نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه تهران
2 دانشیار گروه میکروبیولوژی پردیس علوم، دانشکده زیست شناسی و قطب تبار زایی موجودات زنده، دانشگاه تهران، تهران، ایران
3 3. دانشیار گروه بیوشیمی دانشکده علوم زیستی دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
چکیده
لاکازها به دلیل توانایی اکسیداسیون طیف گستردهای از ترکیبات فنولی کاربردهای بیوتکنولوژیکی گوناگونی دارند. در این مطالعه سویه بومی QZA2 که از خاکهای ایران جدا شده است مورد استفاده قرار گرفت. این سویه بر اساس توالی SrRNA 16دارای بیشترین شباهت به باکتری باسیلوس آنتراسیس سویه ATCC 14578 بود. ژن کد کننده آنزیم لاکاز از سویه QZA2 به وسیله پرایمرهای کلونینگ تکثیر شد و سپس محصول PCR در ناقل بیانی (pET21a) کلون شد و آنالیز توالی انجام گرفت. این ژن سپس در باکتری اشریشیاکلی سویه BL21(DE3) تحت کنترل فاژ T7 بیان شد. ژن مولتی کوپر اکسیداز در سویه QZA2 یک قالب باز خواندن دارد که دارای 1656 نوکلئوتید بوده و 551 اسید آمینه را کد میکند و شامل 4 دمین غنی از هیستیدین متصل شونده به مس بود. توالی آمینواسیدی مولتی کوپراکسیداز سویه QZA2 دارای 16% همسانی به توالی آمینو اسیدی پروتئین CotAدر باکتری باسیلوس سوبتیلیس و 57% شباهت را به توالی مولتی کوپر اکسیداز باکتری باسیلوس هالودورانس نشان داد. بیان تحت شرایط میکروآئروفیلیک به منظور دستیابی به مقادیر بیشتر پروتئین محلول انجام گرفت. بیان آنزیم با استفاده از سوبسترای معمول لاکاز ABTS سنجیده شد.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Cloning and Expression of Laccase Enzyme from Bacillus anthracis strain QZA2
نویسندگان [English]
1 university of Tehran/ student
2 Associated professor of Microbiology department, School of Biology and Center of Excellence in Phylogeny of Living Organisms, College of Science, University of Tehran, Tehran, Iran
3 Associated professor of Biochemistry department, University of Tarbiatmodares, Tehran, Iran
چکیده [English]
Laccases have many biotechnological applications due to their oxidation ability towards a wide range of phenolic compounds. In this study, the strain QZA2 isolated from Iran soils was used. This strain showed high similarity to Bacillus anthracis strain ATCC 14578 according to 16S rRNA gene sequence. Laccase gene was amplified by cloning primers.then PCR product cloned in the expression vector (pET21a) and transferred to BL21(DE3) strain of E. coli under the control phage T7 and sequence analysis carried out. The gene of the QZA2 has an open reading frame composed of 1656 bases, which encodes 551 amino acid residues and contain four histidine rich copper-binding domains. The laccase gene from QZA2 showed 16% similarity with CotA from B. subtilis and 57% similarity with multicopper oxidase B. halodurans . The expression was performed under microaerobic condition in order to obtain high amounts of soluble protein. Biochemical properties were investigated using common laccase substrates ABTS.
کلیدواژهها [English]
`کلونینگ و بیان ژن کد کننده آنزیم لاکاز از باکتری باسیلوس آنتراسیس سویه QZA2
پروین زمانی1، محمدعلی آموزگار1* و خسرو خواجه2
1 تهران، دانشگاه تهران، پردیس علوم، دانشکده زیست شناسی، بخش میکروبیولوژی
2 تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه بیوشیمی
تاریخ دریافت: 15/1/92 تاریخ پذیرش: 28/2/93
چکیده
لاکازها به دلیل توانایی اکسیداسیون طیف گستردهای از ترکیبات فنولی کاربردهای بیوتکنولوژیکی گوناگونی دارند. در این مطالعه سویه بومی QZA2 که از خاکهای ایران جدا شده است مورد استفاده قرار گرفت. این سویه بر اساس توالی SrRNA 16دارای بیشترین شباهت به باکتری باسیلوس آنتراسیس سویه ATCC 14578 بود. ژن کد کننده آنزیم لاکاز از سویه QZA2 به وسیله پرایمرهای کلونینگ تکثیر شد و سپس محصول PCR در ناقل بیانی (pET21a) کلون شد و آنالیز توالی انجام گرفت. این ژن سپس در باکتری اشریشیاکلی سویه BL21(DE3) تحت کنترل فاژ T7 بیان شد. ژن مولتی کوپر اکسیداز در سویه QZA2 یک قالب باز خواندن دارد که دارای 1656 نوکلئوتید بوده و 551 اسید آمینه را کد میکند و شامل 4 دمین غنی از هیستیدین متصل شونده به مس بود. توالی آمینواسیدی مولتی کوپراکسیداز سویه QZA2 دارای 16 درصد همسانی به توالی آمینو اسیدی پروتئین CotAدر باکتری باسیلوس سوبتیلیس و 57 درصد شباهت را به توالی مولتی کوپر اکسیداز باکتری باسیلوس هالودورانس نشان داد. بیان تحت شرایط میکروآئروفیلیک به منظور دستیابی به مقادیر بیشتر پروتئین محلول انجام گرفت. بیان آنزیم با استفاده از سوبسترای معمول لاکاز ABTS سنجیده شد.
واژه های کلیدی: لاکاز، مولتی کوپر اکسیداز، کلونینگ، باسیلوس آنتراسیس
* نویسنده مسئول، تلفن : 02161113557 ، پست الکترونیکی: amoozegar@ut.ac.ir
مقدمه
پروتئینهای آبی چند مسی ( MCBP) از معروفترین گروههای پروتئین حاوی مس، دارای گروه متغیری از پروتئینها با 6-2 یون مس هستند (12). اکسیدازهای چند مسی یک گروه از MCBP هستند که آنزیمهای متعددی مانند لاکازها (EC 1.10.3.2)، آسکوربات اکسیدازها (EC 1.10.3.3.)، سرولوپلاسمین (EC 1.16.3.1) و فرواکسیداز (EC 1.16.3.1) در این گروه قرار دارند (21).
لاکازها (بنزندیولاکسیژناکسیدوردوکتاز) پلی فنول اکسیدازهایی هستند که طیف گستردهای از ترکیبات فنولی را اکسید کرده و به طور گستردهای در گیاهان، باکتریها، قارچها و حشرات توزیع شدهاند (4). این آنزیمها دارای 4 دمین غنی از هیستیدین متصل شونده به مس هستند. اتمهای مس کوئوردینه شده در این پروتئین بر اساس خصوصیات اسپکتروسکوپی به سه نوع I، II و III دستهبندی میشوند. ویژگی اسپکتروسکوپی مس نوع I اساساً مشابه پروتئینهای انتقال دهنده الکترون است و بیشترین جذب را در طول موج 610 نانومتر دارد، مس نوع II جذب ضعیفتری در این طول موج دارد و مس نوع III بیشترین جذب را در طول موج 330 نانومتر نشان میدهد. مس نوع I و II به وسیله EPR قابل تشخیص بوده و دارای یک اتم مس هستند، در حالی که مس نوع III دارای یک جفت اتم مس است که به وسیله EPR قابل تشخیص نیست (22). لاکازها به دلیل توانایی اکسیداسیون سوبستراهای گوناگون در سالهای اخیر از لحاظ کاربردهای بیوتکنولوژیکی اهمیت زیادی پیدا کردهاند و در صنایع مختلفی مانند: صنایع کاغذسازی، نساجی، غذایی، دارویی و همچنین در حذف زیستی ترکیبات فنولی کاربرد دارند (15).
تا کنون لاکازها به طور وسیعی از قارچها جدا شدهاند و در حال حاضر دارای کاربردهای بیوتکنولوژیکی هستند (8). با وجود اینکه لاکازها به طور گستردهای در باکتریها وجود دارند اما تاکنون تعداد کمی از لاکازهای باکتریایی شناسایی شده است. لاکازهای باکتریایی تاکنون از باکتریهایی مانند آزوسپیریلوم لیپوفروم (اولین لاکاز پروکاریوتی گزارش شده) (11)، مارینوموناس مدیترانهای (20)، باسیلوس هالودورانس (17)، باسیلوس لیکنیفورمیس (13)، باسیلوس سوبتیلیس (25) و باسیلوس اسفاریکوس گزارش شده است (5) . مهمترین لاکاز باکتریایی که تاکنون به خوبی بررسی شده و خصوصیات ساختاری و بیوشیمیایی آن تعیین شده، پروتئین CotA اندوسپور باکتری باسیلوس سوبتیلیس است که به نظر میرسد این پروتئین در محافظت در برابر نور uv و پراکسید هیدروژن نقش دارد (25). از جمله بررسیهای دیگری که در مورد جداسازی این آنزیم از باکتریها در ایران انجام شده است مربوط به جداسازی یک سویه ملانوژنیک (HR03) متعلق به جنس باسیلوس است که توانایی بالایی برای تولید انواع پلیفنول اکسیدازها مانند: کرزولازها (EC1.14.18.1)، کتکولازها (EC1.10.3.1) و لاکاز (EC.1.10.3.2) را دارد (2). آنزیم لاکاز این سویه کلون و بیان شده و ویژگیهای بیوشیمیایی آن تعیین شده است (16). بررسیهای انجام شده در تجزیه و تحلیل کل ژنوم مشخص کرده که این آنزیمها در باکتریها به طور گستردهای توزیع شدهاند، با وجود این اطلاعات در مورد لاکازهای باکتریایی کم است (19). با توجه به توسعه روشهای مولکولی و ابزارهای ژنتیکی گوناگون امکان بررسی ژنوم باکتریایی بیشتر شده و از آنجایی که فرآیندهای بیوتکنولوژیکی به خوبی شناسایی شدهاند، توسعه لاکازهای باکتریایی با توجه به مزایایی آنها از جمله پایداری بالا و تولید در مدت زمان کوتاه در محیطهای ارزان، اهمیت قابل ملاحظهای دارد. در این پژوهش ژنهای جدید دارای فعالیت بالقوه لاکاز با جستجو در پایگاه دادههای پروتئینی و نوکلئوتیدی، با الگو قرار دادن توالی ژن لاکازهای باکتریهایی که تاکنون شناسایی و توالی یابی شدهاند، مورد بررسی قرار گرفت. از بین ژنهای کاندید، ژن کد کننده آنزیم لاکاز از سویه QZA2، که از خاکهای بومی ایران جدا شده بود برای شناسایی، کلون و بیان ژن استفاده شد.
مواد و روشها
مواد: ایزوپروپیلβ-D-1- تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG)، آنزیمهای محدود کننده XhoI و NdeI از شرکت فرمنتاز (آلمان) و ABTS از شرکت سیگما-آلدریچ (آمریکا) و سایر مواد از شرکت مرک (آلمان) خریداری شد.
سویهها و محیط کشت: باکتری اشریشیاکلی سویه XL1-Blue به عنوان سویه کلونینگ و باکتری اشریشیاکلی سویه BL21(DE3) به عنوان سویه بیانی مورد استفاده قرار گرفت. انتخاب باکتری مورد نظر برای شناسایی تکمیلی بر اساس سویه بومی QZA2 انجام گرفت. این سویه از خاکهای ایران و از منطقه فیروز کوه تهران جدا شد. آزمونهای میکروسکوپی و فیزیولوژیک برای شناسایی سویه انجام شد. رنگ آمیزی گرم بر اساس روش هوکر انجام شد، و شکل میکروسکوپی سویه توسط میکروسکوپ نوری مشاهده شد. حرکت سلول با استفاده از روش لام مرطوب بررسی شد (10). برای مشاهده حرکت از میکروسکوپ نوری استفاده شد. برای بررسی فعالیت کاتالازی از کشت 24 ساعته سویه و پراکسید هیدروژن سه درصد به عنوان معرف استفاده شد و تولید حباب به عنوان واکنش مثبت در نظر گرفته شد. برای مشاهده اسپور باکتری از محیط اسپورزایی آگاردار استفاده شد، به علاوه جهت تأمین رشد و کاهش میزان آلودگی، کلرید سدیم به میزان 3 درصد حجم محیط اضافه گردید (1). ابتدا باکتری در محیط تولید اسپور کشت داده شد، و بعد از 4 روز رنگ آمیزی اندوسپورها با رنگ فوشین بازی بر اساس روش شافر و فولتون انجام گرفت (10). بررسی حساسیت سویه به پنیسیلین به روش انتشار از دیسک پس از انجام کشت چمنی از سویهها در محیط نوترینت آگار انجام شد. وجود هاله عدم رشد نشان دهنده حساسیت سویهها به پنیسیلین بود (3). فعالیت همولیتیکی باکتری در محیط کشت آگار خوندار حاوی 5 درصد خون گوسفند از لحاظ وجود و عدم وجود هاله شفاف اطراف کلنیها بررسی شد (9).
شناسایی تکمیلی سویه منتخب با تکثیر و تعیین توالی ژن S rRNA16 انجام شد. برای این منظورDNA ژنومی سویه QZA2 استخراج شد (24) و به عنوان الگو برای انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز مورد استفاده قرار گرفت (23) و با استفاده از پرایمرهای عمومی S16 rRNA، 27F با توالی (5¢-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3¢) و 1492R با توالی (5¢-GGTTACCTTGTTACGACTTCACC-3¢) تکثیر انجام شد. به منظور تکثیر ژنS S rRNA16 با استفاده از واکنش زنجیرهای پلیمراز، بافر با غلظت X1 در ترکیب نهایی، MgCl2 با غلظت نهایی 5/2 تا 5/0 میلی مول ، dNTP با غلظت 4/0 میلی مول از هر کدام، آنزیم Taq DNA پلیمراز به میزان 50U/2 میکرولیتر و پرایمرهای رفت و برگشت از هر کدام به میزان 5/0 تا 4/0 میلی مول و DNA الگو به میزان مناسب استفاده شد. در انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز از نمونه با شرایط مشابه با سایر نمونهها که در آن به جای DNA الگو از آب مقطر استفاده شده بود، به عنوان شاهد منفی استفاده شد. برای انجام این واکنش واسرشت سازی اولیه با دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه و 30 چرخه تکرار شونده شامل واسرشت سازی با دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه، اتصال پرایمرها در 57 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه گسترش در 72 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه و پس از اتمام 30 چرخه برای گسترش نهایی در 72 درجه سانتی گراد به مدت 7 دقیقه انجام شد. محصول نهایی حاصل از واکنش تعیین توالی شد (شرکت ماکروژن کره جنوبی).
کلونینگ ژن مورد نظر: همان طور که گفته شد لاکازها جزء آنزیمهای مولتی کوپر اکسیداز هستند. سویه از جنس باسیلوس که توالی مولتی کوپر اکسیدازی با فعالیت لاکازی دارد و همچنین توالی آمینواسیدی و توالی نوکلئوتیدی و همچنین خصوصیات بیوشیمیایی آن به خوبی شناسایی شده، باکتری باسیلوس هالودورانس است. در نتیجه از توالی آمینواسیدی و توالی نوکلئوتیدی ژن مولتی کوپراکسیداز باکتری باسیلوس هالودورانس با شماره دسترسی NP_242948 به عنوان الگوی جستجو درپایگاه اطلاعاتی بانک ژنی استفاده شد. به منظور به دست آوردن توالی نوکلئوتیدی کد کننده مالتیکوپر اکسیدازهای باکتریایی که دارای فعالیت لاکاز باشند، از توالی نوکلئوتیدی مولتی کوپر اکسیداز باکتری باسیلوس هالودورانس به عنوان الگو استفاده شد و جستجو tBLASTn در پایگاه اطلاعاتی بانک ژنی، انجام شد.
به منظور طراحی پرایمر برای ژن مورد نظر در باکتری باسیلوس آنتراسیس سویه QZA2 توالی ژنی مولتی کوپر اکسیداز در سویههای مختلف باکتری باسیلوس آنتراسیس انتخاب شد و در دو پایگاه clustalW2 و NCBI Blas مورد بررسی قرار گرفت. واکنش زنجیرهای پلیمراز برای ژن مورد نظر با استفاده از پرایمر رفت با توالی 5´-ATACATATGATGCGATATATATATTAACAGCGG-3´ دارای جایگاه برش آنزیم NdeI در طرف ¢5 و پرایمر برگشت با توالی 5´-GTGCTCGAGTTATTCTGGCTTATTAGGAATAATTTGGG-3¢ دارای جایگاه برش آنزیم XhoI در طرف ˊ5 انجام شد. DNA ژنومی استخراج شده از سویه QZA2 به عنوان الگو مورد استفاده قرار گرفت. با استفاده از پرایمرهای طراحی شده ژن مورد نظر با واکنش زنجیرهای پلیمراز تکثیر شد. به منظور تکثیر ژن مورد نظر با واکنش زنجیرههای پلیمراز بافر با غلظت x1 در ترکیب نهایی، MgCl2 با غلظت نهایی 5/2 میلی مول، dNTP با غلظت 4/0 میلی مول از هر کدام، آنزیم Taq DNA پلیمراز 50U/2 میکرولیتر و پرایمرهای رفت و برگشت از هر کدام 8/0 تا 1 میلی مول و DNA الگو به میزان مناسب استفاده شد. در انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز از نمونه با شرایط مشابه با سایر نمونهها که در آن به جای DNA الگو از آب مقطر تزریقی استفاده شده بود، به عنوان شاهد منفی استفاده شد. برای انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز از واسرشت سازی اولیه با دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه و 30 چرخه تکرار شونده شامل واسرشت سازی با دمای 94 درجه سانتی گراد و اتصال با دمای بین 55-60 درجه سانتی گراد هر کدام به مدت 60 ثانیه و سنتز با دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت 60 ثانیه و پس از اتمام 30 چرخه برای سنتز نهایی دمای 72 درجه سانتی گراد برای مدت 15 دقیقه در نظر گرفته شد. محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز با کیت خالص سازی محصول PCR ،Bioneer (AccuPrep, nano-plus Plasmid mini Extraction kit, korea) خالص شد.
محصول خالص شده و پلاسمید بیانی pET21a(+) توسط آنزیمهای محدود کننده به صورت جداگانه مورد هضم آنزیمی قرار گرفتند. به منظور هضم آنزیمی در واکنشهای جداگانهای، بافر تانگو با غلظت x2در حجم نهایی، آنزیم lμ NdeI 10U/ و lμXhoI 10U/ ، محصول خالص شده و پلاسمید بیانی و آب مقطر تزریقی به میزان مناسب افزوده شد و به مدت 4 ساعت در 37 درجه سانتی گراد گرما گذاری شد. محصولات هضم شده توسط کیت خالص سازی محصول PCR خالص شد و سپس با غلظت مناسب توسط آنزیم لیگاز به هم اتصال یافت. واکنش اتصال شامل، بافر ویژه آنزیم لیگاز با غلظت نهایی x1، آنزیم لیگاز (T4 DNA Ligase) lμU/5 و قطعات ژنی پلاسمید بیانی pET21a(+) و ژن خالص شده به میزان مناسب افزوده شد و به مدت یک ساعت در 22 درجه سانتی گراد و سپس 12 ساعت در 16 درجه سانتی گراد گرما گذاری شد. پلاسمید حاصل از اتصال قطعات ژنی در سویه XL1-Blue به عنوان وکتور کلونینگ، با روش شوک حرارتی ترانسفورم گردید. محصول حاصل از انتقال پلاسمید به سلول میزبان بر روی محیط کشت جامد دارای آمپیسیلین کشت داده شد. کلنیهای مثبت دارای پلاسمید نوترکیب انتخاب و صحت حضور پلاسمید مورد نظر در این سویه با روش هضم دوگانه با آنزیمهای محدود کننده NdeI و XhoI و همچنین روش کلنی PCR تأیید شد. پلاسمید نوترکیب pET21a از این سویه با استفاده از کیت استخراج پلاسمید Bioneer استخراج شد و برای اطمینان از صحت توالی مورد نظر با استفاده از پرایمرهای T7 promoter وT7 terminator تعیین توالی گردید.
بعد از اطمینان از صحت توالی مورد نظر پلاسمید نوترکیب pET21a در سویه بیانی BL21(DE3) E. coli ترانسفورم شد و سپس بر روی محیط LB دارای آمپیسیلین کشت داده شد. یکی از کلنیهای BL21 مثبت دارای پلاسمید نوترکیب pET21a که بر روی محیط LB جامد دارای آمپیسیلین رشد کرده بود به محیط LB حاوی آمپی سیلین به عنوان پیش کشت تلقیح شد و در شیکر انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی گراد با 220 دور در دقیقه به مدت 12 ساعت گرما گذاری شد. پس از این زمان از محیط پیش کشت به محیط TB حاوی آمپیسیلین تلقیح شد و در دمای 30 درجه سانتی گراد با شیک 180 دور در دقیقه قرار داده شد تا به OD 6/0-5/0 برسد. بعد از این زمان IPTG با غلظت نهایی 1/0 میلیمولار و CuSO4 با غلظت نهایی 2 میلیمولار به عنوان القاء کننده به محیط افزوده شد. به طور همزمان به عنوان نمونه شاهد، محیط کشتی با شرایط مشابه با شرایط قبل از همان کلنی مثبت تهیه شد اما بعد از رسیدن به OD القاء نشد. یک کلنی از سلولهای BL21 فاقد پلاسمید نوترکیب با شرایط یکسان با کلنی مثبت حاوی پلاسمید نوترکیب، نیز به عنوان نمونه شاهد منفی به طور همزمان کشت داده شد. سپس محیطهای کشت القاء شده و القاء نشده (حاوی کلنیهایی با پلاسمیدهای نوترکیب و غیر نوترکیب) به مدت 4 ساعت در دمای 18 درجه سانتی گراد با 140 دور در دقیقه شیک شد و بعد از آن به مدت 20 ساعت بدون شیک در دمای 180 درجه سانتی گراد گرما گذاری شد. همچنین نمونههای تهیه شد که بعد از القاء شدن به مدت 24 ساعت در دمای 18 درجه سانتی گراد با 140 دور در دقیقه (شرایط هوازی) قرار گرفتند.
از آنجایی که پروتئینهای بیان شده در داخل سلول مجتمع میشوند، سلولها بعد از 20 ساعت گرما گذاری، با سانتریفیوژ در g4000 به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد جمعآوری شدند. رسوب به دست آمده در بافر فسفات 50 میلیمولار با 6/7pH حاوی مهار کننده پروتئاز PMSF 1mM حل شد و سپس بر روی یخ سونیکیت شد. بقایای سلولهای شکسته شده با سانتریفیوژ با g13000 به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد رسوب داده شد. محلول رویی در 70 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه گرما گذاری شد و سپس برای حذف پروتئینهای دناتوره شده درg 13000 به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ گردید. عصاره سلولی به دست آمده برای هر دو نمونه کنترل و آزمون، به منظور سنجش بیان آنزیم و ارزیابی میزان فعالیت آنزیم بیان شده، مورد سنجش آنزیمی قرار گرفت.
سنجش بیان آنزیمی: فعالیت آنزیمی در دمای اتاق در حضور سوبسترای معمول این آنزیم ABTS سنجیده شد. اکسیداسیون (mM 2) ABTS در بافر فسفات mM 100 با 4pH توسط افزایش جذب در طول موج 420 نانومتر به مدت 5 دقیقه اندازه گیری شد.
نتایج
جستجوی tBLASTn در پایگاه اطلاعات ژنی با استفاده از توالی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی باکتری باسیلوس هالودورانس به عنوان الگو انجام شد. در نتیجه این جستجو توالیهای متعددی در باکتریهای گوناگون شناسایی شد. یکی از این توالیها، توالی مولتیکوپر اکسیداز باکتری باسیلوس آنتراسیس بود که تاکنون نوع فعالیت و ویژگیهای این توالی شناسایی نشده بود. در نتیجه باکتری باسیلوس آنتراسیس به عنوان باکتری منتخب برای کلونینگ و بیان توالی مورد نظر در باکتری اشریشیاکلی انتخاب شد.
شناسایی سویه QZA2: نتایج بررسی صفات اولیه در سویه QZA2 نشان داد که این سویه، سویهای گرم مثبت، دارای اندوسپور و کاتالاز مثبت، فاقد حرکت و حساس به پنیسیلین است و همچنین توانایی همولیز گلبولهای قرمز خون گوسفند را ندارد.
نتایج حاصل از تعیین توالی ژن S rRNA16 با استفاده از نرم افزار Chromas Pro (Technelysium Pty Ltd, Australia) ویرایش شد و با استفاده از ابزار BLAST در دو بانک اطلاعاتی NCBI و پایگاه اطلاعاتی EzTaxon-e server (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/; Kim et al., 2012) مورد بررسی قرار گرفت. سویه QZA2 از نظر میزان شباهت در توالی ژن S rRNA16 بررسی شد و درخت فیلوژنتیک این سویه با الگوریتم Neighbor joining (18) و ضریب Boot Strap 1000 (7) و با نرم افزار MEGA5 (Molecular evolutionary genetics analysis, version 5, Tokyo, Japan) (14) رسم شد. بررسی توالی ژن S rRNA16 سویه QZA2 نشان داد که این سویه دارای 100 درصد شباهت به باکتری باسیلوس آنتراسیس سویه ATCC 14578T است (شکل 1).
تکثیر اختصاصی ژن لاکاز: توالی ژن لاکاز در باکتری باسیلوس آنتراسیس سویه QZA2 با استفاده از پرایمرهای طراحی شده اختصاصی ژن، تکثیر شد و صحت توالی آن مورد بررسی قرار گرفت.
پس از تأیید کلون شدن ژن مورد نظر در وکتور pET21a(+)، پلاسمیدهای نوترکیب تخلیص شد و با استفاده از پرایمرهای T7 promoter و T7 terminator تعیین توالی شد. نتیجه تعیین توالی ژن بررسی شد. توالی نوکلئوتیدی در پایگاه دادههایExPASy (www.expasy.ch، مؤسسه بیوانفورماتیک سوئیس SIB) به توالی آمینواسیدی تبدیل و مشخص شد توالی بدون جهش بود.
Strain QZA2 |
Bacillus anthracis ATCC 14578(T) (AB190217) |
Bacillus anthracis Ames (AE016879) |
Bacillus cereus ATCC 14579(T) (AE016877) |
Bacillus thuringiensis ATCC 10792(T) (ACNF01000156) |
Bacillus gaemokensis BL3-6 KCTC 13318(T) (FJ416489) |
Bacillus mycoides DSM 2048(T) (ACMU01000002) |
Bacillus weihenstephanensis KBAB4 (CP000903) |
Bacillus weihenstephanensis WSBC 10204(T) (Z84578) |
Bacillus mycoides ATCC 6462(T) (AF155956) |
Bacillus pseudomycoides DSM 12442(T) (ACMX01000133) |
Bacillus manliponensis BL4-6(T) (FJ416490) |
Bacillus cytotoxicus NVH 391-98(T) (CP000764) |
Bacillus marisflavi TF-11(T) (AF483624) |
Bacillus subtilis subsp. subtilis NCIB 3610(T) (ABQL01000001) |
Bacillus subtilis subsp. spizizenii NRRL B-23049(T) (CP002905) |
Bacillus atrophaeus JCM 9070(T) (AB021181) |
Bacillus niabensis 4T19(T) (AY998119) |
Bacillus herbersteinensis D-1-5a(T) (AJ781029) |
Bacillus persicus B48(T) (HQ433471) |
Bacillus flexus IFO 15715(T) (AB021185) |
Bacillus megaterium IAM 13418(T) (D16273) |
Viridibacillus arenosi LMG 22166(T) (AJ627212) |
Viridibacillus arvi LMG 22165(T) (AJ627211) |
100 |
86 |
100 |
100 |
98 |
39 |
41 |
47 |
56 |
100 |
72 |
100 |
100 |
39 |
90 |
35 |
36 |
41 |
61 |
44 |
0.01 |
شکل 1: درخت فیلوژنتیک سویهQZA2 با روش Neighbor-joining و با استفاده از معیار Boot strap 1000
سنجش بیان آنزیم لاکاز: فعالیت آنزیمی لاکاز در دمای اتاق در حضور سوبسترای معمول این آنزیم ABTS انجام شد. از بین کلنیهای بررسی شده تنها کلنی دارای پلاسمید نوترکیب pET21a که تحت شرایط القاء با IPTG و CuSO4 قرار گرفته بود فعالیت آنزیمی نشان داد. سنجش فعالیت آنزیمی شامل اکسیداسیون ABTS (2میلی مولار( در بافر فسفات 100 میلی مولار با 4pH با افزایش جذب در 420 نانومتر مشاهده شد، همچنین در اثر اکسیداسیون ABTS با آنزیم لاکاز در مخلوط واکنش رنگ سبز ایجاد شد، که نشانگر حضور آنزیم لاکاز در مخلوط واکنش بود (شکل 2).
الف
(ب) ( ج)
شکل 2- الف) افزایش جذب در اثر اکسیداسیون ABTS در طول موج 420 نانومتر، بعد از زمان 5 دقیقه میزان جذب به 7/0 رسید. نمونه شاهد 1/0 افزایش جذب به علت شکستن خودبه خودی ABTS نشان میدهد. ب) ایجاد رنگ سبز در اثر اکسیداسیون ABTS با آنزیم لاکاز برای نمونه لاکاز مثبت ج) نمونه کنترل که عدم تغییر رنگ را نشان میدهد.
بحث
بیان ژن لاکاز در شرایط معمول یعنی کشت سلول تحت شرایط هوازی جواب مطلوبی نداشت. همان طور که قبلاً گزارش شده است در شرایط هوازی تنها بخش کمی از آنزیم بیان شده به صورت فعال باقی مانده و بیشتر محصول بیان به فرم جسم تودهای میباشد که این اتفاق احتمالاً به دلیل جایگزینی ناقص یون مس در ساختار آنزیم میباشد (10). همانطور که دورائو (Durao) و همکاران به این نکته اشاره کردهاند که محتوای مس CotA وابسته به غنی سازی محیط کشت با یون مس و وجود اکسیژن در محیط کشت است (6). تغییر شرایط آئروبیک به میکروآئروبیک محتوای داخل سلولی مس را افزایش میدهد. افزایش یون مس داخل سلولی و همچنین وجود شرایط میکروآئروبیک منجر به ایجاد وضعیتی مناسب برای تاخوردگی و تشکیل هولوآنزیم میگردد. با توجه به این نتایج، القاء با IPTG و در محیط غنی شده با CuSO4 انجام گرفت و بعد با خاموش کردن شیکر میزان دسترسی به اکسیژن در کشت کاهش یافت. توالی آمینواسیدی مولتی کوپراکسیداز سویه QZA2 بررسی شده در NCBI Blast نشان داد که این توالی دارای 16 درصد همسانی و 24 درصد شباهت به توالی آمینو اسیدی باکتری باسیلوس سوبتیلیس است. از طرف دیگر توالی آمینواسیدی مولتی کوپراکسیداز سویه QZA2 دارای 40 درصد همسانی و 57 درصد شباهت به توالی آمینواسیدی لاکاز باکتری باسیلوس هالودورانس است.
چهار دمین غنی از هیستیدین متصل شونده به مس در آنزیمهای لاکاز وجود دارد. جایگاههای T1، T2 و T3 دارای ریشههای آمینواسیدی حفاظت شدهای هستند. همان طور که جدول 1 دیده میشود، این جایگاههای متصل شونده به مس در توالی آمینواسیدی ژن مولتی کوپر اکسیداز سویه QZA2 نیز وجود دارند و ژن مورد نظر در سویه QZA2 دارای 4 ناحیه غنی از هیستیدین متصل شونده به مس است و شباهت زیادی به پروتئینهای متصل شونده به مس دارد (جدول 1).
جدول 1- هم تراز سازی 4 دمین متصل شونده به مس در توالی آمینواسیدی برخی سویههای باسیلوسی و سویههای قارچی و مقایسه آنها با توالی مالتیکوپراکسیداز باکتری باسیلوس آنتراسیس سویه QZA2. ریشههای آمینواسیدی متصل شونده به مس حفاظت شده برای مس نوع 1، 2 و 3 با سایه نشان داده شده است. اعداد داخل پرانتز شماره دسترسی پروتئین مربوطه است (9).
313 1 |
1 2 3 |
3 3 |
2 3 |
نام و شماره دسترسی |
470 NFLHCHIDW HL |
418 HPFHLHGHTFSVV |
126 TFWYHSH |
83 TIHWHG |
Phlebia radiate ( Q01679) |
489 NFLHCHIDF HL |
415 HPFHLHGHAFAVV |
125 TFWYHSH |
82 SIHWHG |
Trametes versicolor (AAL00887) |
466 NFFHCHIEF HL |
414 HPFHLHGHAFSVV |
123 TFWYHSH |
80 SIHWHG |
Coprinus cinereus (AAD30964) |
480 NFLHCHIDWHL |
427 HPFHLHGHTFDVI |
139 TFWYHSH |
96 SIHWHG |
Pleurotus ostreatus (Q12793) |
47 NFLHCHIDF HL |
425 HPFHLHGHTFSVV |
128 TFWYHSH |
85 TIHWHG |
Trametes villosa (AAB477) |
486 YVWHCHILE HE |
419 HPIHLHLVSFRVI |
14 9 ILWYHDH |
103 VV HLHG |
B. subtilis Cot A (NP_388511) |
462 NMFHCHEF HA |
413 HPMHLHGDFFHVI |
143 TYWYHSH |
103 ALHLHG |
B. halodurance (NP_242948) |
516 WMFHCHDL HLA |
461 HPMHLHGHFFQ |
157 TYWYHSH |
107 SIHWHG |
QZA2 |
487 YVWHCHILE HED |
417 HPIHLHLVQFM |
146 ALWYHDH |
100 VVHLHG |
B. licheniformis (YP_077905) |
485 VYWHCHILE HE |
418 HPIHLHLVSFR |
148 ILWYHDH |
102 VVHLHG |
HR03 (FJ663050) |
جدول2- مقایسه همسانی ژن لاکاز در برخی از سویههای قارچی و برخی از باسیلوسها که با ClustalW2 بررسی شده است. QZA2، Bs B. subtilis، Bh B. halodurans، Bl B. licheniformis، Bf: Botryotinia fuckeliana، Pr: Phlebia radiata، Tv: T. versicolor، Cc: C. cinereus، Tvi: T. villosa، Pleurotus ostreatus Po:
Identity (%) with multicopper oxidase from: |
Enzyme |
|||||||||
Po |
Tvi |
Cc |
Tv |
Pr |
Bf |
Bl |
Bh |
Bs |
HR03 |
|
21 |
20 |
20 |
20 |
20 |
20 |
13 |
41 |
16 |
16 |
QZA2 |
13 |
13 |
11 |
12 |
13 |
13 |
65 |
19 |
98 |
|
HR03 |
12 |
13 |
11 |
12 |
12 |
12 |
65 |
19 |
|
|
B. subtilis CotA |
16 |
16 |
14 |
17 |
17 |
20 |
18 |
|
|
|
B. halodurans |
10 |
11 |
12 |
12 |
13 |
13 |
|
|
|
|
B. licheniformis |
31 |
32 |
30 |
28 |
29 |
|
|
|
|
|
Botryotinia fuckeliana laccase (Lcc2) |
64 |
69 |
55 |
68 |
|
|
|
|
|
|
Phlebia radiate laccase |
63 |
69 |
57 |
|
|
|
|
|
|
|
T. versicolor laccase (Lcc1) |
53 |
54 |
|
|
|
|
|
|
|
|
C. cinereus laccase (Lcc1) |
59 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
T. villosa laccase (Lcc5) |
مقایسه توالی آمینو اسیدی مولتی کوپر اکسیداز سویه QZA2 با توالی آمینواسیدی برخی لاکازهای قارچی و لاکازهای باکتریایی که تاکنون شناسایی شده است، با ClustalW2 و BLAST پروتئینی در پایگاه اطلاعات بانک ژنی نشان داد که توالی آمینو اسیدی مولتی کوپر اکسیداز باکتری باسیلوس آنتراسیس سویه QZA2 دارای بیشترین شباهت به لاکاز قارچی، بوتریوتینیا فوکلیانا با شماره دسترسی AAK77953 و با 28 درصد همسانی و 41 درصد شباهت است . گرچه شباهت کلی سویه QZA2 به لاکازهای قارچی خیلی بالا نیست اما نسبت به سایر لاکازهای باکتریایی که تاکنون بررسی شدهاند، بالاتر است (جدول 2(. اگرچه بیان آنزیم با افزودن مس به محیط کشت، کاهش دما و ایجاد شرایط میکروآئروبیک، نسبت به شرایط هوازی افزایش مییافت، اما با این حال تنها بخش کمی از آنزیم بیان شده به صورت فعال بود. بهینه سازی شرایط بیان برای تولید آنزیمی با فعالیت بیشتر، بررسی فعالیت و پایداری آنزیم در شرایط مختلف دما و pH، تعیین ویژگیهای آنزیمی، تعیین مکانیسم عمل آنزیم و تعیین ساختار آنزیمی برای ادامه کار پیشنهاد میشود.