منظور تعیین توانایی جدایه های استرپتومایسس به دست آمده در تولید ماده ضد قارچی علیه قارچ مذکور، ‌قطعه ای از پرگنه های هر جدایه 10-7 روزه در کشت خطی همراه با محیط کشت به قطر6 میلی متر توسط چوب پنبه سوراخ کن جدا نموده و بر روی کشت چمنی تازه قارچ قرار داده شد. سپس پلیتها به مدت 5 روز در دمای 28  درجه سانتی گراد قرار گرفتند و بر اساس قطر ناحیه ممانعت از رشد، جدایه های استرپتومایسس فعال  انتخاب گردیدند (23و24).

استخراج DNA استرپتومایسس ها و انجام PCR با نشانگر RAPD : پس از غربالگری جدایه های استرپتومایسس، DNA ژنومی هر جدایه با روش CTAB استخراج گردید(10) و واکنش زنجیره ای پلیمراز  با 10 آغازگر تصادفی RAPD  انجام پذیرفت. مواد واکنش دهنده در مخلوط 25 میکرولیتری PCR شامل ، µl1 از DNA الگوی تهیه شده با غلظت ng/µl50، µl2  MgCl₂با غلظت mM50، µl5/2 dNTP با غلظت mM5/2، µl3/0 Taq DNA polymerase با غلظتunit/µl  5، µl 2 پرایمر با غلظت µM 2،µl  5/2 PCR Buffer دارای غلظت 10برابر [mM 500 KCl و Tris-HCl (4/8=pH)] و µl7/14 آب دو بار تقطیر استریل بود. ترموسایکلر مورد استفاده در این تحقیق از نوع اپندورف در نوع ساده وگرادیان بود. ابتدا دمای اتصال بهینه هر آغازگر با استفاده از ترموسایکلر گرادیان (شیب دمایی) به دست آمد. برنامه دمایی PCR برای همه آغازگر ها مانند هم بود و بخش متغیر آن دمای اتصال آغازگر به DNA تک رشته بود. تکثیر بدین صورت انجام گرفت: 1- واسرشت آغازین DNA در 94 درجه سانتی گراد به مدت 4 دقیقه (یک سیکل)، 2- 35 سیکل شامل: تک رشته ای شدن DNA در دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت 50 ثانیه، اتصال آغازگر به DNA تک رشته ای در دمای اتصال بهینه مربوط به هر آغازگر(55-47 درجه سانتی گراد) به مدت 40 ثانیه، بسط آغازگر در دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت 2 دقیقه، 3- تکمیل بسط در دمای C ْ 72 به مدت 8 دقیقه (یک سیکل). پس از انجام برنامه در دستگاه PCR، نمونه ها بلافاصله خارج شده و تا زمان انجام الکتروفورز، در دمای 20- درجه سانتی گراد حداکثر به مدت یک ماه نگهداری شدند.

آنالیز باندهای حاصل از الکتروفورز: جهت بررسی فرآورده های واکنش زنجیره ای پلیمراز از ژل آگارز 1 درصد استفاده شد. پس ازانجام الکتروفورز و مشاهده باندها در دستگاه ژل نگار، از ژل با فرمتهای مختلف عکس تهیه گردید. سپس عکسها به نرم افزار Gene tools منتقل گردید. حضور یا عدم حضور هر کدام از باندهای مشاهده شده برای هر یک از 10 آغازگر به ترتیب با اعداد 1 و 0 امتیازدهی شدند و سپس در نرم افزار Excel یک ماتریس از اعداد 1 و 0 برای آغازگرهای مورد استفاده تهیه شد. تعیین تشابه بین نمونه ها با استفاده از شاخص دایس و تجزیه خوشه ای با استفاده از روش UPGMA در نرم افزار NTSYS صورت گرفت .برای کاهش حجم داده ها و تفسیر راحت تر مشاهدات، با استفاده از تجزیه به مؤلفه های اصلی پلاتهای دو بعدی و سه بعدی نیز رسم شد.

نتایج و بحث

غربالگری جدایه های استرپتومایسس جهت تعیین فعالیت ضد قارچی: پس از انجام آزمایش آنتی بیوگرام به روش دیسک گذاری، منطقه ممانعت از رشد به صورت یک هاله شفاف نزدیک جدایه ها علیه S. sclerotiorum ایجاد گردید (شکل1) (4). از مجموع 30 جدایه استرپتومایسس 10 جدایه توانایی جلوگیری از رشد قارچ را داشتند و 20 جدایه دیگر غیر فعال بودند.

شکل 1- ایجاد هاله های ممانعت از رشد در اطراف دیسکهای جدایه استرپتومایسس UK363(چپ و راست) علیه قارچ بیمارگرSclerotinia sclerotiorumبه روشDisc-Agarدر محیط کشتPDA. (نقل از4)

سپس جدایه های استرپتومایسس براساس روش
 El- Trabily و همکارانش (5) به چهار دسته تقسیم شدند. سه دسته فعال شامل 1- قطر هاله ممانعت از رشد برای جدایه های استرپتومایسس ضعیف 10–5 میلی متر(+)، 2- برای جدایه های متوسط 30-10 میلی متر(++) 3- برای جدایه های قوی  بالاتراز30 میلی متر(+++) و یک دسته غیر فعال که هاله ممانعت از رشد ایجاد نمی کنند. جدول 1 نحوه تمایز جدایه های استرپتومایسس فعال را نشان می دهد.

جدول1- تنظیم جدایه های استرپتومایسس فعال بر اساس روش El- tarabily و همکاران (5) 

نتایج حاصل از امتیاز دهی ژل ها و تجزیه وتحلیل آنها: پس از مشاهده باندها وعکس برداری از ژلها با دستگاه ژل نگار ، مجموعاً 128 باند قوی و واضح توسط 10 آغازگر در محدوده bp250 تا bp2800 تشخیص داده شد. تعداد باندهای ایجاد شده برای هر پرایمر متفاوت بوده و بین 6 باند برای آغازگر 391  تا 20 باند برای آغازگر 54 متغیر بود(شکل 2). به طور متوسط هر آغازگر 8/12 باند را تکثیر نمود. میانگین تعداد باند چند شکل برای هر آغازگر 6/11 بود (جدول 2).

درختچه حاصل از تجزیه خوشه ای با ضریب تشابه دایس در شکل3 نشان داده شده است. اگر خط برش در فاصله تشابه 58 درصد در درختچه حاصل از تشابه دایس زده شود، جدایه های استرپتومایسس به دو گروه کلی تقسیم می شوند. گروه اول شامل جدایه هایی است که توانایی جلوگیری از رشد قارچ و ایجاد هاله ممانعت را داشتند، یعنی جدایه های استرپتومایسس UK363، UK361، UK344،UK370،UK364،UK273،UK262،UK360،UK139و UK246 که در فاصله تشابه 61 درصد ، این جدایه ها خود به سه زیرگروه تقسیم می شوند (جدول 3).

گروه دوم شامل جدایه های استرپتومایسس UK353، UK431، UK367، UK359، UK211، UK145، UK126، UK157، UK425، UK98، UK302، UK335، UK365، UK331، UK371، UK412، UK304، UK432، UK321 و UK366 می باشد.

این جدایه ها توانایی جلوگیری از رشد قارچ را نداشتند. خط برش در فاصله تشابه 61 درصد، این جدایه ها را در پنج زیرگروه قرار می دهد (جدول 4).

جدول2- تعداد باندها و میزان چندشکلی آغازگرهای  RAPDمورد استفاده 

شکل 2- باندهای چند شکلی مشاهده شده با نشانگر 66 درتعدادی از جدایه های استرپتومایسس پس از الکتروفورز

شکل3- درختچه حاصل از تجزیه خوشه ای 30 جدایه استرپتومایسس مورد بررسی با ضریب تشابه دایس

جدول 3- زیر گروههای مربوط به گروه اول درختچه حاصل بر اساس ضریب تشابه دایس

جدول 4- زیر گروههای مربوط به گروه دوم درختچه حاصل بر اساس ضریب تشابه دایس

جدایه های استرپتومایسس UK359، UK360، UK361 ، UK363 ، UK364، UK365 و UK366 از یک مکان جمع آوری شده بودند، نتایج  نشان داد که این جدایه های جمع آوری شده از یک ناحیه جغرافیایی لزوماً دارای قرابت ژنتیکی نمی باشند، به طوری که سه جدایه UK359، UK365 و UK366 برخلاف چهار جدایه دیگر که متعلق به همان مکان بودند و توانایی جلوگیری از رشد قارچ را داشتند، نتوانستند از رشد قارچ جلوگیری نمایند و این جدایه ها در گروهها و زیر گروههای مختلفی قرار گرفتند.

تجزیه به مؤلفه های اصلی: از تجزیه به مؤلفه های اصلی بر روی داده های حاصل از RAPD یک پلات دو بعدی (شکل 4) و یک پلات سه بعدی (شکل5) حاصل شد. سه مؤلفه اصلی که بیشترین سهم را در ایجاد تنوع داشته اند به ترتیب 68/27، 18/16و 64/9 در صد از میزان کل تنوع را کنترل کرده اند.

شکل4- پلات دو بعدی حاصل از تجزیه به مؤلفه های اصلی

نتایج حاصل از پلات دو بعدی و سه بعدی اگرچه اطلاعات خلاصه شده و مناسبی از وضعیت جدایه های استرپتومایسس را نشان داد، اما نتایج کلی و اطلاعات حاصله نشان می دهد که کلاستر بندی حاصل از کل اطلاعات ، نتایج دقیق تر و جامع تری را حاصل کرده است که نشان از انتخاب مناسب نسبی پرایمرها می باشد. ضمن آنکه با افزایش تعدادآغازگرها می توان اطلاعات دقیق تری به دست آورد. برای استفاده بهینه از باکتریها به عنوان عوامل بیوکنترل، توسعه روشهای مولکولی برای تشخیص این گونه ها اهمیت فراوانی دارد. استفاده از انگشت نگاری DNA یک روش ایده آل است که به طور وسیع در شناسایی موجودات از جمله باکتریها به کار رفته است (6 و12). استفاده از نشانگر مولکولی RAPD یکی از روشهای موفق است که می تواند جهت تولید الگوهای تکثیری متفاوت برای گونه های مختلف به کار رود (1و8).

شکل5- پلات سه بعدی حاصل از تجزیه به مؤلفه های اصلی

جدول5- گروه بندی جدایه های استرپتومایسس بر اساس پلات سه بعدی