نوع مقاله : مقاله پژوهشی
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله English
نویسندگان English
Simultaneous transfer of hydrophilic and hydrophobic drugs using nano- particles reduces side effects and also increases the effectiveness of treatment. Biocompatible polymers of polylactic acid, polyethylene glycol and chitosan were used to design the nanoparticles.Iron oxide and folic acid nanoparticles were used to induce magnetic properties and target the nanoparticles, respectively. Nanoparticles were prepared from a combination of folic acid (FA)-polyethylene glycol(PEG)-chitosan-polylactic acid, Fe3O4-OA and paclitaxol (PTX) and siRNA according to the solvent diffusion method. The morphology, size and surface charge of the nanoparticles as well as the loading percentage and release pattern of PTX and siRNA were investigated. MTT, fluorescence microscopy and flow cytometry were used to evaluate the biocompati- bility and capability of MFMNPs nanoparticles in drug delivery and siRNA, respectively. The results showed that MFMNPs nanoparticles have a spherical structure and a size of about 250 nm and their surface charge was -9±1.6 millivolts. The siRNA loading percentage was significantly higher than PTX. Drug and siRNA release in acidic media is significantly increased. The IC50 for paclitaxel was 60.3 nM, while the MFMNPs/PTX and MFMNPs/siRNA/PTX nanoparticles were 76.5 and 78.3 nM, respectively.The ability of MFMNPs nanoparticles to transmit siRNA to MCF-7 cells was also confirmed by fluore- scence microscopy and flow cytometry. The results showed that MFMNPs nanoparticles had a high ability to transfer paclitaxol and siRNA to MCF-7 cells, while no significant toxicity was observed for these nanoparticles.
کلیدواژهها English
تهیه و بررسی اثرات ضد سرطانی نانوذرات پلیمری هدفمند حاوی پاکلیتاکسل و siRNA در رده سلولیMCF-7 سرطان پستان
هادی اسکانلو1، ندا فرازی2، میلاد داننده باقرآباد1، بشیر ندایی شکراب3 و هاشم یعقوبی1*
1 ایران، اردبیل، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد اردبیل، گروه زیست شناسی
2 ایران، اردبیل، دانشگاه محقق اردبیلی، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی
3 ایران، اردبیل، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد اردبیل، گروه فیزیک
تاریخ دریافت: 13/06/1401 تاریخ پذیرش: 05/01/1402
چکیده
این مطالعه با هدف سنتز نانوذرات مغناطیسی جهت انتقال همزمان داروی پاکلیتاکسل و siRNA طرح ریزی و انجام گرفت. بدین منظور ابتدا کوپلیمر Chitosan-poly lactic acid-(PEG) polyethylene glycol-(FA) Folic acid ، سنتز شد سپس از آن جهت انکپسوله سازی نانوذرات اکسید آهن، داروی پاکی تاکسول و siRNA-FAM استفاده گردید. از میکروسکوپ الکترونی نگاره و میکروسکوپ الکترونی عبوری به منظور بررسی مرفولوژی نانوذرات استفاده گردید. همچنین اندازه و بار سطحی نانوذرات MFMNPs/siRNA/PTX با استفاده از دستگاه DLS ارزیابی گردید. جهت بررسی زیست سازگاری و قابلیت نانوذرات MFMNPs در انتقال دارو و siRNA به ترتیب از تست MTT، میکروسکوپ فلورسانس و دستگاه فلوسایتومتری استفاده گردید. نتایج تحقیق حاضر نشان داد نانوذرات MFMNPs/siRNA/PTX از ساختار کروی و اندازه حدود 250 نانومتر برخوردارند و بار سطحی آنها 6/1±9- میلیولت بود. نتایج حاصل از تست MTT نشان داد نانوذرات MFMNPs از زیست سازگاری مطلوبی برخوردار بوده و از پتانسیل بالایی در انتقال داروی PTX به سلول های MCF-7 برخوردار هستند. میزان IC50 برای نانوذرات MFMNPs/PTX و MFMNPs/siRNA/PTX به ترتیب برابر 5/76 و 3/78 نانومولار بود. نتایج حاصل از میکروسکوپ فلورسانس و دستگاه فلوسایتومتری از سلولهای MCF-7 تیمار شده با نانوذرات MFMNPs بیانگر توانایی بالای این نانوذرات در انتقال siRNA این سلولها بود به نحوی که میزان انتقال siRNA-FAM توسط نانوذرات MFMNPs به سلولهای MCF-7 برابر با 63/58 درصد بود.
واژهای کلیدی: پاکلیتاکسل، اسیدفولیک، نانوذرات پلیمری، siRNA، سرطان پستان
*نویسنده مسئول، پست الکترونیکی: yaghoubi_h@iauardabil.ac.ir
مقدمه
بهطور عادی، تکثیر و تمایز سلولها توسط یک مکانیسم کاملاً حسابشده و در پاسخ به نیازهای مختلف انجام میشود.در طول نمو طبیعی، گروههای ژنتیکی پیچیده تبادل بین تکثیر و مرگ سلولی را در پاسخ به سیگنالهای آپیتوز کنترل میکنند. بههرحال در مواردی مشاهده میشود که سلولها از بین کنترل منظم و دقیق خارجشده و منجر به اختلالاتی میگردند که نتیجه آن ایجاد سرطان است. امروزه سرطان یکی از بیماریهای مهلک است که هر ساله تعداد زیادی از انسان ها را می کشد. سرطان پس از بیماریهای قلبی عروقی دومین علت شایع مرگومیر در جهان محسوب میشود. ریسک ابتلا به بیماری سرطان علیرغم پیشرفت علم بشر در جنبههای بیولوژیکی و پزشکی، همواره رو به افزون است. با این حال درصد افراد مبتلا به سرطان در قاره آسیا بطور قابل توجهی بالاتر از سایر قارههاست. در اروپا و امریکای شمالی از هر ۴ نفر بر اثر سرطان جان خود را از دست میدهند. هدف از تحقیق در زمینهی سرطان توسعهی روشهای جدید و مؤثر غیر سمی در درمان سرطان است. با توجه به تفاوت مکانیسمهای مولکولی درگیر در سرطانزایی که در هر نوع سلول سرطانی وجود دارد درمانهای متفاوتی نیز باید به کار گرفته شود (16).
شیمی درمانی در ترکیب با جراحی یکی از مؤثرترین روش ها است جهت درمان سرطان است. اگرچه داروهای شیمی درمانی موجود در کنترل سلولهای سرطانی بسیار کارآمد هستند با این حال این داروها بین سلولهای سرطانی و طبیعی تمایز قائل نمی شوند بنابراین، عوارض جانبی زیادی پس از تجویز دارو رخ می دهد که می توانند حتی برای افراد آن کشنده باشد علاوه بر این، اکثر داروهای شیمی درمانی معمولی نامحلول در آب هستند و نمی توان مستقیماً به بدن تزریق شوند. ژن درمانی مجموعه ای از روش های درمانی است که در آن با رفع عیب ژنها، و یا غیر فعال سازی ژنها مضر بیماری را درمان میکنند. در چند دهه گذشته تحقیقات زیادی در این زمینه انجام شده است استفاده از رترویروسها جهت ژندرمانی با وجود بازده بالایی آنها در انتقال ژن به دلایلی از قبیل امکان ایجاد جهش در این ویروسها و همجنین محدودیت در اندازه DNA جهت انتقال به سلولها محدود شده است. با این حال امروزه استفاده از نانوذرات مختلف که از قابلیت انتقال ژن به سلولهای یوکاریوتی برخوردار هستند به عنوان روشی جایگزین مطرح است (4،18).
با توجه به این محدودیت ها در استفاده از داروهای شیمی درمانی، در سالهای اخیر ظهور نانوذرات نه تنها به عنوان ناقلی قدرتمند برای تحویل انتخابی دارو مد نظر قرار گرفته است بلکه توانایی این نانوذرات در انتقال همزمان ترکیبات آبدوست و آبگریز به سلولهای سرطانی اهمیت آنها را در سیستمهای دارورسانی بسیار کرده است. اخیرا نانوناقلهای کاتیونی مورد استفاده جهت انتقال ژن و دارو با قابلیت ایجاد کمپلکس با گروههای منفی موجود در DNA طراحی و ساخته شده اند که از قابلیت بالایی جهت انتقال ژن و دارو به سلولها برخوردار هستند. که این خصوصیات آنها سبب شده است تا در صنایع داروسازی بسیار مورد توجه قرار گیرند (17). از جمله مهمترین ناقل های مورد استفاده جهت انتقال نوکلئیک اسید به سلول های یوکاریوتی میتوان به پلیمرهای کاتیونی اشاره کرد. این پلیمرها به سادگی با نوکلئیک اسیدهایی از قبیل DNA و RNA برهمکنش میدهند. از میان پلیمرهای کاتیونی کیتوسان به خصوص کیتوسانهایی که دارای وزن ملکولی بالاتری هستند علاوه بر قابلیت بالا در برهمکنش و فشرده سازی DNA از زیستسازگاری مطلوبی نیز برخوردار هستند (9،14). از دیگر پلیمرهای زیست سازگار و زیست تخریب پذیر که بطور گستردهای در سیستمهای دارورسانی مورد استفاده قرار میگیرند میتوان به پلیمرهای پلی اورتان PU (Polyurethane)، PLA (lactic acid Poly) و PCL اشاره کرد. ترکیب این قبیل پلیمرها با پلیمرهای آبدوست از قبیل PEG سبب تولید کوپلیمرهای آمفیپاتیکی میگردد که از خصوصیات منحصر به فردی از قبیل توانایی در کنترل رهش دارو و همچنین انتقال همزمان داروهای آبدوست و آبگریز به سلولها برخوردار میباشند (12،23). نانوذرات مغناطیسی از دیگر نانوذرات مورد علاقه جهت استفاده در سیستمهای دارورسانی و همچنین ژن رسانی هستند. خواص منحصر به فرد این نوع از نانوناقلها شامل سوپر پارامغناطیسی، فوق اشباع و Magnetic susceptibility میباشد که از خصوصیات مغناطیسی این نانوذرات میگیرد. در این تحقیق نانوذرات جدیدی با اتصال قطعات کیتوزان، پلیاتیلن گلیکول PEG، PLA و همچنین نانوذرات اکسید آهن سنتز شد تا علاوه بر زیست سازگاری مناسب از توانایی انتقال داروهای آبگریز و نوکلئیک اسیدهایی از قبیل RNA به سلولهای سرطانی بطور همزمان برخوردار باشند. همچنین جهت افزایش جذب سلولی این نانوذرات سطح نانوذرات MFMNPs با استفاده از اسیدفولیک پوشش داده شد تا علاوه بر افزایش بازده انتقال به سلولهای سرطانی، جذب غیر اختصاصی دارو را به سلولهای نرمال کاهش دهد.
مقاومتهای دارویی در درمان بسیاری از بیماریها همواره به عنوان یکی از چالشهای اصلی در درمان بیماریها بوده اند. به گونهای که برخی از دارو خواص درمانی خود را به دلایل متعددی از دست میدهند لذا محققان همواره دنبال راهکارهایی جهت ممانعت از مقاومت دارویی و یا استفاده از داروهای متعدد در درمان بیماریها بودهاند با این حال خصوصیات متفاوت داروها از قبیل حلالیت متفاوت اثرات سوء سینرژیک داروها بر یکدیگر و غیره امکان استفاده از چندین دارو را در سیستمهای درمانی محدود کردهاند (11،15). امروزه استفاده از نانوذرات با قابلیت انتقال داروهای آبدوست و آبگریز سبب برطرف کردن برخی از چالشها در این زمینه شده اند. انتقال نوکلئیک اسیدها از قبیل DNA و RNA به سلولها نیازمند خنثی سازی بار منفی و همچنین فشرده سازی این ترکیبات است (15،22). از طرف دیگر محافظت از این ماکرومولکولها در برابر شرایط مخرب بدن از دیگر فاکتورهای ضروریست که در طراحی ناقلهای ژنی باید مد نظر قرار گیرد. پلیمرهای آبگریز جهت انکپسولاسیون داروهای آبگریز از قبیل پاکلیتاکسل همواره مورد توجه بودهاند با این حال برهمکنش غیر اختصاصی این قبیل پلیمرها با پروتئینهای موجود در پلاسما سبب افزیش اندازه در این نانوذرات میگردد که این پدیده شناسایی نانوذرات را توسط ماکروفاژها افزایش داده و زمینه حذف این نانوذرات را فراهم میکند (5). لذا اتصال این ترکیبات با ترکیبات آبدوست و زیستسازگار از قبیل PEG میتواند با تشکیل میسلهای با سطح آبدوست امکان برهمکنش این نانوذرات را با ترکیبات آبگریز سلول به حداقل برساند. در مجموع و با توجه به آنچه گفته شد جهت طراحی نانوساختارهایی با قابلیت انتقال همزمان داروهای آبگریز و همچنین نوکلئیک اسیدها باید به موارد متعددی توجه داشت که از جمله این موارد وجود ترکیبات کاتیونی جهت برهمکنش با DNA، آبگریز بودن حداقل یکی از قطعات مورد استفاده در ساختار نانوذرات جهت انکپسوله سازی داروهای آبگریز و همچنین وجود لایه قطبی در پوسته خارجی نانوذرات جهت به حداقل رساندن برهمکنشهای نامطلوب درون سلول اشاره کرد (7،13). در تحقیق حاضر نانوذرات چند عملکردی با استفاده از کیتوزان، PLA، PEG تهیه شد که وجود بار کاتیونی در کیتوزان امکان برهمکنش با RNA را میدهد. همچنین قطعات PLA و PEG در این نانوذرات به ترتیب امکان انکپسوله سازی داروهای آبگریز از قبیل پاکلیتاکسل و همچنین امکان فرار از سیستم ایمنی بدن برای نانوذرات را فراهم می کنند. هدف از این تحقیق سنتز نانوذرات مغناطیسی با قابلیت انتقال همزمان siRNA-FAM و پاکلی تاکسول به سلول های MCF-7 بود. بررسی زیست سازگاری نانوذرات و توانایی آن در خنثی سازی بار منفی siRNA-FAM از دیگر اهداف این تحقیق بود.
مواد و روشها
در این مطالعه تجربی رده سلولی MCF-7 از انستیتو پاستور؛ ایران خریداری و در محیط کشت RPMI-1640 حاوی 10% سرم گاوی و 20% پنی سیلین- استرپتومایسین کشت داده شد. محلول MTT و FBS از سیگما، محلول های تریپسین و پنی سیلین- استرپتومایسین از گیبکو تهیه شدند. اولئیک اسید، پلی اتیلن گلیکول، کیتوزان، پلی لاکتیک اسید، اتانول، هگزان، بافر فسفات، تریپان بلو و نیز پاکلیتاکسل، siRNA CGGCCTGAACTGTCCTTCT-FAM 3′ 5′ توالی از شرکت Integrated DNA Technologies (IDT) کشور آمریکا تهیه گردید. خلوص این ترکیب بالای 95 درصد بوده و توسط HPLC خالص سازی گردید. از دستگاه میکروسکوپ الکترونی نگاره (SU1510 model; Hitachi Ltd., Tokyo, Japan) ساخت ژاپن و همچنین دستگاه میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM, JEM-2100PLUS, JEOL Ltd., Japan) ساخت ژاپن، FTIR (Nicolet 380 FTIR spectrometer; Thermo Fisher Scientific) ساخت آمریکا. اندازه نانوذرات توسط دستگاه Malvern Panalytical ساخت کشور انگلستان بررسی شد.
تهیه کوپلیمر Chitosan-PLA-Chitosan : سنتز PLA-Chitosan-Spermine در چند مرحله توضیح داده شده در زیر انجام شد (شکل 1).
شکل 1. شماتیک نحوه تهیه کوپلیمر PLA-Chitosan-PEI
تهیه آکریلات کیتوزان: کیتوزان و انیدرید فتالیک در DMF خشک شده گرم شدند تا فتالوکلتوزان (PHCS) مطابق روشی که قبلاً توسط لیو و همکاران شرح داده شده بود سنتز گردد (10). سپس ، 2/0 میلی مولار از ترمینال هیدروکسیل فتالویلی کیتوزان با 4/0 میلی مولول آکریلیل کلراید در تولوئن خشک حاوی 4/0 میلی مول تری تیل آمین مخلوط شد. مخلوط واکنش به مدت 6 ساعت در دمای 90 درجه سانتیگراد همزده شد. سپس، این مخلوط در دمای اتاق خنک شد. به منظور حذف هیدروکلراید تری اتیل آمین، و سایر ناخالصیها محصول نهایی با استفاده از فیلتر، فیلتر شد و چندین مرتبه توسط N-هگزان سرد شستشو داده شد. نهایتا رسوبات جمع آوری و تحت شرایط خلاء به مدت 24 ساعت خشک شدند. به منظور حذف آکریلات- فتالویل از کیتوزان 3 گرم آکریلات- فتالویل کیتوزان در 20 میلی لیتر DMF حل شد و سپس ، این محصول به مدت 30 دقیقه در دمای 100 درجه سانتیگراد تحت نیتروژن هم زده شد. هیدرازین منوهیدرات به محلول اضافه شد و واکنش به مدت 60 دقیقه ادامه یافت. در پایان واکنش، محصول نهایی در دمای اتاق سرد شدند. سرانجام محصول نهایی توسط سانتریفیوژ جمع آوری شد، و پس از شستشو توسط اتانول با استفاده از دستگاه فریزدرایر خشک شد.
اتصال کیتوسان به acrylate-PLA-acrylate : 20 میلیلیتر
از acrylate-Chitosan به صورت قطره قطره به مقدار برابری از محلول به acrylate-PLA-acrylate اضافه شد و به مدت 24 ساعت در 50 درجه سانتیگراد مخلوط گردید. نهایتا محصول حاصل با استفاده از مخلوط اتانول و آب و در حضور غشاء دیالیز 10000 دالتون برای 2 روز و در 4 درجه خالص سازی گردید.
اتصال NH2-PEG-FA به chitosan-PLA-chitosan : به منظور اتصال NH2-PEG-FA به chitosan-PLA-chitosan از روش اتصال کیتوسان به acrylate -PLA-acrylate استفاده گردید بدین منظور میزان یک گرم از NH2-PEG-FA و 2 گرم از chitosan-PLA-chitosan در 20 میلی لیتر از کلروفورم حل شد سپس محلول NH2-PEG-FA به صورت قطره قطره به محلول chitosan-PLA-chitosan اضافه شد و به مدت 24 ساعت در دمای 50 درجه سانتیگراد مخلوط داده شدند سپس با استفاده از غشاء دیالیز 10000 دالتون و در حضول آب و متانول خالص سازی شدند (شکل1).
آماده سازی و بررسی خصوصیات نانوذرات FA-PEG-Chitosan-PLA-Chitosan-PEG-FA/siRNA/PTX (MFMNPs/ siRNA/PTX) : تهیه نانوذرات FA-PEG-Chitosan-PLA-Chitosan-PEG-FA/siRNA/PTX (MFMNPs/siRNA/PTX) با تکنیک انتشار حلال انجام گردید (12). به طور خلاصه مقدار متفاوتی از MFMNPs با غلظت 30 میلیگرم بر میلیلیتر میلی گرم به 2/0 میلی لیتر بافر فسفات7.4 pH حاوی 250 میکروگرم siRNA-FAM، 2 میلیگرم از نانوذرات Fe3O4-OA (پوشش داده شده توسط اولوئیک اسید) 2 میلی گرم پاکلی تاکسل اضافه شد. سپس به مدت 30 ثانیه سونیکه شد. مخلوط حاصل با 5/1 میلیلیتر محلول PVA یک درصد ترکیب و به مدت 2 دقیقه روی یخ سونیکه شد. جهت فورمولاسیون نانوذرات MFMNPs/siRNA/PTX محلول فوقالذکر به 25 میلیلیتر ازPVA 3/0 درصد اضافه گردید و به مدت 5 ساعت در دمای اتاق مخلوط گردید. حلالهای موجود در مخلوط واکنش با استفاده از روتاری حذف گردید.
سپس نانوذرات حاصل به مدت 30 دقیقه و با دور 12000 دور جداسازی شدند. نانوذرات MFMNPs/siRNA/PTX توسط بافر فسفات چندین مرتبه شسته شده و نهایتا توسط دستگاه فریز درایینگ، خشک شدند (شکل2).
بررسی درصد بارگذاری PTX و siRNA توسط نانوذرات MFMNPs : بدین منظور سوپرناتانت رویی سوسپانسیون حاوی نانوذرات MFMNPs بطور جداگانه جمع آوری شد و جذب آن به ترتیب در 230 (برای داروی PTX) و 490 نانومتر (برای siRNA-FAM) توسط اسپکتروفتومتری بررسی شد سپس با عدد جذبی هر کدام از نمونهها با عدد جذبی نمونههای مورد استفاده در در فرایند تهیه نانوذرات مورد مقایسه قرار گرفت (فرمول1).
بررسی خصوصیات نانوذرات MFMNPs/siRNA/PTX : به منظور بررسی خصوصیات مرفولوژیکی نانوذرات حاصل از میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) و همچنین میکروسکوپ الکتروی نگاره (SEM) استفاده گردید. بدین منظور ابتدا مقدار مناسبی از نانوذرات متفاوت توسط سونیکاتور به مدت 120 ثانیه سونیکه شد سپس بمنظور مشاهده توسط میکروسکوپ الکترونی عبور استفاده شدند. جهت بررسی اندازه و همچنین بار سطحی نانوذرات از دستگاه DLS استفاده گردید.
شکل2. شماتیک تکنیک انتشار حلال جهت تهیه نانوذرات MFMNPs/siRNA/PTX
همچنین به منظور بررسی خصوصیات مگنتیک نانوذرات از دستگاه Vibrating-sample magnetometer (VSM) استفاده شد. محدوده مگنتیک هریک از نانوذرات در محدود 10000- تا 10000 مورد بررسی قرار گرفت.
بررسی پایداری siRNA در نانوذرات MFMNPs و توانایی نانوذرات در خنثی سازی بار منفی siRNA توسط ژل آگارز: به منظور بررسی پایداری siRNA و انکپسولاسیون سالم آن توسط نانوذرات MFMNPs، siRNA از نانوذرات MFMNPs جداسازی شد و توسط ژل آگارز مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور یک میلیگرم از نانوذرات MFMNPs/siRNA/PTX با بافر فسفات حاوی هپارین 1 درصد به مدت 4 ساعت بر روی انکوباتور شیکردار با دمای 45 درجه و دور rpm 120، نگهداری شدند. سپس siRNA جداسازی شده توسط اتانول و به وسیله سانتریفیوژ رسوب و شستشو داده شد سپس توسط دستگاه فریزدرایینگ تغلیظ شد. نهایتا جهت بررسی پایداری siRNA در نانوذرات MFMNPs، siRNA تخلیص شده توسط ژل آگارز و در کنار siRNA کنترل الکتروفورز گردید همچنین مقدار یک میلیگرم از نانوذرات MFMNPs/siRNA/PTX به همراه نمونههای فوق الذکر و به منظور بررسی توانایی نانوذرات در خنثی سازی بار منفی DNA استفاده شد. نمونه ها به مدت 1 ساعت در ژل آگارز 5/2 درصد و در V80 الکتروفورز گردیدند.
بررسی اثر سایتوتوکسیتی نانوذرات MFMNPs/ siRNA/PTX بر رده سلولی MCF-7 با استفاده از تست MTT : جهت بررسی تاثیر نانوذرات MFMNPs/ siRNA/PTX بر توانایی زیستی سلول و همچنین میزان سایتوتوکیستی آنها بعد از تریپسینه کردن و تهیه سوسپانسیون سلولی MCF-7 و سپس شمارش سلول ها با استفاده از تریپان بلو میزان 7500 سلول به هر کدام از چاهک پلیت 96 خانه انتقال یافت . همچنین جهت یکسان شدن تعداد سلول ها در هر چاهک قبل از انتقال آن ها به آرامی با استفاده از ورتکس مخلوط گردیدند. پس از انتقال سلول ها به پلیت 96 خانه، به مدت 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه نگهداری شدند. تا سلولها به فاز رشد مناسبی برسند، بعد از گذشت این مدت، محیط کشت رویی خارج شد و محیط کشت جدید همراه با غلظتهای مختلف نانوذرات MFMNPs/siRNA/PTX با سلولها تیمار شدند و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجهسانتیگراد و همچنین CO2 5 درصد نگهداری شدند سپس زیستایی سلولهای MCF-7 با استفاده از آزمون MTT مورد بررسی قرار گرفت.
تست MTT : MTT نمک زرد و حلال در آب است که به کمک آن میتوان قابلیت زیستی سلولهای مختلف را مورد ارزیابی قرار داد. جهت انجام آزمون MTT محیط رویی سلولها MCF-7 دور ریخته شد، و بعد از شستوشو توسط بافر PBS، محیط کشت تازه حاوی 10 درصد MTT اضافه شد، سپس به مدت 4 ساعت در انکوباتور در دمای 37 درجه و در شرایط تاریکی نگهداری شد. به منظور بررسی میزان واکنش، ابتدا کریستالهای نامحلول آبی رنگ با اضافه کردن 100 میکرولیتر از حلال DMSO به هر چاهک، حل شدند سپس محلول ارغوانی حاصل با استفاده از دستگاه الایزا ریدر و در طول موج 570 نانومتر بررسی شد. درصد زندهمانی سلولها با استفاده از فرمول زیر محاسبه گردید:
100×(میانگین جذب نوری سلولهای شاهد/جذب نوری هر یک از سلولهای تیمار شده)= درصد زندهمانی سلولها
بررسی تاثیر نانوذرات MFMNPs/siRNA/PTX و MFMNPs/PTX بر بازده کشندگی رده سلولی MCF-7 : جهت بررسی تاثیر نانوذرات MFMNPs/siRNA/PTX و MFMNPs/PTX بر بازده کشندگی رده سلولی MCF-7 توسط PTX ابتدا میزان IC50 داروی PTX محاسبه گردید سپس نانوذرات MFMNPs/siRNA/PTX و MFMNPs/PTX حاوی مقدار ثابتی از داروی PTX به طور جداگانه با سلولهای MCF-7 اضافه شدند (جهت محاسبه دقیق تاثیر نسبتهای متفاوت نانوذرات بر بازده کشندگی PTX میزان نانوذرات مورد نیاز برای هر کدام از تیمارها به گونهای محاسبه شد که در تمامی تیمارها مقدار دارو برابر با میزانPTX استفاده در گروه کنترل باشد (بدین منظور درصد بارگذاری دارو نیز در نظر گرفته شد). پس از تیمار سلولها با نانوذرات MFMNPs/siRNA/PTX و MFMNPs/PTX، سلول ها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد و CO2 5 درصد، نگهداری شدند. سپس زندهمانی سلولها با استفاده از آزمون MTT و فرمول ارائه شده فوق الذکر محاسبه شدند.
انتقال siRNA به سلولهای MCF-7 با استفاده از نانوذرات MFMNPs/siRNA : سلولهای MCF-7 با تراکم 20000 سلول در میلیلیتر به 500 میکرولیتر محیط کشت RPMI-1640 حاوی FBS 10 درصد به هر چاهک از پلیت24 خانه ای انتقال یافتند سپس در دمای 37 درجه سانتی گراد وCO2 5 درصد به مدت 24 ساعت نگهداری شدند. پس از آنکه سلول ها با فاز رشدی مناسبی رسیدند به هرچاهک به طور جداگانه نانوذرات MFMNPs/siRNA و در سه تکرار اضافه شد. از siRNA فاقد پوشش به عنوان کنترل منفی در این تحقیق استفاده شد. پس از نگهداری سلولها در دمای 37 درجه سانتیگراد و CO2 5 درصد به مدت 7 ساعت، سلول ها با استفاده از بافر فسفات مورد شستشو قرار گرفتند و نهایتا از میکروسکوپ فلورسانس و دستگاه فلورسایتومتری به منظور بررسی بازده انتقال siRNA به سلولهای MCF-7 استفاده گردید.
تجزیه تحلیل آماری: تمامی فاکتورهای کمی مورد ارزیابی در این تحقیق در حداقل 3 تکرار انجام شدند. تجزیه آماری با استفاده از نرم افزار SPSS ورژن 20 و از طریق تجزیه واریانس یک طرفه (One-way ANOVA) صورت گرفت. آزمون چندمرحلهای دانکن و در سطح احتمال 5 درصد به منظور بررسی مقایسه میانگین داده های حاصل از این تحقیق استفاده شد سپس میانگین هر یک از تیمارها به همراه انحراف معیار (Mean ± SE) بیان گردید.
نتایج
NMR از پلیمرهای acrylate-PLA-acrylate، PLA-chitosan و PLA-chitosan-PEG-FA : جهت بررسی ساختار کوپلیمرهای سنتز شده از طیف سنجی HNMR استفاده گردید همان طور که در شکل های 5-3 قابل مشاهده است پیکهای مشاهده در منطقه 63/1 و 45/4 به ترتیب مربوط به هیدروژنهای شماره a و b در PLA میباشند همچنین پیکهای مشاهده شده در منطقه 6 الی 5/6 مرتبط با هیدروژنهای گروه آکریلات در پلیمر acrylate-PLA-acrylate میباشد. پس از اتصال PLA به کیتوسان پیکهای جدیدی در منطقه 9/3 و 7/5 مشاهده شد که مربود به هیدروژنهای گروه a و b کیتوسان بودند.پس از اتصال PEG-FA به کوپلیمر PLA-chitosan پیک های چندگانه شدیدی در منطقه 5/3 مشاهده شد که مربوط به هیدروژنهای PEG بودند همچنین پیک های ضعیف مشاهده شده در منطقه 7 الی 5/8 مربوط به هیدروژنهای گروه فولیک اسید بودند.
شکل 3. طیف سنجی HNMR از کیتوسان
شکل 4. طیف سنجی HNMR از کوپلیمر PLA-chitosan
شکل5. طیف سنجی HNMR از کوپلیمر PLA-chitosan-PEI
شکل 6. تصویر طیف سنجی FTIR از پلیمرهای مختلف
نتایج حاصل از طیف سنجی FTIR از کیتوسان نشان داد پیکهای مشاهده شده در محدوده 1638مربوط به گروهها C=O میباشند همچنین پیک مشاهده شده در محدوده 1557 مربوط به پیوند N-H و پیک مشاهده شده در محدوده 3338 و 1082 به ترتیب مربوط به گروه OH و پیوند C-O در کیتوسان بود. پس از اتصال PLA به کیتوسان پیک جدیدی در محدوده 1561 مشاهده شد که مرتبط با آمین نوع دوم بود. اتصال PEG-FA به کوپلیمر PLA-chitosan سبب شد تا پیک مربوط به پیوند C-CH2 در محدوده 950 الی 1050 قابل مشاهده باشند (شکل6).
بررسی خصوصیات مرفولوژیکی، اندازه و بار سطحی نانوذرات MFMNPs/siRNA/PTX : نتایج حاصل از بررسی ساختار مورفولوژیکی نانوذرات MFMNPs/ siRNA/PTX نشان داد، این نانوذرات دارای ساختار کروی بوده و از میزان خودتجمعی کمی برخوردار بودند علاوه براین این نتایج نشان داد نانوذرات حاصل از سطوح صاف و اندازه نسبتا یکسانی برخوردار بودند (شکل 7). نتایج حاصل از بررسی اندازه نانوذرات MFMNPs/siRNA/PTX نشان داد اندازه و پتانسیل زتای این نانوذرات به ترتیب در محدوده 256±26 و بار سطحی 6/1±9- میلیولت بود (شکل 8).
بررسی توانایی کوپلیمر PLA-Chitosan-PEI در خنثی سازی بار منفی DNA : برهمکنش الکترواستاتیک بین پلیمرهای کاتیونی و بار منفی حاصل از گروه فسفات در RNA از جمله شرایط مهم جهت ایجاد کمپلکس بین نانوذرات و RNA میباشد. باتوجه به وجود بار منفی در RNA حرکت RNA در دستگاه الکتروفورز به سمت قطب مثبت میباشد. کاهش بار منفی RNA توسط نانوذرات MFMNPs سبب توقف در حرکت RNA به سمت قطب مثبت دستگاه میگردد.
شکل 7. تصویر میکروسکوپ الکترونی عبوری(A) و میکروسکوپ الکترونی نگاره (B) از نانوذات MFMNPs/siRNA/PTX
شکل 8. بار سطحی نانوذرات (A) و اندازه (B) نانوذرات MFMNPs/siRNA/PTX
تصویر ژل آگارز نشان داد زمانی که RNA با نانوذرات MFMNPs برهمکنش داده شد بار آن خنثی شد و در نتیجه حرکت آن به سمت قطب مثبت دستگاه متوقف شد. همچنین این نتایج نشان داد ساختار RNA پس از انکپسوله شدن در نانوذرات MFMNPs تغییر معنی داری در مقایسه با شاهد نداشته است (شکل 9).
بررسی سمیت نانوذرات MFMNPs: در این تحقیق از قطعات زیست سازگار جهت سنتز نانوذرات استفاده شد. لذا انتظار بر این بود که نانوذرات حاصل فاقد اثر سمیت بر سلول ها باشند نتایج حاصل از تست MTT با نتایج مورد انتظار در تطابق کامل بود به نحوی که تا غلظت مورد استفاده یک میلیگرم بر میلیلیتر از نانوذرات MFMNPs اثر سمیت قابل ملاحظه ای از نانوذرات MFMNPs بر سلولهای MCF-7 مشاهده نشد همچنین این نتایج نشان داد انکپسولاسیون RNA درون نانوذرات MFMNPs تاثیر قابل ملاحظهای بر سمیت این نانوذرات ندارد. کمترین درصد زندهمانی سلول ها پس از تیمار با غلظتهای متفاوت نانوذرات MFMNPs و MFMNPs/siRNA تنها حدود 86 درصد بود که در سلول های تیمار شده با 500 میکروگرم بر میلیلیتر از نانوذرات MFMNPs مشاهده شد (شکل 10).
بررسی تاثیر نانوذرات MFMNPs بر افزایش کارایی داروی پاکلیتاکسل: نتایج مقایسه میانگین حاصل از بررسی سمیت نانوذرات MFMNPs نشان داد این نانوذرات تاثیر معنیداری بر کاهش درصد زندهمانی سلولها نداشتند. این نتایج نشان داد این نانوذرات از سازگاری زیستی مناسبی جهت استفاده در سیستمهای دارورسانی برخوردار هستند (شکل 11).
باتوجه به اینکه این نانوذرات از اثر سمیت بر سلول های MCF-7 برخوردار نیستند لذا افزایش درصد کشندگی سلول ها پس از انکپسولاسیون داروی پاکلی تاکسل درون این نانوذرات به دلیل اثر داروی انکپسوله شده در این نانوذرات می باشد نتایج مقایسه میانگین نشان داد داروی PTX فاقد پوشش از قابلیت بیشتری در مقایسه با نانوذرات MFMNPs/PTX و MFMNPs/siRNA/PTX بر کشندگی سلولهای MCF-7 برخوردار هستند. به نظر می رسد اندازه کوچک دارو در مقایسه با نانوذرات و انتشار سریع آن به سلول های سرطانی یکی از دلایل افزایش تاثیر این دارو در مقایسه با نانوذرات حاوی دارو باشد.
شکل 9. تصویر ژل آگارز از RNA شاهد (چاهک اول) RNA برهکنش داده شده با نانوذرات MFMNPs (MFMNPs/RNA/PTX) (چاهک دوم) و RNA استخراج شده از نانوذرات MFMNPs
شکل 10. مقایسه میانگین درصد زندمانی سلول در غلظتهای مختلف از نانوذرات MFMNPs و MFMNPs/siRNA
شکل 11. نمودار مقایسه میانگین بررسی تاثیر نانوذرات MFMNPs بر افزایش بازده داروی پاکلی تاکسل
شکل12. نمودار IC50 از PTX و نانوذرات MFMNPs/PTX و MFMNPs/PTX/siRNA
میزان IC50 برای داروی پاکلی تاکسل 3/60 نانومولار بود در حالی که این میزان برای نانوذرات MFMNPs/PTX و MFMNPs/siRNA/PTX به ترتیب برابر 5/76 و 3/78 نانومولار بود (شکل12).
بررسی خصوصیات مغناطیسی نانوذرات MFMNPs/ PTX/siRNA : خصوصیات مگنتیک نانوذرات با استفاده از VSM و در دمای اتاق مورد بررسی قرار گرفت. شکل 13، نمودار هیسترزیس لوپ (Hysteresis loop) را برای نانوذرات نانوذرات Fe3O4، Fe3O4-OA و MFMNPs/PTX/siRNA نشان میدهد. سطوح مغناطیسی برای نانوذرات Fe3O4، Fe3O4-OA و MFMNPs/PTX/siRNA به ترتیب برابر با 46، 37 و 18 (emu/g) بود. این نتایج نشان داد، پوشش نانوذرات اکسید آهن توسط ترکیبات غیرمغناطیسی از قبیل اولوئیک اسید، PLA، کیتوزان و PEG سبب کاهش خواص مغناطیسی این نانوذرات میگردد. نتایج حاصل از انکپسوله سازی siRNA و پاکلیتاکسل توسط نانوذرات MFMNPs نشان داد بین درصد بارگذاری دارو و siRNA در نانوذرات MFMNPs تفاوت معنی داری وجود درصد بارگذاری در siRNA بطور معنی داری بالاتر از PTX بود به طوری که میزان باگذاری siRNA توسط نانوذرات MFMNPs 53 درصد بود این درحالی بود که این مقدار برای داروی PTX 32 درصد بود به نظر می رسد افزایش اندازه siRNA و همچنین برهکنش آن با بار مثبت کیتوزان دلیل افزایش درصد بارگذاری آن در مقایسه با PTX باشد. نتایج حاصل از بررسی الگوی رهش siRNA و PTX در شکل 14 نشان داده شده است.
با توجه به تفاوت بافت سرطانی در مقایسه با بافت نرم از لحاظ pH، الگوی رهش siRNA و PTX در دو محیط با اسیدیته متفاوت (6 و 4/7) مورد ارزیابی قرار گرفت این نتایج نشان داد الگوی رهش siRNA از نانوذرات MFMNPs کمی بیشتر از داروی PTX بود با این حال این اختلاف قابل ملاحظه نبود. سرعت رهش PTX و siRNA در محیط اسیدی به طور قابل توجهی افزایش یافت به طور مثال مجموع میزان رهش PTX پس از سه روز 59 درصد بود
شکل 13. Fe3O4، Fe3O4-OA و MFM NPs/PTX/siRNA
شکل 14. بررسی الگوی رهش siRAN و PTX از نانوذرات MFMNPs/PTX/siRNA در بافر PBS با pH 4/7 (A) و 6 (B).
شکل 15. تصویر میکروسکوپ فلورسانس از سلولهای (A) تیمار شده با siRNA-FAM و (B) ترانسفکت شده با نانورات MFMNPs/siRNA-FAM
شکل 16. نتایج حاصل از دستگاه فلوسایتومتری از سلولهای ترانسفکت شده توسط siRNA-FAM و MFMNPs/siRNA-FAM
این در حالی بود که این میزان در مدت زمان مشابه در محیط اسیدی تا 96 درصد افزایش یافت.همچنین روند مشابهی برای siRNA مشاهده شد (شکل14).
بررسی توانایی نانوذرات MFMNPs در انتقال siRNA به سلولهای MCF-7 : توانایی نانوذرات MFMNPs در انتقال siRNA به سلولهای MCF-7 با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس و دستگاه فلوسایتومتری مورد ارزیابی قرار گرفت. در این تحقیق از siRNA نشاندار شده توسط FAM به عنوان ژن گزارشگر به منظور تایید توانایی نانوذرات در انتقال siRNA مورد استفاده قرار گرفت. در صورت انتقال siRNA-FAM به سلولهای MCF-7، نشر سبز رنگی درون سلول در اثر برخورد نور UV به FAM ساطع میگردد که نشان دهنده انتقال siRNA-FAM به سلولهای MCF-7 میباشد. نتایج حاصل از میکروسکوپ فلورسانس نشان نانوذرات MFMNPs از توانایی بالایی در انتقال ژن به سلولهای MCF-7 برخوردار هستند. بر اساس نتایج فلورسایتومتری میزان انتقال siRNA توسط نانوذرات MFMNPs برابر با 63/58 درصد بود این در حالی بود که این نتایج نشان داد siRNA-FAM فاقد پوشش (کنترل) از قابلیت انتقال به سلولهای MCF-7 برخوردار نبود. (شکل 15 و 16).
بحث و نتیجه گیری
در این مطالعه مشخص شد که نانوذرات MFMNPs در انتقال پاکلیتاکسل و siRNA به سلولهای MCF-7 از توانایی بالایی برخوردار هستند. یانگ و همکارانش از نانوذرات دندریمری هدفمند شده با پپتید PTP جهت انتقال همزمان داروی پاکلیتاکسل و همچنین siRNA به سلولهایPanc-1 استفاده کردند. در این تحقیق ابتدا نانوذرات PSPGP سنتز شد سپس جهت تایید صحت سنتز نانوذرات از طیف سنجی NMR استفاده گردید نتایج تحقیقات ایشان نشان داد نانوذرات حاصل از ساختار کروی و اندازهای در حدود 500 الی 150 نانومتر برخوردار بودند، در مطالعه ما نیز نانوذرات دارای ساختار کروی و از میزان خودتجمعی کمی برخوردار بودند و اندازه نانوذرات هم در حدود 26±256 نانومتر بود. همچنین الگوی رهش دارو از این نانوذرات در دو مرحله رهش انفجاری و رهش پیوسته صورت گرفت به نحوی که بیشتر از 50 درصد از مجموع داروی رهاسازی شده تنها پس از چهار ساعت انکوباسیون کمپلکس PSPGP/siRNA/PTXبا بافر فسفات رهاسازی شد. انکپسولاسیون GSH بطور قابل توجهی سرعت رهش دارو را افزایش داد. بطوریکه مجموع دارو پاکلیتاکسل رهاسازی شده از نانوذرات PSPGP در مدت زمان 28 ساعت پس از انکوباسیون با بافر فسفات 30 درصد بود درحالیکه انکپسولاسیون GSH در این نانوذرات این مقدار را تا بیش از 90 درصد در مدت زمان مشابه پس از انکوباسیون افزایش داد، در مطالعه ما نیز دارو و siRNA در نانوذرات طی دو مرحله رهش انفجاری و رهش پیوسته انجام گرفت، رهش دارو و siRNA در محیط اسیدی به طور قابل ملاحظهای افزایش مییابد. سرعت رهش PTX و siRNA در محیط اسیدی به طور قابل توجهی افزایش یافت بطور مثال مجموع میزان رهش PTX پس از سه روز 59 درصد بود این در حالی بود که این میزان در مدت زمان مشابه در محیط اسیدی تا 96 درصد افزایش یافت. همچنین روند مشابهی برای siRNA مشاهده شد. بررسی سمیت نانوذرات با استفاده از تست MTT در این تحقیق نشان داد نانوذرات PSPGP از زیستسازگاری مناسبی برخوردار بودند به طوری که کمترین درصد زندهمانی پس از تیمار با نانوذرات PSPGP 83 درصد بود با این حال انکپسولاسیون داروی پاکلیتاکسل در این نانوذرات درصد زندهمانی سلولها را تا کمتر از 10 درصد کاهش داد، که با نتایج مطالعه ما مطابقت داشت؛ نانوذرات تاثیر معنیداری بر کاهش درصد زندهمانی سلولها نداشتند. افزایش درصد کشندگی سلول ها پس از انکپسولاسیون داروی پاکلی تاکسل درون این نانوذرات به دلیل اثر داروی انکپسوله شده در این نانوذرات بود. همچنین توانایی این نانوذرات در انتقال siRNA با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس مورد ارزیابی قرار گرفت این نتایج نشان دهنده توانایی بالای نانوذرات PSPGP در انتقال همزمان داروی پاکلیتاکسل و siRNA به سلولهای Panc-1 بود (12و1) که مشابه با نتایج مطالعه ما بود که نانوذرات MFMNPs از توانایی بالایی در انتقال پاکلیتاکسل و siRNA به سلولهای MCF-7 برخوردارند.
در مطالعة Abebe و همکارانش گزارش شد این ترکیب از خصوصیات منحصر به فردی در رهش دارو در محیطهایی با اسیدیته متفاوت برخوردار است (3) آنها گزارش کردند وجود قطعات PLA در کوپلیمرهای آمفیپتیک سبب محافظت از DNA از عوامل مخرب زا در شرایط فیزیولوژیک میگردد این در حالی بود که شرایط اسیدی مانع رهش DNA نمیگردد. نتایج تحقیق حاضر با نتایج بدست آمده توسط Abebe و همکارانش مطابقت داشت به نحوی که با کاهش اسیدیته محیط از 4/7 به 6 سرعت رهش siRNA و همچنین دارو PTX به طور قابل توجهی افزایش یافت. باتوجه به اینکه محیط تومور در مقایسه با بافت نرمال از اسیدیته پایینتری برخوردار است بنظر می رسد استفاده از PLA به عنوان بخش آبگریز در طراحی نانووکتورها جهت انتقال دارو و ژن، رهش زودهنگام دارو در بافت طبیعی را به حداقل برساند در حالی که رهش دارو در بافت سرطانی را تسهیل ببخشد. استراتژی انتقال همزمان نوکلئیک اسید و دارو به ویژه به عنوان یک روش درمانی برای سرطان امیدوار کننده است زیرا علائم مختلف بیماری از جمله MDR ، تهاجم / متاستاز و مقاومت در برابر آپوپتوز، می تواند به یکباره از طریق چنین مکانیسم ها مورد هدف قرار گیرد (6). استفاده همزمان از نوکلئیک اسید و دارو با ایجاد تاثیرات هم افزایی سبب بهبود درمان و همچنین کاهش عوارض جانبی دارو می گردد. در این استراتژی از هرکدام از نوکلئیک اسید و دارو نیاز به دوز کمتری در مقایسه با زمانی است که تنها از یکی از آنها جهت در مان استفاده می گردد. هدف از این عمل، استفاده از نوکلئیک اسید جهت تنظیم سیستم تکثیر سلولی مد نظر است. در این روش سعی برآن است تا با تنظیم سیستم رونویسی سلول سلولهای بدخیم را از بین ببرند. در مورد خاص از siRNAها، جهت جلوگیری از تولید پروتئین های خاص که توسط سلول های سرطانی بیان میشوند استفاده میگردد. قابلیت نانوذرات MFMNPs در انکپسوله سازی و انتقال دارو و siRNA در این تحقیق از روشهای متعددی از جمله تست MTT، میکروسکوپ فلورسانس و همچنین دستگاه فلوسایتومتری مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان دهنده توانایی بالای این نانوذرات در انتقال همزمان دارو و siRNA به سلولهای MCF-7 بودند که در مطالعه ما نیز نانوذرات MFMNPs از توانایی بالایی در انتقال پاکلیتاکسل و siRNA به سلولهای MCF-7 برخوردار بودند. همچنین توانایی این نانوذرات در انکسپوله سازی نانوذرات مغناطیسی از دیگر موارد مورد ارزیابی در تحقیق حاضر بود. که نتایج حاصل از دستگاه VSM بیانگر القاء خواص مگنیک نانوذرات اکسید آهن به نانوذرات MFMNPs بود که با نتایج مطالعه ما که در آن پوشش نانوذرات اکسید آهن توسط ترکیبات غیرمغناطیسی از قبیل اولوئیک اسید، PLA، کیتوزان و PEG سبب کاهش خواص مغناطیسی این نانوذرات میگردد، مشابه بود.
در تحقیق دیگر یووانگ و همکارانش در سال 2012 از نانوذرات لیپیدی کاتیونی PcSLN جهت انتقال همزمان پاکلیتاکسل و siRNA به سلولهای KB استفاده کردند. در این تحقیق نانوذرات PcSLN با استفاده از تکینک انتشار حال تهیه شد. به منظور توانایی این نانوذرات در خنثیسازی بار منفی siRNA از الکتروفورز ژل آگارز استفاده شد. از میکروسکوپ فلورسانس و دستگاه فلورسایتومتری جهت بررسی بازده انتقال siRNA استفاده شد. نهایتا قابلیت نانوذرات بر افزایش کارایی داروی پاکلی تاکسل و siRNA بر کشندگی سلولهای KB توسط تست MTT مورد آزمون قرار گرفت. نتایج تحقیقات ایشان نشان داد نانوذرات PcSLN از توانایی خنثی سازی بار منفی siRNA برخوردار بودند و در مطالعه ما نیز تصویر ژل آگارز نشان داد زمانی که RNA با نانوذرات MFMNPs برهمکنش داده شد بار آن خنثی شد و در نتیجه حرکت آن به سمت قطب مثبت دستگاه متوقف شد. نتایج دستگاه فلوسایتومتری نشان داد شدت فلورسانس به دلیل غیر فعال سازی ژن GFP توسط siRNA در سلولهای تیمار شده با نانوذرات PcSLN بطور قابل توجهی در مقایسه با شاهد کاهش یافت که مشابه با مطالعه ما بود که در آن میزان انتقال siRNA توسط نانوذرات MFMNPs برابر با 63/58 درصد بود و siRNA-FAM فاقد پوشش (کنترل) از قابلیت انتقال به سلولهای MCF-7 برخوردار نبود. همچنین روند مشابهی در زنده مانی سلولهای تیمار شده با نانوذرات PcSLN حاوی داروی پاکلیتاکسل مشاهده شد. به طوریکه میزان زندهمانی در سلولهای تیمار شده با PcSLN در مقایسه با داروی پاکلیتاکسل فاقد پوشش به طور معنیداری کاهش یافت (21و2).
علاوه بر آنچه در بالا ذکر شد تحقیقات مشابه متعددی کارایی انتقال همزمان دارو و siRNA را در اثر بخشی موثرتر دارو به اثبات رساندهاند که از جمله این تحقیقات میتوان به تحقیقات انجام شده توسط ویو و همکارانش در سال 2013، یان و همکارانش در سال 2015، هیو و همکارانش در سال 2012 اشاره کرد (6،19 و 20)
هدفمندسازی روش های درمانی به سلولهای سرطانی دارای پتانسیل فوق العاده ای است که می تواند در بقای بیمار و کیفیت زندگی تأثیر مثبت داشته باشد. بر اساس گزارشات قبلی استفاده همزمان از داروهای نوکلئیک اسید و همچنین داروهای مورد استفاده در شیمی درمانی از قابلیت بالایی در کنترل تومور برخوردار هستند. در این تحقق از قطعات زیست سازگار از قبیل کیتوزان، پلی لاکتیک اسید و پلی اتیلن گلیگول نانوذراتی تهیه شدند که بر اساس نتایج مشاهده شده در این تحقیق از قابلیت انتقال همزمان دارو پاکلی تاکسل و همچنین siRNA برخوردار بودند. الگوی رهش siRNAو پاکلیتاکسل از نانوذرات MFMNPs به شدت وابسته به اسیدیته محیط بود به گونهای که رهش دارو و siRNA در شرایط اسیدی به طور قابل مشاهده ای در مقایسه با شرایط فیزیولوژیکی بالا بود. باتوجه به اسیدی بودن بافت تومور به نظر میرسد این خصوصیت نانوذرات MFMNPs در درمان سرطان مفید واقع گردد اگرچه نتیجه گیری نهایی در این رابطه نیازمند به انجام تحقیقات وسیعی در شرایط In-vivo و بالینی میباشد.
تشکر و قدردانی
بدینوسیله از حمایت های دانشگاه آزاد اسلامی واحد اردبیل و همچنین از زحمات همکاران مرکز تحقیقات سلول های بنیادی دانشگاه جهت همکاری در این تحقیق، تقدیر و تشکر می گردد.
پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)