نوع مقاله : مقاله پژوهشی
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله English
نویسندگان English
The enzyme L-asparaginase is widely used as complementary chemotherapy and an enzymatic drug to treat many diseases. However, as a medication, L-asparaginase also faces difficulties because of the inherent nature of proteins. As a result, various natural and synthetic polymers are used to create biodegradable nanospheres and microspheres for drug delivery and release. In this study, the effect of poly (lactic acid) (PLA) on the structure and dynamics of L-asparaginase was studied using molecular dynamics (MD) simulations. The results showed that the secondary and tertiary structures of the protein in the presence of the polymer did not change during the simulation time and even increased the stability of the structure and decreased the protein dynamics. This study showed that lysine and arginine actively interact with the PLA polymers. Several hydrophobic and polar amino acids interact with the polymer and the enzyme. The results showed that the main binding forces of PLA polymer to L-asparaginase are electrostatic and van der Waals interactions. The findings of this study can provide useful information to clarify some of the ambiguities in the experimental results for the encapsulation of the enzyme L-asparaginase and its use in the pharmaceutical industry.
کلیدواژهها English
مطالعه ساختار و دینامیک ال-آسپارژیناز در حضور پلیمر پلی (لاکتیک اسید) به کمک شبیه سازی دینامیک مولکولی
سما الزوینی، فرامرز مهرنژاد*، یاسمن محمودی، علی حسین رضایان و محمد برشان تشنیزی**
ایران، تهران، دانشگاه تهران، دانشکده علوم و فنون نوین، گروه مهندسی علوم زیستی
تاریخ دریافت: 24/11/1400 تاریخ پذیرش: 11/03/1401
چکیده
آنزیم ال-آسپارژیناز به عنوان مکمل شیمی درمانی و یک داروی آنزیمی به طور گسترده در درمان بسیاری از بیماریها کاربرد دارد. با این حال استفاده از ال-آسپارژیناز، به عنوان یک دارو، به دلیل ماهیت ذاتی پروتئینها با مشکلاتی همراه است. در نتیجه، از پلیمرهای طبیعی و مصنوعی مختلف برای ایجاد نانو و میکروسفرهای زیست تخریبپذیر به منظور رسانش و رهایش آن استفاده میشود. دراین تحقیق، اثر پلیمر پلی (اسید لاکتیک) (PLA) بر ساختار و دینامیک ال-آسپارژیناز با استفاده از شبیهسازی دینامیک مولکولی مطالعه و بررسی شد. نتایج نشان داد که ساختار دوم و سوم پروتئین در حضور پلیمر در طول مسیر شبیهسازی تغییر نداشته است و حتی باعث افزایش پایداری ساختار و کاهش دینامیک پروتئین شده است. این تحقیق نشان داد که اسیدهای آمینه لیزین و آرژنین بیشترین سهم برهم کنشها را با پلیمر PLAدارند و همچنین تعدادی از اسیدهای آمینه آبگریز و قطبی در برهمکنش بین پلیمر و آنزیم شرکت کردند. نتایج نشان داد که نیروهای اصلی اتصال پلیمر PLA به آنزیم ال-آسپارژیناز از نوع الکترواستاتیک و واندروالسی میباشد. یافتههای این تحقیق میتواند اطلاعات مفیدی برای روشن شدن برخی از ابهامات موجود در نتایج تجربی برای کپسوله شدن آنزیم ال-آسپارژیناز و استفاده در صنعت دارورسانی را فراهم کند.
واژه های کلیدی: ال-آسپارژیناز؛کپسوله سازی؛ پلی(اسید لاکتیک)؛ شبیه سازی دینامیک مولکولی؛ خوبازیابی
* نویسندگان مسئول، پست الکترونیکی: mehrnejad@ut.ac.ir ، ** پست الکترونیکی: mbarshan@ut.ac.ir
مقدمه
داروهای پروتئینی یک گزینه حیاتی برای کمک به بیمارانی هستند که بیشترین نیاز را به پیشرفتهترین درمانها دارند. در حالحاضر پروتئینهای نوترکیب تأیید شده برای درمان طیف وسیعی از علائم بالینی، از جمله سرطان، قرار گرفتن در معرض عوامل عفونی، خودایمنی، عفونت، و اختلالات ژنتیکی توسعه یافتهاند (35). علاوه بر این، پیشرفتها در مهندسی پروتئین به داروسازان این امکان را داده است تا با حفظ یکپارچگی محصول و افزایش کارآیی، خواص عملکردی مشخص پروتئینهای ضروری را تنظیم و از آنها بهرهبرداری کنند (38). توسعه سیستمهای دارورسانی پروتئینی به دلیل ساختار مولکولی پیچیده پروتئینها همچنان یک چالش بزرگ برای محققان است (6 و 7). پروتئینها به دلیل وزن مولکولی بالا و آب دوستی، مستعد تخریب پروتئولیتیک هستند و جذب ضعیفی دارند. در حال حاضر، در مواردی که حاملهای کلوئیدی با عبور از موانع سلولی دسترسی بالاتری را فراهم میکنند، از نانوذرات پلیمری به عنوان حامل دارورسانی پروتئینها استفاده میشود (1 و 5). نانوذرات برای رسانش و رهایش پروتئینهای درمانی مفید هستند به طوری که از تخریب شدن محافظت کرده و رهاسازی آنها را طولانیتر میکند، بنابراین تثبیت داروهای پروتئینی، حفظ فعالیت زیستی و اجتناب از به وجود آمدن محصولات در حال تجزیه سمی برای درمان موفقیت آمیز، ضروری است (7 و 45)
آنزیم ال-آسپارژیناز (ASNase)از سال 1994 که ال-آسپارژیناز II (EcAII) باکتری اشرشیاکلی تایید شد، مورد استفاده قرار گرفته است. اولین فناوری دارویی در نانوپزشکی مربوط به این آنزیم، پگیلاسیون آن در سال 2006 بود (1 و 3 و9). ال-آسپاراژیناز II تولید شده توسط اشریشیا کلی یک هوموتترامر با وزن مولکولی حدود 142 کیلو دالتون است (10). که به عنوان مکمل شیمی درمانی و یک داروی آنزیمی برای درمان بیماریهایی مانند لوسمی لنفوبلاستیک حاد (Acute lymphocytic leukemia (ALL))، رتیکولوسارکوم، لوسمی لنفوسیتی مزمن، لوسمی حاد میلوژن، ملانوسارکوم، لوسمی میلومونوسیتی حاد و لنفوسارکوم استفاده میشود (23 ، 33 ، 36و 39). ال-آسپارژیناز 40 درصد از سهم کل آنزیمهای سفارش داده شده در سراسر جهان را به خود اختصاص داده است. همچنین یک سوم نیاز جهانی را به عنوان ترکیب ضد سرطان خون و لنفوم را تشکیل میدهد که آن را به یکی از مهمترین داروهای ضد سرطان برای ALL تبدیل میکند (11 و 42).
ال-آسپاراژیناز، هیدرولیز ال-آسپاراژین را به ال-آسپارتات و آمونیاک تحریک میکند (32 و 34) و جزء سرم خوکچه هندی است که ال-آسپاراژین را در سرم تخلیه و علاوه بر جلوگیری از گسترش لنفوم، برخی از سلولهای سرطانی را حذف میکند (16). نتایج این فرآیند، مهار سریع سنتز پروتئین ، DNA و RNA است (12، 28 و30). به مدت 60 سال، این نتیجه در توسعه پروتکلهای بالینی برای درمان ALL مورد استفاده قرار گرفته است که شامل تزریق ال-آسپارژیناز در حین تجویز سایر عوامل ضد سرطان است و منجر به نرخ بقای کودکان بیش از 90 درصد در ایالات متحده شده است (40). آسپارژیناز یکی از موثرترین ترکیبات با برخی عوارض جانبی است (10). با این حال، عوارض جانبی آن که شامل حساسیت مفرط، اختلال در عملکرد کبد، ناهنجاری های انعقادی، عدم تعادل عصبی و پانکراتیت است از کاربرد بالینی آنها جلوگیری میکند (25). علاوه بر این، نیمه عمر کوتاه عامل محدود کننده اصلی در استفاده بالینی از آن است که نیاز به تزریقهای متعدد دارد. علاوه بر حساسیت بیش از حد، که از واکنشهای آلرژیک خفیف تا آنافیلاکسی متغیر است، ایمنسازی آنزیمی نیز مشاهده شده است. نیمه عمر ال-آسپارژیناز در گردش خون به دلیل تشکیل آنتیبادیهای خنثی کننده به5/2 ساعت کاهش مییابد. برای درمان این مشکل، محققان پلی اتیلن گلایکول را به صورت کووالانسی به ال-آسپارژیناز متصل کردند، که در نتیجه آن نیمه عمر به 15 روز افزایش و ایمنیزایی کاهش یافت (45). برای افزایش نیمه عمر و تثبیت آنزیم، آسپاراژیناز به لیپوزومها (13 و 15) و نانوساختارهای پلیلاکتیک کو گلایکولیک اسید (Poly (D, L-lactide-co-glycolide)(PLGA)) وارد شد (26). به دلیل خاصیت زیست تخریبپذیری و زیستسازگاری، این کوپلیمرها توسط سازمان غذا و دارو برای استفاده در انسان تایید شده اند (2).PLGA قادر به تشکیل نانوذراتی است که به طور گسترده برای کپسوله کردن دارو، داربستهای جراحی و سایر کاربردها استفاده میشود (14). همانطور که توسط گاسپارد و همکارانش گزارش شده است، نانوذرات ساخته شده از PLGA و بارگیری شده با آسپاراژیناز با گروه های انتهایی کربوکسیل آزاد، که به آن PLGA نوعH نیز گفته میشود، بار پروتئین بالایی داشتند و دارو را به مدت 20 روز به طور مداوم رهاسازی کردند. این در حالی است که با استری شدن گروههای انتهایی کربوکسیلات از PLGA، بارگیری پروتئین کمتر بود و آنزیم فعالی رسانش نشد. در طی یک دوره 20 ساله، برخی از مطالعات نانوکپسولاسیون ال-آسپارژیناز با پلیمرزومها (3) و لیپوزومها (15) گزارش کردهاند، اما این موارد دارای محدودیتهایی هستند. عیب اصلی پلیمرزومها که وزیکولهای جامد هستند، پیچیدگی خودآرایی آنها است که ممکن است منجر به کاهش تولید کپسولهای ماکرومولکول شود (43). از سمت دیگر لیپوزومها دچار ناپایداری شیمیایی وزیکولهای لیپیدی است. کپسولهسازی در نانوذرات میتواند راهبردی برای کاهش حذف این آنزیم با محبوس کردن آن در یک ماتریکس پلیمری باشد (26 و 44).
گروههای شیمایی استر، عمدتاً میتوانند در طبیعت تجزیه شوند. از این رو برخی از پلیمرهای مصنوعی حاوی پیوندهای استری، قابلیت تجزیه در طبیعت را دارند. پلیاسترهایی مانند پلیلاکتیک اسید (PLA)، پلیگلیکولیک اسید (PGA) و کوپلیمرهای پلیلاکتیک گلیکولیک اسید (PLGA) زیستتخریبپذیر بوده و کاربردهای پزشکی فراوانی دارند. PLA و PLGA توسط سازمان غذا و داروی ایالات متحده (FDA) در دهه 1970 به عنوان موادی برای ساخت بخیههای جراحی با قابلیت جذب زیستی تایید شدند (1 و5). پلیلاکتیک اسید (Poly (lactic acid)(PLA)) یکی از معروفترین پلیمرهای زیستی است که کاربرد زیادی در پزشکی دارد از جمله ویژگیهای بارز آن زیستتخریبپذیری، استحکام بالا و زیستسازگاری است. این پلیمر برای رسانش و رهایش مولکولهای دارویی کوچک تا پروتئینها استفاده میشود (5). پلیلاکتیک اسید یا پلیلاکتاید نوعی پلیاسترآلفاتیک ترموپلاستیک قابل تجزیه زیستی است که در اثر پلیمریزاسیون اسید لاکتیک تشکیل میشود. درواقع PLA یک پلیاستر است، یعنی دارای واحدهای استر تکرارشونده است. این پلیمر در یک فرایند دومرحلهای تولید میشود، که ابتدا حلقه لاکتیک پلیمریزاسیون شده باز میشود و سپس این چرخه لاکتیک اسید تکرار میشود (8، 19 ، 20 و 27).
برخی محدودیتها برای ارزیابی خواص پروتئینها توسط روشهای تجربی وجود دارد. این محدودیتها شامل هزینه بالا، راندمان کم، زمان بر بودن و بدون نتیجه ماندن است. روشهای محاسباتی اغلب برای غلبه بر تعدادی از این محدودیتها موثر هستند. شبیه سازی دینامیک مولکولی از جمله روش محاسباتی است که به طور گسترده مورد استفاده قرار میگیرد که برای بررسی سیستمهای تعادل و تعاملات دینامیکی پروتئینها به کار میرود (4). استفاده از شبیهسازی دینامیک مولکولی توصیف سیستمهای زیستی را با جزئیات بسیار بیشتر و در مقیاس کوچکتر در سطح اتمها و همچنین برهمکنشهای بین آنها را ممکن میسازد (41).
در حال حاضر، محققان روشهای مختلفی را برای توسعه کپسوله کردن و افزایش پایداری آنزیم ال-آسپارژیناز در داخل پلیمرهای مختلف استفاده کردند و تاثیر این پلیمرها بر ساختار، عملکرد و پایداری پروتئین را در سطح ماکروسکوپی مطالعه کردهاند با این حال یک سوال اصلی وجود دارد که پلیمرها چه اثری بر ساختار و دینامیک پروتئین میگذارند؟ بنابراین دراین تحقیق برای پاسخ به این سوال ، جزئیات اتمی و مولکولی برهمکنش بین پلیمرPLA و آنزیم ال-آسپارژیناز به کمک شبیهسازی دینامیک مولکولی بررسی شد و همچنین اثر این پلیمر برای روی ساختار و دینامیک پروتئین مطالعه شد. هدف این مطالعه درک مکانیسم مولکولی برهم کنش بین پروتئین ال-آسپارژیناز با سیستمهای پلیمری و چگونگی تجمع پلیمر در اطراف پروتئین است و همچنین تلاش می شود نحوه برهمکنش و نیروهای موثر در این برهمکنش معرفی گردند. در این تحقیق با استفاده از شبیهسازی دینامیک سعی شد تا رفتار پروتئین در مواجه با رشتههای پلیمری با جزئیات اتمی بررسی شود. ما امیدوار هستیم که نتایج این مطالعه بتواند اطلاعانت مفیدی برای روشن شدن برخی از ابهامات موجود در نتایج تجربی برای کپسوله شدن آنزیم ال-آسپارژیناز و استفاده در صنعت دارورسانی فراهم کند.
مواد و روشها
شبیه سازی دینامیک مولکولی: مختصات ال-آسپارژیناز از پایگاه داده پروتئین (PDB ID: 6uog) مشتق شده است(16). پارامترهای پلیمری از سرور Automated Topology Builder (ATB) گرفته شده است (29). به منظور تهیه سیستمهای پروتئین-پلیمر بر اساس اندازه جعبه و وزن مولکولی پلیمر مورد نظر برای غلظتهای خاص، تعداد معینی از مولکولهای پلیمری به صورت تصادفی در جعبه شبیه سازی در کنار پروتئین ریخته شد. به عنوان یک حلال، مولکولهای آب با بار نقطه ای ساده (SPC) مورد استفاده قرار میگیرند (46). سپس یونها برای خنثی کردن آنها به سیستمها عرضه شد. برای به حداقل رساندن انرژی، از شیب دارترین الگوریتم نزولی استفاده شد. سیستمها در حالتهای گروه NVT و NPT متعادل شدند. روش های V-rescale (18) و Parrinello-Rahman به ترتیب برای ثابت نگه داشتن دما و فشار سیستم استفاده شد (31) پس از اتمام دو مرحله تعادل، یک شبیه سازی به مدت 500 نانوثانیهای انجام شد. برای اجرای شبیه سازی دینامیک مولکولی از نرم افزار GROMACS (21) و میدان نیروی GROMOS96 54a7 استفاده شد. با استفاده از الگوریتم LINCS، طول پیوند محدود شد (22). برهمکنشهای الکترواستاتیکی در برد کوتاه تا فاصله 0/1 نانومتر محاسبه شد. برای محاسبه برهمکنشهای الکترواستاتیکی دوربرد از تکنیک (Particle Mesh Ewald (PME)) استفاده شد (37).
محاسبه انرژی در سیستم شبیهسازی: برای محابسه انرژی آزاد از ابزار g_mmpbsa استفاده شد، که در واقع از روش (Molecular Mechanic Poisson-Boltzmann Surface Area (MMPBSA)) برای محاسبه انرژی استفاده میکند (17). در این روش متوسط انرژی آزاد سیستم با محاسبه و میانگینگیری انژی آزاد سیستم از تعداد خاصی از تصاویر لحظهای (Snapshots) حاصل از فایل خروجی شبیهسازی بدست میآید. به طور کلی انرژی اتصال بین ملکولها در این روش با استفاده از معادلهی زیر بدست میآید:
معادله 1 ) معادله ΔG اتصال اول
که Gprotein نشان دهنده انرژی آزاد پروتئین مورد نظر و Gligand نشاندهندهی انرژی آزاد مربوط به لیگاند پروتئین میباشد. برای محاسبه انرژی اتصال کل، انرژی اتصال قطبی، و انرژی اتصال غیرقطبی از معادلات زیر استفاده شد:
معادله 3) معادله ΔG اتصال قطبی
معادله 4) معادله ΔG اتصال غیرقطبی
ΔGpolar binding بیانگر انرژی آزاد اتصال قطبی، ΔGnon-polar binding انرژی آزاد اتصال غیرقطبی، ΔGelectrostatic انرژی آزاد الکتروستاتیک، ΔGpolars انرژی آزاد قطبی حلال، ΔGnon-polars انرژی آزاد غیر قطبی حلال و ΔGvdW انرژی آزاد واندروالسی میباشند.
نتایج و بحث
میزان تغییرات ساختاری و پایداری پروتئین: در ابتدا دینامیک، ساختار و پایداری پروتئین L-آسپاراژیناز در حضور زنجیره های PLA مورد آنالیز قرار گرفت. در شکل 1 آنالیز جذر میانگین مربع انحرافات (Root Mean Square Deviation (RMSD)) نسبت به ساختار اولیه در آب خالص و درحضور پلیمرPLA در طول زمان شبیهسازی نشان داده شده است. به طور کلی،RMSD میزان انحراف موقعیت مکانی اتمها نسبت به موقعیت اولیه در هر نقطه از زمان را نشان میدهد هر چه قدر مقادیر RMSD بیشتر باشد، احتمالا میزان تغییرات ساختاری بیشتر خواهد بود. در واقع با مشاهده میزان شیب نمودار بدست آمده، میتوان میزان پایداری مولکول مورد نظر را سنجید (32). در این قسمت مقادیر RMSD در برابر زمان برای اتم های کربن آلفای پروتئین محاسبه شده است. همانطور که در شکل 1 قابل مشاهده است، پلیمر در ابتدای شبیهسازی باعث افزایش RMSD و ناپایداری پروتئین شده است. در واقع با اضافه کردن پلیمر به محیط، پروتئین دچار استرس شده است و میانگین کل نوسانات آن افزایش یافته است ولی پس از گذشت 250 نانوثانیه از زمان شبیهسازی، میزان RMSD تقریبا به یک میزان ثابتی (3/0 نانومتر) رسیده و تغییری نمیکند. لازم به ذکر است که در مقدار RMSD در سیستم پروتئین در آب خالص یک افزایش نسبی در کل طول زمان شبیهسازی دیده میشود. با مقایسه RMSD پروتئین در حضور و عدم حضور PLA، می توان نتیجه گرفت که در اواخر شبیه سازی، کنفورماسیون پروتئین مورد نظر در حضور پلیمر تغییر چشمگیری نکرده و پلیمر ساختار پروتئین را حتی پایدارتر کرده است.
شکل 1 – انحراف جذر مربع میانگین (RMSD) برای کربن های آلفای پروتئین در حضور و عدم حضور پلیمر
جذر میانگین مربع نوسانات (Root Mean Square Fluctuations (RMSF)) هر آمینواسید در یک ماکرومولکول نیز از طریق مقایسه با یک ساختار مرجع به عنوان ساختار اولیه آن ماکرومولکول قابل محاسبه است. این آنالیز نیز مانند آنالیز قبلی میتواند به عنوان یک معیار برای بررسی میزان تغییرات در ساختار پروتئین با توجه به شرایط اعمال شده در طی شبیهسازی دینامیک مولکولی مورد استفاده قرار گیرد (32). در شکل 2 جذر میانگین مربع نوسانات کربن آلفا به ازای هر آمینواسید نشان داده شده است. درنمودار RMSF، میانگینگیری بر روی کل زمان شبیهسازی به ازای هر آمینواسید انجام میگیرد. همانطور که در شکل 2 مشاهده می کنید، میزان افت و خیزها در حضور پلیمر کمتر از آب خالص است که این نتیجه قابل انتظار بوده است. بنابراین در مجموع، با جذب پلیمر بر روی پروتئین، میزان متوسط انعطافپذیری در قسمتهای مختلف پروتئین کاهش یافته است. شکل 3 آخرین تصویر گرفته شده از پروتئین و پلیمرها را نشان میدهد. اثر پلیمر PLA بر کاهش نوسانات پروتئینها درتحقیقات قبلی هم نشان داده شده است و این تحقیق نیز آنها را تایید میکند (24).
شکل 2 - جذر میانگین مربع نوسانات (RMSF) کربن آلفا به ازای هر آمینواسید
شکل 3- تصویر گرفته شده از لحظه آخر شبیه سازی به کمک نرم افزار VMD
یکی دیگر از قابلیتهای مهم شبیهسازی دینامیک مولکولی، تحلیل ساختار دوم پروتئین با استفاده از الگوریتم (Dictionary of the Secondary Structure of Protein (DSSP)) است. به منظور درک میزان تغییرات ساختار دوم پروتئین طی 500 نانوثانیه شبیهسازی، نمودار DSSP به دست آمد (شکل4). با کمک DSSP می توان درصد احتمال حضور و یا عدم حضور ساختارهای مختلف موجود در پروتئین را در طول زمان کل شبیه سازی محاسبه کرد. بطور کلی، بر اساس نتایج نمودار DSSP میتوان گفت که تقریبا تمام ساختارهای دوم پروتئین در حضور پلیمر تا انتهای شبیهسازی حفظ شدهاند. همچنین در نقاطی مشاهده میشود که ساختارهای مارپیچ آلفا در حضور پلیمر PLA بیشتر حفظ شدهاند (ناحیه مربوط به رزیدوهای 160 تا 200)، در صورتی که در سیستم آب خالص مارپیچها کمتر شدهاند. کاهش مقدار RMSF نیز در این ناحیه در حضور پلیمر PLA میتواند به علت پایدار ماندن کنفورماسیون مارپیچ باشد.این نتایج با مقایسه با ساختار سه بعدی اولیه تعیین شده تایید شد (16). سطح قابل دسترس حلال (Solvent Accessible Surface Area (SASA))، یکی از شاخص های مهم در بررسی ساختار پروتئین است. شکل 5، سطح قابل دسترس حلال بر حسب زمان را نمایش می دهد. همانطور که قابل ملاحظه است، در هر دو سیستم (حضور و عدم حضور پلیمر) سطح قابل دسترس حلال تغییری نداشته است. این نتیجه، داده های بدست آمده از آنالیزهای قبلی (RMSD، RMSF و DSSP) را تایید میکند.
شکل 4- نمودار DSSP در حضور و عدم حضور پلیمر PLA
شکل 5- سطح قابل دسترس حلال (SASA) بر حسب زمان شبیهسازی در حضور و عدم حضور پلیمر
برای بررسی میزان تراکم ساختار پروتئین و میزان فشردگی آن، شعاع ژیراسیون بررسی شد. شعاع ژیراسیون میزان فاصله کربن آلفا با اتمهای اطراف را نشان میدهد. نمودار مربوط به شعاع ژیراسیون (شکل 6) نشان میدهد در سیستمی که پلیمرهای PLA با آنزیم L - آسپاراژیناژ برهم کنش دارند، شعاع ژیراسیون افت و خیز کمتری دارد و کاملا حالت صاف دارد. این مسطح بودن نمودار شعاع ژیراسیون، پیشنهاد میکند پروتئین در حضور PLA به حالت ساختاری پایداری رسیده است.
شکل 6- نمودار شعاع ژیراسیون در دو حالت حضور و عدم حضور پلیمر
برهم کنش پلیمر با پروتئین: جهت بررسی علت پایداری ساختار ال- آسپاراژیناز، تعداد پیوندهای هیدروژنی بین پروتئین و پلیمر در طول زمان شبیهسازی مورد محاسبه قرار گرفت. شکل7 تعداد پیوندهای هیدروژنی را نشان میدهد. همانطور که در شکل واضح است با گذشت زمان تعداد پیوندهای هیدروژنی بین پروتئین و پلیمرهای PLA افزایش یافته است، ولی بعد از 400 نانوثانیه کمی کاهش داشته است، که احتمالاً زنجیرههای PLA نیز میان خود پیوند هیدروژنی درون مولکولی ایجاد میکنند. در واقع با گذشت زمان شبیهسازی، برهمکنش میان زنجیرههای پلیمر و پروتئین به تعادل رسیده و با توجه به آنالیزهای قبلی پروتئین در کنار پلیمر PLA ساختار خود را حفظ میکند و پایدار شده است (24).
شکل 7- آنالیز تعداد پیوند هیدروژنی میان پروتئین و پلیمر
تابع توزیع شعاعی (Radial distribution function) میان پروتئین ال-آسپاراژیناز و پلیمرPLA نیز بدست آمد (شکل 8). توزیع شعاع ذره B در اطراف ذره A به طریق زیر محاسبه میشود:
در این فرمول 
برابر با چگالی ذره نوع B در فاصلهای به شعاع r در اطراف ذره نوع A است و برابر با میانگین چگالی ذره B در بیشترین فاصله از ذره A است (r max). در این آنالیز مقدار r max برابر نصف جعبه شبیهسازی است.
مقایسه RDF میان 5 نانوثانیه اول و 5 نانوثانیه آخر شبیهسازی حاکی از نزدیک شدن پلیمرهای PLA به پروتئین در طول زمان شبیهسازی است. در نمودار پیک شاخصی در ناحیه 5/2 نانومتری مشاهده میشود که نشان دهنده بیشترین احتمال حضور پلیمرهای PLA در آن فاصله است. بنابراین همانطورکه از شکل 8 هم قابل مشاهده است، میتوان اظهار داشت که پلیمرهای PLA در 5 نانوثانیه آخر شبیهسازی نسبت به 5 نانوثانیه اول به ال-آسپاراژیناز خیلی نزدیک شدهاند.
شکل 8- نمودار تابع توزیع شعاعی 5 نانوثانیه اول و آخر شبیهسازی
در این مطالعه، با استفاده از آنالیزهای صورت گرفته از جمله بررسی پایداری و تغییر ساختار پروتئین، بررسی تغییرات میزان سطح در دسترس حلال و بررسی تغییرات محتوی ساختار دوم پروتئین قبل و بعد از برهمکنش با پلیمر، شاهد عدم تغییر ساختار پروتئین و حتی پایداری بیشتر پروتئین در حضور پلیمر بودیم (16 و24). با مقایسه نمودارهای حاصله از شبیهسازی پلیمر با ال- آسپاراژیناز، از جمله نمودارهای کاهش انحراف جذر مربع میانگین و همچنین عدم تغییر سطح در دسترس پروتئین نسبت به حالت پروتئین در آب (عدم حضور پلیمر) ، شاهد پایداری هر چه بیشتر پروتئین در طول زمان شبیه سازی خواهیم بود. هدف اصلی ما در این تحقیق، بررسی ساختار و دینامیک آنزیم آسپاراژیناز در برهمکنش با پلیمرهای PLA بود. در این تحقیق با انجام آنالیز RDF مشخص شد که پلیمرهای PLA به طور قابل توجهی به پروتئین نزدیک و وارد برهمکنش شدهاند. به طور کلی، نتایج نشان داد که پلیمر PLA تاثیر چندانی برروی ساختار و دینامیک پروتئین ندارد. همچنین پلیمر PLA قادر بود برای پروتئین نقش حفاظتی بازی کند و پروتئین را پایدارتر کند. نتایج بدست آمده از این مطالعه میتوانند در اختیار محققین در رشتههای مرتبط علم پزشکی جهت بالا بردن پتانسیل کاربردی این پلیمرها در صنعت غذایی و سیستمهای دارورسانی قرار بگیرد. به علاوه، ما امیدواریم که نتایج این تحقیق بتواند دادههای مفیدی را برای روشن کردن برخی از ابهامات در نتایج تجربی برهمکنش آسپاراژیناز با پلیمرهای زیستتخریب پذیری همچون PLA فراهم کند، و بتواند دانش فعلی ما را در مورد مکانیسمهای کپسوله کردن و برهمکنشهای مولکولی بین پروتئین و پلیمرها را گسترش دهد.
انرژی آزاد اتصال: محاسبه کل انرژی اتصال آزاد با MMPBSA از نتایج شبیهسازی دینامیک مولکولی نشان می دهد، که کدام یک از نیروهای الکترواستاتیک ، واندر والس و آبگریز در جذب پروتئین به سطح پلیمر نقش داشتهاند (34). در شکل9، اسیدهای آمینه با سطح انرژی کمتر از Kj.mol-1 2- نشان داده شدهاند. کمترین (بهترین) سطح انرژی برای آمینو اسید آرژنین 272 (Kj.mol-1 78/12-) است. نتایج انرژی آزاد اتصال نشان می دهد با توجه به حضور گروههای کربوکسیلیک در روی پلیمر، آمینو اسیدهای با بار مثبت (لیزین و آرژنین) بیشترین برهم کنش را با پلیمر دارند. علاوه بر آمینو اسیدهای با بار مثبت، آمینو اسیدهای آب گریز و قطبی هم در برهم کنش بین پلیمر و آنزیم شرکت کردند ( شکل 9). نتایج بهدست آمده از پارامترهای ترمودینامیک در MMPBSA نیز نشان داد که نیروهای اصلی اتصال پلیمر PLA به رشتههای پلیمری از نوع الکترواستاتیک و واندروالسی میباشد (شکل10).
شکل 9- انرژی آزاد نسبت به هرآمینو اسید پرتئین
شکل 10- مجموع انرژی آزاد اتصال پروتئین ال-آسپارژیناز به پلیمر
نتیجه گیری
در این مطالعه با استفاده از شبیهسازی دینامیک مولکولی اثر پلیمرPLA بر روی ساختار و دینامیک آنزیم ال-آسپارژیناز بررسی و مطالعه شد. نتایج این تحقیق نشان داد ساختار دوم و سوم آنزیم در حضور سیستم پلیمری در طول شبیهسازی کاملا پایدار باقی میمانند. علاوه بر این، پلیمر PLA برای ایجاد یک تماس کامل با پروتئین خود به خود جمع میشود. با این حال، پروتئین در طول شبیه سازی به نواحی از نانوذره پلیمری متصل شده و تا آخر شبیه سازی متصل باقی میماند. این تحقیق نشان داد که آمینو اسیدهای لیزین و آرژنین بیشترین برهم کنشها را با پلیمرها دارند همچنین آمینو اسیدهای آب گریز و قطبی در برهم کنش بین پلیمر و آنزیم شرکت کردند. نتایج نشان داد که نیروهای اصلی اتصال پلیمر PLA به آنزیم از نوع الکترواستاتیک و واندروالسی میباشد. در نهایت، نتایج این شبیهسازی دینامیک مولکولی میتواند به توضیح چگونگی محصور شدن آنزیم در حامل پلیمری در مقیاس اتمی کمک کند و اطلاعات مفیدی را در مورد ساختار و دینامیک پروتئین نشان دهد که آزمایشها نمیتوانند به راحتی آنهارا ثبت کنند.
پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)