نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشجوی دکتری/ دانشگاه گیلان
2 عضو هیات علمی/ دانشگاه گیلان
3 عضو هیات علمی/ دانشگاه تربیت مدرس
4 عضو هیات علمی/دانشگاه شهید مدنی آذربایجان
5 عضو هیات علمی/ دانشگاه تهران
چکیده
ترمولیزین یک پروتئاز گرمادوست با کاربرد در صنعت به ویژه سنتز پپتید بوده و از باکتری باسیلوس ترموپروتئولیتیکوس به دست می آید. مطالعات قبلی نشان داده است که نمک کلرید سدیم باعث فعال سازی آنزیم می شود. ترمولیزین دارای چهار یون کلسیم ساختاری می باشد که در پایداری آن در برابر دما حائز اهمیت اند. در مطالعه حاضر، نقش کلسیم در فعال سازی آنزیم توسط نمک بررسی گردید. فعالیت آنزیم در حضور سوبسترای FAGLA در حضور نمک کلرید سدیم 2 مولار و در حضور و عدم حضور کلرید کلسیم 10 میلی مولار بررسی شد. به علاوه، طیفسنجی دورنگ نمایی دورانی و فلورسانس به منظور درک تغییرات ساختاری ترمولیزین در حضور نمک و حضور و عدم حضور کلرید کلسیم مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج نشان داد که میزان فعالیت آنزیم در حضور FAGLA وکلرید کلسیم 10 میلی مولار 5/2 برابر افزایش یافت. نتایج طیفسنجی دورنگ نمایی دورانی پیشنهاد نمود که ساختار کلی ترمولیزین طی فعال سازی نمک وابسته به کلسیم تغییر نکرده و مطالعات فلورسانس نشان داد که جایگاه فعال تحت تاثیرکلسیم دستخوش تغییر شده است. بنابر نتایج بدست آمده از مطالعه حاضر، اتصال یون های کلسیم میتواند بر میزان فعال سازی ترمولیزین توسط نمک موثر میباشد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
The effect of calcium on the activation of thermolysin by salt
نویسنده [English]
چکیده [English]
Thermolysin, obtained from bacillus thermoproteolyticus, is a thermophilic protease having application in peptide synthesis. Previous studies have revealed that salt activates the enzyme. Thermal stability of TLN is critically dependent on four calcium ions bound in N- and C-terminal domains. The aim of present study is unraveling the role of calcium ions in the salt activation of enzyme. On the presence of NaCl 2 M, measurement of the activity of enzyme in the absence and presence of CaCl2 10 mM using FAGLA as substrate showed activation of enzyme using FAGLA and in the presence of CaCl2 10 mM increased 2.5 times. Circular dichroism and fluorescence spectroscopies were used to understand the calcium dependent changes in the enzyme structure. Circular dichroism spectra suggest that the overall structure of thermolysin has not changed during salt and calcium activation. However, fluorescence studies revealed that the active site has changed under calcium-dependent salt activation. According to the results of the present study, the binding of calcium ions might influence the activation of thermolysin by salt.
کلیدواژهها [English]
اثر کلسیم بر فعالسازی ترمولیزین توسط نمک کلرید سدیم
عبدالعلی وارسته1، سید محسن اصغری1*، مجید تقدیر2، محمود رضا آقا معالی1، محمد پاژنگ3 و فرامرز مهرنژاد4
1رشت، دانشگاه گیلان، دانشکده علوم پایه
2تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی
3تبریز، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، دانشکده علوم پایه
4تهران، دانشگاه تهران، دانشکده علوم و فنون نوین
تاریخ دریافت: 18/3/95 تاریخ پذیرش: 31/5/95
چکیده
ترمولیزین یک پروتئاز گرمادوست با کاربرد در سنتز پپتید بوده و از باکتری باسیلوس ترموپروتئولیتیکوس به دست میآید. مطالعات قبلی نشان داده است که نمک کلرید سدیم باعث فعالسازی آنزیم میشود. پایداری حرارتی ترمولیزین به شدت وابسته به 4 یون کلسیم بوده که به دمینهای انتهای آمینو و کربوکسیل متصل شدهاند. در مطالعه حاضر، نقش کلسیم در فعالسازی آنزیم توسط نمک کلرید سدیم بررسی گردید. فعالیت آنزیم در حضور سوبسترای FAGLA در حضور نمک کلرید سدیم 2 مولار و در حضور و عدم حضور کلرید کلسیم 10 میلیمولار بررسی شد. به علاوه، طیفسنجی دورنگ نمایی دورانی در ناحیه دور و فلورسانس به منظور درک تغییرات ساختاری ترمولیزین در حضور نمک کلرید سدیم و حضور و عدم حضور کلرید کلسیم مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج نشان داد که میزان فعالیت آنزیم در حضور FAGLA وکلرید کلسیم 10 میلیمولار 5/2 برابر افزایش یافت. نتایج طیفسنجی دورنگ نمایی دورانی در ناحیه دور پیشنهاد نمود که ساختار کلی ترمولیزین طی فعالسازی نمک وابسته به کلسیم تغییر نکرده و مطالعات فلورسانس نشان داد که جایگاه فعال تحت تأثیرکلسیم دستخوش تغییر شده است. بنابر نتایج به دست آمده از مطالعه حاضر، اتصال یونهای کلسیم میتواند بر میزان فعالسازی ترمولیزین توسط نمک کلرید سدیم مؤثر باشد.
واژه های کلیدی: ترمولیزین، فعالیت آنزیمی، کلرید سدیم، کلسیم.
* نویسنده مسئول، تلفن: 01333333647، پست الکترونیکی: sm_asghari@guilan.ac.ir
مقدمه
ترمولیزین [EC 3.4.24.27]، حاصل از باکتری باسیلوس ترموپروتئو لیتیکوس، کاربرد فراوانی در زیست فناوری و صنایعی همچون صنایع غذایی، داروسازی و سنتز پپتید داشته و از پایداری حرارتی بالایی برخوردار است (10). ترمولیزین اولین آنزیم ترموفیل بوده که ساختار در حالت بلور آن در سال 1972 تعیین شده (6) و به عنوان یک آنزیم مدل مورد مطالعه قرار گرفته است. این آنزیم در دمین انتهای آمینی غنی از صفحات بتا و در دمین انتهای کربوکسی دارای مارپیچهای آلفا میباشد (8 و 9). ترمولیزین هیدرولیز پیوندهای پپتیدی را بهویژه در محل باقیماندههای آبگریز کاتالیز میکند (8) و به طور گسترده در تشکیل پیوند پپتیدی از طریق واکنش معکوس هیدرولیز مورد استفاده قرار میگیرد (10). این پروتئین از 316 اسید آمینه تشکیل شده و از یک اتم روی برای فعالیت و چهار اتم کلسیم برای پایداری ساختاری تشکیل شده است (7، 13، 15 و 16). چهار جایگاه اتصال کلسیم در ترمولیزین به ترتیب Ca1 تا Ca4 نامگذاری شدهاند. کلسیمهای متصل به ترمولیزین برخی دارای اتصال محکم و بعضی دارای اتصال ضعیف میباشند. از بین چهار یون کلسیم مذکور، Ca1 با تمایل بالا و Ca3 با تمایل کم به آنزیم اتصال یافتهاند اما در مورد تمایل آنزیم به اتصال به دو جایگاه دیگر شامل Ca2 و Ca4 اختلاف نظر وجود دارد.
مطالعاتی که تاکنون بر روی جایگاههای اتصال کلسیم در ترمولیزین صورت گرفته به طور عمده بر نقش آنها بر پایداری حرارتی آنزیم استوار بوده است. در مطالعات قبلی مشخص شده که افزایش کلرید سدیم تا غلظت چهار مولار باعث افزایش فعالیت تا حد 6 الی 7 برابر میشود (11)، اما تاکنون اطلاعاتی پیرامون نقش یونهای کلسیم در فعالشدن آنزیم در دسترس نیست. هدف از تحقیق حاضر بررسی نقش یونهای کلسیم بر فعالسازی ترمولیزین توسط نمک است. بدین منظور فعالسازی آنزیم توسط نمک در عدم حضور و غلظت 10 میلیمولار کلرید کلسیم مورد بررسی قرار گرفت. همچنین در حضور و عدم حضور کلسیم تغییرات ساختاری آنزیم با استفاده از روشهای طیفسنجی دورنگ نمایی دورانی ناحیه دور و فلورسانس ذاتی مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
مواد: آنزیم ترمولیزین از شرکت سیگما ،(St. Louis, MO. USA) و FAGLA از شرکت Bachem خریداری شد. سایر مواد استفاده شده از شرکت مرک آلمان (Darmstadt, Germany) خریداری شد.
سنجش فعالیت با استفاده از سوبسترای FAGLA: فعالیت پروتئازی آنزیم با استفاده از FAGLA، که یک سوبسترای کروموژن برای خانواده ترمولیزین است، مورد بررسی قرار گرفت (12). هیدرولیز FAGLA توسط ترمولیزین از طریق کاهش جذب در 345 نانومتر اندازهگیری شد. میزان FAGLA هیدرولیز شده با استفاده از اختلاف جذب مولی ناشی از هیدرولیز (Δε345 = -310 M-1 cm-1) در 25 درجه سانتیگراد بهدست آمد. مخلوط واکنش (400 ماکرولیتر) شامل تریس 50 میلیمولار، pH 7.5، CaCl2 5 میلی مولار، تریتون X-100 01/0 درصد و 50 میکرولیتر FAGLA 20 میلیمولار میباشد که در DMSO حل شده است. غلظت نهایی آنزیم 20 میکروگرم بر میلی لیتر بود. یک یونیت فعالیت آنزیمی برابر با مقدار آنزیم مورد نیاز برای شکستن یک میکرومول FAGLA در یک دقیقه و در دمای اتاق میباشد.
مطالعات فلورسانس ذاتی: فلورسانس ذاتی ترمولیزین در بافر تریس 50 میلیمولار 5/7 pH اندازهگیری شد. غلظت نهایی آنزیم در مطالعات فلورسانس ذاتی 5 میکروگرم بر میلیلیتر بوده است. طول موج برانگیختگی 295 نانومتر و طول موج نشر 300 تا 400 نانومتر بود. سرعت طیفگیری 500، Slit برانگیختگی و نشر 10 و دمای طیفگیری 25 درجه سانتیگراد بود.
دورنگ نمایی دورانی ناحیه دور: طیف دورنگ نمایی دورانی ناحیه دور جهت بررسی ساختار دوم ترمولیزین در حضور نمک و حضور و عدم حضور کلسیم، پس از انکوبه شدن به مدت 10 دقیقه، توسط دستگاه اسپکترومتر JASCO J-715 ثبت گردید. نتایج به صورت بیضیواری مولی [θ] (deg cm2 dmol-1) و بر اساس رابطه [θ] = (θ×100MRW)/(cl) تعیین گردید که در آن C غلظت پروتئین بر حسب میلیگرم بر میلیلیتر، l طول مسیر نور و θ بیضیواری اندازهگیری شده در دامنه طول موج فرابنفش دور میباشد (14).
نتایج
دورنگ نمایی دورانی ناحیه دور: به منظور درک اینکه آیا فعالیت در حضور نمک با تغییراتی در ساختار ترمولیزین همراه میباشد، طیفسنجی دورنگ نمایی ناحیه دور در حضور و عدم حضور کلرید کلسیم 10 میلیمولار و در حضور کلرید سدیم 2 مولار انجام شد. همانگونه که در شکل 1 مشاهده میشود پیک 197 نانومتر که مربوط به ساختار بتا میباشد اندکی کاهش پیدا کرده است.
شکل 1- طیف دورنگ نمایی دورانی ناحیه دور آنزیم ترمولیزین در حضور نمک 2 مولار(خط پیوسته) و در حضور نمک 2 مولار و کلسیم10 میلیمولار (خط چین).
طیف فلورسانس ذاتی: به علاوه، تغییرات ساختاری القاء شده توسط نمک در حضور و عدم حضور کلسیم در آنزیم از طریق فلورسانس ذاتی بررسی شد. با توجه به شکل 2 مشاهده میشود که اضافه شدن کلسیم موجب شده نشر فلورسانس به مقدار قابل توجهی کاهش یابد، به طوریکه حداکثر شدت فلورسانس در عدم حضور کلسیم 594 و در حضور کلسیم 497 میباشد.
فعالیت آنزیم: بهمنظور درک این نکته که فعالسازی آنزیم بهوسیله نمک تحت تأثیر اتصال یونهای کلسیم به جایگاههای ضعیف قرار دارد، فعالیت آنزیم در حضور FAGLA و در حضور نمک 2 مولار و عدم حضور و حضور کلسیم 10 میلیمولار بررسی شد.
شکل 2- طیف نشری آنزیم ترمولیزین در حضور نمک 2 مولار (خط پیوسته) و در حضور نمک 2 مولار و کلسیم 10 میلیمولار (خط چین).
نتایج نشان داد که Km آنزیم از 72/0 میلیمولار در عدم حضور کلسیم به 22/0 میلیمولار در حضور کلسیم 10 میلیمولار کاهش یافتهاست. همچنین میزان kcat آنزیم از 79/0 بر ثانیه در عدم حضور کلسیم به 56/0 در ثانیه در حضور 10 میلیمولار کلسیم کاهش یافت. در مجموع، میزان کارآیی کاتالیتیک (kcat/Km) آنزیم در حضور FAGLA حدوداً به میزان 5/2 برابر در کلسیم 10 میلیمولار در مقایسه با عدم حضور کلسیم افزایش یافت (جدول 1).
ساختار سه بعدی آنزیم ترمولیزین با کد ورودی 1TLX در پایگاه داده www.rcsb.org در شکل 3 نشان داده شده است.
جدول 1- پارامترهای سنتیکی ترمولیزین در حضور نمک 2 مولار و عدم حضور و حضور کلسیم 10 میلیمولار.
|
پارامترهای سنتیکی |
|||
[CaCl2], mM |
|
Km, (M-1×10-3) |
kcat (sec-1) |
kcat/Km (M-1sec-1×10-3) |
0 |
0.72 ± 0.04 |
0.79 ± 0.04 |
1.10 ± 0.01 |
|
10 |
0.22 ± 0.01 |
0.56 ± 0.02 |
2.54 ± 0.03 |
شکل 3- ساختار در حالت بلور آنزیم ترمولیزین
دورنگ نمایی دورانی ناحیه دور: مطالعات دورنگ نمایی دورانی ناحیه دور نشان داد که در پیک 197 نانومتر، به دنبال اتصال کلسیم به ساختار، کاهش مشاهده گردید. این پیک مربوط به ساختمان بتا میباشد. از طرفی همانگونه که در مقدمه اشاره شد صفحات بتا در دمین انتهای آمینو قرار دارند، بنابراین احتمالاً در حضور کلرید کلسیم 10 میلیمولار، یون کلسیم به جایگاه Ca3 ،که تمایل کمی به کلسیم دارد، متصل شده و موجب تغییر در انتهای آمینی میشود.
فلورسانس ذاتی: مطالعات صورت گرفته با کمک فلورسانس تأیید مینماید که ریزمحیط اطراف آمینواسیدهای تریپتوفان دستخوش تغییر شده است. ترمولیزین حاوی سه باقیمانده تریپتوفان میباشد که عبارتند از تریپتوفان 55، 115 و 186. از این میان تریپتوفان 55 در نزدیکی Ca3 قرار گرفته است. با توجه به کاهش نشر فلورسانس در حضور کلسیم 10 میلیمولار، به نظر میرسد که ریزمحیط تریپتوفان (ها) پس از اتصال به کلسیم قطبیتر شده، بدین معنی که احتمالاً حلقه ایندول تریپتوفان به دنبال اتصال کلسیم دستخوش جا به جایی شده و در ریزمحیط قطبیتری قرار گرفته است. البته این احتمال هم دور از ذهن نیست که همین اتفاق در ریزمحیط تریپتوفان 186، که در مجاورت Ca1 قرار دارد، رخ داده باشد.
بحث
بررسی فعالیت آنزیم در حضور نمک 2 مولار و عدم حضور و حضور کلسیم 10 میلیمولار نشان داد که حضور کلسیم باعث افزایش فعالیت آنزیم میگردد(1 و 3). در تحقیقات قبلی اشاره کردهاند که کلسیم تأثیری بر فعالیت نداشته، با این حال، اصغری و همکاران نشان دادند که به دنبال اتصال یون کلسیم به یک جایگاه اتصال کلسیم مهندسی شده در یک Zn- متالوپروتئاز همولوگ، الاستاز حاصل از سودوموناس آئروجینوزا، خصوصیات سنتیکی آنزیم جهش یافته شامل هر دو پارامتر Km و kcat دستخوش تغییر شدهاند (2). ترمولیزین در حین فرآیند کاتالیز آنزیمی دستخوش فرآیندی موسوم به hinge-bending میگردد (15 و 17). در این فرآیند جایگاه فعال آنزیم که بین دو دمین واقع است، به دنبال اتصال سوبسترا به آنزیم، متحمل ساختاری موسوم به "ساختار بسته" میشود. در مقابل وقتی جایگاه فعال خالی از سوبسترا است "ساختار باز" مشاهده میشود. تحقیقات اخیر نشان میدهند که اتصال کلسیم به جایگاه (های) با تمایل اتصال کم موجب تغییر زاویه لولا شده و بر پارامترهای سنتیکی ترمولیزین مؤثر است (4). دادههای طیف سنجی دورنگ نمایی دورانی ناحیه دور و فلورسانس نیز مؤید تغییرات ساختاری در پروتئین میباشد. همین توضیح در مورد اثر توأم کلرید کلسیم و کلرید سدیم بر فعالیت آنزیم قابل بیان میباشد. این زاویه بر تمایل آنزیم جهت اتصال به سوبسترا و همچنین بر دینامیک جایگاه فعال و در نتیجه ثابت سرعت واکنش کاتالیز (kcat) مؤثر است (5). بر این اساس، احتمالاً، تغییرات مشاهده شده در خصوصیات سنتیکی آنزیم، به دنبال اتصال کلسیم، می تواند به تغییر در ناحیه لولا مرتبط باشد.
سپاسگزاری
نویسندگان از معاونت پژوهشی دانشگاه گیلان به خاطر حمایت مالی و فراهم کردن امکانات آزمایشگاهی، بسیار سپاسگزارند.