تولید پپتیدهای نوترکیب پکسیگانان-ایزگانان و پکسیگانان درگیاه توتون

تولید پپتیدهای نوترکیب پکسیگانان و ایزگانان درگیاه توتون

الهام عطایی کچویی، علی نیازی^* و فرزانه آرام

ایران، شیراز، دانشگاه شیراز، دانشکده کشاورزی، پژوهشکده بیوتکنولوژی

تاریخ دریافت: 19/01/1400          تاریخ پذیرش: 28/09/1401

چکیده

تکامل باکتری‌های بیماری‌زا منجر به توسعه مکانیسم‌های مقاومتی در بسیاری از پاتوژن‌ها در برابر آنتی بیوتیک‌های مرسوم شده است که منجر به جستجو برای جایگزین‌های درمانی جدید شده است. پپتیدهای ضد میکروبی یکی از امیدوارکننده‌ترین گزینه‌های جایگزین برای غلبه بر تکثیر پاتوژن‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک هستند. پکسیگانان و ایزگانان دو پپتید ضد میکروبی مهم هستند که فعالیت لیتیک سریع و قوی در برابر طیف وسیعی از پاتوژن‌ها از خود نشان می‌دهند. مطالعات نرم افزاری نشان می‌دهد که شکل همجوش دو پپتید به‌مراتب خاصیت ضدمیکروبی قویتری از هر دوی این پپتیدها به تنهایی دارد بنابر این پتانسیل معرفی بعنوان پپتیدی جدید را دار می‌باشد. تولید پپتیدهای ضد میکروبی در مقیاس وسیع همچنان یک چالش مهم است. بیان هترولوگ در سیستم‌های مبتنی بر گیاه، یا همان کشاورزی مولکولی، تولید مقرون به صرفه بسیاری از پروتئین‌های نوترکیب و پپتیدهای ضد میکروبی را امکانپذیر می‌سازد. در مطالعه حاضر، پکسیگانان و یک پپتید همجوش پکسیگانان-ایزگانان برای اولین بار در گیاه تنباکو بیان شدند. نتایج این مطالعه نشان داد پپتید نوترکیب پکسیگانان-ایزگانان فعالیت ضد میکروبی قوی‌تری نسبت به پکسیگانان نشان می‌دهد. همچنین هر دو پپتید نوترکیب در طیف وسیعی از دما خواص ضد میکروبی خود را حفظ می کنند که برای خالص‌سازی پروتئین‌های نوترکیب تولید شده در گیاه در مقیاس وسیع بسیار مهم است.

واژه های کلیدی: پپتید­های نوترکیب پکسیگانان و پکسیگانان-ایزگانان، زراعت مولکولی، فعالیت ضد میکروبی، توتون.

* نویسنده مسئول، تلفن: ۰۷۱۳۲۲۷۲۸۰۵ ، پست الکترونیکی: niazi@shirazu.ac.ir

مقدمه

مقاومت به آنتی­بیوتیک­های رایج در میکروب­ها، نیاز به تولید و توسعه جایگزین­ برای آن­ها را روزافزون نموده­است. پپتیدهای ضدمیکروبی توسط تعداد بسیار زیادی از موجودات تولید می شوند و فعالیت گسترده و غیر اختصاصی دارند، این خصوصیت آنها را بعنوان انتخابی قدرتمند برای کاربردهای دارویی و درمانی بسیار مناسب می کند [25, 32]. پپتیدهای ضدمیکروبی الیگوپپتیدهایی با تعداد متغیر از ۵ تا کمتر از ۱۰۰ اسید آمینه با بار مثبت (عمدتاً اسیدهای آمینه لیزین و آرژینین) و بخش قابل توجهی از اسید آمینه‌های هیدروفوب می‌باشند. پپتیدهای ضدمیکروبی دامنه گسترده‌ای از موجودات را مورد هدف قرار می‌دهند[3]. برخلاف آنتی‌بیوتیک‌ها که فعالیت‌های سلولی خاص را هدف قرار می‌دهند، پپتیدهای ضدمیکروبی لایه لیپوپلی‌ساکاریدی غشای سلولی را مورد هدف قرار می‌دهند. مکانیسم عمل ضد میکروبی پس از نفوذ از غشای سلولی پاتوژن بر اساس نوع پپتید و ویژگی‌های آن می‌تواند، هدف قرار دادن سنتز DNA، سنتز پروتئین یا دیواره سلولی میکروارگانیسم باشد ]25, 49 [. داشتن سطح بالایی از کلسترول و بار آنیونی پایین، سلول های یوکاریوتی را از دامنه هدف بسیاری از پپتیدهای ضدمیکروبی خارج می کند. قابلیت مهم دیگر پپتیدهای ضدمیکروبی اثر کشندگی سریعشان است. برخی از پپتیدهای ضدمیکروبی می توانند چند ثانیه پس از تماس اولیه با غشای سلول آنرا از بین ببرند. همچنین مشخص شده است که پپتیدهای ضدمیکروبی فعالیت آنتی بیوتیک ها را از طریق اثر هم­افزایی افزایش می دهند. پس از تخریب غشا و یا تشکیل منفذ در غشای سلول باکتری بوسیله پپتید ضدمیکروبی نفوذ آنتی بیوتیک درون سلول باکتری افزایش یافته و در نتیجه تأثیر کشندگی آنتی بیوتیک افزایش می­یابد [23, 41, 49].

در بین صدها پپتید ضدمیکروبی سنتز شده ورمز شده بوسیله ژن ها، magainin-2 و آنالوگ هایش بخوبی مطالعه شده‌اند]23[.magainin-1  و magainin-2  در ۱۹۸۷ از Xenopus Laevis جداسازی شدند. زمانیکه این موجود با پوست زخمی در آب حاوی سطوح بالای میکروبی قرار گرفت و دچار عفونت نشد، مشخص شد که magainin-2 با ۲۳ اسید آمینه دارای دامنه گسترده فعالیت ضد باکتریایی و ضد قارچی است. نتیجه تحقیقات بر روی خواص دارویی magainin-2 باعث تولید شکل سنتزی آن یعنی MSI-78 یا پکسیگانان (pexiganan) شد. این شکل سنتزی که خواص ضدمیکروبی بمراتب قویتری از magainin-2  دارد از جایگزینی اسیدهای آمینه شماره22، 21، 18، 8 و 7 در maganin-2  با اسیدآمینه لیزین ، جایگزینی اسید آمینه شماره 19 با ایزولوسین و اسید آمینه شماره 20 با لوسین به دست آمده است (جدول1 ). وزن مولکولی پکسیگانان 4/2 کیلودالتون می­باشد. نتایج به‌وضوح، اثر بخشی و دامنه گسترده فعالیت پکسیگانان را در  شرایط آزمایشگاهی نشان می‌دهد [23]. فعالیت ضدباکتریایی پکسیگانان علیه طیف گسترده از گونه‌های باکتری آنرا به یک انتخاب امید بخش برای درمان عفونت‌های باکتریایی تبدیل کرده­است. بعلاوه در زمینه کاربردهای موضعی پکسیگانان برای درمان زخم‌های دیابتیک در مراحل آخر آزمایشات کلینیکی است و بزودی وارد بازار می‌شود [20,23, 40].

پپتیدهای ضدمیکروبی Protegrin بخشی از خانواده پپتیدهای ضدمیکروبی درونزاد و منحصربفرد می‌باشند که بخش مهمی از سیستم دفاعی میزبان را تشکیل می­دهند. دامنه گسترده، فعالیت میکروب‌کشی سریع، احتمال پایین تولید مقاومت و هدفگیری غیر اختصاصی غشاهای میکروبی از جمله مهمترین ویژگی­های مهم این پپتیدها می‌باشد. پپتیدهای ضدمیکروبی Protrgrin مقاوم به نمک هستند و فعالیت آن­ها در غلظت نمک فیزیولوژیک افزایش می­یابد و بوسیله کاتیون‌های دوظرفیتی و ترکیبات سرم تحت تأثیر قرار نمی­گیرند]4[. همچنین در دامنه وسیعی از pH فعال باقی می‌مانند. پپتیدهای ضدمیکربی Protegrin طبیعی در اصل از لوکوسیت‌های خوک جدا شده‌اند.  تا بحال پنج گروه Protegrin (PG-1 تا PG-5) شناسایی شده است. این پپتیدهای ضدمیکروبی کاتیونیک هستند، غنی از آرژنین و سیستئین بوده و حاوی ۱۶-۱۸ باقیمانده آمینو اسیدی می‌باشند. توالی طبیعی Protegrin، بصورت صفحات بتای متشکل از ۱۶-۱۸ اسید آمینه که بوسیله ۲ پل دی‌سولفیدی پایدار شده است می­باشد]4[. ساختار صفحات بتا عامل کلیدی پایداری ساختار Protegrin بویژه در حضور نمک فیزیولوژیک است. پپتیدهای ضدمیکروبی Protegrin علیه دامنه گسترده‌ای از باکتری‌های گرم مثبت و منفی، قارچ‌ها و انواع ویروس‌ها فعال هستند. ویژگی‌های پپتیدهای ضد میکروبی Protegrin آن‌ها را به انتخاب‌های جذابی برای تحقیق و توسعه جهت کابردهای ضدمیکروبی تبدیل کرده­است. ایزگانان ( Iseganan (IB-367)) یک آنالوگ سنتزی Protegrin است (جدول 1). ایزگانان فعالیت میکروب کشی سریع در بزاق دهان دارد که آن­را به یک ترکیب مناسب برای کنترل عفونت­های دهانی تبدیل کرده­است. فعالیت میکروب­کشی در حضور غلظت‌های نسبتاً بالای نمک و توانایی تولید یک محلول از ایزگانان این پپتید را یک عامل بالقوه جذاب برای درمان عفونت‌های تنفسی مزمن در بیماران فیبروز کیستیک (cystic fibrosis) می‌کند] 4[. ایزگانان علیه طیف گسترده ای از باکتری های گرم مثبت و گرم منفی و مخمر کشنده است. حداقل غلظت ممانعت کنندگی (MIC))Minimum Inhibitory Concentration ) برای ایزگانان از آنتی‌بیوتیک‌های مرسوم کمتر می‌باشد] 4[. ایزگانان فعالیت باکتری­کشی سریع خود را در بزاق در مقایسه با آنتی­بیوتیک‌های مرسوم حفظ می‌کند[4]. فرآیندهای فاز III کلینیکال ایزگانان در بیماران در یافت کننده شیمی درمانی Stomatotoxic و بیماران با سرطان گردن و سر تحت درمان با اشعه یا شیمی درمانی در حال انجام است ]4[. درمان‌های فوق در این بیماران فلور دهان را تغییر داده و ایجاد شرایط مناسب برای ایجاد انواع عفونت­های دهان و دندان می­کند. کاربرد موضعی ایزگانان هیدروکلراید به شکل قابل توجهی کل باکتری­های هوازی دهان، استرپتوکوک و مخمر را کاهش می­دهد و بعنوان یک عامل ضد میکروبی دهان در جلوگیری از عفونت عمل می­کند[4, 11, 42, 46].

جدول 1- مقایسه توالی آمینواسیدی پپتیدهای ضدمیکروبی Magainin-2 و Pexiganan و Protegrin و Iseganan.

اخیراً، شناسایی و معرفی پپتیدهای ضدمیکروبی جدید با خواص ضدمیکروبی قویتر توجه بسیاری از محققین را بخود جلب کرده است. بر این اساس نرم­افزار و سایت­های پیش بینی خواص ضدمیکروبی متعددی از جمله، CAMP (Collection of Anti-Microbial Peptides)، (Antimicrobial Peptid Prediction) AMP perd، (Antimicrobial Peptide Database) APD3 ، AMPA (Antimicrobial Sequence Scanning System) برای پیش بینی فعالیت ضدمیکروبی توسعه یافته­است. بررسی و مقایسه خواص ضدمیکروبی پپتیدهای پکسیگانان و ایزگانان با استفاده از این نرم­افزارها نشان داد که پپتید حاصل از همجوشی پپتیدهای پکسیگانان و ایزگانان (با وزن مولکولی 4/4 کیلودالتون) خواص ضدمیکروبی قوی­تری نسبت به هرکدام از پپتیدها به تنهایی دارد ]14, 31, 35[.

دو روش برای بدست آوردن پپتیدهای ضدمیکروبی وجود دارد، جداسازی از موجودات میزبان یا سنتز شیمیایی]15[. جداسازی این مولکول‌های دفاعی از بافت­های میزبان مثل پوست قورباغه مراحل چندگانه جداسازی و خالص‌سازی و سپس تست‌های میکروبیولوژیکی برای تعیین خواص میکروب کشی آنها نیاز دارد]15[. با استفاده از این روش بیش از ۷۰۰ پپتید کاتیونی کشف شده است. با این وجود این روش­های جداسازی پپتیدهای ضدمیکروبی خسته کننده است، نیاز به مقادیر زیادی از مواد منبع دارد و معمولاً بازده پایینی دارد]15[. از سوی دیگر سنتز شیمیایی پپتیدها با استفاده از تکنیکهای فاز جامد سریعتر است، بصورت خودکار قابل انجام است و نیاز به مراحل ساده‌تر تخلیص دارند]15[. این تکنیک اجازه مطالعه ارتباطات فعالیت ساختاری را بدون محدودیت­های بیولوژیکی بدلیل سمیت می­دهد. این روش امکان تلفیق اسیدآمینه‌های غیر طبیعی را می­دهد در حالیکه پپتیدهای تولید شده بوسیله ریبوزوم­ها به یک زیرمجموعه از اسیدهای آمینه محدود شده است. با این حال سنتز شیمیایی پپتیدها هنوز گران است و محدودیت­های مربوط به تغییرات پیچیده پس از ترجمه را دارد[15]. در مورد پپتیدهای مورد بررسی در این پژوهش پپتید پکسیگانان دارای ساختار آلفا هلیکس خطی می­باشد و در هیچ منبعی اشاره­ای به تغییرات پس از ترجمه این پپتید نشده است ]23[. اما پپتید Iseganan پپتیدی با ساختار صفحات بتا می­باشد که دارای دو پل دی سولفیدی بین سیستئین شماره 5 و 14 و سیستئین شماره 7 و 12 می باشد]4[. بنابر این بیان ژن های ضدمیکروبی در میزبان مناسب یک راه حل مؤثر برای این مشکل است[30, 44]. به این منظور سیستم های بیان پروکاریوتی و یوکاریوتی تولید پروتئین نوترکیب مثل باکتری­ها، قارچ­ها، سلول­های حشرات و پستانداران و سیستم­های بیان گیاهی توسعه یافته­اند [33, 48].

در طی پیشرفت زیست‌فناوری و توسعه روش­های ژنتیک مولکولی و مهندسی ژنتیک، میزبان­های مختلفی مانند باکتری­ها، مخمرها‌، قارچ‌ها‌، سلول­های پستانداران‌، جلبک­ها، حشرات، سلول­های سوسپانسیون گیاهی، ریشه­های مویین، جانوران و گیاهان تراژن برای تولید پروتئین‌های نوترکیب مورد استفاده قرار گرفته است[17, 18].  سیستم­های بیان مبتنی بر گیاه بعنوان ابزار ارزشمندی برای تولید پروتئین­های نوترکیب یوکاریوتی مورد توجه قرار گرفته­اند [21, 38]. سیستم­های تولید پروتئین نوترکیب بر مبنای گیاهان نسبت به سیستم­های تولید مرسوم بدلیل عدم آلودگی آن­ها با ویروس­های حیوانی یا باکتریایی ایمن­تر است[ 22, 39 ,44]. از دیگر مزایای تولید پروتئین های نوترکیب در سیستم­های بیان گیاهی می­توان به اقتصادی بودن تولید آن­ها نسبت به سیستم­های صنعتی، تولید فرآورده­های زیستی فعال و مشابه شکل طبیعی­ تولید بالای پروتئین نوترکیب و پایداری بیشتر و همچنین عدم وجود خطرات ناشی از آلودگی اشاره کرد [6, 10, 17]. از طرفی، امکان هدایت پروتئین سنتز شده به اجسام داخل سلولی با هدف پایداری بیشتر، وجود دارد [10]. با استفاده از توالی­های هدف­گیری کننده به جایگاه­های مناسب در سلول نیز می­توان موجبات افزایش تجمع پروتئین نوترکیب را فراهم آورد[47]. شبکه آندوپلاسمی سلول (ER) حاوی پروتئین­های چاپرونی مختلف است که موجب بسته­بندی صحیح پروتئین­ها شده و از تجمع و تشکیل ساختارهای سه بعدی ناصحیح جلوگیری می­کند. بنابراین قرار گرفتن پروتئین نوترکیب در ER موجب بسته­بندی صحیح پروتئین شده و در نتیجه پایداری و تجمع آن افزایش می­یابد. توالی KDEL از جمله توالی­هایی است که برای قرار گرفتن پروتئین در شبکه آندوپلاسمی در مطالعات متعددی استفاده و کارایی آن به اثبات رسیده است[9]. بعلاوه تحقیقات متعدد نشان داده­اند که وجود توالی حفاظت شده ACCAUGG (توالی کوزاک) در اطراف ناحیه کدون آغاز، اثر مطلوبی بر بیان ژن و کارایی ترجمه دارد[29].

تا کنون هیچ گزارشی مبنی بر بیان پروتئین نو ترکیب پکسیگانان در گیاه و همچنین پپتید حاصل از همجوشی پپتیدهای پکسیگانان و ایزگانان بعنوان یک پپتید جدید وجود ندارد. هدف از این تحقیق انتقال ژن­های کد کننده پپتید پکسیگانان و پکسیگانان-ایزگانان بعنوان یک پپتید جدید به گیاه توتون با هدف تولید پپتید نوترکیب به‌منظور بررسی و مقایسه فعالیت ضد باکتریایی این پپتیدها علیه پاتوژن­های انسانی است.

مواد و روشها

ساخت سازه­های بیان pBI121-pexiganan و pBI121- pexiganan-iseganan: توالی نوکلئوتیدی کد کننده پپتید پکسیگانان (22 اسیدآمینه: GIGKFLKKAKKFGKAFVKI LKK) و ایزگانان (۱۷ اسید آمینه: RGGLCYCRGRFCVC VGR) از پایگاه اطلاعاتی پپتیدهای ضدمیکروبی (APD) بدست آمد. برای هر سازه توالی کوزاک (CCACCAUG)، 6His tag بترتیب به انتهای '۵ توالی­های کد کننده و توالی سیگنال پپتید KDEL به انتهای '۳ توالی­های کد کننده اضافه شد. برای سازه همجوش پکسیگانان-ایزگانان، توالی­های کد­کننده پکسیگانان و ایزگانان با دو کدون کد کننده گلیسین بعنوان اتصال دهنده به یکدیگر متصل شدند (شکل ۱). در نهایت، توالی های نوکلئوتیدی طراحی شده با استفاده از نرم­افزار Gene Designer2.0 بر اساس جدول ترجیح کدونی موجود در نرم‌افزار برای گیاه توتون بهینه­سازی شدند. توالی­های نوکلئوتیدی به شکل مصنوعی توسط شرکت General Biosystems آمریکا سنتز شدند. توالی‌های نوکلئوتیدی سنتز شده پس از هضم آنزیمی با آنزیم‌های برشی BamH I و SaC I در ناقل بیان pBI121 هضم شده با این دو آنزیم همسانه­سازی گردیدند. سپس سازه­های نوترکیب pBI121-pexiganan-iseganan (سازه ۱) و pBI121-Pexiganan (سازه ۲)  بوسیله واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از جفت آغازگرهای اختصاصی مربوط به ژن­های Pexiganan و Pexiganan-Iseganan و همچنین جفت آغازگرهای مربوط به ناقل pBI121 (جدول2) تأیید شدند.

شکل ۱- نقشه (الف) pBI121-pexiganan-iseganan  (سازه ۱) و (ب) pBI121-pexiganan (سازه۲). توالی 6His-tag و سیگنال شبکه آندوپلاسمی (KDEL) بترتیب به انتهای C- ترمینال و  N- ترمینال ژن­ها اضافه شدند. ژن­های بهینه سازی شده pexiganan-iseganan و  pexiganan تحت کنترل پروموتر 35S و ترمیناتور NOS در وکتور pBI121 همسانه سازی شدند. وکتور pBI121 حمل کننده ژن مقاومت به کانامایسین (NptII) تحت کنترل پروموتر NOS می­باشد.

جدول2- لیست و توالی آغازگرهای استفاده شده در این پژوهش.

Ta, temperature annealing; F, Forward; R, Reverse.

انتقال ناقل بیان به باکتری و شناسایی کلون­های نوترکیب: از سلول­های مستعد باکتری Escherichia coli سویه DH5α جهت ترانسفورماسیون به روش الکتروپوریشن با استفاده از دستگاه Xcell^TM GenePulser استفاده شد. باکتری­های ترانسفورم شده روی محیط انتخابی LB جامد حاوی آنتی­بیوتیک کانامایسین با غلظت ۵۰ میلی­گرم بر لیتر کشت شدند. ­بمنظور تأیید کلون­های نوترکیب از واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی توالی پکسیگانان و پکسیگانان-ایزگانان (جدول2) استفاده شد. سپس از کلون­های تأیید شده با واکنش زنجیره­ای پلیمراز استخراج پلاسمید با استفاده از کیت استخراج پلاسمید شرکت VIVANTIS (UK) [28] انجام شد. پلاسمید استخراج شده با روش الکتروپوریشن به سلول­های مستعد Agrobacterium tumefasience سویه C58 با استفاده از دستگاه Xcell^TM GenePulser منتقل شد و روی محیط انتخابی LB جامد حاوی آنتی بیوتیک­های کانامایسین با غلظت ۵۰ میلی­گرم بر لیتر و ریفامپیسین با غلظت ۱۰۰میلی­گرم بر لیتر قرار داده شد. کلون­های نوترکیب تأیید شده بوسیله واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی مربوط به ژن­های pexiganan-iseganan و pexiganan برای انتقال به ریزنمونه­های برگی گیاه توتون انتخاب شدند.

مواد گیاهی: بذرهای توتون ( Nicotiana tabacum. Cv.turkish) به مدت ۱۰ دقیقه در محلول شوینده (µL۳۰۰ هیپوکلریت سدیم ۵٪، µL۶ تریتون ۱۰٪ و µL۷۰۰ آب مقطر) غوطه­ور شده تا ضدعفونی شوند و سپس پنج بار با آب مقطر استریل شسته شدند. بذرها بصورت فاصله­دار بر روی محیط MS  ( 4 گرم از پودر MS و 10 گرم پودر آگار در 1000 میلی‌لیتر آب)[37] قرار داده شد و در شرایط نوری ۱۰۰۰۰ لوکس و در دمای ۲۵ تا ۲۸ درجه سانتیگراد در اتاق کشت نگهداری شدند. نمونه برگی سترون از گیاهان رشد یافته از این بذرها تهیه شد. برگ­ها در عرض به فواصل یک سانتیمتر برش داده شدند، سپس درون مایع تلقیح  A. tumefasience حاوی سازه ۱ و سازه ۲ بصورت جداگانه منتقل شده و ۵ دقیقه تکان داده شدند. ریزنمونه­های برگی آلوده به باکتری روی کاغذ صافی سترون قرار داده شدند تا خشک شوند. سپس روی محیط هم­کشتی MS بدون هورمون و آنتی بیوتیک قرار داده شدند بطوریکه سطح فوقانی برگ روی محیط کشت قرار گرفت. هم­کشتی به مدت ۲ تا ۳ روز در شرایط تاریکی و در دمای ۲۲ تا ۲۶ درجه سانتیگراد انجام شد و سپس ریزنمونه­ها به محیط انتخابی حاوی کانامایسین با غلظت ۵۰ میلی­گرم بر لیتر و مروپنم با غلظت۳۰ میلی­گرم بر لیتر جهت حذف آلودگی آگروباکتریوم و رشد انتخابی ریزنمونه های ترانسفورم و BAP (6-Benzylaminopurine) ۲ میلی­گرم بر لیتر و  NAA (Naphthylacetic Acid) ۱/۰ میلی­گرم بر لیتر جهت هدایت ریزنمونه­ها به تشکیل شاخساره ، در دمای ۲۵ تا ۲۸ درجه سانتیگراد و چرخه نوری ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی منتقل شدند . واکشت مرتب ریزنمونه ها روی این محیط انتخابی تا تشکیل گیاهچه روی ریزنمونه­های برگی انجام گرفت. پس از ظهور گیاهچه اطراف ریزنمونه­ها ، گیاهچه­های تشکیل شده از روی ریزنمونه­ها جداسازی شد و به محیط جدید حاوی ترکیب آنتی­بیوتیک و هورمون مشابه قبل منتقل شدند. پس از رسیدن ارتفاع گیاهچه­ها به ۲ سانتیمترگیاهچه­ها به محیط انتخابی حاوی کانامایسین با غلظت ۵۰ میلی­گرم بر لیتر و مروپنم با غلظت۳۰ میلی­گرم بر لیتر و NAA(Naphthylacetic Acid)۱/۰ میلی­­گرم بر لیتر جهت هدایت ریزنمونه­ها به تشکیل ریشه، منتقل شدند. پس از تشکیل ریشه و رسیدن ارتفاع گیاهچه­های حاصل به ۵ سانتیمتر، گیاهچه­ها به گلدان­های حاوی پرلیت و خاک به نسبت مساوی منتقل شدند. پس از استقرار گیاهان در خاک برداشت ریزنمونه­های برگی از گیاهان تراژن حاصل جهت آنالیز­های بعدی انجام شد.

استخراج DNA ژنومی و تأیید تراژنی: بمنظور تأیید وجود ژن Pexiganan-Iseganan در گیاهان تراژن حاصل از سازه ۱ و ژن Pexiganan در گیاهان تراژن حاصل از سازه۲، استخراج DNA از برگ گیاهان بروش CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide) انجام شد [13]. سپس واکنش زنجیره­ای پلیمراز روی DNA استخراج شده با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن­های Pexiganan-Iseganan و Pexiganan (جدول2) انجام شد و سپس محصول واکنش زنجیره­ای پلیمراز روی ژل آگارز ۱٪ بارگذاری شد. بمنظور اطمینان از عدم حضور آلودگی به آگروباکتریوم واکنش زنجیره­ای پلیمراز روی DNA استخراج شده با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژنوم آگروباکتریوم ، VirG (جدول2)، انجام شد و سپس محصول واکنش زنجیره­ای پلیمراز روی ژل آگارز ۱٪ بارگذاری شد.

استخراج RNA و سنتز cDNA: بمنظور تأیید بیان ژن­های Pexiganan-Iseganan و Pexiganan در گیاهان تراژن حاصل، استخراج RNA مطایق با روش کیت دنازیست ( Column RNA Isolation kit I) انجام و با استفاده از آنزیم DNaseI ( شرکت Thermoscientific) آلودگی ژنومی حذف شد و سنتز cDNA  با استفاده از کیت cDNA synthetase (شرکت Thermoscientific) با مقدار 1 میکروگرم از  RNA استخراج شده و با استفاده از آغازگر OligodT انجام شد.

واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از cDNA: بمنظور تأیید بیان ژن­های Pexiganan-Iseganan و Pexiganan در گیاهان تراژن تولید شده در این پژوهش، واکنش زنجیره­ای پلیمراز بر روی cDNA سنتز شده با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن­های Pexiganan-Iseganan و Pexiganan در حجم نهایی ۲۰ میکرولیتر شامل 1 میکرولیتر ( از استوک با غلظت ۱۰ پیکو مول) از هر آغازگر اختصاصی ژن­ها µl۱۰ از PCR master mix ( Amplicon) انجام شد. حجم کل به منظور تکثیر در ۱ چرخه دمایی ۹۴ درجه سانتیگراد بمدت ۵ دقیقه، ۳۰ چرخه شامل ۹۴ درجه سانتیگراد بمدت ۱ دقیقه، ۴۹ درجه سانتیگراد بمدت ۴۵ ثانیه برای ژن Pexiganan-Iseganan و ۴۹ درجه سانتیگراد به مدت ۴۵ ثانیه برای ژن Pexiganan، ۷۲ درجه سانتیگراد به مدت ۲۰ ثانیه و نهایتاً چرخه ۱۰ دقیقه در ۷۲ درجه سانتیگراد قرار داده شد.

استخراج پروتئین: استخراج پروتئین با استفاده از روش استون و همکاران [43] انجام گردید. به این ترتیب که 10 گرم از بافت برگ گیاه در 50 میلی‌لیتر از بافر فسفات (PBS  (NaCl 137mM،KCl 2.7mM، Na2HPO4 4.3 mM، KH2PO41.47mM) PH 7.4) در هاون کاملا کوبیده و همگن شد و سپس در سانتریفیوژ با سرعت rpm 8000 به مدت 20 دقیقه رونشین حاوی پروتئین از بافت برگی جداسازی شد. غلظت پروتئین استخراج شده بروش Bradford [5] اندازه گیری و در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری شد.

آزمایش فعالیت ضد میکروبی: بررسی فعالیت ضد میکروبی پپتیدهای پکسیگانان-ایزگانان و پکسیگانان نوترکیب تولید شده با استفاده از بررسی فعالیت پروتئین کل استخراج شده از برگ گیاهان علیه میکروارگانیسم­های انسانی شامل باکتری گرم مثبت Staphylococcus aureus PTCC1112 (ATCC 6538)، باکتری گرم منفی Escherichia coli PTCC 1330 (ATCC 8739) ، استرین قارچ Aspergillus niger PTCC 5010 (ATCC 10864) و مخمر Candida albicans PTCC5027  (ATCC 10231) با استفاده از روش انتشار دیسکی [45] انجام شد. بدین منظور میکروارگانیسم­های مورد نظر تا OD_600nm=0.4 در محیط LB مایع رشد داده شدند و به میزان ۵۰ میکرولیتر به ۵۰ میلی­لیتر از محیط کشت LB جامد که دمای آن پایین آمده بود اضافه شدند و در پتری دیش ریخته شدند. بعد از بستن محیط، با استفاده از تیپ استریل در محیط داخل پتری­دیش­ها چاهک­هایی تعبیه شد و در هر چاهک به میزان ۵۰ میکروگرم از پروتئین استخراج شده از گیاهان اضافه شد. پتری دیش­ها بمدت ۱۵ ساعت در دمای ۳۷ درجه برای رشد میکروارگانیسم­ها قرار داده شدند. میزان فعالیت ضد میکروبی پروتئین­ها با اندازه­گیری قطر هاله عدم رشد ایجاد شده در اطراف چاهک­ها بررسی گردید. میکروارگانیسم­های استفاده شده در این پژوهش از مرکز کلکسیون قارچ­ها و باکتری­های صنعتی ایران تهیه شدند. در تست بررسی خواص ضدمیکروبی µg۲۵۰ از آنتی بیوتیک کانامایسین بعنوان کنترل مثبت و پروتئین استخراج شده از گیاهان توتون غیر تراژن بعنوان کنترل منفی در نظر گرفته شد.

بررسی پایداری دمایی پپتیدهای نوترکیب پکسیگانان-ایزگانان و پکسیگانان تولید شده: بمنظور مطالعه پایداری دمایی پپتیدهای نوترکیب تولید شده در این پژوهش، پروتئین کل استخراج شده از گیاهان تراژن و گیاه غیرتراژن توتون در معرض دماهای °C۵۰، °C۷۵ و °C۱۰۰ به مدت ۱ ساعت قرار داده شد و سپس فعالیت ضدمیکروبی µg۵۰ از پروتئین­ها علیه باکتری E. coli بمدت ۱۵ ساعت در دمای °C۳۷ با روش انتشار دیسکی مورد بررسی قرار گرفت.

خالص سازی پروتئین­های نوترکیب با استفاده از ستون آگارز-نیکل: پروتئین­های نوترکیب پکسیگانان-ایزگانان و پکسیگانان با استفاده از ستون آگارز-نیکل ( cat. No. 31014، شرکت کیاژن) خالص­سازی شدند. در ابتدا، بمنظور متعادل سازی ستون آگارز- نیکل 1000میکرولیتر بافر فسفات 100mM با pH 7 به مدت یک ساعت روی ستون بارگذاری شد. پس از خروج بافر فسفات از ستون mg/ml 5/0 از پروتئین استخراج شده از گیاهان حاوی پروتئین­های نوترکیب روی ستون­ها بارگذاری شد و ستون­ها بمدت 12 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار داده شدند.پس از 12 ساعت اجازه داده شد تا محتوای ستون خارج شود. سپس هر ستون دو بار با 1000میکرولیتر از بافر شستشو (50mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8.0) شستشو داده شد. در نهایت بمنظور استخراج پپتیدهای خالص از ستون بافر پاک کننده ((50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH 8.0 مورد استفاده قرار گرفت. در نهایت پپتیدهای خالص شده در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. جهت تأیید حضور پپتیدهای نوترکیب پکسیگانان-ایزگانان و پکسیگانان در محصول نهایی خالص سازی آزمون الیزا با استفاده از آنتی بادی ضد His-tag انجام شد.

تأیید حضور پپتیدهای نوترکیب پکسیگانان-ایزگانان و پکسیگانان در محصول نهایی خالص سازی با استفاده از آزمون الیزا: بمنظور بررسی حضور پپتیدهای نوترکیب پکسیگانان-ایزگانان و پکسیگانان پس از خالص سازی با استفاده از ستون آگارز-نیکل آزمون الیزا با استفاده از آنتی بادی ضد His-tag انجام شد. پروتئین استخراج شده از گیاهان غیر تراژن بعنوان کنترل منفی استفاده شد و یک پروتئین حاوی سیگنال پپتید His-tag بعنوان کنترل مثبت استفاده شد. بمنظور انجام آزمون الیزا ، 50 میکروگرم از پروتئین­های خالص شده در چاهک های پلیت الیزا (با سه تکرار) بارگذاری شد و بمدت 16 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار داده شد. سپس چاهک­ها دو بار با 300 میکرولیتر از بافرPBS-T  (%0.02 KCl, %0.144 NaHPO4, %0.024 KH2PO4, %0.8 NaCl, and %50 Tween 20, PH 7.4) شستشو داده شدند و مجدداً دو بار با محلول PBS (%0.02 KCl, %0.144 NaHPO4, %0.024 KH2PO4, and %0.8 NaCl, PH 7.4) شستشو داده شدند. پس از آخرین مرحله شستشو، 200 میکرولیتر از BSA 2% (Bovine Serum Albumin solved in PBST) درون هر چاهک اضافه شد و بمدت 1 ساعت در دمای 37 درجه قرار داده شد. سپس چاهک­ها با PBS-T و PBS بترتیب مجدداً شستشو داده شدند. سپس 100 میکرولیتر از آنتی بادی mg/ml2  His-tagبه هر چاهک اضافه شد و بمدت 1 ساعت در دمای 37 درجه قرار داده شد. سپس مجدداً چاهک ها با PBS-T و PBS بترتیب شستشو داده شدند و سپس 100 میکرولیتر از محلول TMB (50 μl TMB A+ 50 μl TMB B) به هر چاهک اضافه شد و بمدت 1 ساعت در تاریکی در دمای اتاق قرار داده شد. سپس بمنظور متوقف کردن واکنش 30 میکرولیتر از H2SO4 5 مولار به هر چاهک اضافه شد. در نهایت جذب نوری هر چاهک با استفاده از اسپکتوفتومتر در 450 نانومتر خوانده شد و BSA 2%  بعنوان بلانک مورد استفاده قرار گرفت.

آنالیز آماری داده­ها

آنالیز آماری داده­ها بوسیله آزمون یکطرفه (ANOVA) انجام شد. بمنظور مقایسه میانگین داده­ها از نرم­افزار SPSS و Graphpad Prism5 و آزمون دانکن استفاده شد.

نتایج و بحث

صحت همسانه­سازی سازه­های طراحی شده در باکتری A.tumefasience با انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن Pexiganan-Iseganan و Pexiganan به‌ترتیب با مشاهده قطعه ۱۲۷ جفت بازی مربوط به ژن Pexiganan و قطعه ۱۰۹ جفت بازی مربوط به ژن Pexiganan روی ژل آگارز اثبات شد (شکل ۲). همچنین عدم حضور آلودگی به آگروباکتریوم با انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز روی DNA استخراج شده از گیاهان تراژن حاصل با استفاده از جفت آغازگرهای اختصاصی مربوط به ژنوم آگروباکتریوم انجام شد. عدم حضور قطعه ۵۲۹ جفت بازی مربوط به ژنوم آگروباکتریوم عدم آلودگی نمونه­ها را اثبات کرد (شکل ۳).

شکل ۲- نقوش الکتروفورزی محصول PCR از A. tumefasience ترانسفورم شده با سازه ۱ (شکل الف) و سازه ۲ (شکل ب) با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن­های pexiganan-iseganan، pex-isF/pex-isR و pexiganan، pexF/pexR. در هرکدام از شکل­ها، M: نشانگر مولکولی bp۱۰۰، چاهک­های ۱ تا ۶ : نمونه­های باکتری ترانسفورم شده با سازه ۱ ( محصول ۱۲۷ جفت بازی در شکل الف) و سازه ۲ (محصول ۱۰۹ جفت بازی در شکل ب)، چاهک ­های ۷ نمونه کنترل منفی PCR  (H₂O). M: .Gene Ruler TMDNA Ladder Mix 1kb (Fermentas)

شکل۳- نقوش الکتروفورزی محصول PCR از DNA استخراج شده از گیاهان تراژن ترانسفورم شده با سازه ۱ (شکل الف) و سازه ۲ (شکل ب) با آغازگرهای اختصاصی ژنوم آگروباکتریوم (virG). در هرکدام از شکل­ها، M: نشانگر مولکولی bp ۱۰۰، راهک­های با علامت- : نمونه کنترل منفی PCR  (اH₂O)، چاهک‌های با علامت  +: کنترل مثبت PCR ( آگروباکتریوم). M: .Gene Ruler TMDNA Ladder Mix 1kb (Fermentas)

انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز روی DNA استخراج شده از گیاهان تراژن حاصل با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن Pexiganan-Iseganan و Pexiganan و الکتروفورز محصول بدست آمده وجود قطعه ۱۲۷ جفت بازی مربوط به ژن Pexiganan-Iseganan در گیاهان تراژن با سازه ۱ و قطعه ۱۰۹ جفت بازی مربوط به ژن Pexiganan در گیاهان تراژن با سازه ۲ را مورد تأیید قرار داد ( شکل ۴).

شکل۴- نقوش الکتروفورزی محصول PCR از DNA استخراج شده از گیاهان تراژن ترانسفورم شده با سازه ۱ (شکل الف) و سازه ۲ (شکل ب) با آغازگرهای اختصاصی ژن­های pexiganan-iseganan، pex-isF/pex-isR و pexiganan، pexF/pexR.  در هرکدام از شکل­ها، M: نشانگر مولکولی bp۱۰۰، چاهک­های ۱ تا ۶ : نمونه­های باکتری ترانسفورم شده با سازه ۱ ( محصول ۱۲۷ جفت بازی در شکل الف) و سازه ۲ (محصول ۱۰۹ جفت بازی در شکل ب)، چاهک های ۱۱(شکل الف) و ۹ (شکل ب) : کنترل مثبت PCR ( آگروباکتریوم) چاهک ­های ۷ نمونه کنترل منفی PCR  (H₂O). .Gene Ruler TMDNA Ladder Mix 1kb (Fermentas) :M

در فرآیند انتقال ژن جهت تولید پروتئین­های نوترکیب، ترجیح کدونی بین گونه­های مختلف از اهمیت بالایی برخوردار است و موفقیت یا شکست بیان و تولید پروتئین­های نوترکیب تا حد زیادی به این مورد وابسته است [27]. در این پژوهش توالی مربوط به ژن­های Pexiganan-Iseganan و Pexiganan بر اساس گیاه توتون بهینه­سازی شد. بیان ژن­های مورد نظر در گیاهان تراژن حاصل با انجام PCR روی cDNA حاصل از گیاهان تراژن با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن­های Pexiganan-Iseganan و Pexiganan با تکثیر قطعه قطعه ۱۲۷ جفت بازی مربوط به ژن Pexiganan-Iseganan در گیاهان تراژن با سازه ۱ و قطعه ۱۰۹ جفت بازی مربوط به ژن Pexiganan در گیاهان تراژن با سازه ۲ تایید شد ( شکل ۵).

شکل ۵- نقوش الکتروفورزی محصول PCR از cDNA سنتز شده از گیاهان تراژن حاصل سازه ۱ (شکل الف) و سازه ۲ (شکل ب) با آغازگرهای اختصاصی ژن­های pexiganan-iseganan، pex-isF/pex-isR و pexiganan، pexF/pexR.  در هرکدام از شکل­ها، M: نشانگر مولکولی bp۱۰۰، چاهک­های ۱ تا ۸ : گیاهان ترانسفورم شده با سازه ۱ ( محصول ۱۲۷ جفت بازی در شکل الف) و چاهک­های ۱ تا ۶ : گیاهان ترانسفورم شده با سازه ۲ (محصول ۱۰۹ جفت بازی در شکل ب)، چاهک ­های ۱۰ در شکل الف و ۸ در شکل ب نمونه: کنترل منفی PCR  (H₂O)، چاهک ۱۱ در شکل الف و ۷ در شکل ب: کنترل مثبت (آگروباکتریوم). M: .Gene Ruler TMDNA Ladder Mix 1kb (Fermentas)

تولید پپتیدهای نوترکیب پکسیگانان-ایزگانان و پکسیگانان در گیـاهان تـراژن حاصـل با بررسی فعالیت ضـدمیکروبی

پپتیدهای تولید شده به اثبات رسید ( شکل۶).

شکل۶- فعالیت ضدمیکروبی پروتئین­های استخراج شده از گیاهان ترانسفورم شده با سازه ۱ (شکل الف) و سازه ۲ (شکل ب). فعالیت ضدمیکروبی پروتئین کل (µg۵۰) حاصل از گیاهان تراژن علیه E.coli. در شکل­های الف و ب ، S: µg۵۰ از پروتئین کل استخراج شده از گیاهان تراریخت با سازه ۱ و سازه ۲. C-: پروتئین استخراج شده از گیاهان غیرتراریخت، C+: µg۲۵۰ آنتی بیوتیک کانامایسین.

نتایج حاصل از ارزیابی فعالیت ضدمیکروبی پروتئین استخراج شده از گیاهان تراژن حاصل نشان دهنده اثر ضد میکروبی بالای پپتیدهای پکسیگانان-ایزگانان و پکسیگانان نسبت به نمونه کنترل منفی ( پروتئین استخراج شده از گیاهان توتون غیر تراژن) بود ( نمودار۱). مقایسه نتایج تست­های  ضدمیکروبی علیه پاتوژن­ها باکتریایی شامل  E.coliو S.aureuse ، پاتوژن قارچی A.niger و مخمر C.albicans نشان داد این پپتیدهای نوترکیب اثر ضدباکتریایی قوی­تری نسبت به اثر ضد قارچ و مخمر دارند (نمودار ۱). مطالعات قبلی نشان داده­اند که پکسیگانان و ایزگانان دامنه فعالیت گسترده­ای علیه باکتری­های گرم مثبت و گرم منفی و مخمر دارند [4, 16, 23]. این نتایج ممکن است مربوط به نحوه عمل تخریبی پپتیدهای کاتیونیک تولید شده توسط موجودات متفاوت مانند باکتری­ها ، گیاهان و حیوانات روی غشای سلولی باکتری­ها باشد [1, 2].  پپتیدهای ضدمیکروبی با اتصال به لیپوپلی ساکارید موجود در غشای سلول باکتری­ باعث تشکیل منافذی در غشای سلولی و سپس مختل شدن سنتز DNA و پروتئین درون سلول باکتری می­شوند. این فرآیند بهمراه بهم ریختن نیروی اسمزی در سلول باکتری باعث تخریب و مرگ سلول باکتری ­می شود[19, 23]. در این مطالعه برای نخستین بار بررسی فعالیت ضدقارچی پپتیدهای نوترکیب پکسیگانان-ایزگانان و پکسیگانان انجام شد. مطالعات بسیاری روی نحوه فعالیت ضدقارچی پپتیدهای ضدمیکروبی انجام شده­است. در مورد پپتیدهای پکسیگانان-ایزگانان و پکسیگانان نحوه فعالیت ضد قارچی همچنان نیاز به مطالعه دارد. بعلاوه نتایج این مطالعه نشان داد که اختلاف معنی­داری بین فعالیت ضدمیکروبی پکسیگانان-ایزگانان و پکسیگانان نوترکیب تولید شده وجود دارد. بر اساس نتایج (نمودار ۱) پپتید نوترکیب پکسیگانان-ایزگانان خواص ضدمیکروبی قویتری از پکسیگانان به تنهایی نشان می­دهد. نتایج بررسی خواص ضدمیکروبی این پپتیدها با نرم افزارهای CAMP، AntiBP2، APD3وAMPA  نیز نشان داده بود که پکسیگانان-ایزگانان خواص ضدمیکروبی قویتری نسبت به پکسیگانان دارد. این نتایج احتمالاً به علت نحوه عمل منحصربفرد این پپتیدها در تخریب اختصاصی باکتری­ها است. عمل تخریبی پکسیگانان و ایزگانان با اتصال این پپتیدها به دیواره لیپوپلی­ساکاریدی غشای سلولی باکتری و در نهایت تخریب سلول باکتری اتفاق می افتد.

شکل ۷- مقایسه فعالیت ضد میکروبی پروتئین نوترکیب استخراج شده از گیاهان تراژن حاصل از دو سازه. اختلاف معناداری بین فعالیت ضدباکتریایی دو سازه وجود دارد.  قطر هاله ممانعت کنندگی به سانتیمتر در محور Y و پاتوژن­ها شامل E. coli (1112), S. aureus (1330), A. niger (5010) وC. albicans (5027) در محور X نشان داده شده است. در تمام موارد P value of ≤0.05 معنادار در نظر گرفته شده است.

حتی اگر پپتیدهای ضدمیکروبی اثر خود را از طریق مسیرهای داخل سلولی مانند اثر روی مسیرهای سنتز DNA، RNA و پروتئین اعمال کنند بازهم میانکنش اولیه پپتید با غشای سلولی برای فعالیت ضدمیکروبی نیاز است و این میانکنش دامنه سلول­های هدف پپتیدها را تعیین می­کند. اکثر پپتیدهای ضدمیکروبی که غشای میکروارگانیسم­ها را هدف قرار می­دهند، آمفی­پاتیک هستند، بدین معنا که آن­ها کاتیونیک و هیدروفوب می‌باشند. این ویژگی باعث ایجاد میانکنش الکترواستاتیک اولیه با غشای سلولی با بار منفی می­شود. عمل پپتیدهای ضد میکروبی پس از میانکنش اولیه متوقف نمی­شود. بخش هیدروفوب یک پپتید ضد میکروبی به ورود پپتید ضپد میکروبی داخل غشای سلولی کمک می­کند. بنابراین میانکنش اصلی شامل میانکنش­های یونی و هیدروفوبیک است و این میانکنش­ها بیشتر وابسته به دو ویژگی کاتیونیک و هیدروفوبیک بودن پپتید است[24, 34] . بررسی ویژگی­های هیدروفوبیسیتی و کاتیونیک پپتیدهای پکسیگانان-ایزگانان و پکسیگانان با استفاده ازAPD3  ]26[ نشان داد که پپتید حاصل از همجوشی پکسیگانان و ایزگانان (پکسیگانان-ایزگانان) قدرت کاتیونی بالاتری دارد که می­تواند یکی از دلایل احتمالی برای قویتر بودن خواص ضدمیکروبی پپتید نوترکیب پکسیگانان-ایزگانان نوترکیب تولید شده در این پژوهش نسبت به پپتید نوترکیب پکسیگانان تولید شده باشد.

پایداری دمایی پپتیدهای نوترکیب پکسیگانان-ایزگانان  و پکسیگانان تولید شده: نتایج تست پایداری دمایی پپتیدهای نوترکیب پکسیگانان-ایزگانان و پکسیگانان نشان داد که این پپتیدها خواص ضدمیکروبی خود را تا دمای °C ۱۰۰ به خوبی حفظ می­کنند (شکل ۸). و از آنجایی که استفاده از این پپتیدها بعنوان دارو نیازمند استفاده از میزان معین از پپتید خالص می­باشد بنابر این خالص سازی یکی از مراحل بسیار مهم تولید این پپتیدهای نوترکیب بعنوان دارو می­باشد. مراحل خالص‌سازی پپتیدهای نوترکیب تولید شده در گیاهان شامل مراحل با شرایط خالص‌سازی ویژه ازجمله دمای بالا می­باشد [12]. بعلاوه یکی از راهکارهای پیشنهادی برای کاهش پروتئین­های میزبان تا ۹۰٪ رسوب دمایی در ۶۵-۷۰ درجه سانتیگراد در پروسه بازیابی پروتئین نوترکیب تولید شده­است [7]. بنابراین استفاده از دمای بالا برای استخراج و خالص‌سازی پپتیدهای نوترکیب پکسیگانان-ایزگانان و پکسیگانان راهکاری مفید و قابل اجرا می­باشد و هیچگونه تأثیری بر خاصیت ضدمیکروبی آن­ها ندارد. پایداری دمایی پپتیدها نوترکیب تولید شده در دمای بالا یکی از ویژگی­های مهم در خالص‌سازی پپتیدهای نوترکیب تولید شده در گیاه می­باشد.

شکل ۸- پایداری دمایی پپتیدهای نوترکیب پکسیگانان-ایزگانان و پکسیگانان.  پایداری دمایی پپتیدهای نوترکیب پکسیگانان-ایزگانان و پکسیگانان. شکل الف: تست ضدمیکروبی و نمودار مربوط به پرونئین استخراج شده از گیاهان تراریخت حاوی سازه ۱  در دماهای ˚C۵۰، ˚C۷۵ و ˚C۱۰۰ بمدت ۱ علیه باکتری E. coli. شکل ب:  تست ضدمیکروبی و نمودار مربوط به پرونئین استخراج شده از گیاهان تراریخت حاوی سازه ۲ در دماهای ˚C۵۰، ˚C۷۵ و ˚C۱۰۰ به مدت ۱ ساعت علیه باکتری E. coli. کنترل منفی: پروتئین استخراج شده از گیاهان غیرتراژن و کنترل مثبت: µg۲۵۰ از آنتی­بیوتیک کانامایسین. در تمام موارد P value ≤ 0.05 معنی­دار در نظر گرفته شد.

تأیید حضور پپتیدهای نوترکیب پکسیگانان-ایزگانان و پکسیگانان در پروتئین استخراج شده از گیاهان با استفاده از آزمون الیزا: بررسی حضور پپتیدهای نوترکیب پکسیگانان-ایزگانان و پکسیگانان در پروتئین استخراج شده از گیاهان تراژن حاصل پس از خالص­سازی پروتئین استخراج شده با استفاده از ستون His-tag و با انجام آزمون الیزا صورت گرفت. پروتئین خالص شده  از گیاه غیرتراژن بعنوان کنترل منفی و یک پروتئین دارای سیگنال پپتید His-tag بعنوان کنترل مثبت آزمون الیزا استفاده شدند. نتایج نشان داد که میانگین جذب نوری نمونه­های پپتید خالص شده ( با سه تکرار برای هر نمونه) برای هر دو سازه ۱ (1AR (pBI121-pexiganan-iseganan)) و سازه ۲ 2AR (pBI121-pexiganan) بطور معنی داری (P value ≤ 0.05) بیشتر از نمونه های پروتئین خالص شده از گیاهان غیرتراژن است. همچنین نتایج الیزا نشان­دهنده عدم وجود اختلاف معنی دار (P value ≤ 0.05 ) بین میزان پپتید خالص شده از گیاهان حاصل از دو سازه بود ( شکل 9).

شکل 9- نمودار مربوط به نتایج آزمون الیزا ( خوانش چگالی نوری نتایج آزمون الیزا در طول  nm۴۵۰) نمونه­های پپتید خالص شده از گیاهان تراژن حاصل از سازه ۱ ( pBI121-pexiganan-iseganan) (1AR/S) و گیاهان تراژن حاصل از سازه 2 (pBI121-pexiganan) (2AR/S)که با برنامه ANOVA با استفاده از نرم­افزار Graphpad Prism5 ترسیم شده است. کنترل-: پپتید خالص شده از گیاهان غیرتراژن، کنترل+: پروتئین حاوی سیگنال پپتید His-tag و BSA: بلانک. در تمام موارد P value ≤0.05 معنادار در نظر گرفته شده است.

با توجه به نتایج الیزا نمونه­های پروتئین استفاده شده جهت آزمون­های ضدمیکروبی حاوی میزان تقریباً یکسانی از پپتیدهای نوترکیب پکسیگانان-ایزگانان و پکسیگانان بودند. بعلاوه، نتایج نشان­دهنده کارآمدی سیستم خالص­سازی با استفاده از ستون His-tag می­باشد. گزارشات متعددی در استفاده موفقیت آمیز از سیستم خالص­سازی با استفاده از ستون His-tag در خالص­سازی پروتئین­هایی مانند MAP30 و لاکتوفرین وجود دارد]8, 36 [.

سپاسگزاری

بدینوسیله از حمایت مالی ستاد توسعه زیست فناوری در انجام این تحقیق کمال تشکر و قدردانی را داریم.