معرفی مدل های غشای سلول سرطانی و ارزیابی عملکردی آن ها در تقابل با پپتید زیست-فعال، با استفاده از شبیه سازی های دینامیک مولکولی تمام-اتمی و هدایت شده

معرفی مدل‌های غشای سلول سرطانی و ارزیابی عملکردی آن‌ها در تقابل با پپتید زیست-فعال، با استفاده از شبیه سازی‌های دینامیک مولکولی تمام-اتمی و هدایت شده

سمیه دباغ صادق پور¹، محبوبه ضرابی^1*، سعید بلالایی² و ریحانه رمضانی³

¹ایران، تهران، دانشگاه الزهرا، دانشکده علوم زیستی، گروه بیوتکنولوژی ،آزمایشگاه زیست‌شناسی محاسباتی

²ایران، تهران، دانشگاه خواجه نصیرالدین طوسی، دانشکده شیمی، گروه شیمی دارویی، مرکز تحقیقات شیمی پپتید

³ایران،تهران، دانشگاه الزهرا، پژوهشکده مطالعات خانواده،آزمایشگاه بیومدیکال

تاریخ دریافت: 29/06/1402          تاریخ پذیرش: 21/08/1402

چکیده

با توجه به اهمیت انکوزوم‌های سرطانی در پیشروی سلول‌های سرطانی، دو مدل غشای انکوزوم ایستا(صلب) و پویا(سیال) ساخته شد و نقش درجه‌ی اشباع دو لایه‌ی لیپیدی، بواسطه ایجاد تنوع در دنباله‌های اسیدچرب واجد چند پیوند دوگانه در مدل پویا با پپتید GL13K و توسط شبیه‌سازی دینامیک مولکولی بررسی شد. تراجکتوری‌های شبیه‌سازی‌، ناهمواری‌های سطحی بیشتر انکوزوم پویا را نسبت به ایستا نشان داد. فسفولیپیدها در مدل ایستا بسته بندی بهتری نسبت به پویا دارد. مقایسه‌ی ماژول‌های تراکم پذیری سطحی در هر دو غشاء مقاومت بیشتر مدل ایستا را در برابر نیروهای خارجی نسبت به مدل پویا، نشان داد. نتایج حاصل از آرایش اسیدهای چرب اولئیک بعنوان فراوانترین نوع اسیدچرب در هر دو غشای مدل، سیالیت مدل پویا نسبت به ایستا را تأیید کرد. انکوزوم پویا با فراهم کردن فضای سطحی بیشتر برای جذب سطحی و نفوذ پپتید، تعاملات پایدارتری را شکل داد. تعاملات وابسته به ساختار مارپیچ آلفا در مدل ایستا تا 50 نانوثانیه ابتدایی بوده ولی درمدل پویا تا 175 نانوثانیه نیزحفظ شد و در ادامه پپتید ساختار خود را از دست داد. رصد برهم کنش‌ها در طی بازه‌های زمانی 25 نانوثانیه‌ای، نقش کلیدی رزیجوهای KIIKLKA و آمینو اسید لیزین 5 را نشان داد. فسفولیپیدهای SDPE و SAPE در مدل پویا نقش ویژه‌ای در ثبات برهم کنش‌ها دارد. مقایسه‌ی نیروهای دینامیک مولکولی هدایت شده تمایل بالای جذب سطحی پپتید به دو لایه‌ی مدل پویا را بواسطه‌ی آنالیزهای هدایت شده تأیید کرد. پژوهش حاضر با نتایج آزمایشگاهی مبنی بر خواص ضد سرطانی پپتید GL13K هم راستا می باشد.

واژه های کلیدی: اسیدهای چرب غیر اشباع- انکوزوم - زیست محاسباتی

* نویسنده مسئول، پست الکترونیکی: mzarrabi@alzahra.ac.ir

مقدمه

بسیاری از فعالیت‌های بیوشیمیایی سلول نیازمند حضور فسفولیپیدهای غشای پلاسمایی است (17). عدم تقارن فسفولیپیدها ما بین دو نیم لایه‌ی غشایی وجود دارد و فراوانی فسفاتیدیل‌کولین و اسفنگولیپیدها در نیم لایه‌ی خارجی غشاء بیشتر بوده و فسفولیپیدهایی با گروه سر آمینی از جمله سرین و اتانول آمین، به نسبت بیشتری در نیم لایه‌ی داخلی غشاء حضور دارند (36). گروه ویژه‌ای از پروتئین‌های ناقل غشایی مسئولیت حفظ عدم تقارن دو لایه را بر عهده دارد (56). این وجه از عدم تقارن غشایی در طی فرایندهای فیزیولوژیکی گوناگون از جمله آپوپتوز و نکروپتوز فرو می‌پاشد (10، 55). در چنین شرایطی با قرارگیری فسفولیپیدهای آمین دار در نیم لایه‌ی خارجی، سلول‌ها برای فرایندهای ایمونولوژیکی آتی از جمله فاگوسیتوز و افروسیتوز برچسب گذاری شده (4) و با برهم کنش ما بین فسفولیپیدهای آمین دار نیم لایه‌ی خارج سلولی و سلول‌های لنفاوی، پاسخ ایمنی را مهار کرده و روند آپوپتوز را پیش می‌برند (29). طبق پژوهش‌های مولکولی و ایمنی‌شناسی، سلول‌های سرطانی با استفاده از استراتژی‌های مشابه و با سرکوب سیستم ایمنی، تهاجم خود به بافت ها را گسترش می‌دهند (24). مطالعات تجربی نشان داده است که در روند سرطان‌زایی، متابولیسم لیپیدها تغییر می‌کند و بدنبال آن آرایش لیپیدهای غشای پلاسمایی نیز دست‌خوش تغییر می‌شود (3). آنالیزهای لیپیدومی متعدد، تغییرات محتوای لیپیدی غشای سلول‌های سرطانی را در مقایسه با سلول‌های سالم تأیید کرده است (11، 25). از مهم ترین آن‌ها، ایجاد آسیب در مکانیسم‌های مربوط به حفظ عدم تقارن غشایی بویژه عاملی که پخش فسفاتیدیل سرین در نیم لایه‌ها را تحت تأثیر قرار می دهد، می‌باشد (35). فسفاتیدل سرین تنها سه درصد از لیپیدهای سلولی را تشکیل می‌دهد و همانند سایر لیپیدهای غشایی با عملکرد آنزیم فلیپاز بین دو نیم لایه جا به جا می‌شود (48). در سلول‌های سرطانی با ایجاد تغییر در هموستازی کلسیم درون سلولی و بدنبال آن تغییر در عملکرد افتراقی آنزیم فلیپاز میزان بالایی از فسفاتیدیل سرین در نیم لایه‌ی اگزوپلاسمی غشاء جای می‌گیرد. وجود هموستازی بالای کلسیم درون سلولی بواسطه‌ی تغییر در پروتئین‌های درگیر در این مسیر از یک سو و افزایش pH درون سلولی از سویی دیگر، نه تنها تقارن نسبی دو نیم لایه‌ی غشای سلول سرطانی را تضمین می‌کند، بلکه با کاهش دافعه‌ی ما بین سرهای فسفاتیدیل سرین در نیم لایه‌ی اندوپلاسمی غشاء افت سیالیت و تنگ‌شدگی بیشتر نیم لایه‌ی درونی غشای سرطانی را در پی داشته و سبب بروز پدیده‌ی مقاومت دارویی می‌شود (48، 58). نتایج اسپکتروسکوپی جرمی، سطوح بالایی از فسفولیپیدهای کولین و اتانول آمین دار را در انواع بدخیمی‌ها در مقایسه با انواع سلول‌های خوش‌خیم، نشان داده ‌‌است(8).‌ فسفاتیدیل اتانول‌آمین، از دمتیلاسیون و دکربوکسیلاسیون فسفاتیدیل کولین و فسفاتیدل سرین شکل می‌گیرد و با توجه به عملکرد افتراقی آنزیم‌های مربوط و همچنین هموستازی نامتعادل سلولی، توزیع فسفاتیدل اتانول آمین، بین دو نیم لایه تغییرکرده و اتانول آمین برای حضور در نیم لایه‌های خارج سلولی تمایل بیشتری پیدا می‌کند (51). سطوح بالای فسفاتیدل اتانول آمین در طی تنش‌های استرس‌زا همچون تولید گونه‌های فعال اکسیژن و عوامل پرتوزا در محیط توموری و همچنین سلول‌های رگ‌زایی توموری نیز به اثبات رسیده است (50). با توجه به نقش چاپرونی فسفاتیدل اتانول آمین در کمک به تا شدن پروتئین‌های غشایی و لنگراندازی پروتئین‌های محیطی غشایی بواسطه‌ی آمین انتهایی لیپید، افزایش حضور آن در نیم لایه‌ی خارجی سلول سرطانی، با سمی کردن ساختار پروتئین‌های عملکردی غشاء و ایجاد اختلال در سیستم‌های پیام‌رسانی سلولی، از شکل گیری صحیح آپوپتوز ممانعت کرده و بدین روش در پیشبرد روند سرطان زایی نقش ویژه ای ایفا می‌کند (53). مشخص شده است که فسفاتیدیل سرین و اتانول آمین، بعنوان لیگاندهای مهاری پروتئین‌های پیام‌رسان موجود در غشای گروهی از سلول‌های لنفاوی از جمله سلول‌های کشنده‌ی طبیعی عمل کرده و با ممانعت از روند فاگوسیتوز کامل سلول‌های سرطانی، از عملکرد صحیح و کامل سیستم ایمنی جلوگیری می‌کند (29).از دیگر عوامل بروز تغییرات غشایی در طی سرطانی شدن یک سلول، تغییر در متابولیسم اسیدهای چرب یا آنزیم‌های درگیر در متابولیسم لیپیدها می‌باشد (3). افزایش بیان آنزیم اسیدچرب سنتاز با افزایش لیپوژنز سلول‌های سرطانی ارتباط مستقیم داشته و با اشباع کردن اسیدهای چرب فسفولیپیدهای غشایی در برخی از مراحل سرطان‌زایی، از روند اکسیداسیون سلول‌های سرطانی ممانعت می‌کند. نوسان در میزان کلسترول غشای سرطانی و کاهش آن در طی مراحل متاستاز پیشرانه‌ی عبور سلول متاستاتیک از دیواره‌ی اندوتلیال عروقی و لانه‌گزینی در جایگاه ثانویه است. در حالی که میزان بالای کلسترول در سلول‌های مقاوم به دارو، عاملی مهم در افت سیالیت غشایی و مهار نفوذ انواع گوناگون داروهای شیمی درمانی وابسته و غیر وابسته به ناقل‌های غشایی می‌باشد (43). علاوه بر کلسترول، متابولیسم سرامیدها نیز بعنوان یک مکانیسم مقاومتی در سرطان مطرح شده است. تداخل در عملکرد آنزیم اسفنگومیلیناز سلول‌های سرطانی، تعادل ما بین تولید سرامید و اسفنگومیلین را بر هم می‌زند و بدلیل پایین بودن میزان تولید سرامید از شکل‌گیری صحیح نانودمین‌های قرارگیرنده‌ی پروتئین‌های غشایی واجد نقش در آپوپتوز جلوگیری شده و مسیر پیام‌رسانی آپوپتوز مختل می‌شود (62). بدلیل وجود موانع در ردیابی تجربی ساختارهای تغییر یافته‌ی غشای سلول سرطانی از رویکردهای جایگزین همانند شبیه سازی دینامیک مولکولی برای رصد تغییرات غشایی و تعاملات اجزای لیپیدی آن با پروتئین‌های داخلی، محیطی و همچنین پپتیدها و مولکول‌های کوچک ضد سرطانی، استفاده می‌شود. تاکنون انواع گوناگونی از مدل‌های غشای سرطانی معرفی شده ‌است (41). در اکثریت مدل‌های معرفی شده، روی سیالیت غشاء بواسطه‌ی افزایش و کاهش کلسترول و بهره‌گیری از فسفولیپیدهای واجد بار منفی، تأکید شده است (41،43،52). بعنوان نمونه در سال 2013، تیم تحقیقاتی کلن با استفاده از اطلاعات پایه‌ای از محتویات لیپیدی غشای گلبول قرمز، مدلی از غشای سلول سرطانی را ارائه دادند که در آن بواسطه‌ی افزایش 8 برابری فسفاتیدیل سرین در نیم لایه‌ی خارج سلولی، نامتقارن بودن غشاء برهم زده شد و سپس دینامیک مولکولی تمام اتمی و هدایت شده‌ی نفوذ ذره‌ی کاتیونی OMIM به غشای مدل مورد بررسی قرار گرفت (25). در سال 2019، ریول اثر تقارن غشای سلول سرطانی را در نفوذ داروی سیسپلاتین مورد بررسی قرار داد. نتایج شبیه‌سازی دینامیک مولکولی تمام-اتمی و هدایت شده‌ی گروه مذکور، نقش تقارن و درجه‌ی سیالیت غشای سلول سرطانی را بواسطه‌ی افت کلسترول در میزان نفوذ داروی سیسپلاتین ارزیابی کرده و مقاومت سلول های صلب با درجه‌ی بالاتری از میزان کلسترول را در برابر نفوذ سیسپلاتین نشان داد (43). از دیگر مطالعات این حوزه، می‌توان به پژوهش‌های مهرنژاد در سال 2021 اشاره کرد. این گروه برای بررسی نقش محتوای لیپیدی غشاء روی عملکرد دندریمرهای PAMPAM، از مدل غشایی ترکیبی فسفاتیدل کولین و فسفاتیدل گلیسرول، بعنوان نماینده‌ای از مدل غشای سرطانی واجد بار منفی استفاده کردند (22). آنچه که از این مطالعات استنتاج می‌شود، اهمیت محتوای لیپیدی غشاء در تأثیرگذاری بر عملکرد حامل‌ها و داروهای ضد سرطانی است (46). محتوای لیپیدی غشای سلولی نه تنها در بین سرطان‌های مختلف متفاوت است، بلکه در طی روند سرطان‌زایی نیز تغییر می‌کند (15). مطالعات مرتبط با چیپ‌های میکروفلوییدیکی بر روی دو رده‌ی سرطان سینه، مهاجرت متغیر رده‌های MCF-7 و MDA-MB-231 را اثبات کرده است (14). در نگاهی جزیی‌تر، مطالعات تجربی حاصل از طیف سنجی جرمی سلول‌های سرطانی افزایش حضور فسفولیپیدهای آمین دار در نیم لایه‌ی خارجی غشای پلاسمایی و تغییر سیالیت غشایی را بواسطه‌ی حضور انواع متنوعی از اسیدهای چرب اشباع و غیراشباع و درجه‌های متغیری از کلسترول در هر دو نیم‌لایه‌ی غشایی، اثبات کرده است (44). درک صحیح از محتوای لیپیدی غشایی و دخالت دادن هر یک از این موارد در مدل‌های غشای سلول سرطانی می‌تواند نگرش واقع بینانه‌تری از مکانیسم عملکردی پپتید یا سایر داروهای شیمی درمانی را ارائه دهد چرا که ارتباط ساختار- عملکرد پپتید، مفهوم مستقلی نبوده و به محتوای لیپیدی غشایی نیز بستگی دارد (15). بر همین اساس، پژوهش حاضر با تکیه بر اطلاعات تجربی حاصل از نتایج آنالیز محتوای لیپیدومی غشای سلول‌های سرطانی جامد، بر بررسی سیالیت غشای سلول سرطانی و بواسطه‌ی حضور اسیدهای چرب اشباع و همچنین غیر اشباع واجد چند پیوند دوگانه ، متمرکز شده است. با توجه به اهمیت افزایش حضور فسفولیپیدهای آمین‌دار در نیم‌لایه‌ی خارج سلولی و همچنین ریز محیط توموری ، دولایه‌های غشایی از فسفولیپیدهای یکسان از نظر گروه سر( واجد فسفاتیدیل اتانول آمین و فسفاتیدیل سرین) و متغیر از نظر دنباله‌ی اسیدچرب، دو نوع مدل غشایی سرطانی با عناوین انکوزوم ایستا (Static Oncosome) و انکوزوم پویا (Dynamic Oncosome) مدلسازی شد. انکوزوم‌ها، وزیکول‌های تولید شده توسط سلول‌های توموری است که محتوای لیپیدی غشای آن‌ها نسبت به اگزوزوم‌های تولیدی توسط سلول‌های سالم متفاوت بوده و افزایش حضور لیپیدهای آمین‌دار و کاهش حضور کلسترول در آن‌ها نسبت به سلول‌های منشأ یافته از آن، مشاهده شده است (49). با توجه به افت کلسترول و اهمیت حضور لیپیدهای آمین دار (32)، در این مطالعه تلاش شد تا سیالیت غشاهای مدل از طریق حضور اسیدهای چرب اشباع و غیراشباع مورد بررسی قرارگیرد و پس از بررسی و تحلیل ویژگی‌های بیوفیزیکی حاصل از شبیه سازی دو لایه‌های واحد، دینامیک مولکولی برهم کنشی تمام-اتمی و هدایت شده‌ی آن‌ها با پپتید زیست-فعال GL13K ارزیابی شود (25). ویژگی ضد میکروبی و ضد بیوفیلمی پپتید GL13K مورد ارزیابی قرار گرفته است (2،12). اخیرا روی ویژگی‌های ضد سرطانی این پپتید و آرایه‌های تغییریافته‌ی آن مطالعات تجربی گوناگونی صورت گرفته است (52). نتایج بیوفیزیکی حاصل از شبیه سازی دینامیک مولکولی GL13K با مدل‌های انکوزوم ایستا و پویا و بررسی نقش سیالیت غشایی در عملکرد پپتید، زمینه‌ساز پیشبرد اهداف آتی در تغییر احتمالی ساختار پپتیدهای ضد سرطانی موجود - طراحی پپتیدهای جدید - مدل سازی و ساخت سازه‌های مورد نیاز برای انتقال هدفمند داروهای ضد سرطانی خواهد‌ بود.

مواد و روشها

دو لایه‌های غشایی شبیه‌سازی شده: در این پژوهش، دو مدل غشای سلول سرطانی مبتنی بر پژوهش‌های تجربی، ساخته شد. بطور معمول، در غشای پلاسمایی پستانداران، فسفاتیدیل سرین در نیم لایه‌ی داخلی و اتانول آمین با فراوانی نسبی (1:4)، در هر دو نیم لایه‌های خارجی و داخلی حضور دارد (53). پژوهش‌های مرتبط با تکنیک‌های برچسب گذاری بواسطه‌ی نشانگر‌های اتانول آمین همچون دورامایسین، افزایش بیان این فسفولیپید را از حالت معمول سلولی، به 70 % تا 90 % در نیم لایه‌ی خارجی غشاء تائید کرده است (50). افزایش حضور فسفولیپیدهای اتانول آمین دار در غشای پلاسمایی سلول سرطانی، در سایر مطالعات بیوشیمیایی نیز اثبات شده است (11، 50، 51). افزایش 10 تا 25 درصدی از فسفولیپید سرین در سلول‌های توموری، بواسطه‌ی نشان گرهای مبتنی بر آنتی بادی بویتاکسیمب، با سایر نتایج مرتبط با تقارن فسفاتیدیل سرین در هر دو نیم لایه هم راستا است (50). پروفایل لیپیدومی طیف سنجی جرمی در رده‌های سرطانی سلول‌های جامد، ازدحام اسیدهای چرب غیر اشباع را نشان داده و با تهاجمی‌تر شدن سلول، نسبت اسیدهای چرب غیر اشباع به کل اسیدهای چرب کمتر می شود (13 ، 37). در سلول‌های تهاجمی سرطانی تنوع خاصی از اسیدهای چرب غیر اشباع و فسفولیپیدهایی با اتصالات اتری نیز یافت شده است (11). این اتصالات بیشتر در فسفولیپیدهای اتانول آمین دار بوده و دنباله‌های فسفاتیدیل سرین بیشتر از اولئیک اسید و استئاریک اسید، شکل‌ گرفته است  (11،13). با در نظرگیری موارد عنوان شده و حذف سایر فسفولیپیدهای غشایی، دو مدل غشایی مبتنی بر استفاده از فسفولیپیدهای اتانول آمین و سرین با نسبت (2:1) ساخته شد. در مدل (1) که اٌنکوزوم ایستا نام دارد، از دنباله‌های اسید چربی فیزیولوژیکی معمول پالمیتیک اسید (16:0) و اولئیک اسید (18:1) استفاده شده است (25). در مدل(2)که انکوزوم پویا نام دارد، با حفظ نسبت (2:1) فسفولیپیدهای اتانول آمین به سرین، از اسیدهای چرب اشباع استئاریک اسید (18:0)، انواع غیر اشباع واجد چند پیوند دوگانه شامل آراشیدونیک اسید (20:4) و دوکوزاهگزانوئیک اسید (22:6) و همچنین از دنباله‌های اتصالی اتری نیز استفاده شده است ( جدول 1). دو لایه‌های متقارن غشایی انکوزوم ایستا و پویا (100 واحد)، توسط سرور Charmm-Gui (30) و با هدف شبیه سازی تمام-اتمی در نرم افزار گرومکس، در غلظت نمکی 0.15 مولار سدیم کلرید و دمای 310.15 درجه ی کلوین، ساخته شد. 

جدول 1- نوع و تعداد فسفولیپیدهای مورد استفاده در مدل‌های غشایی

آماده‌سازی ساختار پپتید: پپتید 13 واحدی GL13K با توالی آمینواسیدی N-GKIIKLKASLKLL-C ، توسط سرور PEPFOLD3 مدل سازی شد (47) و بر اساس امتیاز DOPEE ، بهترین مدل انتخاب شد. پس از کمینه سازی انرژی، 20 نانوثانیه، شبیه سازی دینامیک مولکولی تمام-اتمی پپتید، انجام گرفت (61). آنالیز DSSP ساختارهای ثانویه‌ی محتمل برای این پپتید را مشخص کرد.

آماده سازی دولایه‌های غشاء-پپتید: ساختار پپتید مدل سازی شده بصورت موازی با صفحه ی X*Y و در فاصله ی تقریبی 1-2 نانومتری از لایه‌ی فوقانی دو لایه‌های مدل انکوزوم ایستا و پویا ، قرار داده شد.

شبیه‌سازی دینامیک مولکولی تمام-اتمی: میدان نیروی تمام-اتم  charmm36m برای همه مولکول‌ها در سیستم‌های شبیه سازی استفاده شد (19). تمامی شبیه‌سازی‌ها با بسته شبیه‌سازی گرومکس (1. 2018) انجام شد. در طی مرحله کمینه‌سازی انرژی (Energy minimization)، محدودیت‌های مورد نیاز برای جلوگیری از فروپاشی احتمالی در فرآیند شبیه‌سازی اعمال شد. مراحل تعادل‌رسانی بر اساس دستورالعمل‌های سرور Charmm-Gui برای فایل‌های ورودی گرومکس و در هنگرد هم دما-هم فشار، انجام گرفت و دما در 310.15 درجه ی کلوین در ثابت زمانی یک فمتو ثانیه و سیستم کوپلینگ برندسن انجام گرفت. پیوندهای هیدروژنی با استفاده از الگوریتم لینک محدود شد. برهم کنش‌های غیر پیوندی در فاصله‌ی 1.2 نانومتری محاسبه شد. مدل‌های غشایی و دولایه‌های مدل با پپتید، هر یک به مدت 200 نانوثانیه در گام‌های زمانی 2 فمتوثانیه‌ای شبیه سازی شد. با استخراج فایل‌های تراجکتوری حاصل، ویژگی‌‌های هندسی مدل‌های ایستا و پویا بررسی شده و بیوشیمی برهم‌کنش رزیجوهای آمینو اسیدی با فسفولیپیدهای مدل‌های غشایی تحلیل شد. مصور سازی نتایج و آنالیزهای هندسی غشاء، به ترتیب با استفاده از نرم افزارهای VMD(1.9.3) و UCSF Chimera (1.16) و FATSLiM ، انجام گرفت (5 ، 20، 39 ). 

شبیه‌سازی دینامیک مولکولی هدایت شده: دینامیک مولکولی هدایت شده، تقلیدی از عملکرد میکروسکوپ نیروی اتمی است که در آن مرکز جرم تابع هدف اولیه (پپتید) توسط فنری مجازی و با سرعتی ثابت به سمت مرکز جرم تابع هدف ثانویه (دولایه‌ی مدل)، کشیده می شود (18). در چنین شرایطی نیروی جایجایی، ارتباط مستقیمی با گرادیان انرژی پتانسیل ( ΔU ) داشته و بر اساس رابطه‌ی زیر محاسبه می شود که در آن U انرژی پتانسیل، k ثابت نیروی فنر، v سرعت کشش، t زمان، r موقعیت برداری لحظه‌ای اتم مرکز جرم و r₀ موقعیت برداری اولیه‌ی اتم مرکز جرم و n تعداد جهت‌های کشش است:

F= - ΔU

U= k [ vt – (r-r₀). n]²

در این شبیه‌سازی، مرکز جرم پپتید GL13K با سرعت ثابت 0.01 نانومتر بر پیکوثانیه، به سمت مرکز جرم دو لایه‌های مدل کشیده شد. با مقایسه‌ی نتایج حاصل از منحنی‌های تغییرات نیرو در طی کشش، عملکرد پپتید در قبال هر دو مدل ایستا و پویا مورد بررسی قرار گرفت.

نتایج

در بخش‌های زیر، به  تفصیل  نتایج  شبیه سازی  دینامیک

مولکولی عنوان شده است.

مقایسه‌ی ویژگی‌های مدل‌های غشائی: تمامی آنالیزهای مدل‌های انکوزوم ایستا و پویا، بر اساس تراجکتوری‌های حاصل از 200 نانو ثانیه از شبیه‌سازی دینامیک مولکولی تمام-اتمی انجام گرفت. در این پژوهش، ویژگی‌های هندسی غشاء از جمله مساحت غشاهای مدل، ناحیه‌ی سطحی هر لیپید در غشاها، ضخامت و فاصله‌ی هسته‌های آبگریز میانی دو لایه‌های مدل غشایی، میزان تراکم پذیری غشاهای مدل و همچنین ویژگی‌های فازی غشاء از جمله آرایش دنباله‌های اسیدهای چرب و تعداد پیوند‌های هیدروژنی درون زنجیره‌ای، مورد محاسبه قرار گرفت.

آنالیز مساحت و ناهمواری‌های سطحی غشاهای مدل: حضور کلسترول در دو لایه‌های غشایی و بواسطه‌ی کاهش دافعه‌ی وان دروالسی ما بین دنباله‌های اسیدهای چرب فسفولیپیدی، سبب بسته بندی بهتر غشاء شده و مساحت غشاء (X*Y)، بدلیل کاهش 10 الی 20 درصدی ناحیه‌ی سطحی فسفولیپیدها، کم می‌شود (30). با توجه به عدم حضور کلسترول در مدل‌های غشایی انکوزوم ایستا و پویا، نقش اسیدهای چرب واجد چند پیوند دوگانه، بر اثرگذاری روی مساحت و ناحیه‌ی سطحی هر لیپید و همچنین میزان فرورفتگی و برآمدگی‌های سطح غشاء مورد بررسی قرارگرفت (جدول3). در میان گروه‌های سر فسفولیپیدها، کولین بزرگترین و اتانول آمین کوچکترین گروه را به خود اختصاص می‌دهد. در پژوهش حاضر نیز SOPE کمترین میزان اشغال فضای سطح را داشته و تفاوت در ناحیه‌ی سطحی هر فسفولیپید، به هنگام حضور اسیدهای چرب واجد چند پیوند دو گانه، اندکی چشم گیر می‌شود. تفاوت زیادی ما بین فسفولیپیدهای سرین دار مشاهده نمی‌شود. در جدول 3، میانگین مساحت غشاء و ناحیه‌ی سطحی هر غشاء، در 200 نانو ثانیه از شبیه‌سازی، گزارش شده است که با نتایج تجربی مربوط به تک تک فسفولیپیدها همخوانی دارد. نتایج نشان داد که علی‌رغم یکسان بودن گروه‌های سر در هر دو مدل غشایی، درجه‌ی اشباع اسیدهای چرب فسفولیپیدها، تأثیر ویژه‌ای در ناحیه‌ی سطحی فسفولیپیدها داشته و مساحت دو لایه‌ی انکوزوم پویا، اندکی بیشتر از مدل ایستا است. همین امر روی هندسه‌ی سطحی غشاء نیز تأثیر گذار است. پلات‌های کانتور مربوط به تراجکتوری های 200 نانوثانیه ای از مدل‌های ایستا و پویا، تفاوت‌های موضعی بین دو مدل را نشان می‌دهد (شکل1). همین میزان از درجه‌ی غیر اشباع بودن و تعدد پیوندهای دوگانه، روی ناهمواری‌های سطح غشاء نیز تأثیر می‌گذارد (شکل 2).

شکل 1 توپوگرافی سطحی از مدل‌های غشایی انکوزوم ایستا و پویا در 150 نانوثانیه از شبیه سازی با استفاده از نقطه گذاری اتم‌های فسفر گروه‌های سر فسفولیپیدها در نرم افزار FATSlIM. با توجه به هر دو مدل، بیشتر ناحیه‌ی سطحی لیپیدی در مدل ایستا ، محدوده ی 0.6 تا 0.5 را در بر می گیرد و در مدل پویا محدوده ی 0.6 تا 0.9 غالب است. اختلاف ارتفاع در مقیاس z (0.4-0.96) درمدل ایستا نسبت به مدل پویا(-0.9 -1.5) کمتر بوده که می تواند نشان دهنده‌ی نزدیک تر بودن گروه های سر نسبت به هم و بسته بندی بهتر فسفولیپیدها در مدل ایستا باشد.

شکل 2 نمودار انحناهای متوسط، اطلاعاتی را از شکل معکوس سطح در اختیار می گذارد. اطلاعات حاصل بر اساس موقعیت گروه های فسفات فسفولیپیدها و توسط نرم افزار FATSLIM بدست آمده است. نواحی قرمز رنگ نشاندهنده ی برآمدگی ها، آبی رنگ نشاندهنده ی فرورفتگی ها و نواحی سفید رنگ ( H=0)، نشان گر نقاط هموار است. علی رغم بالا بودن ارتفاع و عمق برآمدگی و فرورفتگی ها در مدل ایستا، تعدد و میزان فرورفتگی های غشایی در مدل پویا نسبت به مدل ایستا بیشتر است.

آنالیز حالت‌های فازی، ضخامت و تراکم‌پذیری سطحی غشاهای مدل: بدلیل تنوع دنباله‌های اسیدهای چرب در مدل‌های غشایی و بمنظور بررسی صحیح‌تر، فراوانترین نوع اسید چرب در هر دو مدل ایستا و پویا ( اولئیک اسید 18:1)، جهت بررسی شرایط فازی غشاء، انتخاب شد. بر اساس نتایج، اولئیک اسید در مدل انکوزوم ایستا، نسبت به مدل انکوزوم پویا، ساختار منظم تری دارد (شکل 3). نتایج در طی 200 نانوثانیه از شبیه‌سازی و با تکرارهای 50 نانوثانیه‌ای، تأیید شد. حضور فسفولیپیدهای واجد اسیدهای چرب غیر اشباع چند گانه در مدل انکوزوم پویا، سبب القای خمیدگی‌ها و پیچ خوردگی‌های دنباله‌های لیپیدی در هسته‌ی هیدروفوبی غشاء شده، که با افزایش دافعه‌ی وان دروالسی و بی نظم‌تر کردن آرایش اسیدهای چرب در مرکز دو لایه، حالت فازی ژل را در مدل پویا، اعمال می‌کند (59). چنین حالت‌هایی از دو لایه‌های غشایی در سلول‌های سرطانی مهاجم و متاستاتیک مفروض بوده و آرایه‌های اثباتی آن در برخی از مطالعات تجربی، مورد پژوهش و تحلیل قرارگرفته است(36). آنالیزهای مربوط به بررسی ضخامت هسته‌ی هیدروفوبی دو لایه های مدل انکوزوم ایستا و پویا، نشان دهنده‌ی نازک بودن هسته‌ی هیدروفوبی در مدل انکوزوم پویا و بسته بندی منظم‌تر دنباله‌های چربی در مدل ایستا، است. نتایج مذکور که بر اساس محاسبه‌ی میانگین فاصله‌ی برداری گروه‌های کربن هسته ی هیدروفوب (D_C-C) که در مدت زمان 200 نانوثانیه از شبیه‌سازی انجام گرفته است، با نتایج حاصل از میزان تراکم پذیری سطحی دو لایه‌ی غشایی، همخوانی دارد. شاخص تراکم پذیری سطحی غشاء (Area compressibility madule) (K_A)، بیان‌گر میزان مقاومت غشاء، نسبت به فشرده سازی یا انبساط سطحی است و نسبت مستقیم با دمای محیط و مساحت کلی نیم لایه‌ی غشایی و نسبت معکوس با تعداد فسفولیپیدها در هر نیم لایه را دارد (40). بر همین اساس، برای ایجاد تنش برشی در مدل انکوزوم پویا با حالت فازی ژل و هسته‌ی هیدروفوبی ضخیم، نیروی کمتری نسبت به مدل ایستا نیاز است. در معنی دیگر، مدل ایستا، مقاومت بیشتری در برابر انبساط و فشرده سازی سطحی را دارد (جدول 4).

شکل 3 مقایسه ی رفتار فازی اولئیک اسید (18:1) بر اساس سنجش فراوانی در هر دو مدل غشایی انکوزوم ایستا ( رنگ سیاه) و انکوزوم پویا ( رنگ قرمز).

آنالیز پیوندهای هیدروژنی در نیم لایه‌ها: با هدف بررسی نقش هر یک از فسفولیپیدها در برقراری پیوندهای هیدروژنی درون زنجیره‌ای و مقایسه‌ی فراوانی پیوندها بین هر دو مدل انکوزوم ایستا و پویا، گروه بندی لیپیدی انجام شد و تعداد پیوندهای هیدروژنی بین تک تک گروه ها در طی 200 نانوثانیه از زمان شبیه سازی، محاسبه شد (شکل 4). با توجه به نقشه‌ی حرارتی، فراوانی گروه‌های مشارکت کننده در تشکیل پیوند هیدروژنی در مدل انکوزوم پویا بیشتر از مدل انکوزوم ایستا است. در هر دو مدل فسفولیپیدهای واجد گروه سر سرین نقش بیشتری را دارند. در مدل پویا، SOPS ( با وجود تعداد کمتر نسبت به فسفولیپیدهای اتانول آمین دار)، در مشارکت حداکثری با SOPE ، بیشترین نقش را در شکل دهی پیوندهای هیدروژنی داشته، در مقابل فسفولیپیدهای SDPE و POPEE ، حضور کمرنگ‌تری در ایجاد پیوندهای هیدروژنی دارد. در شکل 5، ساختار فسفولیپیدهای مذکور نشان داده شده است. این چنین بنظر می رسد که علی رغم یکسان بودن ساختار گروه‌های سر فسفولیپیدی در هر دو مدل، نوع و آرایش اسیدهای چرب نیز در شکل گیری پیوندهای هیدروژنی تأثیر گذار باشد.

تقابل غشاهای مدل با پپتید و ارزیابی عملکردی آن‌ها: نتایج حاصل از شبیه‌سازی در غشاهای مدل، سیالیت بالای مدل انکوزوم پویا نسبت به مدل ایستا را تأیید کرد. در گام بعدی، تعامل ما بین غشاهای مدل با پپتید هدف GL13K به مدت 200 نانو ثانیه شبیه‌سازی شد و رفتار اولیه‌ی پپتید (فرایند جذب سطحی) در تقابل با هر دو مدل صلب و سیال مورد بررسی قرار گرفت.

بررسی ویژگی‌های پپتید: پپتید زیست فعال GL13K با 13 آمینو اسید (N-GKIIKLKASLKLL-C)، واجد ساختار مارپیچ آلفا، مشتق شده از پروتئین‌های ترشحی غدد بنا گوشی، دارای خواص انتخابی ضد میکروبی و ضد بیوفیلمی است (2)( شکل 6). اخیرا مطالعاتی پیرامون خواص ضد سرطانی آن انجام گرفته و میزان اثر بخشی آرایه های انانتیومری D و L از آن، روی رده‌های سلولی گوناگون و همچنین اریتروسیت‌ها مورد مطالعه قرار گرفته است. نتایج شبیه‌سازی اهمیت محتوای لیپیدی در نحوه‌ی بر هم کنش پپتید با غشاهای سرطانی را برجسته کرد (52).

شکل 4 خوشه بندی فسفولیپیدها بواسطه ی نقشه‌ی حرارتی از تعداد پیوندهای هیدروژنی محتمل ما بین گروه های فسفولیپیدی در 200 نانوثانیه از شبیه سازی تمام اتمی.نقاط پر رنگ، نشان دهنده‌ی ازدیاد گروه های درگیر در شکل دهی پیوند هیدورژنی است.

شکل 5 ساختار فسفولیپیدهای مدل غشای انکوزوم پویا که بیشترین (کادر قرمز) و کمترین (کادر آبی) مشارکت را در شکل دهی پیوندهای هیدروژنی درون غشایی دارند.

شکل 6 مشخصه های ساختاری پپتید GL13K الف) ساختار سه بعدی پپتید (مارپیچ آلفا) بر اساس مطلوب ترین امتیاز مدلسازی (https://mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr) . ب) چرخه ی مارپیچی پپتید GL13K ؛ ممان آبگریزی 0.264 ، آبگریزی 0.516 و بار خالص مثبت 4 ، (https://heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin ) . پ) مدل اتمی پپتیدGL13K   

با هدف بررسی رفتار ساختاری پپتید منفرد در حلال، شبیه سازی تمام اتمی پپتید انجام گرفت. آنالیز ساختار ثانویه‌ی پپتید در بازه‌ی زمانی 20 نانوثانیه، حضور غالب آمینو اسیدها در ساختارهای مارپیچی را تأیید کرد (شکل 7- الف). 

بررسی برهم کنش GL13K با مدل‌های انکوزوم ایستا و پویا: پپتید GL13K بصورت موازی و در فاصله‌ی تقریبی یک تا دو نانومتر بر فراز دو لایه‌های مدل قرار داده شد و روند بر هم کنشی آن با هر دو لایه در طی 200 نانو ثانیه، رصد شد. آنالیز DSSP ، گویای شکل گیری ساختارهای ثانویه‌ی متفاوت پپتید در روند شبیه‌سازی با غشاهای مدل است (شکل7 ب و پ). همان گونه که در (شکل 7) مشخص شده است، مشارکت آمینواسیدهای انتهای N پپتید در ساختارهای مارپیچی بیشتر بوده و محتوای لیپیدی و درجه‌ی سیالیت غشاء (میزان اشباع بودن دنباله‌های اسیدچرب فسفولیپیدها)، بر نحوه‌ی شکل‌گیری ساختار ثانویه‌ی پپتید، تأثیر دارد. پپتید GL13K همانند دیگر پپتیدهای زیست-فعال، در شرایط عادی، ساختار مشخصی ندارد و ویژگی‌های مارپیچی خود را تنها در 20 نانوثانیه‌ی ابتدایی از زمان شبیه‌سازی در حلال آبی، حفظ می‌کند (12).

شکل 7 بررسی ساختار ثانویه ی پپتید در سه شرایط گوناگون، تصاویر سمت راست آنالیز DSSP و تصاویر سمت چپ بیانگر درصد حضور هریک از ساختارهای ثانویه ی محتمل در 50 نانوثانیه ی ابتدایی از روند شبیه سازی. الف) پپتید در حلال آبی و شرایط فیزیولوژیک بدن انسان ب) پپتید در تعامل با غشای مدل انکوزوم ایستا پ) پپتید در تعامل با غشای مدل انکوزوم پویا

آنچه که مشخص است، ارتباط مستقیم عملکرد با ساختار پپتید است و در این گروه از پپتیدها، جزء تعاملی (دو لایه غشایی) نقش ویژه ای دارد (15). در طی این پژوهش، مشاهده شد که GL13K ، ساختار مارپیچی خود را در تقابل با هر دو غشای مدل و از سمت رزیجوهای انتهای N، تا محدوده ی 50 نانوثانیه از شبیه سازی حفظ کرده و سپس ساختار ثانویه‌ی پپتید تغییر کرده و رفتار دو گانه‌ای را نسبت به هر دو غشای مدل نشان می دهد. GL13K، بصورت قابل توجهی در برهم کنش با مدل انکوزوم پویا (مدل سیال) ، مارپیچ آلفا خود را تا 175 نانوثانیه از شبیه سازی در کنار سایر ساختارهای ثانویه دارد ولی در مدل ایستا (صلب)، مارپیچ آلفای خود را از دست می دهد. با توجه به اهمیت ساختارهای مارپیچی در شکل‌گیری برهم کنش های پپتید-غشاء (مخرب-سازنده)، رفتار پپتید با دو لایه‌های مدل در بازه‌های زمانی 25 نانوثانیه ای مورد بررسی قرار گرفت (شکل های 8 و 9 ).

شروع برهم کنش‌های الکترواستاتیک پپتید با انکوزوم ایستا، در 25 نانوثانیه‌ی ابتدایی از شبیه‌سازی و از طریق آمینو اسیدهای لیزین است . مشارکت گروهی از فسفولیپیدهای POPE و POPS برهم کنش و نفوذ پپتید از انتهای N را فراهم می کند (شکل 8-50 نانوثانیه). برهم کنش‌های پپتید-غشاء، در بازه ی زمانی 75 نانوثانیه، به اوج می رسد و پپتید با حفظ ساختار مارپیچی در رزیجوهای -KIIKLKA- و از انتهایN خود در حال جای گیری در ناحیه‌ی سر نیم لایه‌ی خارجی غشاء است. روند مذکور تا 25 نانو ثانیه ی بعدی (100 نانوثانیه) ، پایدار نبوده و رفته رفته پپتید با از دست دادن قابلیت نفوذ خود به بخش های داخلی‌تر غشاء، مدل عملکردی خود را با ایجاد تغییر در ساختارهای ثانویه‌ی خود تغییر می‌دهد؛ به این صورت که در فواصل زمانی 25 نانوثانیه ای تا پایان شبیه‌سازی، پپتید ساختار بی نظم کویل را به خود می‌گیرد و در تلاش است تا بواسطه‌ی آمینواسیدهای لیزین خود و از هر دو انتهای N و C ، برهم کنش‌های الکترواستاتیک را با غشاء، پایه ریزی کند (شکل 8).

در مدل انکوزوم پویا، پپتید پس از رصد سطح غشاء در 25 نانوثانیه‌ی ابتدایی از شروع شبیه‌سازی و توسط آمینواسید لیزین 5 (موجود در ساختار مارپیچ آلفا)، برهم کنش‌های الکترواستاتیک خود را با SOPS غشاء شروع می‌کند. این روند توسط فسفولیپیدهای SAPE و POPE پشتیبانی می‌شود. در 25 نانوثانیه‌‌ی بعدی، پپتید با حفظ ساختار هلیکس خود، با سطح غشاء موازی شده و لیزین 2 بواسطه ی لنگرگاه ایجادی توسط گلایسین، با SOPS برهم کنش دارد. ایزولوسین های 3 و 4 ، تعاملات واندروالسی را شروع کرده و بدنبال آن، دو زنجیره ی SOPS ، لیزین 5 را از کناره‌ها احاطه می‌کنند. در 50 نانوثانیه از شبیه سازی، پپتید روند موازی با سطح غشاء را در دستور کار خود داشته و بنظر می‌رسد بیشترین میزان مشارکت SOPS ها و شکل‌گیری برهم کنش‌های هیدروژنی (شکل 10)، در این بازه‌ی زمانی رخ می‌دهد. در فواصل زمانی آتی ( شکل 9- 75 نانوثانیه)، لیزین شماره 5 ، نقش پر رنگ تری را ایفا می کند و پپتید با حفظ ساختار هلیکس خود در رزیجوهای KIIKLKA ، بصورت عمودی و از انتهای N ، در حال نفوذ به غشاء است. در چنین شرایطی مجموعه‌ای از فسفولیپیدهای SOPS ، POPE،SDPE  و SAPE نقش دارند و با شکل‌گیری برهمکنش‌های وان‌دروالسی و الکترواستاتیکی، فضای مورد نیاز برای ورود پپتید را فراهم می‌کنند. در بازه‌ی زمانی 100 نانوثانیه نیز پپتید حالت عمودی خود با غشاء را حفظ کرده است و لیزین 5 نقش کلیدی را در این روند دارد. در سویی دیگر لیزین 7 )انتهای C ) برهم کنش خود با گروه‌های سر فسفولیپیدی را شروع کرده است. این روند تا بازه‌ی زمانی 125 نانوثانیه ادامه دارد. سپس پپتید بواسطه ی لیزین 11(انتهای C) با گروه‌های فسفولیپیدی کناری ارتباط برقرار کرده و سرین 9 نیز در برهم کنش با گروه‌های اتانول آمینی شرکت کرده (شکل 9- 150نانوثانیه) و پپتید از حالت عمودی خود زاویه گرفته و با سپری شدن زمان شبیه سازی (شکل 9- 175نانوثانیه)، ساختار مارپیچی خود را از دست داده، با سطح غشاء موازی می شود و نفوذ خود را بواسطه‌ی آمینواسیدهای قطبی و غیر قطبی پیش می‌برد (شکل 9- 200 نانوثانیه).  

شکل 8 برهم کنش پپتید GL13K (GKIIKLKASLKLL) با غشای مدل انکوزوم ایستا (POPE:POPS)، در طی فواصل زمانی 25 نانوثانیه از شبیه سازی تمام اتمی. رنگ بندی آمینو اسیدهای پپتید : لیزین (بنفش)- سرین (صورتی)-  ایزولوسین (آبی)- لوسین (نارنجی). رنگ بندی فسفولیپیدها: POPE(آبی)- POPS (قرمز).

شکل 9 برهم کنش پپتید GL13K (GKIIKLKASLKLL) با غشای مدل انکوزوم پویا در طی فواصل زمانی 25 نانوثانیه از شبیه سازی تمام اتمی. رنگ بندی آمینو اسیدهای پپتید : لیزین (بنفش)- سرین (صورتی)-  ایزولوسین (آبی)- لوسین (نارنجی). رنگ بندی فسفولیپیدها: SOPS ( قرمز تیره)-SAPE( سبز)

نتایج حاصل از برهم کنش‌های پپتید با هر دو مدل در فواصل زمانی 25 نانوثانیه، اهمیت سیالیت غشاء بر نحوه‌ی برهم کنش را نشان می‌دهد. در هر دو مدل لیزین 5 و حفظ ساختار مارپیچی KIIKLKA پپتید در حین برهم کنش، نقش ویژه ای را ایفا می‌کند.

شکل 10 میانگین فاصله ی پپتید GL13K با گروه های فسفات نیم لایه ی بالایی غشاهای مدل در طی 200 نانوثانیه از زمان شبیه سازی. رنگ سبز نشان دهنده ی فاصله ی رزیجوهای انتهای C، رنگ قرمز نشانگر رزیجوهای انتهای N و رنگ مشکی نشان دهنده ی فاصله ی رزیجوهای میانی با غشاء.

شکل 11 نمودار نیرو-جابجایی، رنگ قرمز نشان دهنده ی کشش پپتید به سمت مرکز جرم مدل ایستا و رنگ آبی نشان دهنده‌ی کشش پپتید به مرکز جرم مدل پویا است.

سیالیت بالای مدل انکوزوم پویا نسبت به مدل ایستا، سبب شده است که گروه‌های سر فسفولیپیدی، فضای سطحی بیشتری را احاطه کنند و بیشتر در معرض تعاملات محیطی (حلال-پپتید) قرار گیرند و از این رو مقاومت کمتری نسبت به تنش‌های برشی محیط داشته باشند (جدول 4). در چنین شرایطی پپتید برهم کنش و نفوذ بهتری را به نواحی سر و میانی غشای مدل پویا خواهد داشت. حضور فعال فسفولیپید غیراشباع SAPE با فضای سطحی بالا (جدول 2) در روند برهم کنش های پپتید-غشاء نیز گویای این مطلب است. نتایج حاصل از آنالیز فاصله‌ی رزیجوهای مرکزی، انتهای N و انتهایC  پپتید با گروه‌های فسفات نواحی سر غشاهای مدل، اهمیت رزیجوهای دنباله ی N پپتید در برهم کنش با هر دو مدل غشایی و بویژه مدل پویا را تأیید می‌کند (شکل 10).

جدول 3- میانگین مساحت و ناحیه سطحی غشاء