نوع مقاله : مقاله پژوهشی
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله English
نویسندگان English
The reproduction of most breeds of sheep, especially the Iranian breeds, is seasonal. The hormone melatonin plays an important role in seasonal reproduction. The purpose of this research was to examine the polymorphism(s) in exon two of the MTNR1A gene in Afshari sheep in two groups of random and non-seasonal samples (35 randomly selected ewes and 44 spring calving ewes). After extracting DNA from blood samples and designing specific primers, the target DNA was amplified by the PCR method. Based on the results of the sequence analysis in some samples, a polymorphism at nucleotide 408 of the amplified fragment was identified (corresponding to the C519C>T polymorphism of the cDNA sequence). Genotype identification of non-sequenced samples was performed by PCR-RFLP. All three genotypes of this SNP: CC, CT and TT with frequencies of 0.78, 0.1 and 0.06, respectively, were observed. The frequency of the C allele (0.835) was higher than that of the mutant allele. However T allele had a higher frequency in the non-seasonal group. In addition, a positive and significant correlation between genotype and seasonal reproduction was observed (r=0.36, p-value=0.0001). Analysis of the odd ratios also showed that the T allele was 19 times more likely to occur in the non-seasonal group than in the random group. In general, it appears that the T allele in this position correlates with non-seasonal reproduction in sheep. If this results can be confirmed in further studies, the mentioned polymorphism can be used in breeding schemes to improve the reproductive status of sheep.
کلیدواژهها English
شناسایی واریانتهای اللی ژن گیرنده ملاتونین((MTNR1A در جمعیتی از میشهای نژاد افشاری
ندا صبا، رحیمه سپهری* و محمدطاهر هرکی نژاد
ایران، زنجان، دانشگاه زنجان، دانشکده کشاورزی، گروه علوم دامی
تاریخ دریافت: 12/07/1402 تاریخ پذیرش: 06/09/1402
چکیده
در اکثر نژادهای گوسفند بهویژه نژادهای داخل ایران، تولیدمثل فصلی است. هورمون ملاتونین نقش مهمی در تولیدمثل فصلی دارد در پژوهش حاضر، چندشکلی(های) موجود در اگزون شماره دو ژن MTNR1A در گوسفند افشاری در دو گروه نمونههای تصادفی (35 راس) و غیرفصلی (44 راس) بررسی شد. پس از استخراج DNA از نمونه خون دامها و طراحی پرایمرهای اختصاصی جهت تکثیر قطعه مورد نظر (بخش انتهایی اینترون یک، کل اگزون شماره دو و بخش ابتدایی اینترون دو)، تکثیر این قطعه با دستگاه PCR انجام و شناسایی چندشکلی(های) موجود به کمک توالییابی تعدادی از نمونهها صورت گرفت. توالیها در نرمافزارهای Chromas lite و ClC Main Workbench 5 بررسی شدند. یک چندشکلی در نوکلئوتید 408 از قطعه تکثیر شده (منطبق بر چندشکلیC519C>T از توالی cDNA) شناسایی شد. با تعیین ژنوتیپ محصولات توالی یابی نشده به کمک RFLP، سه ژنوتیپ CC، CT و TT به ترتیب فراوانیهای 78/0، 1/0، 11/0 شناسایی شدند. براساس نتایج حاصله، در کل دادهها، فراوانی آلل C وآلل T بهترتیب، 835/0 و 165/0 بود. ولی در گروهی که آبستنی غیرفصلی داشتند، آلل T فراوانی بیشتری داشت. همچنین، همبستگی مثبت و معنیداری بین ژنوتیپ و تولیدمثل غیرفصلی مشاهده شد(r=0.36, p=0.0001) . بررسی نسبت Odds نیز نشان داد که احتمال وجود آلل T در این گروه 19 برابر بیشتر از گروه تصادفی میباشد. لذا، احتمالا آلل T با غیرفصلی بودن تولیدمثل این گوسفندان مرتبط است. با توجه به نتایج بدستآمده و در صورت تأیید نتایج فوق در مطالعات تکمیلی، از چندشکلی فوق میتوان در جهت بهبود وضعیت تولیدمثلی گوسفند استفاده نمود.
واژههای کلیدی: گوسفند افشاری، تولیدمثل غیرفصلی، ملاتونین، اگزون دو، چندشکلی تکنوکلئوتیدی
* نویسنده مسئول، پست الکترونیکی: sepehri_r@znu.ac.ir
مقدمه
رفتار دورهای حاکم بر طبیعت بر فیزیولوژی موجودات، اثر تعیین کنندهای دارد. مهمترین دوره زمانی درونی، دوره شبانهروزی است که بسیاری از فرآیندها از جمله ترشح هورمونها تحت تأثیر نوسانات طول شبانهروز قرار میگیرد. در کنار نوسانات زمانی روز، یک دورهی تابع فصل نیز وجود دارد (1). نژادهای گوسفند که در مناطق معتدل زندگی میکنند تولیدمثل فصلی دارند که توسط دورههای نوری تنظیم شده است. این صفت در دوره خاصی از سال منجر به زاد و ولد میشود (10 به نقل از 5). تولیدمثلی فصلی با طول دوره روشنایی روز تنظیم میشود و هنگامیکه ساعات تاریک در حال افزایش است و با کوتاه شدن طول روز (از تابستان تا زمستان)میشها فعالیت تولیدمثلی بیشتری نشان میدهند (10). یک پیام سلولی شیمیایی برای دورههای نوری در پستانداران هورمون ملاتونین میباشد که نقش کلیدی در تولیدمثل فصلی بازی میکند (2) و این هورمون، بصورت مشخصی در بروز، کنترل و رفتار جنسی گوسفندان اثر گذار است (19).
با توجه به اینکه اغلب نژادهای گوسفند دارای تولیدمثل فصلی هستند، این خصوصیت گوسفند در بسیاری از مناطق دنیا منجر به محدود شدن رفتار تولیدمثلی شده و تنها یک بار زایش انجام میپذیرد (10). در نتیجه، در یک سیستم تولید گوشت، بازده تولید به ازای هر حیوان را میتوان با زیاد کردن عملکرد تولیدمثل از طریق افزایش باروری و چندقلوزایی و کاهش طول چرخهی تولیدمثل (چندبارزایی) افزایش داد ( 20،9). از جمله راهکارهایی که جایگزین مناسبی برای حیوانات پلیاستروس (Polyestrous) باشد تا بتوانند بدون در نظر گرفتن دوره سال و یا اجتناب از ترفند هورمون تراپی به فعالیت تولیدمثلی برگردند، شناسایی ژنوتیپهایی است که به تولیدمثل فصلی کمتر حساس هستند (2).
بدین منظور، ژن گیرنده ملاتونین (Melatonin receptor 1A=MTNR1A) به طور مکرر در مطالعات پیشین بعنوان ژن کاندیدا پیشنهاد شدهاست و بنظر میرسد در کنترل دورههای نوری که در آن غلظت ملاتونین با تغییرات طول روز تحت تأثیر قرار میگیرد، نقش کلیدی دارد. در مطالعات پیشین متعددی ارتباط آماری چند شکلی های نوکلئوتیدی در این ژن در گونههای مختلف با تولیدمثل فصلی گزارش شده است. بویژه ساختار و پلیمورفیسم اگزون شماره دو از این ژن در چند نژاد گوسفند بررسی شده و ژنوتیپهای خاصی با فعالیتهای تولیدمثلی مرتبط بودهاند (3،15،16).
در این راستا، مسر (Messer) و همکاران (12) برای اولین بار با استفاده از توالی ژن MTNR1A گوسفند (ثبت شده با کد u14109 در بانک اطلاعاتیNCBI) یک جفت پرایمر جهت تکثیرقطعه 824 جفتبازی از اگزون شماره دو را طراحی نمودند. دو جهش در نواحی ژنی 606 و 612 شناسایی شد. جهش ناحیه 606 در اثر جابجایی نوکلئوتید T باC و در جهش ناحیه612 نوکلئوتید A جایگزین باز نوکلئوتیدی G شده بود. در پژوهشی که به منظور بررسی چندشکلی ژن MTNR1A در گوسفندان نژاد قزل انجام شد، دادههای حاصل از فناوری توالییابی نمونهها، نتایج مسر و همکاران (12) را تأیید کرد (13). نتایج آماری بدست آمده از بررسی ارتباط بین ساختار ژن MTNR1A و فعالیت تولید مثلی در نژاد ساردا، ارتباط معنی داری بین ژنوتیپ Rr و فعالیت تولیدمثلی نشان دادند که به شدت تحت تأثیر دوره نوری قرار میگیرد (2).
مرادی و همکاران (14) از تعداد 124 رأس میش از نژاد زل و نائینی با استفاده از روش PCR-RFLP یک چندشکلی تک نوکلئوتیدی در ناحیه 605 جفت بازی اگزون دوم شناسایی کردند. آنها پیشنهاد دادند که میتوان از این نتایج در مطالعات همبستگی بین ژنوتیپ و صفات مرتبط به تولیدمثل گوسفند بهره جست. ارتباط بین فصلی بودن تولیدمثل و ژن MTNR1A در گوسفند راسا (Rassa) در پژوهشی مورد بررسی قرار گرفت و 17 چندشکلی در ناحیه پروموتر و 11 چندشکلی در ناحیه اگزون دوم شناسایی شد. همچنین، سه ژنوتیپ برای SNPهای 606 و 612 در نظر گرفته شده بود و نتایج آنها نشان داد که آلل جهش یافته T در ارتباط با تولیدمثل غیرفصلی میباشد (11). در گوسفندان ساردا (Sarda) بمنظور بررسی تأثیر پلیمورفیسم ژن MTNR1A بر آغاز تولیدمثل و ارزیابی تأثیر سن و نمره وضعیت بدن بر آن، مطالعهای انجام شد. دادهها نشان داد که پلیمورفیسم ژن MTNR1A بر از سرگیری تولیدمثل در فصل بهار در این نژاد تأثیر مثبت داشته و علاوه بر این، نشان داده شد که در حیطهای که این آزمایش انجام شده نمره وضعیت بدنی و سن تأثیر معنیداری بر فعالیتهای تولیدمثلی نداشته است (4 و16). بمنظور مطالعه و بررسی پلیمورفیسم ژن MTNR1A و ارتباط آن با فصلی بودن تولیدمثل، پژوهشی در یک مرکز اصلاح نژاد گوسفندان بومی یونان انجام شد. در این آزمایش، ساختار ژن MTNR1A برای اولین بار در گوسفند بومی یونان آنالیز شد. تجزیه و تحلیل آماری نشان داد که همبستگی مثبت بین ژنوتیپ و فصلی بودن تولیدمثل وجود دارد و ژنوتیپ C/Cنقش مهمی در فعالیت تولیدمثل خارج فصلی بازی میکند(7). بررسی پلیمورفیسم گیرنده ژن ملاتونین (MTNR1A) در جمعیت بزهای کاسانگ (Kacang) و پراناکان اتاوا (Peranakan Ottawa) در منطقه جنوب اندونزی نیز با انتخاب تصادفی 253 رأس بز انجام و برای تعیین ژنوتیپها از روش PCR-RFLP توسط آنزیم RsaI استفاده شد. مشاهده دو آلل R و r در نتایج نشان داد که تنوع ژنتیکی در ژنMTNR1A بزهای کاسانگ و پراناکان وجود دارد. با توجه به نتایج آزمون هاردی واینبرگ، این جمعیت برای ژن MTNR1A در تعادل بود (6). با توجه به اهمیت مسالهی تولید مثل گوسفندان و ارتباط عوامل پیرامونی و هورمونی با این مقوله و در راستای برنامه ریزی کاربردی در این بخش، این تحقیق با هدف شناسایی تنوع آللی در ناحیه ای از ژن گیرنده ملاتونین در گوسفندان افشاری انجام شد (5).
مواد و روشها
انتخاب دام ها و تهیه نمونههای خون: جهت اجرای تحقیق حاضر، از گوسفندان نژاد افشاری استفاده شد. نژاد افشاری، نژادی سنگین وزن است و از پتانسیل مناسبی برای تولید گوشت برخوردار است ( 17). با توجه به بالا بودن میزان دوقلوزایی در این نژاد، میتوان آن را از نژادهای گوشتی گوسفندان ایرانی محسوب نمود ( 18). دامهای مورد استفاده در دو گروه قرار گرفتند. گروه یک در مجموع، 35 رأس میش که به طور تصادفی از گلههای مختلف انتخاب شدند و گروه دو در مجموع، 44 رأس میش بودند که در فصل غیر تولیدمثل آبستن شده بودند. خونگیری با کمک ونوجکت خلأدار 6 سیسی حاوی ماده ضد انعقاد EDTA از سیاهرگ وداج انجام شد. نمونههای خون تا زمان استخراج DNA در فریزر با دمای منهای 20 درجه سانتیگراد نگهداری شد.
آزمایشات مولکولی: استخراج DNA از نمونههای خون به روش فنل-کلروفرم انجام شد. کمیت و کیفیت DNA استخراج شده نیز با استفاده از دستگاه نانودراپ مشخص گردید. بمنظور تکثیر قطعه مورد نظر، آغازگر اختصاصی توسط نرمافزار آنلاین (http://bioinfo.ut.ee/primer 3-0.4.0/) Primer 3 (v.0.4.0) طراحی شد. آغازگرهای پیشنهاد شده توسط نرمافزار تحت آزمونهای Primer Blast، Fast Pcr و Mfold جهت انتخاب بهترین آغازگر که بتواند کاملاً، اختصاصی ناحیه مورد نظر را تکثیر دهد، قرار گرفت و بهترین آغازگرهای پیشرو و پسرو انتخاب شدند.
مواد لازم برای انجام واکنش PCR عبارت بودند از، بافر واکنش PCR ، کلرید منیزیم، dNTPs و آنزیم تک پلیمراز که همگی به صورت مخلوط در red master mix خریداری شده موجود بودند و آغازگرها و DNA حاصل از نمونههای استخراج شده، به عنوان الگو در واکنشهای PCR استفاده شد. هر مخلوط واکنش (25 میکرولیتر) شامل 5/12 میکرولیتر از Red Master Mix، 1/0 میکرولیتر از هر آغازگر و 1 میکرولیتر از DNA ژنومیک به ازای هر واکنش استفاده شد. برنامه زمانی مورد استفاده برای اگزون شماره دو به صورت: واسرشته سازی اولیه: دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه و 30 سیکل شامل؛ 95 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، 58 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، و 72 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه بود که در انتها با دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه پایان می یافت.
جهت بررسی وجود SNP(های) احتمالی موجود در قطعه تکثیر شده از ژن مورد بررسی، از روش ترکیبی توالییابی مستقیم و RFLP استفاده شد. بدین صورت که، در ابتدا، تعداد 10 نمونه از محصولات حاصل از تکثیر بهطور تصادفی انتخاب و جهت توالییابی به شرکت زیست فناوری کوثر ارسال شد. توالیهای بدست آمده توسط بررسی کروماس (منحنی مربوط به توالی) آنها در نرمافزار Chromas lite و نیز نرمافزارClC Main Workbench 5 از نظر وجود چندشکلیهای تک نوکلئوتیدی مورد بررسی و آنالیز قرار گرفت. پس از مشاهده چندشکلی در نمونههای توالییابیشده تعیین ژنوتیپ سایر محصولات توالی یابی نشده به کمک RFLP انجام شد. شناسایی آنزیم محدودکننده مناسب برای تشخیص ژنوتیپها نیز به کمک نرمافزار ClC Main Workbench 5 انجام شد.
جدول 1 - آغازگرهای اختصاصی طراحی شده جهت تکثیر اگزون شماره دو ژن MTNR1A
|
پرایمر |
جهت |
توالی (5'→3') |
طول قطعهی تکثیر شده |
TM |
|
ناحیهی تکثیر |
|
MTNR1A |
پیشرو |
GCTTGAATACCCAGGAAAGG |
1026 |
58 |
|
اگزون دوم |
|
پیرو |
GCATCTACCAACAGGGAATGA |
|
تجزیه و تحلیل آماری دادهها
بررسی فراوانی های ژنوتیپی و آللی و وجود تعادل هاردی واینبرگ بکمک نرمافزار Popgene (21) انجام شد. از آنجاییکه متغیرهای مورد بررسی در مطالعه حاضر، متغیرهای پیوسته نبوده و طبقهبندی شده میباشند؛ لذا، از روشهای آماری ناپارامتری برای آنالیز این دادهها استفاده شد. بدینمنظور، از نرم افزار آنلاین Medcalc (https://www.medcalc.net/statisticaltests/odds_ratio.php) برای محاسبه odd ratio (نسبت شانس)و همچنین از روش اسپیرمن (Spearman) برای محاسبه ضریب همبستگی بین دو متغیر استفاده شد.
نتایج و بحث
تکثیر قطعه 1026 جفت بازی شامل کل ناحیه اگزون شماره دو ژن MTNR1A و بخشهایی از اینترون یک و دو با استفاده از پرایمرهای طراحی شده در این پژوهش با موفقیت انجام شد. برای تعیین موقعیت باندهای حاصل از تکثیر از یک شاخص مولکولی 100جفت بازی (Ladder) استفاده شد (شکل 1). براساس نتایج حاصل از آنالیز محصولات توالییابیشده، مطابقت توالیها با توالی رفرنس ثبتشده (NM_001009725.1) تأیید و یک چندشکلی در نوکلئوتید 408 از قطعه تکثیر شده (منطبق با نوکلئوتید 326 از اگزون شماره 2) شناسایی شد. در این چندشکلی نوکلئوتید C با نوکلئوتید T جایگزین شده است. صحت قطعه تکثیر شده با استفاده از تعیین توالی محصولات PCR حاصله نیز مورد تأیید قرار گرفت (شکل 2).
برای شناسایی چندشکلی ذکر شده در نمونههای توالییابی نشده از روش RFLP با استفاده از آنزیم محدود کننده RsaI با جایگاه اتصال و برش GTAC استفاده شد.
بر اساس نتایج ارائه شده در جدول شماره 2، این آنزیم قطعه تکثیر شده را در حالت مرجع در چهار جایگاه برش میدهد و پنج قطعهی 411، 267، 186، 23،139 جفت بازی را تولید میکند. درحالیکه در نمونههایی که در منطقه مورد نظر، آلل T (جهش یافته) را دارند یکی از جایگاههای برش حذف و در نتیجه چهار قطعه به طول های 411، 290، 186، 139 جفت بازی را تولید میشوند. اگرچه، قطعه 23 جفت بازی تولیدشده در حالت رفرنس در انتهای ژل قرار گرفته یا خارج شده و قابل تشخیص نخواهد بود. لذا در هر دوحالت هموزیگوت رفرنس (CC) و هموزیگوت جهش یافته (TT) چهارقطعه قابل مشاهده خواهد بود ولی یکی از قطعهها در ایندو هموزیگوت متفاوت (267 جفت باز در حالت رفرنس و290 جفت باز در حالت جهشیافته) خواهد بود. در ژنوتیپ هتروزیگوت، یکی از کروموزومها در محل چندشکلی موردنظر تحت تأثیر برش آنزیمی قرار میگیرد ولی در کروموزوم دیگر (همتا) برش آنزیمی اتفاق نمیافتد به همین دلیل هر دو قطعه 290 و 267 جفت بازی مشاهده میشود.
شکل 1- باندهای حاصل از الکتروفورز محصولات PCR شامل بخش انتهایی اینترون یک، کل اگزون شماره دو و بخش ابتدایی اینترون دو ژن MTNR1A روی ژل آگارز یک و نیم درصد (bp1026(. چاهک اول از سمت چپ مربوط به نشانگر مولکولی DNA (100bp) و بقیه چاهکها قطعه تکثیر شده نمونههای مختلف میباشند.نتایج تکثیر قطعه 1026 جفت باز از توالی اگزون شماره 2 ژن با استفاده از الکتروفورز محصولات.
با بررسی تغییرات نوکلئوتیدی شناسایی شده و ثبت شده در اگزونهای این ژن بخصوص اگزون شماره دو و مطابقت چندشکلی شناسایی شده در پژوهش حاضر با موارد ثبت شده در پژوهشهای سایر محققین مشخص شد که SNP شناسایی شده در پژوهش حاضر قبلاً، شناسایی و با کد rs406779174 در NCBI ثبت شده است. شمارهی این SNP در توالی cDNA این ژن (C519C>T) میباشد. SNP شناسایی شده در پژوهش حاضر، از نوع هممعنی (Synonymous) میباشد و در نتیجه منجر به تغییر اسیدآمینه نمیشود. اگرچه تغییرات هممعنی در کدونها منجر به تغییر اسیدهای آمینه پروتئینهای مربوطه نمیشوند، اما، میتوانند میزان بیان ژن مربوطه را به دلیل موضوع بهینه بودن یا نبودن کدون برای یک موجود زنده بخصوص تحت تأثیر قرار دهند. این موضوع بویژه در بحث انتقال ژن مورد توجه ویژه قرار میگیرد.
شکل 2 - بررسی توالی محصولات PCR: ردیف فوقانی که با فاصله بیشتری از سه ردیف بعدی قرار گرفته، توالی مرجع و توالیهای بعدی توالی نمونههای تکثیر شده هستند که به ترتیب ژنوتیپ CC، ژنوتیپ CT و توالی ردیف آخر ژنوتیپ TT را نشان میدهند. خطهای قرمز عمودی چندشکلی مشاهده شده در توالی نوکلئوتیدی نمونهها را نشان می دهد
جدول 2-جزئیات تعیین ژنوتیپ چندشکلی شناسایی شده در اگزون شماره دو ژن MTNR1A بهروش RFLP
|
نام ژن |
روش تعیین ژنوتیپ |
چندشکلی شناسایی شده |
آنزیم محدود کننده |
قطعات حاصل از هضم |
|
MTNR1A
|
PCR-RFLP |
(C408T) از قطعه تکثیر شده |
RsaI |
CC (411، 267 ،186، 139، 23جفت بازی) CT (411، 290، 267، 186، 139 جفت بازی) TT (411، 290، 186، 139 جفت بازی) |
شکل 3- باندهای حاصل از الکتروفورز محصولات هضم آنزیمی با آنزیم RSaI بر روی ژل آگارز دو و نیم درصد. در هر دو شکل، اولین ستون از سمت چپ مربوط به نشانگر مولکولی bp100 و باقی ستونها، باندهای مربوط به تعدادی از نمونههای مورد بررسی را نشان میدهد. شکل چپ: ستونهای 9و 5، 2 ژنوتیپ TT و ستونهای 10 و8، 7، 6، 4، 3 ژنوتیپ CC را نشان میدهد. شکل راست: ستون دوم محصول PCR (شاهد منفی)، ستونهای 4و3 ژنوتیپ TT ، ستون6 ژنوتیپ CT و ستونهای 10 و9، 8، 7 ژنوتیپ CC را نشان میدهند.
جدول 3، فراوانی ژنوتیپی و آللی این SNP را در کل دادهها و همچنین به تفکیک گروه نشان میدهد. براساس نتایج حاصل از آنالیز دادهها با نرمافزار POPGENE (21)، ژنوتیپ TT تنها در گوسفندان گروه 2 (گروه آبستن شده در فصل غیرتولیدمثلی گوسفند) با فراوانی نسبی 21/0مشاهده شد و در دامهای گروه یک هیچ مشاهدهای برای این ژنوتیپ نبود. فراوانی نسبی ژنوتیپ CC برای هر دو گروه و کل دادهها بیشتر از سایر ژنوتیپها بود؛ اگرچه فراوانی نسبی این ژنوتیپ در گروه دوم کمتر از گروه اول (68/0 در مقابل 91/0) بود. فراوانی نسبی ژنوتیپ هتروزیگوت نیز در گروه دوم بیشتر از گروه اول (11/0 در مقابل 08/0) بود. بررسی فراوانی آللی در دو گروه مورد مطالعه نشان داد که در گروهی که آبستنی غیرفصلی داشتند، آلل T فراوانی بیشتری داشت.
آللهای گروه یک یعنی میشهایی که به صورت تصادفی از چند گله مختلف انتخاب شده بودند، در حالت تعادل هاردی ـ واینبرگ قرار داشتند در حالیکه، گروه دو، در اینجا غیر فصلی، در شرایط عدم تعادل قرار داشت. دلیل این موضوع میتواند انتخاب تعداد محدودی از دامها (که تولیدمثل غیر فصلی داشتند) به عبارتی عامل انتخاب و اندازه نمونه باشد. در مطالعه حاضر، فراوانی آلل مرجع (C) بیشتر از آلل جهش یافته T میباشد. فراوانی این دو آلل در نژادهای مختلف گوسفند دنیا متفاوت است.
جدول 3- فراوانی ژنوتیپی و آللی و بررسی وجود تعادل هاردی-واینبرگ در SNP شناسایی شده
|
Pمقدار |
کای اسکوئر |
فراوانی آللی |
فراوانی ژنوتیپی |
گروه |
نوع چندشکلی |
موقعیت چندشکلی |
نام ژن |
|||
|
T |
C |
TT |
CT |
CC |
||||||
|
829/0 |
461/0 |
04/0 |
96/0 |
0 0 |
08/0 (3) |
91/0 (32) |
یک |
هممعنی )Synonymous(
|
C519C>T |
MTNR1A |
|
0000/0 |
95/22 |
26/0 |
74/0 |
21/0 (9) |
11/0 (5) |
68/0 (30) |
دو |
|||
|
000/0 |
85/32 |
165/0 |
835/0 |
11/0 (9) |
1/0 (8) |
78/0 (62) |
کل |
|||
بررسی بخشی از اگزون دو توسط کارکانگیو و همکاران (2)، بر روی نژاد ساردا با روش PCR-RFLP و بهکمک آنزیم برشی RsaI انجام و دو ژنوتیپ با فراوانی 96 درصد و 4 درصد شناسایی شد. آنها فراوانی دو آلل شناسایی شده را در این نژاد به ترتیب 98/0 و 02/0 برآورد نمودند که بسیار نزدیک به نتایج پژوهش حاضر در گروه یک است. در این پژوهش، نیز ژنوتیپ سوم (ژنوتیپ جهشیافته) مشاهده نشد (همانند نمونههای گروه یک پژوهش حاضر). در مطالعهی مشابه دیگری از همین محققان ( 3) روی همین ژن، پس از هضم قطعه تکثیر شده با آنزیم MnlІ، فراوانی آللی برای آلل +، (جایگزین شدن نوکلئوتید A به جای G) 78/0 و برای آلل-، 22/0 میباشد. فراوانی ژنوتیپها نیز 68، 5/20 و 5/11 درصد بترتیب برای ژنوتیپهای + +، - + و - - به دست آمد. همچنین هضم با آنزیم RsaІ فراوانی آللی 66/0 برای آلل C (آلل رفرنس) و 34/0 برای آلل T (آلل جهش یافته) را نشان داد. فراوانی برای ژنوتیپهای CC، CT و TT به ترتیب5/53، 26 و 5/20 بدست آمد. آنها گزارش نمودند که هر دوی این چندشکلیها فاقد تعادل هاردی-واینبرگ میباشند. چندشکلی دوم گزارش شده در پژوهش مذکور با پژوهش حاضر مطابقت دارد.
مورا و همکاران (13 و 14) دو چندشکلی تک نوکلئوتیدی را در ناحیه 606 و 612 قطعه تکثیر شده از اگزون دوی نژاد ساردا شناسایی کردند. در پژوهش آنها نیز فراوانی آلل رفرنس (C) بیشتر از آلل جهش یافته بود نتایج این گزارش نیز با نتایج ما همخوانی دارد.
برای اولین بار جیانتسیس و همکاران (7) اگزون شماره دوی گوسفندان بومی یونان را به منظور بررسی ارتباط تولیدمثل فصلی با ژن MTNR1A مورد بررسی قرار دادند و در ناحیه 606 و 612 دو چندشکلی شناسایی کردند. در هر دو گروه مورد بررسی در این پژوهش نیز فراوانی ژنوتیپ CC و آلل C بیشتر بود. مارتینز و همکاران (11) ارتباط بین فصلی بودن باروری و ساختار ژن MTNR1A را در گوسفند نژاد راسا آرگونسا بررسی کردند. جهشهای خاموش که در ارتباط با تولیدمثل فصلی در سایر نژادها گزارش شده بود در نژاد راسا نیز مشاهده شد. آلل جهش یافته T در نوکلئوتید 606 اگزون دو در ارتباط با چرخه آبستنی میشهای راسا بود. در این پژوهش سه ژنوتیپ برای اسنیپهای 606 و 612 در نظر گرفته شد و نتایج نشان داد که آلل جهش یافته T در ارتباط با تولیدمثل فصلی بوده و باعث افزایش چرخه فحلی در دامهای دارای ژنوتیپ TT شد. نتایج حاصل از مطالعه حاضر در مورد شناسایی چندشکلی، با چندشکلی گزارش شده در مطالعات قبل در جایگاه 606 اگزون شماره دو مطابقت دارد که با رنگ قرمز در شکل 4 نشان داده شده است.
شکل 4- نمای شماتیک از ژن MTNR1A گوسفند، که جعبهها اگزون را نمایش میدهند (توالیهای کدکننده و غیر کدکننده به ترتیب سیاه و خاکستری نشان داده شده است). پلیمورفیسم شناسایی شده در پژوهش حاضر با فلش قرمز رنگ نشان داده شده است. موقعیت پلیمورفیسم با توجه به توالی GenBank AY525665 و u14109 نشان داده شده است. برای SNPهای اگزون دو موقعیت اسیدآمینه و تغییر آن در پرانتز نشان داده شده است.
در کنسرسیوم بینالمللی ژنوم گوسفند (International Sheep Genome Consortium(ISGC)) نتایج پژوهشهایی که بر روی نژادهای مختلف در این باره انجام شده ثبت گردیده است. در برخی از نژادها فقط آلل C، برخی فقط آلل T و در برخی نیز هر دو آلل وجود داشتهاست. (https://asia.ensembl.org/Ovis_aries/Variation/Population). فراوانی آللی که در این مطالعات گزارش شده است بهدلیل کوچک بودن اندازه نمونه، قابل اعتماد کامل نیست. برای نمونه در اطلاعات این کنسرسیوم، برای گوسفند افشاری نیز تنها ژنوتیپ CC ثبت شده است (براساس ژنوتایپینگ 2 نمونه). در حالیکه در مطالعه حاضر آلل T با فراوانی نسبتاً مناسبی مشاهده شد. البته در این مطالعه به دلیل اینکه از گله هایی که از کار تلاقی با ترکیب ژنتیکی چندقلوزا به دور بودهاند نمونه برداری نشد بنابراین دقیقاً نمیتوان گفت که فراوانی آللی T در نژاد افشاری در چه وضعیتی است. اما به هرحال هدف اولیه این پژوهش شناسایی آللهایی در این ژن بود که با غیرفصلی بودن مرتبط باشد و منشأ آلل در ابتدا اهمیت چندانی نداشت. مطالعات تکمیلی میتواند به روشنتر شدن موضوع کمک نماید.
در خصوص ارتباط گروه های تولیدمثلی مورد بررسی با آللهای شناسایی شده در پژوهش حاضر، تجزیه و تحلیل آماری بر اساس نسبت شانس (Odds ratio) نشان داد که فراوانی الل T در دو گروه دامهای انتخاب شده به صورت تصادفی و گروه غیرفصلی معنیدار است. با بررسی وضعیت نسبت شانس آلل T در دو حالت فرضی غالب و مغلوب و با فرض اینکه آلل T سبب غیرفصلی بودن تولیدمثل شود، در حالت مغلوب بودن این آلل، احتمال وجود الل T در گروه غیر فصلی 19 برابر بیشتر از گروه تصادفی است (P-value = 0.04) و در حالت غالب بودن این آلل، احتمال آلل T در گروه غیرفصلی 5 برابر بیشتر از گروه تصادفی است (P = 0.019). لذا بنظر میرسد آلل T با غیرفصلی بودن تولیدمثل این گوسفندان مرتبط باشد. همانطور که در منابع مختلف اشاره شده است، موضوع فصلی بودن تولیدمثل در اغلب نژادهای گوسفند باعث میشود در فصول غیر تولید مثلی بهرهوری گله کاهش پیدا کند. در این خصوص دامهایی که وضعیت غیرفصلی بودن تولیدمثل را دارند از ارزش ویژهای برخوردار هستند. تحقیق حاضر هم از لحاظ نوع ارتباط با صفت تولید مثل و هم به نوعی از نظر فراوانی آللی با برخی از پژوهشهای انجام شده به ویژه حاتمی و همکاران (8) و جیانتسیس و همکاران (7) همخوانی دارد. همانند پژوهشهای کارکانگیو و همکاران (2) و مارتینز و همکاران (11) پژوهش حاضر نیز نشان میدهد که در گوسفند افشاری احتمالاً چندشکلی یافت شده با غیر فصلی بودن تولید مثل میتواند در ارتباط باشد.
بر اساس نتایج حاصل از آنالیز همبستگی اسپیرمن نیز، بین گروه تولیدمثلی و ژنوتیپ همبستگی مثبت و معنی داری (0001/0=p-value ، 365/0=r) مشاهده شد؛ بطوریکه با تغییر گروه تولیدمثلی از تصادفی به غیرفصلی، فراوانی ژنوتیپ TT بیشتر شد. همین ارتباط در مورد آللهای شناسایی شده نیز مشاهده شد ( 012/0=p-value ، 281/0=r).
صفات مرتبط با تولید مثل دام از پیچیدگیهای خاصی برخوردار است. گاهی با وجود تمام انتخابهای که برای تولید دامهای پرتولید انجام میگیرد، پاسخ چندانی بدست نمیآید؛ در حالیکه در مواردی هم ممکن است یک ژن بزرگاثر (مانند FecB ) تحول بزرگی را ایجاد نماید. با توجه به نتایج بدستآمده و در صورتی که مطالعات تکمیلی نتایج فوق را دوباره تائید نمایند، از چندشکلی ذکر شده میتوان در کارهای اصلاح نژادی در جهت بهبود وضعیت تولیدمثلی در گوسفند استفاده نمود. اما بهر حال لازم است که تحقیق در سطح وسیعتری، بویژه در گلههای گوسفند افشاری که در سالهای اخیر تحت پوشش ورود ژن FecB نبوده اند انجام و براساس آن استنتاج بهتری صورت پذیرد.
سپاسگزاری
بدینوسیله از کارشناس محترم آزمایشگاه ژنتیک مولکولی گروه علوم دامی دانشگاه زنجان، سرکار خانم مهندس سیامکی، که نهایت همکاری را در اجرای این پژوهش داشتند تقدیر و تشکر بعمل می آید.
پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)