The RGD sequence improves the binding of collagen IV-derived peptides to integrins: an in silico study

توالی RGD اتصال پپتیدهای مشتق از کلاژن IV به اینتگرین­ها را بهبود می­بخشد: یک مطالعه in silico

ریحانه چمنی^1*، محسن نم­نبات¹، محمد حسین طالقانی¹ و آیلار ایمان­پور²

¹ ایران، یزد، دانشگاه یزد، گروه زیست­شناسی

² ایران، تهران، شبکه جهانی آموزش و پژوهش علمی (USERN)، گروه پزشکی بازساختی (REMED)

تاریخ دریافت: 18/09/1401          تاریخ پذیرش: 22/12/1401

چکیده

اینتگرین­های متصل شونده به RGD گیرنده­هایی هستند که در تومورهای مختلف بیش از حد بیان شده و نقش مهمی در رشد، رگزایی و متاستاز آنها دارند. از این رو، طراحی بازدارنده­های حاوی RGD برای مهار اینتگرین­ها و درمان سرطان بسیار مورد توجه بوده است. اَرستن، کانستاتین و تومستاتین، مهارکننده­های رگزایی مشتق از کلاژن IV، از طریق اتصال به اینتگرین­ها و مهار پیام­رسانی آنها عمل می­کنند. در مطالعه­ای نشان داده شد که پپتیدهای مشتق از ارستن (A)، کانستاتین (C) و تومستاتین (T) قادر به مهار رگزایی و رشد تومور بوده و پپتید C فعالتر از دو پپتید دیگر می­باشد. در مطالعه حاضر، توالی RGD به انتهای پپتیدهای مذکور اضافه شد و ساختار آنها بکمک شبیه­سازی دینامیک مولکولی و برهمکنش آنها با اینتگرین­های αvβ3، αvβ6، αvβ8، α5β1 و α6β1 با استفاده از نرم­افزار اوتوداک 4 بررسی شد. نتایج نشان دادند که افزودن RGD موجب تغییر ساختارهای دوم و کاهش نوسانات ساختاری در پپتیدها می­شود. همچنین، پپتیدهای دارای RGD با انرژی اتصال منفی­تری به تمام اینتگرین­ها متصل شده و انرژی اتصال پپتید CRGD منفی­تر از سایرین بود. بنابراین می­توان پپتیدهای حاوی RGD را برای انجام بررسی­های آزمایشگاهی بیشتر پیشنهاد نمود. در مجموع، نتایج این مطالعه می­تواند برای طراحی مهارکننده­های اینتگرین در جهت مهار رگزایی و رشد تومورها سودمند باشد.

واژه های کلیدی: داکینگ مولکولی، دینامیک مولکولی، مهارکننده رگزایی، اتوداک 4

^* نویسنده مسئول: chamani@yazd.ac.ir

مقدمه

اینتگرین­ها خانواده­ای از گیرنده­های گلیکوپروتئینی هستند که در اتصال سلول­ها به ماتریکس خارج سلولی و سایر سلول­ها نقش دارند. آنها پروتئین­های هترودایمری متشکل از یک زیرواحد α و یک زیرواحد β هستند. حداقل 18 زیرواحد α و هشت زیرواحد β مختلف شناخته شده است که 24 اینتگرین مختلف در انسان را بوجود می­آورند (31). تمام اینتگرین­ها دارای یک دامین خارج سلولی، یک دامین گذرنده از غشا و یک دم سیتوپلاسمی کوتاه هستند. زیرواحدهای α و β بشکل یک سر کروی با دو پا در سطح سلول قرار گرفته­اند (31). اینتگرین­ها می­توانند به لیگاندهای خارج سلولی و یا درون سلولی متصل شده و در نتیجه قادر به پیام­رسانی دوطرفه هستند. در پیام­رسانی "خارج به داخل"، لیگاندهای خارج سلولی به اینتگرین متصل شده، تغییرات ساختاری خاصی را در آن القاء کرده و اینتگرین را فعال می­کنند که منجر به تنظیم فرآیندهای مختلفی مانند تکثیر سلولی، مهاجرت، بقا، رگزایی، بهبود زخم، تمایز سلولی و تهاجم می­شود. در پیام­رسانی "داخل به خارج"، تعامل پروتئین­های داخل سلولی با دم سیتوپلاسمی، اینتگرین را فعال نموده و چسبندگی سلول به ماتریکس خارج سلولی را تنظیم می­کند. بطور کلی، تغییر ساختاری در اینتگرین منجر به تغییر از یک ساختار خمیده و غیرفعال به یک ساختار غیرخمیده و فعال می­گردد (4). اینتگرین­ها بر اساس نوع لیگاند متصل شونده، به چهار زیرخانواده شامل اینتگرین­های الف) متصل شونده به کلاژن، ب) متصل شونده به لامینین، ج) متصل شونده به RGD و د) اختصاصی لکوسیت­ها دسته­بندی می­شوند. هر هشت اینتگرین متصل شونده به RGD یعنی اینتگرین­های αvβ1، αvβ3، αvβ5، αvβ6، αvβ8، α5β1، α8β1 و αIIbβ3 موتیف Arg-Gly-Asp (RGD) را در لیگاندهای خود شناسایی می­کنند (25). اغلب اعضای این دسته از اینتگرین­ها در سلول­های توموری مختلف بیش از حد بیان می­شوند و در رشد تومور، رگزایی و متاستاز نقش دارند. علاوه بر این، در سایر بیماری­ها مانند اختلالات عصبی، سپسیس، فیبروز، بیماری­های قلبی عروقی و عفونت­های ویروسی نقش ایفا می­کنند (37). از این رو، در سال­های اخیر مطالعات پیش‌بالینی و بالینی متعددی بر روی مهارکننده‌های اینتگرین از جمله آنتاگونیست‌های دارای موتیف RGD برای اهداف درمانی و تشخیصی انجام شده است (21).  کلاژن نوع IV، فراوان­ترین جزء غشاء پایه، از یک ساختار مارپیچ هتروتریمر متشکل از زنجیره­های α مختلف (α1- α6) ساخته شده است. هر زنجیره α از سه دامین تشکیل شده است: یک دامین کوتاه S7 در انتهای آمین، یک دامین مارپیچی مرکزی و یک دامین کروی غیرکلاژنی (NC1) در انتهای کربوکسیل (34). پروتئین­هایی که بطور آنزیمی از دامین NC1 زنجیره­های α2، α1 و α3 جدا می­شوند بترتیب اَرِستِن، کانستاتین و تومستاتین نامیده می­شوند و مشخص شده است که اثرات ضدرگزایی و ضدتوموری قوی­ای دارند (15، 29، 30). این پروتئین­ها با برخی از اینتگرین­ها تعامل دارند و مسیرهای پیام­رسانی آنها را مهار می­کنند. بعنوان مثال، اَرِستِن اثرات ضدرگزایی و ضدتوموری خود را از طریق تعامل با اینتگرین α1β1 اعمال می­کند (3). کانستاتین با اینتگرین­های حاوی β1 (بعنوان مثال α1β1 و α3β1) و اینتگرین αvβ5 روی سلول اندوتلیال تعامل دارد (32). علاوه بر این، القاء آپوپتوز توسط کانستاتین در هر دو نوع سلول اندوتلیال و توموری از طریق اینتگرین αvβ3 و αvβ5 انجام می­شود (24). تومستاتین به اینتگرین αvβ3 به روشی مستقل و/یا وابسته به RGD متصل می­شود. علاوه بر این، بنظر می­رسد که اینتگرین α3β1، α1β1 و αvβ5 گیرنده­های سطح سلول­های اندوتلیال برای تومستاتین هستند (11 و 15). با این حال، اتصال این پروتئین­ها به سایر اینتگرین­ها هنوز مورد بررسی قرار نگرفته و اسید­آمینه­های مسئول اتصال در این پروتئین­ها شناسایی نشده است. با توجه به مزایای پپتیدها نسبت به مولکول­های کوچک، پروتئین­های نوترکیب و آنتی­بادی­ها، محققان در حال توسعه پپتیدهای ضدرگزایی و ضدسرطان هستند. در همین راستا، چندین مطالعه برای شناسایی نواحی فعال در پروتئین تومستاتین انجام شد و نتایج نشان دادند که دو پپتید همپوشان بنام‌های T3 (اسید­آمینه­­های 88-69) و T7 (اسید­آمینه­های 98-74) موثرتر از سایر قطعات تومستاتین هستند (23). جهش­زایی هدفمند مشخص کرد که اسید­آمینه­های لوسین 78، والین 82 و آسپارتات 84 برای فعالیت ضدرگزایی تومستاتین با واسطه اینتگرین αvβ3 ضروری هستند (11). از طرفی، گرافتون و همکاران نشان دادند که یک پپتید کوتاهتر حاوی تنها 15 اسید­آمینة همپوشان از T7 و T3 زنده‌مانی سلول‌های اندوتلیال و رگزایی را در شرایط آزمایشگاهی کاهش می­دهد (13). بنابراین ما در مطالعات قبلی ساختار و فعالیت پپتید 9 اسید­آمینه­ای از همین قطعه حاوی لوسین 78، والین 82 و آسپارتات 84 را با قطعات متناظر از ارستن و کانستاتین مقایسه نمودیم. نتایج نشان دادند که این پپتیدها می‌توانند زنده‌مانی، مهاجرت و تشکیل لوله را در سلول‌های اندوتلیال و همچنین رشد تومور را در موش کاهش دهند (6). همچنین ساختار پپتیدها با استفاده از شبیه‌سازی‌ دینامیک مولکولی و اتصال آنها به اینتگرین αvβ3 از طریق شبیه­سازی داکینگ مولکولی بررسی شد. بطور کلی، نتایج نشان دادند که پپتید مشتق از کانستاتین فعالتر از دو پپتید دیگر بوده و با انرژی اتصال منفی­تری به اینتگرین αvβ3 متصل می­شود (6). در مطالعه حاضر، با توجه به اهمیت اینتگرین­های متصل شونده به RGD در رگزایی، رشد و تهاجم تومور، توالی RGD به انتهای پپتیدهای مشتق‌ از اَرِستِن، کانستاتین و تومستاتین افزوده شد و ساختار آنها بکمک شبیه­سازی دینامیک مولکولی و همینطور برهمکنش آنها با اینتگرین­های αvβ3، αvβ6، αvβ8، α5β1 و α6β1 بکمک شبیه­سازی داکینگ مولکولی بررسی شد و با پپتیدهای فاقد RGD مقایسه گردید. هدف از این مطالعه پاسخ به این سوال بود که آیا افزودن RGD به توالی پپتیدها منجر به افزایش اتصال آنها به اینتگرین­ها خواهد شد یا خیر.

مواد و روشها

-          شبیه­سازی دینامیک مولکولی پپتیدها

پپتیدهای دارای RGD مشتق از اَرِستِن، کانستاتین و تومستاتین بترتیب با عنوان ARGD، CRGD و TRGD نامگذاری شدند. ساختار اولیه این پپتیدها با استفاده از برنامه MODELLER ساخته شد و برای شبیه‌سازی‌ دینامیک مولکولی استفاده شد. شبیه­سازی­ها با استفاده از بسته GROMACS 4.5.5 و میدان نیروی CHARMM انجام شدند. پپتیدها در یک جعبه مکعبی حاوی آب شارژ نقطه­ای ساده برای حلالیت قرار داده شدند. سیستم با افزودن یون­های Na⁺ و Cl^- خنثی شد. در تمام شبیه‌سازی‌ها، فشار و دما با استفاده از الگوریتم Berendsen بترتیب نزدیک به مقادیر یک بار و 360 درجه کلوین حفظ شد. سرعت اولیه اتم­ها بطور تصادفی از توزیع ماکسول- بولتزمن در دمای اولیه بدست آمد. قبل از شروع شبیه­سازی، کمینه­سازی انرژی با استفاده از الگوریتم شیب­دارترین نزول انجام شد. سپس، سیستم­ها بمدت 100 پیکوثانیه تحت شرایط NVT (تعداد ذرات، حجم و دمای ثابت) و 1000 پیکوثانیه تحت شرایط NPT (تعداد ذرات، فشار و دمای ثابت) متعادل شدند. در نهایت، مرحله تولید در دمای 300 درجه کلوین برای 50 نانوثانیه انجام شد. داده­ها در فواصل زمانی نیم پیکوثانیه از شبیه­سازی­ها استخراج شدند و مقادیر RMSD، RMSF، شعاع ژیراسیون (Rg) و DSSP بدست آمدند.

-          شبیه­سازی اتصال پپتیدها به اینتگرین­ها با برنامه اتوداک 4.2

اتصال پپتیدها به اینتگرین­های αvβ3 (PDB ID: 4G1M)، αvβ6 (PDB ID: 4UM8)، αvβ8 (PDB ID: 6OM1)، α5β1 (PDB ID: 7NXD) و α6β1 (PDB ID: 7CBE) با استفاده از برنامه AutoDock 4 شبیه­سازی شد. ساختار کریستالی گیرنده­ها با PDB ID ذکر شده از سایت (https://www.rcsb.org/) RCSB PDB بارگیری شدند. در این مطالعه، پپتیدهای بدون RGD مشتق از اَرِستِن، کانستاتین و تومستاتین بترتیب با عنوان A، C و T نامگذاری شدند که از ساختار پپتیدهای حاصل از شبیه­سازی دینامیک مولکولی انجام شده در مطالعه قبل (6) و از ساختار پپتیدهای ARGD، CRGD و TRGD حاصل از شبیه‌سازی‌ دینامیک مولکولی مطالعه حاضر برای داکینگ با اینتگرین­ها استفاده شد. توالی پپتیدها در جدول 1 آورده شده است.

جدول 1: توالی اسید­آمینه­ای پپتیدها

افزودن اتم­های هیدروژن قطبی با جهت مناسب به گیرنده­ها و لیگاندها و ادغام هیدروژن­های غیرقطبی قبل از آغاز داکینگ انجام شد. سپس، بارهای گاستایگر و کولمن محاسبه و اضافه شدند. فایل­های PDB با فرمت PDBQT ذخیره شدند. در داکینگ انجام شده، پپتیدها انعطاف­پذیر و گیرنده­ها بدون انعطاف در نظر گرفته شدند. برای اکثر پارامترها از تنظیمات پیش فرض برنامه استفاده شد. الگوریتم بکار برده شده، ژنتیک لامارکی و تعداد اجراها 50 مورد بود. از آنجایی که هیچ اطلاعاتی درباره ناحیه اتصالی پپتیدها روی گیرنده­ها وجود ندارد، برای مشخص کردن جعبه گرید، ناحیة به اصطلاح "سر" اینتگرین­ها به چند بخش تقسیم شد و چندین داکینگ مختلف انجام شد. در نهایت، انرژی‌های اتصال کمپلکس‌های خروجی بررسی شد و کمپلکس با منفی­ترین انرژی اتصال به عنوان بهترین مدل انتخاب شد و اسیدهای آمینه درگیر در اتصال در بهترین مدل‌ها توسط برنامه Biovia Discovery Studio 2021 تعیین شدند.

نتایج

-   شبیه­سازی دینامیک مولکولی پپتیدهای دارای RGD

برای پاسخ به این سوال که اضافه کردن RGD چه تاثیری بر ساختار پپتیدهای مشتق از ارستن، کانستاتین و تومستاتین دارد، از روش شبیه­سازی دینامیک مولکولی استفاده شد. ابتدا پپتیدها بمدت 50 نانوثانیه تحت شبیه­سازی قرار گرفتند و در پایان پارامترهای RMSD، RMSF، DSSP، شعاع ژیراسیون (Rg) به دست آمدند. انحراف ریشه میانگین مربعات (RMSD) کربن­های آلفای توالی پپتیدی در طول شبیه‌سازی، پایداری ساختاری مولکول را نشان می‌دهد. نتایج برای سه پپتید دارای RGD نشان دادند که شبیه­سازی­ها پایدار بوده و مقادیر RMSD دارای انحرافات قابل تحمل بودند. میانگین مقادیر RMSD در طول زمان شبیه­سازی برای ARGD، CRGD و TRGD بترتیب 11/0، 13/0 و 18/0 آنگستروم بود (شکل 1 الف).

نوسانات ریشه میانگین مربعات (RMSF) کربن­های آلفا نشان دهنده میزان نوسانات هر اسید­آمینه در طول شبیه­سازی است. شکل 1 ب نشان می­دهد که نوسانات کلی پپتید ARGD کمتر از سایرین است و اسید­آمینه­های ابتدا و انتها بیشتر از سایر اسید­آمینه­ها در پپتیدهای CRGD و TRGD نوسان دارند. میانگین مقادیر RMSF در طی زمان شبیه­سازی برای ARGD، CRGD و TRGD بترتیب 08/0، 17/0 و 29/0 آنگستروم محاسبه شد.

برای بررسی نوع ساختارهای دوم در پپتیدهای دارای RGD، میزان DSSP (ساختار دوم تعریف شدة پروتئین) از شبیه­سازی­ها بدست آمد و درصد هر ساختار محاسبه شد. شکل 1ج و جدول 2 نشان می­دهد که ARGD بیشتر شامل پیچه تصادفی، صفحات بتا و پیچ است، در حالی که CRGD عمدتا از پیچه تصادفی و پیچ تشکیل شده است. TRGD فاقد صفحات بتا و پل بتا است و بیشتر دارای پیچه تصادفی و خمش بتا است.

مقدار شعاع ژیراسیون (Rg)، فشردگی ساختاری مولکول را نشان می­دهد. ساختار کمتر فشرده مقدار Rg بالاتری دارد (20). مقادیر میانگین Rg در طول زمان شبیه­سازی برای ARGD، CRGD و TRGD بترتیب 61/0، 62/0 و 83/0 نانومتر بود (شکل 1د). مقدار Rg بالاتر برای TRGD کانفورماسیون با فشردگی کمتر را نشان می­دهد که این مورد با نتایج RMSF و DSSP برای TRGD مطابقت دارد. این پپتید ساختار پیچه تصادفی و نوسانات بالاتری داشته، بنابراین فشردگی کمتری دارد. مقادیر مربوط به RMSF، ساختارهای دوم و شعاع ژیراسیون در مطالعه قبلی برای پپتیدهای فاقد RGD محاسبه شده بود (6) و در جدول 2 جهت مقایسه با نتایج حاضر آورده شده­اند.

-   شبیه­سازی داکینگ مولکولی پپتیدها با اینتگرین­ها

از برنامه اوتوداک 4 برای بررسی و مقایسه اتصال پپتیدهای فاقد و دارای RGD به اینتگرین­های αvβ3، αvβ6، αvβ8، α5β1 و α6β1 استفاده شد.

جدول 2: داده­های حاصل از شبیه­سازی دینامیک مولکولی برای پپتیدهای دارای RGD در مقایسه با پپتیدهای فاقد RGD

شکل 1: شبیه­سازی دینامیک مولکولی پپتیدهای دارای RGD الف) انحراف ریشه میانگین مربعات یا RMSD کربن­های آلفای توالی پپتیدها در طی 50 نانوثانیه از زمان شبیه­سازی ب) نوسانات ریشه میانگین مربعات یا RMSF اسیدهای آمینه پپتیدها در طی شبیه­سازی ج) ساختارهای دوم پپتیدها حاصل از DSSP د) شعاع ژیراسیون یا Rg در طی شبیه­سازی

اینتگرین­هایی انتخاب شدند که ساختار کریستالی آنها در پایگاه RCSB PDB موجود بود و بدلیل در دسترس نبودن ساختار کریستالی سایر اینتگرین­های زیرخانواده متصل شونده به RGD، انجام داکینگ برای آنها ممکن نبود. برای هر پپتید و گیرنده منفی­ترین انرژی اتصال بر حسب کیلو کالری بر مول در جدول 3 آورده شده است. با نگاهی به اعداد بدست آمده مشخص شد که از میان پپتیدهای طبیعی، پپتید مشتق از کانستاتین (پپتیدC ) و در بین پپتیدهای دارای RGD نیز پپتید CRGD منفی­ترین انرژی اتصالی به تمام اینتگرین­ها را دارد. همچنین مقایسه انرژی اتصال بین پپتیدهای فاقد و دارای  RGDنشان داد که افزودن این موتیف سه اسید­آمینه­ای به پپتیدها قدرت اتصال آنها به اینتگرین­ها را افزایش داد. آرژینین و آسپارتات از موتیف RGD در اتصال پپتیدها به اینتگرین­ها بویژه αvβ6 و αvβ8 نقش داشتند (جداول تکمیلی 1 تا 5 ). منفی­ترین انرژی اتصال برای هر سه پپتید دارای RGD مربوط به اتصال به اینتگرین­  α5β1 است و در رتبه­های بعدی αvβ8 و α6β1 قرار دارند.

جدول 3: انرژی اتصال پپتیدها به اینتگرین­ها (کیلوکالری بر مول) حاصل از شبیه­سازی داکینگ مولکولی با برنامه اتوداک 4

اسید­آمینه­های درگیر در اتصال در بهترین کمپلکس­ها (دارای منفی­ترین انرژی اتصالی) با استفاده از برنامه دیسکاوری استودیو 2021 تعیین شدند که در جدول­های تکمیلی 1 تا 5  و شکل­های 2 تا 6 نشان داده شده­اند.

جدول 4: بررسی اتصال پپتیدها به اینتگرین α5β1 با اوتوداک 4 و نرم­افزار دیسکاوری استودیو

شکل 2: بررسی اتصال پپتیدهای دارای RGD به اینتگرین αvβ3 با استفاده از داکینگ مولکولی. رزیدوهای درگیر در اتصال در اینتگرین با رنگ سبز و شماره رزیدوهای آن با رنگ قرمز نمایش داده شده است. پپتیدها با سایر رنگ­ها نشان داده شده­اند. برای تهیه تصاویر از برنامه دیسکاوری استودیو استفاده شد.

جدول 5: بررسی اتصال پپتیدها به اینتگرین α6β1 با اوتوداک 4 و نرم­افزار دیسکاوری استودیو

بکمک این برنامه پیوندهای هیدروژنی، الکترواستاتیک و آبگریز شامل پیوندهای کربن-کربن، الکیل-الکیل، پای-پای و پای-اکیل بین اسیدهای آمینه در لیگاند و گیرنده مشخص شدند. بطور کلی می­توان گفت که محل اتصال پپتیدها روی اینتگرین­ها نزدیک بهم هستند اما کاملا یکسان نبوده و تا حدودی با هم تفاوت دارند. بعنوان مثال، پپتیدC  به اسید­آمینه­های شماره 18، 42، 91، 111، 113، 164، 165، 176، 190، 266، 268، 269 و 288 در اینتگرین αvβ6 متصل شد و پپتید CRGD به اسید­آمینه­های شماره 18، 42، 52، 91، 113، 122، 164، 165، 166، 176، 286، 288 و 289 متصل گردید که هشت اسید­آمینه در این بین یکسان و بقیه متفاوت بودند (شکل 3). همچنین، ARGD به اسید­آمینه­های شماره 164، 176، 189، 283 و 285 متصل شد و TRGD به اسید­آمینه­های شماره 178، 215، 216، 218، 220، 248 و 256 در اینتگرین اتصال یافت که اسیدآمینه­های 164 و 176 بین CRGD و ARGD مشترک هستند اما با TRGD اسید­آمینه مشترکی ندارند، هرچند، نواحی اتصالی بسیار نزدیک هستند. برای سایر پپتیدها و اینتگرین­ها نیز همین روند وجود داشت که برای مشاهده اسیدهای آمینه درگیر در اتصال در سایر گیرنده­ها به جدول‌های تکمیلی 1 تا 5 مراجعه شود (پیوست).

بحث

اینتگرین­ها گیرنده­هایی هستند که در تنظیم فرآیندهای حیاتی مانند تکثیر، مهاجرت، بقا، رگزایی، بهبود زخم، تمایز، تهاجم و چسبندگی در سلول­ها دخالت دارند (37).

در دو دهه اخیر، مطالعات پیش­بالینی و بالینی متعددی بر روی مهارکننده­های اینتگرین­ها برای بیماری­های مختلف انجام شده است (21) و شش مهارکننده که اینتگرین­های αIIbβ3، α4β7، α4β1 و αLβ2 را هدف قرار می‌دهند برای بیماری خشکی چشم، کولیت اولسراتیو، مولتیپل اسکلروزیس و سندرم حاد کرونری تأیید شده‌اند (37).

اینتگرین­های αvβ1، αvβ3، αvβ5، αvβ6، αvβ8، α5β1، α8β1 و αIIbβ3 جزو دسته اینتگرین­های متصل شونده به RGD بوده که میزان بیان اغلب اعضای این زیرخانواده در سلول­های توموری بشدت بالا بوده و در رشد تومور، رگزایی و متاستاز نقش دارند (25).

بیشترین پژوهش­ها روی اینتگرین αvβ3 انجام شده است. این گیرنده در طول رگزایی تومور، بر روی سلول‌های اندوتلیال در حال رگزایی بمقدار زیادی بیان می‌شود و واسطه تعامل سلول‌های اندوتلیال فعال با ماتریکس خارج سلولی است. همچنین این گیرنده در روند پیشرفت تومور باعث تشکیل لاملی و فیلوپودیا شده، مهاجرت و تهاجم سلول‌های سرطانی و انقباض سلولی را تنظیم می‌کند. اینتگرین αvβ3 در سرطان­های پستان، معده، گلیوما، متاستازهای مغزی، ریه، پروستات، پانکراس، کارسینوم سلول سنگفرشی دهان، تخمدان با پیشرفت تومور ارتباط دارد (41).

اینتگرین αvβ6 منحصراً در سلول­های اپیتلیال و در سرطان­هایی مانند سرطان سلول سنگفرشی دهان، پستان، روده بزرگ، کبد، تخمدان و پانکراس بیش از حد بیان می­شود و در تهاجم تومور نقش دارد. این گیرنده با بقای ضعیف بیمار و همچنین مقاومت به شیمی­درمانی و پرتودرمانی مرتبط است (28).

شکل 3: مطالعه برهمکنش پپتیدهای فاقد و دارای RGD با اینتگرین αvβ6 بوسیله برنامه اوتوداک 4. رزیدوهای درگیر در اتصال اینتگرین با رنگ سبز و شماره رزیدوها با رنگ قرمز نمایش داده شده است. پپتیدها با سایر رنگ­ها نشان داده شده­اند.

شکل 4: شبیه­سازی برهمکنش پپتیدها با اینتگرین αvβ8 با استفاده از داکینگ مولکولی. (راهنمای رنگها همانند شکلهای قبل است). برای تهیه تصاویر از برنامه دیسکاوری استودیو استفاده شد.

شکل 5: شبیه­سازی داکینگ مولکولی پپتیدها با اینتگرین α5β1. (راهنمای رنگها همانند شکلهای قبل است).

شکل 6: مطالعه برهمکنش پپتیدها با اینتگرین α6β1 بوسیله داکینگ مولکولی. (راهنمای رنگها همانند شکلهای قبل است).

اینتگرین  αvβ8در سرطان­های سر و گردن، ریه سلول غیرکوچک و پروستات شناسایی شده و در رگزایی نقش دارد (17). یکی دیگر از نشانگرهای مهم رگزایی در سلول­های اندوتلیال، اینتگرین α5β1 است که با بدخیمی تومور، تهاجم و متاستاز ارتباط دارد. در طول فرآیندهای تهاجم، اینتگرین α5β1 افزایش تولید نیروهای چسبندگی، تشکیل فیبر تنش و نیروهای انقباضی را تسهیل می‌کند. این گیرنده بر روی سلول­های تومور مانند کارسینوم سلول سنگفرشی دهان و سلول­های سرطانی تخمدان بیان می­شود (26). اینتگرین α6β1 برای چسبندگی پلاکت­ها به لامینین­ها حیاتی است. لامینین­ها فراوان­ترین اجزای غشای پایه اطراف سلول­های عضله صاف اندوتلیال و میانی هستند و از طریق تنظیم چسبندگی سلولی، تکثیر، تمایز، مهاجرت و آپوپتوز نقش مهمی در رگزایی و حفظ معماری عروق دارند. اینتگرین α6β1 پس از اتصال به لامینین، پلاکت‌ها را با شروع سیگنال‌هایی که سازمان‌دهی مجدد اسکلت سلولی و انتشار فیلوپودیا را ترویج می‌کنند، فعال می‌کند (38).

با توجه به اهمیت اینتگرین­ها در پیشرفت سرطان­ها، در دهه‌های اخیر مطالعات پیش‌بالینی و بالینی متعددی بر روی مهارکننده‌های اینتگرین­ها برای اهداف درمانی و تشخیصی انجام شده است. توالی RGD در حال حاضر پایه اصلی برای طراحی انواع مولکول­های دارای اتصال انتخابی به اینتگرین αvβ3 و سایر اینتگرین­ها است (37). آنتاگونیست‌های αvβ3 فرصتی را برای رساندن داروهای شیمی‌درمانی و پرتودرمانی به اندوتلیوم تومور فراهم می‌کنند. می‌توان در سطح نانوحامل‌هایی مانند لیپوزوم‌ها، نانوذرات، میسل‌ها و غیره، توالی دارای RGD قرار داد تا بطور خاص داروها را به سلول‌های اندوتلیال رگزا و/یا سلول‌های سرطانی که اینتگرین­ها را بیان می­کنند تحویل دهند و به این ترتیب امکان هدف‌گیری فعال تومورها را فراهم می­کنند (21).

بطور سنتی، برای ارزیابی پاسخ بیمار به شیمی­درمانی از روش­های تصویربرداری مانند توموگرافی گسیل پوزیترون (PET) و تصویربرداری رزونانس مغناطیسی (MRI) استفاده می‌شود. اخیرا، علاقه زیادی برای شناسایی و توسعه نشانگرهای مولکولی پاسخ تومور به درمان پدید آمده است. یکی از امیدوارکننده­ترین و بهترین اهداف مورد مطالعه، استفاده از نشانگرهای مولکولی حاوی RGD برای اتصال به اینتگرین αvβ3 در سطح تومور است که می­توان آنها را با تکنیک­های تصویربرداری تشخیص داد (9).

علی­رغم مطالعات گسترده در دهه­های گذشته، تنها چند آنتاگونیست از نوع مولکول­های شیمیایی کوچک وارد آزمایشات بالینی شده­اند. یکی از اشکالات عمده آنتاگونیست­های اینتگرین αvβ3، فارماکولوژی پیچیده وابسته به غلظت آنها است. سیلنژیتید (Cilengitide) که یک پپتید پنج اسید­آمینه­ای حلقوی دارای RGD برای هر دو اینتگرین αvβ3 و αvβ5 است، برای درمان گلیوبلاستوما طراحی شد اما عملکرد آن به اثرات ضدرگزایی مورد انتظار منجر نشد. استفاده از سیلنژیتید با غلظت‌های کمتر از مقدار IC₅₀، اثرات آگونیستی (تحریکی) نشان داد در حالی که در غلظت‌های بالاتر از IC₅₀، اثرات متضاد و آنتاگونیستی (مهاری) رخ داد. از این نظر، بویژه بدلیل فارماکوکینتیک سریع، یعنی نیمه عمر 4 ساعته سیلنژیتید در گردش خون انسان، حتی دوزهای سیستمیک بالا نیز احتمالاً چند ساعت پس از مصرف دارو منجر به دوزهای پایین در تومور و اثرات آگونیستی می­شوند. همچنین، فقدان فراهمی زیستی خوراکی مهارکننده­های اینتگرین یک محدودیت عمده برای استفاده بالینی آنها است (21 و 35). بنابراین، هنوز توسعه داروهای سرطان که اینتگرین­های متصل شونده به RGD را هدف قرار می­دهند، با چالش­های مهمی روبرو است. بیشتر این مهارکننده­های اینتگرین، آنتی­بادی و مولکول­های کوچک شیمیایی هستند. استفاده از پپتیدها بجای آنتی­بادی­ها و مولکول­های کوچک می­تواند مزایایی مانند ایمنی­زایی کم، سمیت کم و تولید ساده­تر و مقرون به صرفه­تر داشته باشد (40).

اَرِستِن، کانستاتین و تومستاتین که بترتیب از دامین انتهای کربوکسیل زنجیره­های α2، α1 و α3 کلاژن IV جدا می­شوند اثرات ضدرگزایی و ضدتوموری قوی­ای دارند (34). این پروتئین­ها اثرات خود را از طریق اتصال به برخی از اینتگرین­ها و مهار مسیر پیام­رسانی آنها اعمال می­کنند (3). اخیرا، ما در مطالعه­ای فعالیت پپتیدهای 9 اسید­آمینه­ای مشتق از اَرِستِن، کانستاتین و تومستاتین را با یکدیگر مقایسه کردیم و نشان دادیم که پپتید مشتق از کانستاتین (با نام پپتید C) بیشتر از دو پپتید دیگر، زنده­مانی، مهاجرت و تشکیل توبول را در سلول­های اندوتلیال HUVEC و رشد تومور را در موش­های دارای سرطان کولون مهار می­کند. همچنین ساختار پپتیدها با استفاده از طیف­سنجی CD و شبیه­سازی دینامیک مولکولی و اتصال پپتیدها به اینتگرین αvβ3 بکمک برنامه اتوداک 4 بررسی شد. نتایج نشان دادند که پپتید C با انرژی اتصال منفی­تری به این گیرنده اتصال می­یابد و پیشنهاد داده شد که تفاوت برخی از اسیدهای آمینه در توالی این پپتیدها مسئول تفاوت ساختاری، تفاوت در اتصال به اینتگرین و در نتیجه عملکرد آنها است (6). در مطالعه­ای دیگر نشان داده شد که پپتید C قادر به القاء آپوپتوز در سلول­های HUVEC و سلول­های تومور می­باشد (7). مطالعات مختلف نشان داده است که افزودن موتیف RGD به پپتیدهای متصل شونده به اینتگرین یکی از استراتژی­های مهم برای افزایش قدرت اتصال و کارایی آنها است. البته این سوال ممکن است مطرح شود که افزودن یک توالی سه اسید­آمینه­ای ممکن است بر ساختار و در نتیجه فعالیت آن پپتید یا پروتئین اثرگذار باشد و این استراتژی فعالیت ضدرگزایی و ضدسرطانی آنها را بهبود میبخشد یا خیر. در چندین مطالعه این مسئله بشکل تجربی بررسی شده است. یکی از مهارکننده­های مهم رگزایی، اندواستاتین است که بر روی پپتیدهای مختلفی از این پروتئین مطالعه شده است. سپس، در چند مطالعه اثر افزودن توالی RGD بر فعالیت پپتیدهای مشتق از اندواستاتین بررسی شده است. بعنوان مثال Pu و همکاران نشان دادند که اضافه کردن RGD به توالی 48-6 انتهای آمین اندواستاتین موجب مهار بیشتر مهاجرت و رگزایی ­سلول­های اندوتلیال و منجر به فعالیت ضدتوموری قوی آن می­گردد. بررسی­ها نشان داد که هدف این پپتید اصلاح شده (با نام EDSM) روی سلول­های اندوتلیال، اینتگرین αvβ3 بود (33). همچنین Xu و همکاران دریافتند که پپپتید مشتق از اسید­آمینه­های 70-60 انتهای آمین اندوستاتین (با نام ES-2) مهاجرت و رگزایی سلول­های اندوتلیال را مهار می­کند اما هیچ تاثیری بر رشد تومور در موش ندارد. با این حال، هنگامی که RGD به ES-2 افزوده شد، این پپتید اصلاح شده نتایج ضدتوموری قابل توجهی را در مدل­های حیوانی نشان داد و موجب کاهش رگزایی در تومورها گردید (44). همچنین Li و همکاران توالی RGDRGD را به انتهای اسید­آمینه­های شماره 1-25 اندواستاتین افزودند و نشان دادند که این پپتید اصلاح شده بسیار موثرتر از پپتید بدون RGD تکثیر، متاستاز، رگزایی و تهاجم رده سلولی HepG2 را سرکوب می­کند (19). حمدان و همکاران توالی RGD را به پپتید FAKLF متصل کردند و نشان دادند که این ساختار فیوژن شده در مهار تکثیر سلول­های اندوتلیال و القاء آپوپتوز قوی­تر از پپتیدهای مجزای RGD و FAKLF عمل می­نماید (16). در مطالعه دیگری توالی RGD به یک پروتئین مهارکننده رگزایی بنام VEGI-192 افزوده شد. نتایج نشان دادند که این پروتئین نوترکیب انسانی بشدت رشد سلول­های اندوتلیال را در شرایط آزمایشگاهی مهار کرد و رگزایی را در مدل غشای کوریوآلانتوئیک مرغ بمیزان بالاتری نسبت به پروتئین بدون RGD سرکوب نمود. همچنین، این پروتئین اصلاح شده توانست بطور قابل توجهی رشد سلول­های MDA-MB-435 را در شرایط آزمایشگاهی مهار کند و باعث آپوپتوز در آنها شود در حالی که پروتئین بدون RGD چنین اثری را نشان نداد (42). از این رو در مطالعه حاضر، توالی RGD به انتهای توالی پپتیدهای مشتق از اَرِستِن، کانستاتین و تومستاتین اضافه شد که بترتیب بنام پپتیدهای ARGD، CRGD و TRGD نامگذاری شدند. ساختار این پپتیدها با استفاده از شبیه­سازی دینامیک مولکولی و نحوه اتصال آنها به اینتگرین­های αvβ3، αvβ6، αvβ8، α5β1 و α6β1 توسط شبیه­سازی داکینگ مولکولی با نرم­افزار اتوداک 4 بررسی و با پپتیدهای فاقد RGD مقایسه شد.    

داکینگ مولکولی یک روش طراحی داروی مبتنی بر ساختار است که تعامل­های مولکولی را شبیه‌سازی می‌کند و حالت اتصال و میل ترکیبی بین گیرنده‌ و لیگاند را پیش‌بینی می‌نماید (2). در سال­های اخیر، این روش بطور گسترده­ای در زمینه تحقیقات مربوط به طراحی داروها و کشف بسیاری از داروهای تایید شده مانند مهارکننده­های پروتئاز HIV-1 مورد استفاده قرار گرفته است. در حال حاضر روش­های in silico از جمله داکینگ مولکولی بدلیل مزایایی مانند سرعت بالا و هزینه پایین در مقایسه با روش­های آزمایشگاهی برای شناسایی و غربالگری لیگاندها، اولین قدم در کشف و توسعه داروها هستند (1). افزایش ظرفیت محاسباتی و در دسترس بودن ساختار کریستالی پروتئین­ها از عوامل اصلی پیشرفت این روش­ها بوده است. اگر قبل از بخش آزمایشی هر تحقیقی از روش­ شبیه­سازی داکینگ مولکولی استفاده شود می‌تواند بدون صرف هزینه­ و زمان فراوان امکان­پذیری انجام هر ایده یا فرضیه­ای را در زمینه طراحی دارو نشان دهد (5 و 12).

تحقیق حاضر نیز با هدف بررسی این فرضیه انجام شد که آیا افزودن توالی RGD در بهبود اتصال به اینتگرین­ها موثر است یا خیر تا بتوان از نتایج بدست آمده برای بررسی تجربی و آزمایشگاهی این ایده و طراحی یک پپتید ضدرگزا و ضدتومور موثر بهره برد. مقایسه نتایج حاصل از شبیه­سازی دینامیک مولکولی پپتیدهای فاقد و دارای RGD (جدول 2) مشخص کرد که افزودن RGD به پپتیدهای A و C منجر به کاهش درصد ساختار پیچ و افزایش صفحات بتا و پل بتا شد. این تغییرات منجر به کاهش نوسانات کلی ساختاری گردید که با مقادیر کمتر RMSF مشخص شد. با این حال، برای پپتید T، افزودن RGD منجر به کاهش ساختار پیچ و افزایش ساختارهای خمش بتا و پیچه تصادفی شد که این تغییرات موجب انعطاف­پذیری بالاتر و فشردگی کمتر در مقایسه با پپتید بدون موتیف RGD گردید. می­توان پیشنهاد داد که تفاوت بین TRGD و سایر پپتیدهای RGD به تفاوت در توالی اسید­آمینه­ای آنها مربوط می­شود. توالی پپتیدها در جدول 1 آورده شده است. مقایسه اتصال پپتیدهای فاقد و دارای RGD به اینتگرین­های αvβ3، αvβ6، αvβ8، α5β1 و α6β1 با استفاده از شبیه­سازی داکینگ مولکولی نشان داد که پپتیدهای دارای RGD با انرژی اتصال منفی­تری به تمام این اینتگرین­ها متصل می­شوند و در این بین انرژی اتصالی پپتیدCRGD  منفی­تر از سایرین بود. منفی­ترین انرژی اتصال برای هر سه پپتید دارای RGD مربوط به اتصال به اینتگرین­  α5β1بود. در ساختار کریستالی اینتگرین αvβ3 با یک تری پپتید RGD مشخص شده است که آسپارتات­های 218 و 150، تیروزین 122، آسپاراژین 215 و آرژینین­های 214 و 216 در اتصال به این پپتید نقش دارند (43). همچنین، ساختار کریستالی اکتودمین اینتگرین α5β1 با یک هگزاپپتید به توالی GRGDNP نشان داد که آسپارتات 227 و گلوتامین 221 در اینتگرین به این پپتید متصل می­شوند (27). در ساختار کریستالی زیرواحد بتا اینتگرین αvβ6 مشخص شد که آلانین 126، آسپارتات 218 و ترئونین 221 اینتگرین به RGD درون لیگاند TGF-β متصل می­شوند (10). محل اتصال پپتیدهای حاوی RGD در مطالعه حاضر تنها در اتصال TRGD به آرژینین 216 اینتگرین αvβ3 و به آسپارتات 218 اینتگرین αvβ6 با مکان­های اتصال اشاره شده در ساختارهای کریستالی مطابق است (جدول­های تکمیلی 1 تا 5) و در بقیه موارد همخوانی ندارند که ممکن است بدلیل تفاوت روش مطالعه و همچنین نوع توالی پپتیدها در دو مطالعه باشد. بنابراین نیاز است محل اتصال این پپتیدها به روش تجربی تعیین شوند. از مجموع نتایج دینامیک و داکینگ مولکولی می­توان پیشنهاد کرد که افزودن RGD به پپتید C منجر به افزایش درصد ساختار دوم، کاهش نوسانات و انعطاف ساختاری و در نتیجه اتصال بهتر به گیرنده شده است که این فرضیه نیاز به بررسی آزمایشگاهی و تجربی دارد.

مطالعه حاضر در راستای چند مطالعه دیگر است که از شبیه­سازی داکینگ مولکولی برای غربالگری و بررسی اتصال پپتیدها به اینتگرین­ها استفاده نمودند. بعنوان مثال، Guzzetti و همکاران (14) و Civera و همکاران (8) بترتیب برهمکنش هفت پپتیدومیتیک حلقوی DKP-RGD با اینتگرین α5β1 و اینتگرین αvβ6 را با استفاده از شبیه­سازی داکینگ مولکولی و همچنین روش تجربی بررسی کردند و نشان دادند پپتیدی که در داکینگ بهترین برهمکنش را با اینتگرین نشان داد، در غلظت­های کمتری نیز از اتصال ویترونکتین به گیرنده جلوگیری می­کند و توانستند با استفاده از شبیه­سازی داکینگ مولکولی اطلاعات خوبی را درباره نحوه اتصال لیگاندها به اینتگرین­ها بدست آورند. Silva و همکاران نیز در راستای توسعه یک روش غربالگری مقرون بصرفه و سریع، مطالعات شبیه­سازی داکینگ مولکولی را بر روی چندین اُکتاپپتید حلقوی حاوی RGD (بنام آنالوگ­های LXW) بعنوان آنتاگونیست­های اینتگرین αvβ3 انجام دادند و نتایج بدست آمده را با غربالگری آزمایشگاهی مقایسه کردند. بشکل جالبی نتایج هر دو روش با یکدیگر همخوانی داشتند که منجر به بهینه‌سازی و آزمایش مداوم جهش‌یافته­های LXW از طریق غربالگری داکینگ مولکولی شد. چندین آنالوگ جدید LXW بعنوان آنتاگونیست اینتگرین αvβ3 پیش‌بینی شد که یکی از آنها  (LXZ2)  با بررسی آزمایشگاهی تایید شد (36). همچنین، Vilaca و همکاران دو پپتید حلقوی دارای RGD را طراحی و سنتز کردند. آنها برهمکنش این ترکیبات را با اینتگرین αvβ3 با استفاده از روش شبیه­سازی داکینگ مولکولی و نرم افزار اوتوداک بررسی کردند و نتایج بدست آمده را با نتایج داکینگ اینتگرین با  سیلنژیتید مقایسه کردند. مشخص شد که دو پپتید RGD حلقوی جدید در مقایسه با سیلنژیتید میل ترکیبی بالاتری به اینتگرین αvβ3 دارند که می­تواند نشان دهنده دو آنتاگونیست بالقوه اینتگرین αvβ3 باشد (39). Li و همکاران بکمک شبیه­سازی دینامیک و داکینگ مولکولی توانستند از روی یک آنتاگونیست اینتگرین αvβ3، آنتاگونیست‌های مولکولی کوچکی بنام TDI-4161 و TDI-3761 را طراحی کنند که از چسبندگی سلولی با واسطه αvβ3 جلوگیری می­کنند اما موجب تغییر ساختاری در گیرنده نمی­شوند. یکی از محدودیت‌های احتمالی آنتاگونیست‌های کنونی، توانایی آنها برای ایجاد یک تغییر ساختاری عمده در گیرنده است که منجر به یک حالت اتصال به لیگاند با میل ترکیبی بالا می‌شود. آنها با استفاده از روش داکینگ، مُدهای اتصالی این آنتاگونیست­ها به اینتگرین را شناسایی کردند که نتایج بدست آمده با نتایج حاصل از کریستالوگرافی لیگاند-گیرنده تایید شدند (18). Yi Ma و همکاران توانستند با استفاده از غربالگری مجازی مبتنی بر فارماکوفور و داکینگ مولکولی با کارایی بالا، دو پپتید خطی کوچک بنام RWr و RWrNM را با میل ترکیبی و ویژگی بالا به اینتگرین αvβ3 شناسایی کنند. آزمایش­های تجربی میل این پپتیدها به اینتگرین αvβ3 را تأیید کرند. شبیه‌سازی دینامیک مولکولی و روش تجربی، میل اتصال و پایداری بالا، بویژه برای RWrNM را نشان دادند (22).

نتیجه­گیری

در مجموع، در مطالعه شبیه­سازی حاضر نشان داده شد که افزودن RGD به پپتیدهای مشتق از اَرِستِن، کانستاتین و تومستاتین اتصال آنها را به اینتگرین­های αvβ3، αvβ6، αvβ8، α5β1 و α6β1 بهبود می­بخشد و پپتید CRGD (مشتق از کانستاتین) با انرژی اتصال منفی­تری به اینتگرین­ها متصل می­گردد. بنابراین، می­توان پپتیدهای حاوی RGD را برای بررسی­های آزمایشگاهی بیشتر پیشنهاد نمود. نتایج این مطالعه می­تواند برای طراحی مهارکننده­های اینتگرین در جهت مهار رگزایی و رشد تومورها سودمند باشد. همچنین، می­تواند به طراحی نشانگرهایی در جهت عکسبرداری از تومورها و انتقال هدفمند داروها به سلول­های توموری کمک نماید.

تضاد منافع

نویسندگان اعلام می­کنند که هیچ تضاد منافعی ندارند.