شبیه‌سازی دینامیک مولکولی بررسی اثرات کوپلیمر پلی لاکتیک کو گلایکولیک اسید در نسبت‌های مختلف مونومرها بر ساختار و دینامیک پروتئین p53

مطالعه دینامیک مولکولی برهمکنش­های بین کوپلیمر پلی­لاکتیک-­کو-­گلایکولیک­اسید در نسبت­های مختلف مونومرها و پروتئین ضد سرطان p53

محبت انصاری¹، محسن شهلایی¹، دانیال کهریزی²، طاهره ناصریه³، امین نوروزی^1* و سجاد مرادی^1*

¹ ایران، کرمانشاه، دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه، پژوهشکده فناوری سلامت، مرکز تحقیقات دارورسانی نانو

² ایران، تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی

³ ایران، کرمانشاه، دانشگاه رازی کرمانشاه، دانشکده فناوری­های نوین، گروه نانوبیوتکنولوژی

تاریخ دریافت: 29/01/1402       تاریخ پذیرش: 24/03/1402

چکیده

جهش و اختلال در عملکرد پروتئین p53 یکی از مهم­ترین عوامل دخیل در بسیاری از سرطان­ها است و همین موضوع استفاده از فرم وحشی آن را بعنوان داروی ضد سرطان هم به روش­ انتقال ژن و هم رسانش مستقیم پروتئین مورد توجه قرار داده است. با وجود کارایی و اختصاصیت بالای داروهای پروتئینی، به دلیل حساسیت زیاد ساختاری به استرس­های محیطی چه در زمان نگهداری و چه حمل و نقل توسعه این دسته از داروها همواره به کندی صورت می­گیرد. از طرف دیگر بهینه­سازی حامل­های مناسب برای استفاده در فرمولاسیون و رسانش داروهای پروتئینی با صرف هزینه و زمان زیادی همراه است. بعنوان یک گزینه ایمن، کو­پلیمر پلی لاکتیک-کو-گلایکولیک اسید به دلیل زیست­سازگاری بالا یکی از پرکاربرد­ترین پلیمرهای مورد استفاده در صنایع دارویی است که می­تواند بعنوان پایدار­کننده فرمولاسیون­های پروتئینی نیز بکار رود. در این تحقیق با استفاده از روش محاسباتی شبیه­سازی دینامیک مولکولی برهمکنش این پلیمر با پروتئین p53 بعنوان کاندیدای داروی ضد سرطان مورد بررسی قرار گرفت. در ابتدا سه نوع کوپلیمر پلی لاکتیک-کو-گلایکولیک اسید با نسبت­های مختلف لاکتیک و گلایکولیک اسید 1به 1، 2به 1 و 1 به 2 بهینه­سازی و اطلاعات توپولوژی آنها بدست آمد. ساختار مولکولی پروتئین نیز از پایگاه داده RCSB تهیه شد. در نهایت شبیه­سازی دینامیک مولکولی با استفاده از نرم­افزار گرومکس در دمای 300کلوین و فشار 1بار به مدت 100 نانوثانیه انجام شد. نتایج نشان دادند هر سه نوع کوپلیمر موجود به خوبی قادر به برهمکنش با پروتئین هستند اما کمیت و کیفیت این برهمکنش­ها متفاوت است. با افزایش میزان گلایکولیک اسید در پلیمر، انعطاف پذیری و توانایی برهمکنش پلیمر با پروتئین بیشتر شده و برهمکنش پایدارتری بین دو مولکول ایجاد می شود. از طرف دیگر پایداری ساختار دوم پروتئین که ارتباط مستقیمی با پایداری ساختار پروتئین دارد در حالت استفاده از کوپلیمر با نسبت مولی مساوی از مونومرها بیشتر است. در نهایت نتایج بدست آمده در این تحقیق نشان می­دهند که پلیمر پلی لاکتیک-کو-گلایکولیک اسید با نسبت­های مساوی مونومرها می­تواند بعنوان یک گزینه مناسب بمنظور پایدارسازی فرمولاسیون­های پروتئین p53 در نظر گرفته­شود. 

واژه های کلیدی: سرطان، برهمکنش  پروتئین-پلیمر، گرومکس، نانو فرمولاسیون، دارورسانی نانو

* نویسندگان مسئول، پست الکترونیکی: amin.nowroozi@yahoo.com و Sajad.moradi@kums.ac.ir

مقدمه

سرطان یکی از بیماری­های شایع و یکی از علل اصلی مرگ و میر در جهان است. در این بیماری سلول­ها از مسیر تقسیم و رشد عادی خود منحرف شده و با تقسیم غیرطبیعی و کنترل­نشده و تکثیر و رشد بیش از اندازه، در عملکرد عادی بدن اختلال ایجاد می­کنند (5). سرطان یک بیماری ترکیبی و مختلط بوده و در ایجاد آن ژن­ها و محصولات ژنی فراوانی درگیر هستند. شاید بتوان گفت مهمترین این محصولات ژنی، پروتئین P53  است که در بیش از 50 درصد سرطان­ها ردپایی از اختلال در عملکرد آن دیده می­شود (8). پروتئین P53 یکی از مهمترین تنظیم­کننده­های چرخه تکثیر سلولی است که با ایجاد وقفه در مرحله G2 باعث توقف چرخه سلولی می­شود و با این کار برای آنزیم­های ترمیم کننده ژنوم­، فرصت کافی را فراهم می­آورد تا جهش­ها و شکستگی­های پیش­آمده در زمان همانند­سازی را ترمیم کنند (28). در صورت وجود نقایص غیر قابل ترمیم، با القای آپوپتوز در واقع موجب مرگ سلول شده و به این طریق از توارث جهش­های سرطان­زا به نسل­های بعدی سلولی جلوگیری کرده، باعث پیش­گیری از سرطان می­شود. به طور خلاصه این پروتئین  نقش حیاتی در پایداری ژنومی، سرکوب توموری همراه با القای آپوپتوز، توقف چرخه سلولی، پیری و مهار رگ­زایی دارد. باتوجه به نقش­های حیاتی در مهار و درمان سرطان، افزایش میزان این پروتئین در سلول­های سرطانی بعنوان یکی از مسیرهای مهم درمان سرطان در نظر گرفته­ می­شود. این عمل به دو صورت انتقال ژن کد­کننده p53 با استفاده از حامل­های ژنتیکی مهندسی­شده و یا رسانش مستقیم پروتئین تولید یا استخراج­شده به بافت هدف انجام پذیر است (10و21و26). در این میان، رسانش مستقیم پروتئین به دلیل عدم نیاز به ماشین­های بیان­کننده سلول­های بافت هدف و در­نتیجه سرعت بالاتر اثربخشی، نسبت به سایر روش­ها برتری دارند. تعداد زیادی از داروهای پروتئینی هم­اکنون در بخش درمان مورد استفاده قرار می­گیرند که هم در زمان حمل و نقل و هم در زمان نگهداری، امکان قرارگیری آن­ها در معرض تنش­های محیطی مانند دما وجود دارد. این تنش­ها می­توانند ساختار پروتئین را ناپایدار کرده و عملکرد درمانی آن­ را مختل کنند. این موضوع بعنوان یکی از مشکلات مهم در مسیر توسعه داروهای پروتئینی همواره مد نظر بوده و بمنظور رفع اینچنین مشکلاتی از مواد همراه مختلفی در فرمولاسیون­ها استفاده می­شود که پلیمرها از ترکیبات عمده در این خصوص هستند (11). کاربرد پلیمرها در صنایع غذایی بعنوان امولسیفایر پایدارکننده و در داروسازی بعنوان ماده همراه و یا اخیرا بعنوان حامل سیستم­های دارورسانی نانو، به فراوانی انجام می­شود (3و25و27). سیستم­های دارورسانی نانو معمولا حاوی یک پلیمر زیست­تخریب­پذیر و زیست­سازگار غیر­سمی بعنوان حامل دارو می­باشند که علاوه بر انتقال هدفمند مواد دارویی به بدن و رهاسازی آن در زمان و مکان مشخص، محافظت از دارو در برابر تخریب شیمیایی یا زیستی آن را نیز برعهده دارند (4و6و24). در سال­های اخیر کوپلیمر پلی لاکتیک-کو-گلایکولیک اسید (PLGA) از جذاب­ترین و پرکاربردترین پلیمرهای مورد استفاده در تحقیقات ساخت قطعات مهندسی بافت و سامانه­های دارورسانی بوده است. این کوپلیمر از  مونومرهای لاکتیک اسید و گلایکولیک اسید تشکیل شده­است که دارای خواص زیست­تخریب­پذیری و زیست­سازگاری است که با تنظیم مناسب نسبت دو مونومر سازنده و همچنین جرم مولکولی آن به طیف گسترده­ای از خواص فیزیکی،  مکانیکی و سرعت تخریب می­توان دست یافت و از همه مهمتر این پلیمر دارای تائیدیه از سازمان غذا و داروی آمریکا (FDA) است که تائیدی بر عدم اثرات منفی بر سلامت انسان است  (7و17و22). شماتیک ساختار مولکولی این کوپلیمر در زیر نشان داده شده است.

بهینه­سازی یک سیستم دارورسانی کارا، در اغلب اوقات با مشکلات، صرف وقت و هزینه­های بسیار زیادی همراه است که همین امر استفاده از روش­هایی که بتوانند بعنوان جایگزین روش­های تجربی، و به­طور محاسباتی قادر به پیش بینی حالت بهینه سیستم باشند را در اولویت تحقیقات تعداد زیادی از گروه­های تحقیقاتی در دنیا قرار داده­است. دانشمندان به دلایل مختلفی از مدل­های مولکولی استفاده می­کنند.

ساختار مولکولی پلی لاکتیک-کو-گلایکولیک اسید

بیشتر این دلایل ریشه مشترکی دارند: روش­های مدل­سازی به تجسم مولکول­ها و رفتار آنها کمک می­کنند. همچنین این روش­ها  به بررسی ساختارهای مولکول بدون نیاز به ابزارهای پیشرفته و بررسی تغییرات ساختار بدون نیاز به فرایند شیمیایی کمک می­کنند (1و2). این روش­ها ارزان، سریع و ساده هستند و در فهم مکانیسم­های مولکولی برهمکنش­ها نقش بسیار مهمی را ایفا می­کنند (19). مطالعات زیادی وجود دارند که مطابقت بالای نتایج بدست آمده از روش­های تجربی و محاسباتی را نشان می­دهند (16و23). با توجه به اینکه استفاده از پروتئین p53 خالص شده بعنوان یک گزینه مناسب در درمان سرطان مطرح بوده و از طرف دیگر تهیه یک فرمولاسیون کارا برای رسانش این پروتئین به بافت­های درگیر یکی از موانع اصلی در این مسیر است در این تحقیق سعی بر آن است تا با استفاده از روش­های محاسباتی، برهمکنش انواع مختلف کوپلیمر PLGA را با پروتئین p53  مورد بررسی قرار داده و در نهایت مناسب­ترین نوع پلیمر برای استفاده در فرمولاسیون دارویی این پروتئین معرفی شود. 

مواد و روشها

تمامی شبیه­سازی­های رایانه­ای با استفاده از نرم افزار گرومکس (GROMACS) ورژن 5 انجام شد (29). در ابتدا ساختار دو بعدی مربوط به پلیمرها با استفاده از نرم افزار ACD/LAB ترسیم و سپس ساختار سه بعدی و کمینه­سازی انرژی در نرم افزار آووگادرو انجام شد (12و20). فایل­های توپولوژی­های مربوط به مولکول­ها از سرور PRODRG (http://davapc1.bioch.dundee.ac.uk/prodrg) بدست آمد و سپس بمنظور همسان­سازی و بالا بردن دقت محاسبات، اطلاعات مربوط به بار اتم­های سیستم  بصورت دستی و طبق اطلاعات مربوط به میدان­نیروی gromos53a6 اصلاح گردید. اطلاعات ساختار کریستال شده پروتئین P53 نیز از پایگاه داده­های پروتئینیRCSB (http://www.rcsb.org)  با فرمت PDB و کد 4MZI بدست­ آمد و  پارامترهای توپولوژیک آن با استفاده از نرم افزار گرومکس تهیه شد. پلیمرهای با نسبت­های مختلف مونومرهای لاکتیک و گلایکولیک اسید بترتیب، نسبت 1:1 با PLGA، نسبت 2:1 گلایکولیک اسید به لاکتیک اسید PLLGA، و نسبت 2:1 گلایکولیک اسید به لاکتیک اسید بنام PLGGA  نامیده می­شوند. تعداد پلیمر در کلیه جعبه­های شبیه­سازی ثابت و با ابعاد 7 نانومتر مکعب قرار داده شد. پس از یک کمینه­سازی اولیه در خلا بمنظور رفع برخوردهای نزدیک، سیستم با استفاده از مدل آب SPC/E آبدهی شد. با توجه به بار نهایی سیستم تعداد مشخصی از یون­های سدیم اضافه شد تا بار سیستم کاملا خنثی شود. کمینه­سازی انرژی با استفاده از الگوریتم steep و تا رساندن سیستم­ها به حداکثر نیروی کمتر از 10 کیلوژول بر مول بر نانومتر انجام شد. با استفاده از هنگردهای NVT و  NPT بترتیب دما و فشار سیستم در 300 کلوین و 1 بار تنظیم و نگهداری شد. در این قسمت الگوریتم ترموستاتی V-rescale و برای ثابت کردن فشار از باروستات پارینلو-رحمان استفاده شد. کلیه پارامترهای پیوندی با استفاده از روش LINCS حول محور تعادلی خود نگه داشته شدند (14). محاسبه برهمکنش­های واندروالسی با تابع لنارد جونز و برهمکنش­های الکترواستاتیک با روش جمع اوالد و هردو تا شعاع 1 نانومتر انجام شد. سپس تمامی سیستم­ها به مدت 100 نانوثانیه و تحت الگوریتم نیم گام جهشی leap frog شبیه­سازی شدند . (9و19و30) انرژی برهمکنش­ها با استفاده از mmpbsa محاسبه و تمام شکل­ها با استفاده از نرم افزار Visual Molecular Dynamic  (VMD) تهیه شدند (13) .

نتایج و بحث

بمنظور بررسی برهمکنش و مقایسه اثرات کوپلیمر PLGA با نسبت­های مختلف لاکتیک و گلایکولیک اسید بر ساختار و دینامیک پروتئین P53 از روش شبیه­سازی دینامیک مولکولی استفاده شد. ساختار نهایی پروتئین در برهمکنش با پلیمرها در شکل 1 نشان داده شده است. همچنان­که مشاهده می­شود هر سه پلیمر توانسته­اند به سطح پروتئین متصل شوند اما پلیمر حاوی گلایکولیک اسید بیشتر، ظاهرا به علت انعطاف پذیری و داشتن گروه­های عاملی کربونیل بیشتر که قادر به ایجاد پیوند هیدروژنی هستند جای­گیری فشرده­تری بر روی پروتئین ایجاد کرده­است. در ادامه بمنظور بررسی دینامیک این برهمکنش و مطالعه تغییرات ساختاری پروتئین آنالیزهای تکمیلی انجام شد.

بعنوان اولین و پایه­ترین ابزار برای آنالیز شبیه­سازی سیستم­های پروتئینی از بررسی تغییرات میانگین مربعات جابجایی اتم­های سیستم Root Mean Squared Deviation (RMSD) استفاده می­شود. نتایج تحلیل RMSD برای بررسی تعادل یا عدم تعادل سیستم و نیز تعین مناسب بودن زمان شبیه­سازی مورد بررسی قرار گرفت (شکل 2) (27). در مورد پروتئین آزاد پس از جهش اولیه در میزان RMSD یک کاهش مشاهده و نهایتا از زمان 50 نانوثانیه تا انتهای شبیه­سازی مقدار ثابتی را نشان داده است.

شکل 1- کانفورماسیون نهایی برهمکنش پروتئین و پلیمرها (الف): پروتئین و پلیمر حاوی گلایکولیک اسید بیشتر، (ب): پروتئین و پلیمر با نسبت مساوی مونومرها، (ج): پروتئین و پلیمر با نسبت بیشتر لاکتیک اسید.

این نتیجه نشان می­دهد ساختار دینامیکی پروتئین در این زمان به تعادل رسیده و تاییدی بر مناسب بودن زمان انتخاب­شده برای شبیه­سازی این پروتئین می باشد. در همه سیستم­های حاوی پلیمر، پروتئین هم در مقدار میانگین RMSD  و هم در میزان نوسانات آن کاهش قابل­توجهی را نشان داد که دلالت بر اثرات مثبت پایدار­کنندگی همه پلیمرها بر ساختار پروتئین دارد. با افزایش میزان گلایکولیک اسید، مقدار میانگین کاهش داشته اما تغییرات آن با مقداری نوسان همراه است. وجود نوسانات در مقدار RMSD همچنین در حالتی که کوپلیمر با نسبت بیشتر لاکتیک اسید در سیستم وجود دارد نیز دیده می­شود. کمترین نوسان همراه با مقدار میانگین کمتر RMSD نسبت به پروتئین ازاد در سیستم با نسبت مساوی مونومرها دیده می­شود که نشان­دهنده اثرات بهتر این کوپلیمر در پایداری ساختاری پروتئین می­باشد.

شکل 2- تغییرات میانگین جابجایی اتم­ها در طول زمان برای سیستم­های مختلف پروتئین-پلیمر

نتایج تحلیل RMSF نوسانات هر بخش از سیستم را نسبت به میانگین نوسانات کل محاسبه می­کند. در حالتی که سیستم شامل پروتئین آزاد است نوسانات بیشتر از حالت متصل به پلیمر است. در حالت­هایی که پلیمر به سیستم اضافه شده نوسانات باقیمانده­های پروتئین نسبت به سیستم پروتئین آزاد کمتر شده که این به این دلیل است که برهمکنش­های الکتروستاتیکی افزایش می­یابد و سبب افزایش صلبیت  پروتئین می­شوند. از طرف دیگر بسته به میزان هر مونومر، نوسانات متفاوت است و بترتیب در میان سیستم­های شامل پلیمر، سیستم­های حاوی گلایکولیک اسید و لاکتیک اسید بیشتر، کمترین و بیشترین نوسانات را دارند زیرا توانایی برقراری برهمکنش­های الکترواستاتیکی و هیدروژنی در گلایکولیک اسید به دلیل گروه­های کربونیلی بیشتر از لاکتیک اسید است. در مورد سیستم پروتئین آزاد به دلیل تحرک بیشتر، میزان نوسانات بیشتر از سایر سیستم­ها است. نتایج این تحلیل در شکل 3 نشان داده شده­اند.

سنجش میزان فشردگی یا باز­شدگی ساختار پروتئین در طول زمان شبیه­سازی با آنالیز شعاع­ دوران انجام می­شود. تغییرات شعاع دوران مولکول p53 در طول زمان شبیه­سازی در شکل 4 نشان داده شده­است.  

شکل 3- تغییرات نوسانات اتم­های پروتئین در برهمکنش با پلیمر

در مورد پروتئین آزاد میانگین میزان شعاع دوران تقریبا ثابت مانده و فقط مقداری بی­ثباتی در آن دیده می­شود. در سیستم­های حاوی پروتئین و پلیمرهای با نسبت­ بیشتر یکی از مونومرها مقداری فشردگی در ساختار پروتئین ایجاد شده و شعاع دوران مولکول کاهش یافته­است. طبق این نتایج با افزایش مونومرهای گلایکولیک اسید شعاع دوران پروتئین نسبت به مقدار اولیه کاهش بیشتری را نشان می­دهد. در مورد پروتئین در حالت اتصال با پلیمر با نسبت­ مساوی مونومرها همانند پروتئین آزاد شعاع دوران ثابت مانده و همزمان میزان نوسانات در مقادیر آن ثابت مانده است. در موافقت با آنالیز RMSD این نتایج نشان­دهنده اثر بهتر این نوع پلیمر نسبت به دو نوع دیگر می­باشد.

تعداد برخوردهای پروتئین با پلیمر می­تواند بعنوان معیاری برای نزدیک شدن و ایجاد برهمکنش بین پروتئین و پلیمر در نظر گرفته شود. طبق نتایج بدست­آمده که در شکل 5 نشان داده شده است تعداد برخورد­ها در مورد سیستم­های کوپلیمرهای با نسبت­های مساوی مونومرها و نسبت گلایکولیک اسید بیشتر تفاوت چندانی با هم ندارند و هردو تقریبا دو برابر تعداد برخوردهای سیستم با کوپلیمر حاوی لاکتیک اسید بیشتر هستند. بنابراین طبق نتایج حاصل از این تحلیل می­توان گفت با کاهش نسبت گلایکولیک اسید در پلیمر، تمایل پلیمر به پروتئین کمتر شده و نزدیکی و برهمکنش­های آنها نیز کاهش می­یابد.

عملکرد خاص هر پروتئین ناشی از ساختار منحصر به فرد دوم و سوم آن است و هرگونه کاهش، تغییر و یا جابجایی در میزان و محل این ساختارها می­تواند موجب تغییر رفتار پروتئین شود. بمنظور بررسی جزییات این تغییرات ساختاری از تحلیل DSSP استفاده شد.

شکل 4- تغییرات شعاع دوران پروتئین در سیستم­های مختلف و در طول زمان شبیه سازی

شکل 5- نمودار مربوط به تغییرات زمانی تعداد برخوردهای پلیمرها با پروتئین در سیستم­های مختلف

نتایج به دست آمده نشان می­دهند در طول شبیه­سازی، در سیستم شامل پروتئین آزاد، تعداد اسیدهای امینه شرکت کننده در مجموعه ساختارهای دوم تغییر محسوسی ایجاد نکرده­اند اما در برخی نواحی جابجایی­هایی میان ساختارها مشاهده شده است (شکل6). نوسانات در این مقادیر برای پروتئین در برهمکنش با پلیمر با نسبت مساوی مونومرها بسیار کمتر و نمودار آن در زمان تعادل صاف­تر از حالات دیگر حتی پروتئین آزاد است. با توجه به نقش ساختارهای دوم در حفظ عملکرد پروتئین، نتایج این آنالیز می­تواند پیش­بینی­کننده تاثیر بهتر این نوع پلیمر در حفظ عملکرد p53 باشد. 

شکل 6- تعداد اسیدهای آمینه موجود در مجموع ساختارهای دوم در طول زمان

 از نظر جابجایی­های ساختاری نیز همچنان­که مشاهده می­شود مارپیچ آلفای ناحیه باقیمانده­های 82 تا 88 در پروتئین آزاد به پیچه تصادفی تبدیل شده است (شکل7). در سایر قسمت­ها نیز ناپایداری­هایی در ساختارهای مختلف دیده می­شود. از این نظر تنها پروتئینی که مارپیچ آلفای ذکر­شده در آن تا پایان زمان شبیه­سازی حفظ شده است سیستم با مقدار مساوی مونومرها است. در این سیستم همچنین سایر ساختارها در قسمت­های دیگر نیز بیشتر از دیگر سیستم­ها حفظ شده و پایداری نسبتا کاملی در ساختارهای دوم پروتئین دیده می­شود. در موافقت با نتایج بدست­آمده از سایر آنالیزها، بررسی ساختارهای دوم پروتئین نیز نشان­دهنده اثرات بهتر پلیمر با نسبت مساوی مونومرها بر پایداری ساختار p53 است.

محاسبه انرژی برهمکنش پروتئین با پلیمر و همچنین نوع انرژی­ها با استفاده از روش mmpbsa انجام و نتایج آن در جدول 1 آورده شده است.

 جدول 1- انرژی­های برهمکنش پلیمرهای مختلف با پروتئین

شکل 7- تغییرات و جابجایی­های ساختاری اسیدهای آمینه در طول زمان برای سیستم­های مختلف

 می­توان دید که با افزایش مقدار گلایکولیک اسید به دلیل افزایش برهمکنش­های الکتروستاتیکی و کاهش برهمکنش­های واندروالسی، اتصالات قوی­تری تشکیل شده­است. با افزایش لاکتیک اسید و کاهش گلایکولیک اسید در سیستم، با افزایش سهم  واندروالسی و همچنین کاهش مقدار برهمکنش­های الکتروستاتیکی، مقدار انرژی کل برهمکنش کاهش و در نتیجه پایداری کمپلکس نیز کمتر شده است. همچنان­که مورد انتظار است میزان انرژی برهمکنش بین پروتئین و پلیمر با نسبت­های مساوی مونومر اعدادی بین دو پلیمر دیگر است.

بسته به ساختار 3بعدی هر پروتئین، مجموعه­ای از حرکات توسط قسمت­های مختلف آن انجام می­شود که می­توان الگوی اصلی این حرکات را با استفاده از تحلیل مولفه اصلی (PCA)  principal component analysis مورد ارزیابی قرار داد. هر حرکت با یک ویژه­بردار مشخص می­شود و هر ویژه­بردار دارای یک ­ویژه­مقدار است که دامنه حرکت را نشان می­دهد. نتایج تحلیل 2 بعدی PCA برای پروتئین p53 در حالت آزاد و در ترکیب با پلیمرها در شکل 8 نشان داده شده­است. در مقایسه با الگوی بدست آمده برای پروتئین آزاد، شبیه­ترین الگو مربوط به پروتئین در حالت برهمکنش با پلیمر حاوی نسبت­های مساوی مونومرها می­باشد که نشان­دهنده حداقل تغییرات الگوی حرکتی در این سیستم می­باشد. با توجه به اینکه حرکات اصلی پروتئین یکی از فاکتورهای مهم در عملکرد آن می باشند، این همسانی در الگوی حرکتی می­تواند نشانه­ای از عدم تاثیرات منفی این نوع پلیمر بر عملکرد p53 بر اثر برهمکنش با پلیمر باشد. علاوه­بر­این همچنان­که در شکل دیده می­شود دامنه مقادیر بر روی PC1 برای پروتئین پس از برهمکنش با پلیمرهای با نسبت بیشتر هریک از مونومرها کاهش یافته که  این می­تواند به معنی کاهش در انعطاف پذیری پروتئین به دلیل اتصال پلیمرها باشد. بیشترین کاهش در حالت اتصال به پلیمر حاوی مقادیر بیشتر گلایکولیک اسید دیده می­شود که این موضوع می­تواند به برهمکنش قویتر این پلیمر با پروتئین ارتباط داشته باشد.

خواص دینامیکی پلیمرها نیز در طول زمان شبیه­سازی با همدیگر مورد مقایسه قرار­گرفت. این تحلیل با اندازه­گیری تغییرات فاصله دو اتم انتهایی برای هر پلیمر انجام و نتایج در شکل 9 آورده شده­است.

شکل 8- نمایش 2بعدی ترکیبات اصلی حرکتی پروتئین در حالات مختلف بدون پلیمر و در حضور پلیمرهای مختلف

شکل 9- تغییرات در فاصله اتم­های انتهایی پلیمرهای مختلف در طول زمان شبیه سازی

نتایج نشان­می­دهند که با افزایش میزان لاکتیک اسید از انعطاف­پذیری پلیمر کاسته شده­است. از طرف دیگر با افزایش مقدار گلایکولیک اسید انعطاف­پذیری پلیمر افزایش یافته و فاصله دو انتهای آن به همدیگر نزدیکتر شده است. این تفاوت­های دینامیکی می­تواند منجر به تغییر توانایی پلیمر برای پیچ­و­تاب خوردن در اطراف پروتئین شده و احتمال می­رود یکی از عوامل متفاوت­بودن انرژی­های اتصال انواع مختلف پلیمر با پروتئین باشد. همچنان­که دیده شد انرژی برهمکنش پلیمرهای مختلف و پروتئین ارتباط مستقیمی با افزایش مقادیر گلایکولیک اسید در سیستم دارد.

با توجه به اینکه p53 یک پروتئین متصل شونده به DNA بوده و از طرف دیگر از نظر پتانسیل الکتریکی، بار مولکول PLGA نیز مانند DNA منفی است، پیش­بینی می­شود این پلیمر از این نظر که احتمالا قادر باشد تا به محل­های اتصالی پروتئین به DNA متصل شود بتواند آن­را در برابر ناپایداری حرارتی یا سایر شرایط نامطلوب محیطی حفظ کند. به این منظور ابتدا با استفاده از روش APBS تعبیه­شده در نرم افزار MGLtools پتانسیل الکتریکی پروتئین محاسبه شد (شکل10). همچنان­که در شکل دیده می­شود بار سطحی پروتئین در منطقه اتصالی به DNA کاملا مثبت بوده و همین امر موجب اتصال سریع­تر پلیمرهای با بار منفی به آن می­شود. از طرف دیگر با افزایش مقدار گلایکولیک اسید در ساختار کوپلیمر، تمایل و قدرت اتصال آن به پروتئین بیشتر می­شود. این نتایج در موافقت با انرژی­های برهمکنش بدست­آمده با روش MMPBSA است که انرژی اتصالی بیشتری از نوع الکترواستاتیک را با افزایش گلایکولیک اسید نشان می­دهد.   

شکل 10- نمایش پتانسیل الکترواستاتیک سطحی پروتئین ( رنگ آبی بار مثبت و رنگ قرمر بار منفی)