نوع مقاله : مقاله پژوهشی
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله English
نویسندگان English
Sperm cryopreservation is a suitable method for the survival of reproduction in men with cancer as well as people with sperm deficiency such as azoospermia and oligospermia. The cryopreservation damage leads to a decrease in the survival rate of sperm and fertility handicap. The aim of this study is to investigate the effect of the polyalcohol xylitol as an antioxidant during sperm cryopreservation and, finally, to reduce the level of free radicals. In this study, 60 normal human sperm samples were collected from 60 people referred to the Infertility Research Center of Royan Research Institute and divided into three groups, including a fresh control group, a frozen control group (samples that were frozen with sperm freezing medium alone) and frozen treatment group (They were frozen with freezing medium supplemented with a concentration of 55 mM xylitol). Sperm motility, viability, and membrane swelling were evaluated based on WHO criteria and the level of free radicals in the mentioned samples. The results of this study showed that adding xylitol to the freezing medium improved the sperm parameters and also increased the survival rate of the cells. The level of free radicals decreased significantly in the presence of xylitol. From this study, it can be concluded that adding xylitol as an antioxidant compound to the freezing medium during sperm cryopreservation is a suitable strategy to reduce the free radicals level in the freezing medium.
کلیدواژهها English
نقش ضداکسیدانتی زیلیتول بر فراسنجههای سلولی اسپرم انسانی طی فرایند
انجماد- یخ گشایی
داریوش غلامی1* و رشید علیجانی اردشیر2
1 ایران، آمل، دانشگاه تخصصی فناوریهای نوین آمل، دانشکده زیستفناوری، گروه زیستفناوری میکروبی
2 ایران، آمل، دانشگاه تخصصی فناوریهای نوین آمل، دانشکده زیستفناوری، گروه زیستفناوری دریا
تاریخ دریافت: 18/03/1401 تاریخ پذیرش: 24/03/1402
چکیده
انجماد اسپرم روشی مناسب برای بقای تولیدمثل در مردان مبتلا به سرطان و همچنین افراد مبتلا به نقصهای اسپرمی از جمله ناهنجاریهای آزو اسپرمی و الیگو اسپرمی است. آسیبهای ناشی از انجماد اسپرم منجر به کاهش نرخ زندهمانی سلولهای اسپرم و به دنبال آن کاهش باروری میشود. هدف از این مطالعه بررسی اثر پلیالکل قندی زیلیتول بهعنوان ضد اکسیدانت طی فرآیند انجماد اسپرم و درنتیجه، کاهش سطح رادیکالهای آزاد تولیدشده است. در این مطالعه 60 نمونه اسپرم نرمال انسانی از 60 فرد مراجعهکننده به مرکز تحقیقات ناباروری پژوهشگاه رویان جمع آوری شد و به سه گروه شامل گروه کنترل تازه، گروه کنترل انجمادی (نمونههایی که با محیط انجمادی اسپرم بهتنهایی منجمد شدند) و گروه تیمار انجمادی (با محیط انجمادی مکمل شده با غلظت 55 میلیمولار ضد اکسیدانت زیلیتول منجمد شدند) تقسیمبندی شدند. جنبایی اسپرم، زندهمانی و تورم غشای اسپرمی بر اساس معیارهای WHO ارزیابی و همچنین سطح رادیکالهای آزاد در نمونههای مذکور بررسی شد. نتایج این مطالعه نشان داد که افزودن زیلیتول به محیط انجمادی باعث بهبودی فراسنجههای اسپرمی و همچنین بالا رفتن نرخ زندهمانی سلولها شد. سطح رادیکالهای آزاد در حضور زیلیتول بهطور قابلتوجهی کاهش یافت. از این مطالعه میتوان نتیجه گرفت که افزودن زیلیتول بهعنوان یک ترکیب ضد اکسیدانت به محیط انجمادی طی فرایند انجماد-یخگشایی اسپرم، یک راهکار مناسب در جهت کاهش سطح رادیکالهای آزاد این محیط انجمادی است.
واژههای کلیدی: ضد اکسیدانت، انجماد-یخگشایی، اسپرم، زیلیتول
* نویسنده مسئول، تلفن: ۴۴۴۴۲۱۳۵-011 ، پست الکترونیکی: d.gholami@ausmt.ac.ir
مقدمه
انجماد اسپرم روشی ارزشمند برای حفظ باروری در کلینیکهای فناوری کمک باروری است (34). این روش مؤثرترین راه برای حفظ باروری در مردان مبتلا به اولیگواسپرمی، سرطان، بیماری خود ایمنی و غیره است (21; 44). علیرغم موفقیتهای بهدست آمده با این روش، آسیب ساختاری و کارکردی به اسپرم که منجر به کاهش قابلیت زندهمانی، جنبایی و درنهایت کاهش توانایی لقاح اسپرم میشود، اتفاق میافتد (7; 14; 16; 17). طی این فرآیند تشکیل بلورههای یخ درونسلولی، شوک سرمایی و آسیب اسمزی منجر به افزایش سطوح گونههای اکسیژن فعال (ROS) (Reactive oxygen species) میشود (13; 20; 37; 38). افزایش سطوح ROS منجر به استرس اکسیداتیو میشود و همچنین باعث کاهش سطح ظرفیت ضد اکسیدانتی کل میشود. این امر منجر به اختلال در پتانسیل میتوکندری و غشای پلاسمای سلولهای اسپرم نیز میشود. رادیکالهای آزاد اکسیژن در پی آزادسازی الکترونهای اسیدهای نوکلئیک، لیپیدها و پروتئینها منجر به آسیبهای برگشتناپذیر به سلول میشوند (4; 18; 29; 36; 41). در شرایط استرس اکسیداتیو، رادیکالهای آزاد مانند آنیون سوپراکسید و پراکسید هیدروژن منجر به افزایش اکسیداسیون اسیدهای چرب غیراشباع غشا (PUFAs) (Polyunsaturated fatty acids) میشود که موجب از دست دادن یکپارچگی ساختاری و کارکردی غشاها میشود. این شدت آسیب پراکسیداتیو PUFAs را میتوان با تخمین محصولات آلدئیدی پایدار انتهایی پراکسیداسیون لیپید از قبیل مالون دیآلدئید (MDA) (Malondialdehyde) سنجید.
امروزه تلاشهای زیادی برای توسعه فناوری انجماد اسپرم در حال انجام است. مهمترین مسئله در یخزدن منی متوقف کردن فعالیتهای متابولیکی اسپرم در زمان یخزدن است؛ بهگونهای که جنبایی اسپرم تا زمان یخگشایی و فرایند لقاح به تعویق بیافتد. سرما و فرایند انجماد و ایجاد بلورههای یخ درونسلولی میتواند برای اسپرم زیانبار باشد. مقدار آثار سوء این فرایند در گونههای مختلف متفاوت است (35). امروزه، معمولترین روش حفاظت سلولها و بافتها از انجماد، استفاده از گلیسرول و دیمتیل سولفوکساید بهعنوان محافظ انجمادی (Cryoprotectant) است. از آنجاییکه این ترکیبات در برخی از مسیرهای پیامرسان سلولی اختلال ایجاد میکنند، استفاده از این محافظهای انجمادی، بهویژه در زمینه پزشکی تولیدمثل و همچنین ذخیره سلولهای اجدادی (Progenitor)، بسیار مسئلهساز است (42). مطالعات شرمن نشان داد که استفاده از گلیسرول ممکن است، باعث تغییراتی از جمله نوسانات غشایی، تغییر در غشای درونی آکروزومی و بههم ریختگی میتوکندریایی شود. گلیسرول بهطور گسترده در انجماد اسپرم انسان استفاده میشود، اما میتواند به درون سلول نفوذ کند و بر ساختار غشایی، نفوذپذیری و پایداری لیپیدهای دو لایه موجود در سطح غشا و همچنین پروتئینهای سطحی آن اثر بگذارد (40).
مواد محافظ انجمادی نفوذناپذیر مانند سوکروز و ترهالوز نمیتوانند از غشای سلولی عبور کنند. درنتیجه، فقط در خارج از سلول کارکرد خود را نشان میدهند. این ماده بر غشای سیتوپلاسمی سلول تأثیرگذار بوده و میتواند مانند یک محلول عمل کرده و نقطه انجمادی سلول اسپرم را کاهش دهد (12). تحقیقات نشان میدهد که افزودن مواد محافظ انجمادی کربوهیدراتی مانند انواع قندها، بقای سلولها را پس از انجماد در اسپرم انسان، ماهی و سگ افزایش میدهد (13).
در سالهای اخیر، مطالعات متعددی برای بهبود فرآیند انجماد اسپرم با مکملسازی محیط انجمادی با ضد اکسیدانتها انجامشده است و نتایج آنها پتانسیل محافظتی ضد اکسیدانتها را در فرایند انجماد نشان میدهد (7). زیلیتول نوعی الکل قندی پنجکربنه طبیعی است که در بیشتر مواد گیاهی از جمله بسیاری از میوهها و سبزیها یافت میشود. این ترکیب بهطور گسترده محصولات غذایی «بدون قند» و بهعنوان ترکیبی که جایگزین شکر شده است، استفاده میشود (47).
این مطالعه باهدف بررسی اثرات بهعنوان یک ضد اکسیدانت طی فرایند انجماد- یخگشایی اسپرم انسانی بر جنبایی و زندهمانی اسپرم، سطح ROS و MDA موجود در منی انجام شد.
مواد و روشها
بیشتر مواد شیمیایی از شرکت سیگما آلدریچ خریداریشده است و در غیر این صورت نام شرکت سازنده درجشده است.
نمونهگیری، آمادهسازی و رقیقسازی اولیه اسپرم: در این مطالعه نمونه منی 60 فرد نرموزوسپرم (افرادی که اسپرم نرمال دارند) برای بررسی اثر زیلیتول بر فراسنجههای سلولی و فرایند آپوپتوز مطابق معیارهای WHO (نمونههای اسپرم با شرایط حداقل حرکت 40 درصد، حداقل غلظت 20 میلیون و حداکثر مورفولوژی 4 درصد اسپرم غیرنرمال) جمعآوری شد (43). این مطالعه در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 گروه کنترل تازه، کنترل بعد از انجماد و تیمار انجمادی (محیط انجمادی مکمل با زیلیتول) انجام شد. همچنین مطالعه حاضر بهوسیله کمیته اخلاق پژوهش دانشگاه تخصصی فناوریهای نوین آمل، آمل، ایران (Ir.ausmt.rec.1402.02) تأیید شد.
نمونههای منی از افراد مراجعهکننده به مرکز ناباروری پژوهشگاه رویان مطابق 3-7 روز دوره عدم نزدیکی با روش استمناء (Masturbation) یا نزدیکی (Coitus) در ظرفهای استریل پلاستیکی اخذ شد. نمونههای اخذشده 20 تا 40 دقیقه در انکوباتور 37 درجه جهت مایعشدن نگهداری شده و سپس بهلحاظ حجم، رنگ، ویسکوزیته، غلظت و pH مورد ارزیابی قرار گرفتند. فرایند رقیقسازی منی با افزودن محیط انجمادی اسپرم و با نسبت 1 به 1 انجام شد و سپس مخلوط حاصل به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد تا متعادلسازی انجام شود.
محیط انجمادی: محیط انجمادی بر پایه زرده تخممرغ بهصورت زیر تهیه شد:
5/1 گرم از گلوکز را با 3/1 گرم سیترات سدیم و 3/1 گرم گلیسین با همدیگر مخلوط و زیلیتول در غلظتهای 25، 55، 100 و 150 میلیمولار (بهصورت جداگانه) افزوده شد و 15 میلیلیتر گلیسرول و 20 میلیلیتر زرده تخممرغ به آن اضافه و با آب مقطر به حجم نهایی 100 میلیلیتر رسانده شد. سپس محلول مذکور به مدت 40 دقیقه در حمام آب با دمای °C 56 انکوبه و به دنبال آن pH بین 8/6 تا 2/7 متعادل شد. محلول با فیلتر 44/0 میکرومتر (شرکت مرک، امریکا) فیلتر و در °C 20- نگهداری شد (43).
فرایند انجماد- یخگشایی: ابتدا پایوتهای حاوی اسپرم و محیط انجمادی به مدت 15 دقیقه در 5 سانتیمتری بالاتر از سطح نیتروژن مایع نگهداری و سپس در نیتروژن مایع فرو برده شدند. بعد از اینکه دو تا سه هفته از قرارداد نمونهها در نیتروژن مایع سپری شد، پایوتها از نیتروژن مایع خارج شده و بعد از چند دقیقه که در بنماری 37 درجه سانتیگراد قرار گرفتند، محتوای پایوت به نسبت 1 به 4 در محلول Tyrode (5) مخلوط شد. سپس نمونهها در g800 و به مدت 4 دقیقه سانتریفیوژ شده و رسوب در 5/0 میلیلیتر از محلول Tyrode بهآرامی مخلوط شد و برای ارزیابیهای مختلف کیفیت اسپرم مورداستفاده قرار گرفت (13).
ارزیابی فراسنجههای مربوط به جنبایی با استفاده از نرمافزار کامپیوتریCASA (Computer Assisted Sperm Analyzer)
برای بررسی جنایی اسپرم پس از فرآیند انجماد- یخگشایی از نرمافزار کامپیوتری CASA نسخه 5.1 (شرکت میکروپتیک، اسپانیا) استفاده شد. بدین منظور ابتدا 6 میکرولیتر از منی یخگشایی شده به زیر میکروسکوپ معکوس فاز کنتراست منتقل و جنبایی اسپرم با استفاده از رایانه مجهز به نرمافزار SCA (Sperm class analyzer) ارزیابی شد. فراسنجههایی که توسط این سیستم برآورد شدند، شامل جنبایی کل (Total motility (%))، جنبایی پیشرونده (Progressive motility (%))،LIN (Linearity (%) (lin=VSL/VCL×100))، STR (Sperm track straightness (%) (STR=VSL/VAP×100))، VCL (Curvilinear velocity (micron/sec))، ( Amplitude of Lateral head displacement (micron)) ALH، ( Average path velocity (micron/sec))VAP، VSL (Straight line velocity (micron/sec)) و BCF (Beat cross frequency (Hz)) بودند.
بررسی زندهمانی اسپرم
بررسی زندهمانی اسپرم با استفاده از رنگآمیزی ائوزین- نگروزین صورت گرفت. در این روش ابتدا 10 میکرولیتر از نمونه با 10 میکرولیتر از مخلوط رنگ ائوزین- نگروزین روی لام مخلوط شده و یک دقیقه زمان داده شد تا واکنش رنگپذیری صورت بگیرد. سپس با یک لام ساده با زاویه 45 درجه روی نمونه و لام تا انتها کشیده تا اسمیر تهیه شد و اجازه داده شد تا در دمای اتاق خشک شود. سپس با میکروسکوپ نوری و بزرگنمایی x100 شمارش انجام و زندهمانی برحسب درصد بیان شد (15).
بررسی یکپارچگی
غشا (HOST)( Hypo- Osmotic Swelling Test)
بهمنظور بررسی یکپارچگی غشای سلول مقدار 735/0 گرم از دهیدرات سدیم سیترات با 351/1 گرم از D-فروکتوز در 100 میلیلیتر آب مقطر حل شد (محلول تهیهشده به محلول Swelling معروف است). سپس محلول Swelling با نسبت 1:2 رقیقشده و به مدت 5 دقیقه در 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت.
مقدار 80 میکرولیتر از محلول Swelling با 40 میکرولیتر از نمونه مخلوط شده و به مدت 30 دقیقه در 37 درجه سانتیگراد قرار داده شد. سپس مقدار 10 میکرونیتر از نمونه تهیهشده را با 10 میکرولیتر از رنگ ائوزین روی لام حاشیهدار گذاشته و مخلوط کرده و یک دقیقه زمان داده میشود تا واکنش انجام شود. سپس با یک لام ساده روی آن کشیده و اسمیر تهیه میشود. لام در دمای محیط خشک شده و با میکروسکوپ نوری (مدل CKX41، شرکت اولیمپوس، ژاپن) با عدسی X40 بررسی شد. اسپرمها با دم بدون تغییر، مرده و اسپرمهایی که دم آنها پیچخورده و متورم است و واکنش در آنها صورت گرفته زنده در نظر گرفته شدند.
اندازهگیری رادیکالهای آزاد سلول
اندازهگیری رادیکالهای آزاد با دستگاه کمیلومینسانس انجام گرفت. اساس دستگاه کمی لومینسانس (مدل INDRA 200، شرکت آپتاسیس، چین) شمارش فوتونها در دقیقه است و با واحد RLU/S/million sperm بیان میشود.
در این روش، ابتدا مایع منی با دور g300 و مدتزمان 7
دقیقه سانتریفیوژ شد تا مایع منی از سلولهای اسپرم جدا شود. سپس رسوب محتوی سلولها با محلول PBS به حجم 3 میلیلیتر رسانده شد و دوباره با دور g300 و مدتزمان 7 دقیقه سانتریفیوژ شد. مقدار 106×20 سلول از محلول برداشته و با محلول PBS به حجم 1 میلیلیتر رسانده شد. سپس در چاهکهای پلیت سفید در یک ستون از بالا به پایین به ترتیب: بلانک حاوی 200 میکرو لیتر محلول PBS، کنترل منفی شامل 196 میکرولیتر به اضافه 5 میکرولیتر محلول لومینال، کنترل مثبت شامل 175 میکرولیتر محلول PBS به اضافه 20 میکرولیتر H2O2 و 5 میکرولیتر لومینال افزوده شد. به دنبال آن مقدار 195 میکرولیتر از نمونه و 5 میکرولیتر از محلول لومینال به هر چاهک اضافه شد و پس از تنظیمات دستگاه به مدت 15 دقیقه خوانش صورت گرفت (13).
اندازهگیری میزان تغییرات مالون دیآلدئید حاصل از پراکسیداسیون لیپیدهای منی با استفاده از روش TBARS (Thiobarbituric acid reactive substances)
ابتدا نمونه منی به مدت 5 دقیقه و با دور g300 سانتریفیوژ شد. سپس به نسبت 1 به 2 پلاسمای منی به TBA (100 میکرولیتر از مایع رویی (پلاسمای منی) به همراه 900 میکرولیتر آب مقطر در لوله آزمایش ریخته شد و به هر لوله 500 میکرولیتر معرف TBA اضافه شد) با همدیگر مخلوط و بلافاصله به مدت 15 دقیقه در بنماری با دمای 95 درجه سانتیگراد انکوبه شد. سپس به مدت 5 دقیقه نمونه روی یخ انکوبه و به مدت 5 دقیقه با دور g300 سانتریفیوژ شد و مایع رویی با دستگاه اسپکتروفتومتری با طولموج 532 نانومتر خوانش شد. جذب نوری نمونههای مختلف یادداشت و در پایان، غلظت MDA (نانومول در میلیلیتر) بر اساس ضریب جذب مولی آن محاسبه شد (3).
آنالیز آماری
دادههای حاصل از مطالعه حاضر بهوسیله نرمافزار SPSS نسخه 25 مورد تجزیهوتحلیل قرار گرفتند. تجزیهوتحلیل دادهها بر اساس آنالیز واریانس یکراهه و به دنبال آن آزمون تعقیبی توکی برای مقایسه چندگروهی استفاده شد. نمایش دادهها بهصورت Mean±SD ارائه شد و معنیدار بودن نتایج در سطح (05/0>P) در نظر گرفتهشده است.
نتایج
تعیین غلظت زیلیتول
مرحله نخست مطالعه تعیین غلظت مناسب زیلیتول است. زیلیتول در غلظتهای 25، 55، 100 و 150 میلیمولار محاسبه شده و به محیط انجمادی اضافه شد. سپس فراسنجههای اسپرمی شامل جنبایی کل و جنبایی پیشرونده در حضور هر غلظت و بعد از طی فرایند انجماد- یخگشایی بررسی شد. همانطور که در شکل 1 مشاهدهشده است، میانگین جنبایی کل (%11/4 ±93/64) و جنبایی پیشرونده (%73/2 ±93/31) در حضور غلظت 55 میلیمولار بیشترین درصد را نشان میدهد (05/0 >P)؛ بنابراین، از بین غلظتهای موردمطالعه، غلظت 55 میلیمولار بهعنوان غلظت نهایی ضد اکسیدانت انتخاب شد و سایر ارزیابیهای اسپرم در حضور این غلظت انجام گرفت.
شکل 1- میانگین جنبایی کل و جنبایی پیشرونده برحسب درصد در غلظتهای مختلف زیلیتول. درصد جنبایی کل (الف) و جنبایی پیشرونده (ب) در غلظت 55 میلیمولار از پلی الکل زیلیتول نسبت به غلظتهای دیگر بهطور معنیدار بالاتر است. ستونهای با حروف غیرمشابه، تفاوت معنیداری با یکدیگر دارند (05/0 >P) و ستونهای با حروف مشابه تفاوت معنیداری با یکدیگر ندارند. حرف a برای گروه با بالاترین مقدار به کار میرود و مقادیر پایینتر به ترتیب حروف الفبا مشخص میشوند.
بررسی فراسنجههای اسپرمی
میانگین درصد جنبایی در گروههای مختلف در جدول 1 نشان دادهشده است. بالاترین درصد جنبایی مربوط به گروه کنترل تازه و پایینترین درصد جنبایی مربوط به گروه انجمادی (05/0 >P) است. گروه تیمار انجمادی نیز با گروه کنترل انجمادی دارای تفاوت معنیداری در میزان جنبایی کل بود، همچنین با گروه کنترل تازه نیز تفاوت معنیداری داشت (05/0 >P).
همچنین درصد جنبایی پیشرونده نیز دارای روند مشابهی بود. بالاترین درصد جنبایی پیشرونده مربوط به گروه کنترل تازه و پایینترین مربوط به کنترل انجمادی بود (05/0 >P). گروه کنترل تازه با گروه تیمار انجمادی نیز تفاوت معنیدار داشت. بین کنترل بعد از انجماد و گروه تیمار بعد از انجماد نیز تفاوت معنیداری مشاهده شد (05/0 >P).
جدول 1- درصد جنبایی کل و پیشرونده گروههای موردمطالعه طی فرایند انجماد- یخگشایی.
|
P-value |
تیمار انجمادی |
کنترل انجمادی |
کنترل تازه |
جنبایی (%) |
|
0001/0 |
07/60± 23/3b |
94/49± 59/1c |
05/79± 37/3a |
جنبایی کل |
|
0003/0 |
58/31± 72/10b |
11/23± 95/6c |
68/59± 19/11a |
جنبایی پیشرونده |
|
071/0 |
46/28± 99/10 |
8/23 ± 6/6 |
6/20 ± 2/9 |
جنبایی غیرپیشرونده |
میانگینهایی که دارای حروف غیرمشابه هستند، تفاوت معنیدار دارند (05/0 >P). تعداد تکرار = 20. از آزمون تعقیبی توکی برای مقایسه چندگروهی استفاده شد.
ارزیابی شاخصهای حرکتی
همانطور که در جدول 2 نشان دادهشده است، شاخص VCL، VSL و VAP در گروه کنترل انجمادی نسبت به کنترل تازه و تیمار انجمادی بهطور معنیداری (05/0 >P) پایینتر بود.
شاخصهای LIN، ALH و BCF در گروه کنترل انجمادی نسبت به گروه کنترل تازه بهطور معنیداری (05/0 >P) بالاتر بود. شاخصهای یادشده در دو گروه کنترل بعد از انجماد و گروه تیمار بعد از انجماد اختلاف معنیداری باهم نداشتند. دو شاخص LIN و ALH در دو گروه کنترل تازه و تیمار انجمادی اختلاف معنیدار نداشتند. شاخص STR در هر سه گروه موردمطالعه فاقد اختلاف معنیدار بود (05/0 <P).
جدول 2- مقایسه شاخصهای حرکتی اسپرم طی فرایند انجماد- یخگشایی.
|
P-value |
تیمار انجمادی |
کنترل انجمادی |
کنترل تازه |
شاخصهای حرکتی |
|
0001/0 |
59/65 ± 01/14b |
26/49 ± 7/14c |
14/87 ± 87/9a |
VCL (µm/s) |
|
0003/0 |
61/32 ± 89/8b |
58/22 ± 16/9c |
99/42 ± 01/18a |
VSL (µm/s) |
|
0002/0 |
81/36 ± 22/8b |
59/28 ± 13/11c |
45/57 ± 17/21a |
VAP (µm/s) |
|
005/0 |
38/39 ± 73/8ab |
37/34 ± 32/15b |
57/48 ± 33/8a |
LIN (%) |
|
106/0 |
12/68± 86/9 |
92/64± 58/15 |
97/73 ± 69/7 |
STR (%) |
|
001/0 |
84/1± 38/0ab |
52/1 ± 49/0b |
29/2 ± 63/0a |
ALH (µM) |
|
0004/0 |
26/10 ± 47/3b |
83/9 ± 15/2b |
23/15 ± 8/3a |
BCF (Hz) |
میانگینهایی که دارای حروف غیرمشابه هستند، تفاوت معنیدار دارند (05/0 >P). مقادیر بهصورت SD ±میانگین بیان شدند. تعداد تکرار = 20. از آزمون تعقیبی توکی برای مقایسه چندگروهی استفاده شد.
بررسی زندهمانی اسپرم
مطابق شکل 2، درصد اسپرمها با زندمانی طبیعی در دو گروه کنترل تازه (8/2±13/76) و گروه تیمار انجمادی (6/2±33/67) بهطور معنیدار در مقایسه با کنترل انجمادی (62/2±13/41) بالاتر بود (05/0 >P). زندهمانی طبیعی اسپرمها در گروه کنترل تازه در مقایسه با گروه تیمار انجمادی بهطور معنیداری بالاتر بود (05/0 >P).
شکل 2- درصد زندهمانی اسپرم در گروههای موردمطالعه. الف) تصویر میکروسکوپ فاز کنتراست سلولهای اسپرم؛ اسپرمهای رنگ گرفته (قرمز) مرده و اسپرمهای رنگ نگرفته (سفید) زنده هستند. ب) نرخ زندهمانی اسپرم در گروه کنترل تازه بهطور معنیدار در مقایسه با کنترل انجمادی و گروه تیمار انجمادی بالاتر است. میانگینهایی که دارای حروف غیرمشابه هستند، تفاوت معنیدار دارند (05/0 >P). مقادیر بهصورت SD ±میانگین بیان شدند. تعداد تکرار = 20، از آزمون تعقیبی توکی برای مقایسه چندگروهی استفاده شد.
یکپارچگی غشا اسپرم در حضور و نبود زیلیتول
مطابق شکل 3 یکپارچگی غشای اسپرمها در دو گروه کنترل تازه (68/0±24/88) و گروه تیمار بعد از انجماد (68/0±4/64) بهطور معنیدار در مقایسه با کنترل بعد از انجماد (68/0±76/36) بالاتر بود (05/0 >P). یکپارچگی غشای اسپرمها در گروه کنترل تازه در مقایسه با گروه تیمار بعد از انجماد بهطور معنیداری متفاوت بود.
شکل 3- یکپارچگی غشای اسپرم در گروههای موردمطالعه. الف) تصویر میکروسکوپ فاز کنتراست سلولها؛ اسپرمهای با دم متورم و پیچخورده در محلول هیپواسموتیک دارای غشای سالم هستند درحالیکه اسپرم با غشای ناسالم در محیط هیپواسموتیک تغییری نشان نمیدهد. ب) یکپارچگی غشای اسپرم در گروه کنترل تازه و گروه تیمار انجمادی بهطور معنیداری در مقایسه با کنترل انجمادی بالاتری است. میانگینهایی که دارای حروف غیرمشابه هستند، تفاوت معنیدار دارند (05/0 >P). تعداد تکرار = 20، از آزمون تعقیبی توکی برای مقایسه چندگروهی استفاده شد.
اندازهگیری رادیکالهای آزاد اکسیژن
همانطور که در شکل 4 مشاهده میشود، غلظت رادیکالهای آزاد اکسیژن در گروه کنترل انجمادی (RLU/Sec/20×106sperm 34/65±11/1088) نسبت به کنترل تازه (RLU/Sec/20×106sperm 01/25±34/540) و تیمار انجمادی (RLU/Sec/20×106sperm 73/42±00/769) بهطور معنیداری بالاتر بود (05/0 >P). همچنین رادیکالهای آزاد اکسیژن در گروه تیمار انجمادی بهطور معنیداری نسبت به گروه کنترل تازه بالاتر بود (05/0 >P).
شکل 4- سطح رادیکالهای آزاد اکسیژن در گروههای موردمطالعه. سطح رادیکالهای آزاد اکسیژن در گروه کنترل انجمادی بهطور معنیداری در مقایسه با دو گروه کنترل تازه و تیمار انجمادی بالاتر است. میانگینهایی که دارای حروف غیرمشابه هستند، تفاوت معنیدار دارند (05/0 >P). تعداد تکرار = 20، از آزمون تعقیبی توکی برای مقایسه چندگروهی استفاده شد.
اندازهگیری میزان پراکسیداسیون لیپیدهای منی
همانطور که در شکل 5 مشاهده میشود، سطح مالون دیآلدئید در گروه کنترل انجمادی (ɳmol/ml 41/3±69/44) بهطور معنیداری نسبت به گروه کنترل تازه (ɳmol/ml 02/2±54/31) و گروه تیمار بعد از انجماد (ɳmol/ml 71/2±36/34) بیشتر بود (05/0 >P). همچنین سطح مالون دیآلدئید در گروه تیمار انجمادی نسبت به گروه کنترل تازه بهطور معنیدار بالاتر بود (05/0 >P).
بحث
فرایند انجماد- یخگشایی باعث تغییراتی در اسپرم میشود
که از مهمترین آنها میتوان به تنشهای گرمایی و سرمایی اشاره کرد. این تنشها که هنگام فرایند سردسازی و یخگشایی به اسپرم وارد میشوند، منجر به تولید تنش دیگری بهنام تنش اکسیداتیو میشوند که احتمالاً دلیل اصلی کاهش پارامترهای حرکتی اسپرم است (46). این تنش میتواند منجر به آسیب غشای اسپرم، آسیب DNA و شروع آپوپتوز شود (39). یکی از مهمترین عواملی که باعث آسیب به سلول اسپرم طی فرایند انجماد میشود، رادیکالهای آزاد اکسیژن است. رادیکالهای آزاد را میتوان اصلیترین عامل تنش شیمیایی یا تنش اکسیداتیو طی فرایند انجماد- یخگشایی دانست.
شکل 5- غلظت مالوندی آلدئید در گروههای موردمطالعه. سطح مالون دیآلدئید در گروه کنترل انجمادی بهطور معنیداری در مقایسه با دو گروه کنترل تازه و تیمار انجمادی بالاتر است. میانگینهایی که دارای حروف غیرمشابه هستند، تفاوت معنیدار دارند (05/0 >P). تعداد تکرار = 20، از آزمون تعقیبی توکی برای مقایسه چندگروهی استفاده شد.
مقادیر اندک انواع گونههای واکنشپذیر اکسیژن (Reactive oxygen species) ازنظر فیزیولوژیکی برای توانایی لقاح و واکنش آکروزومی و ظرفیتپذیری اسپرم نیاز است، هرچند مقادیر زیاد آن موجب آسیب به اسپرم میشود (6). گونههای واکنشپذیر اکسیژن از فعالیت آنزیمهای مؤثر در فرایندهای فسفریلاسیون اکسیداتیو، گلیکولیز یا دیگر مسیرهای تولیدکننده ATP برای سلول اسپرم جلوگیری میکنند. مجموعه این عوامل باعث تنش اکسیداتیو خواهند شد که نتیجه آن در فاز اول، پراکسیداسیون لیپیدهای غشا است و سپس تخریب و عبور از غشای سلول و درنهایت، دسترسی به اندامکهای درونسلولی و تأثیر بر فعالیتهای آنها و تغییر برهمکنشهای بیوشیمیایی در داخل سلول و نیز ایجاد شکستگی در DNA سلولهای اسپرم که منجر به کاهش توان باروری اسپرم میشود (11; 19). این امر سبب میشود که محققین اقدام به استفاده از ضداکسیدانتهای سنتتیک در محیطهای انجماد اسپرم بهمنظور جمعآوری رادیکالهای آزاد فعال و سپس خنثیسازی آنان در داخل و خارج سلولها نمایند (27).
اگرچه این روزها از انجماد اسپرم بهطور گسترده برای حفظ باروری استفاده میشود، اما اثرات نامطلوب آن بر پارامترهای کلاسیک اسپرم، جنبایی، زندهمانی و سایر فراسنجههای اسپرم را نباید نادیده گرفت (23). استفاده از ضد اکسیدانتها در طول انجماد نشاندهنده اثرات مثبت بر فراسنجههای اسپرم است. مکمل ضد اکسیدانتی در اسپرم در افزایش جنبایی پس از یخگشایی، حفظ نرخ بقای سلولی و مهار افزایش آسیب DNA که در طول اسپرم فعال نشده در طول ذخیرهسازی رخ میدهد، کارآمدتر بود. (48; 50).
در مطالعه حاضر، اثرات 55 میلیمولار ضد اکسیدانت زیلیتول بر پارامترهای کلاسیک اسپرم، نرخ زندهمانی، پراکسیداسیون غشای لیپیدها و رادیکالهای اکسیژن آزاد پس از انجماد مایع منی بررسیشده است.
استرس اکسیداتیو به دلیل تولید ROS و کاهش ضد اکسیدانتهای محیطی طی انجماد اسپرم رخ میدهد (12) و استرس اکسیداتیو در اسپرم انسان بر ترکیب لیپیدها، پروتئینها و DNA تأثیر میگذارد و منجر به کاهش زنده ماندن، تحرک و پتانسیل باروری میشود (1). نتایج حاصل از این مطالعه نیز در تطابق با مطالعات پیشین است (13; 15) و طی فرایند انجماد-یخگشایی زندهمانی و جنبایی سلولهای اسپرم کاهش چشمگیری نشان داد. یکی از راهکارهای موجود برای مقابله با شرایط فرسایش اکسیداتیو در طول فرایند انجماد، استفاده از ضد اکسیدانتها است. استفاده از ضد اکسیدانت زیلیتول بهعنوان یک پلی الکل قندی در محیط انجماد بهعنوان یک ماده محافظ غیرقابل نفوذ به داخل سلول، احتمالاً با جلوگیری از تشکیل بلورههای یخ درونسلولی، کارکرد و ساختار اسپرم را تا حدودی محافظت میکند. این یافته در تطابق با یافتههای پیشین است که نشان دادند که ترکیبات ضد اکسیدانت باعث کاهش آسیبهای ناشی از انجماد اسپرم از جمله ترمیم کارکرد اسپرم و محافظت از ساختار آن میشوند (2; 25).
چنین آسیبی میتواند اندامهای درونسلولی درگیر در تحرک و بقای سلول را به دلیل تغییر در فشار اسمزی و تشکیل بلورههای یخ که در طول فرآیند انجماد رخ میدهد، به خطر بیاندازد (9)؛ بنابراین فرآیند انجماد بهتنهایی میتواند باعث تولید مولکولهای ROS شود (26). همانطور که از نتایج این مطالعه مشاهده میشود، در حضور زیلیتول آسیب ناشی از افزایش رادیکالهای آزاد اکسیژن به سلولهای اسپرم طی فرایندهای انجماد- یخگشایی به حداقل میرسد و یکی از دلایل این امر این است که زیلیتول میتواند به لیپیدهای غشای سلولها متصل شود و با پوشاندن آنها مانع از اکسیداسیون لیپیدها و افزایش رادیکالهای آزاد اکسیژن شود (28). چکواما و همکاران در سال 2017 نشان دادند که زیلیتول باعث افزایش سطح آنزیمهای ضد اکسیدانت از جمله گلوتاتیون ردوکتاز، سوپراکسید موتاز و کاتالاز در شرایط آزمایشگاهی و در بدن موجودات زنده میشود. زیلیتول در شرایط آزمایشگاهی اکسید نیتریک و رادیکال هیدروکسیل را مهار و باعث احیای آهن میشود (10) و درنتیجه، احتمال آسیب به سلولها به حداقل میرسد و این یافتهها در تطابق با نتایج مطالعه حاضر است.
علاوه بر این، پراکسیداسیون لیپیدی بهعنوان یک نشانگر اصلی استرس اکسیداتیو در سیستم فیزیولوژیکی شناساییشده است که میتواند با اندازهگیری TBARS بهعنوان معادل MDA تعیین شود (8; 49). این امر به دلیل تجمع ROS است که باعث اختلال در مونتاژ غشای سلولی میشود و باعث تغییر در سیالیت و نفوذپذیری، تغییر در انتقال یون و مهار فرآیندهای متابولیک میشود (33). سطح پراکسیداسیون لیپید در پلاسمای منی نشانگر خوبی از انواع اختلالات اسپرم است. افزودن ضد اکسیدانتها به محیط انجماد خطرات پراکسیداسیون لیپیدی در غشای اسپرم را کاهش میدهد (32). در این مطالعه، افزودن زیلیتول باعث کاهش پراکسیداسیون لیپیدی در پلاسمای مایع منی و کاهش سطح MDA شد که این یافته با یافتههای پیشین مطابقت دارد (30). همچنین با نتایج نیگو و همکاران در سال 2011 مطابقت دارد که در آنها رابطه منفی معنیداری بین غلظت MDA پلاسمای منی و تحرک اسپرم مشاهده شد و تأیید میکند که پراکسیداسیون لیپیدی مسئول کاهش قابلتوجه در تحرک است (31).
اثرات حفاظت انجمادی زیلیتول بر سلولهای اسپرم طی فرایند انجماد- یخگشایی بهخوبی شناختهنشده است. بااینحال، ژانگ و همکاران در سال 2020 گزارش دادند که زیلیتول بهطور قابلتوجهی آسیب ناشی از بلورههای یخ بزرگ به بافتهای عضلانی را کاهش میدهد. در اینجا، مولکولهای زیلیتول احتمالاً با تشکیل پیوندهای هیدروژنی بزرگ با پروتئینهای ماهیچهای، جایگزین مولکولهای آب شدند و درنتیجه، ساختار آنها در غیاب آب در حالت یخزده تثبیت شده و مانع از تخریب ساختار بافتی شد (47). گزارشها حاکی از آن است که برخی از الکلهای قندی، مانند زیلیتول و سوربیتول، میتوانند تثبیت برخی از درشتمولکولهای بیولوژیکی را در برابر تغییرات ساختاری ناشی از دمای پایین و دناتوره شدن متعاقب آن حفظ کنند (22). بر اساس مطالعات ساختار مولکولی، الکلهای قندی خطی مانند زیلیتول، مانیتول و سوربیتول بهاحتمال فراوان بهخوبی بتوانند مولکولهای آب را متصل به خود نگه دارند و از این طریق مانع از تشکیل بلورههای منظم و آسیبپذیر آب به سلولها شوند (47). تغییر در پروتئینهای رشتهای ماهیچهای (میوفیبریلار) ممکن است به دلیل فقدان فعالیت پمپ کلسیم ATPase (Ca2+-ATPase) باشد. سرهای کروی میوزین مسئول اصلی فعالیت Ca2+-ATPase است (45). برای نمونههای موجود در محیط آبی، کاهش قابلتوجه فعالیت پمپ Ca2+-ATPase احتمالاً به دلیل تجمع سرهای کروی میوزین و بازآرایی پروتئینها از طریق برهمکنشهای پروتئین-پروتئین طی تشکیل بلورههای یخ رخ دهد. پایداری پروتئینهای میوفیبریل ممکن است بهطور گسترده بهوسیله برخی از ترکیبات پلیهیدروکسیل کنترل شوند. کونگ و همکاران نشان دادند که ترکیبات پلی الکل مانند سوربیتول میتوانند با ممانعت از کاهش فعالیت پمپ Ca2+-ATPase اثرات محافظ انجمادی قابل قبولی بر سلولهای عضلانی منجمد نشان دهند (24). در اینجا، مانیتول و زیلیتول آزمایششده از تعداد زیادی گروه هیدروکسیل روی زنجیره کربنی تشکیلشده است که هر دو با وزن مولکولی کوچک و ساختار خطی، احتمالاً با میوزین برهمکنش داشته و بخشی از مولکولهای آب را در اطراف سطح میوزین جایگزین کردهاند که منجر به تثبیت ساختاری پروتئین Ca2+-ATPase میشود (47).
نتیجهگیری
طبق نتایج بهدستآمده در این مطالعه مشخص شد که درنتیجه افزودن زیلیتول با غلظت 55 میلیمولار به محیط انجمادی اسپرم، بهبودی فراسنجههای اسپرمی از جمله جنبایی کل و جنبایی پیشرونده و همچنین زندهمانی سلولها بهطور قابلتوجهی مشاهده میشود. همچنین افزودن زیلیتول بهعنوان ضد اکسیدانت طی فرایند انجماد- یخگشایی در کاهش سطح رادیکالهای آزاد مؤثر است و باعث بهبود شرایط انجماد میشود؛ بنابراین چنین مطالعاتی از جمله این مطالعه میتواند راه را برای بهینهسازی محیط کشت انجمادی اسپرم طی فرایند انجماد- یخگشایی هموارتر کند که منجر به معرفی یک محیط کشت انجمادی جدید در این زمینه شود.
تشکر و قدردانی
این طرح تحقیقاتی با استفاده از اعتبارات ویژه پژوهشی (گرنت با شماره 14697/20/14) دانشگاه تخصصی فناوریهای نوین آمل انجامشده است. همچنین نویسندگان از معاونت پژوهشی پژوهشگاه رویان و گروه اسپرم بیولوژی کمال تشکر را دارند.
پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)