ارزیابی تنوع ژنتیکی گوآوا (Psidium guajava ) با استفاده از نشانگرهای مولکولی RAPD و ISSR

ضابط, محمد; ناصری, حامد; علیزاده, زهره

ارزیابی تنوع ژنتیکی گوآوا (Psidium guajava ) با استفاده از نشانگرهای مولکولی RAPD و ISSR

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

محمد ضابط ¹

حامد ناصری ²

زهره علیزاده ³

¹ دانشگاه بیرجند- دانشکده کشاورزی- گروه زراعت و اصلاح نباتات

² گروه زراعت و اصلاح نباتات دانشکده کشاورزی دانشگاه بیرجند

³ دانشگاه بیرجند عضو هیئت علمی

چکیده

آگاهی از میزان تنوع ژنتیکی و درک روابط موجود در بین گونهها و تودههای گیاهی گام مؤثری در راستای حفظ ذخایر ژنتیکی میباشد. در این مطالعه تنوع ژنتیکی 15 ژنوتیپ گوآوا (Psidium guajava ) با استفاده از نشانگرهای مولکولی RAPD و ISSR در آزمایشگاه به‌نژادی مولکولی دانشکده کشاورزی دانشگاه بیرجند مورد بررسی قرار گرفت. 9 تا از 36 آغازگر RAPD و 6 تا از 7 آغازگر ISSR آغازگر چندشکلی نشان دادند. در کل آغازگرهای RAPD و ISSR به ترتیب 80 و 35 نوار تکثیر نمودند و در مجموع، 54 نوار از 80 نوار تکثیر شده توسط آغازگرهای RAPD (5/67 درصد) و 25 نوار از 35 نوار تکثیر شده توسط آغازگرهای ISSR (42/71 درصد) دارای چندشکلی بودند. کمترین و بیشترین میزان محتوای اطلاعات چندشکلی در نشانگر RAPD به ترتیب در آغازگر OPAB09 (13/0) و OPAB17 (40/0) و در نشانگر ISSR به ترتیب در آغازگر ISSR3 (19/0) و آغازگر ISSR5 (37/0) مشاهده شد. بر اساس نشانگر RAPD ژنوتیپ‌های M5 با M4 (83/0) بالاترین و ژنوتیپ‌های CH5 با R4 (19/0) کمترین تشابه را داشتند. بر اساس نشانگر ISSR ژنوتیپ‌های R2 با R3 (86/0) بالاترین و ژنوتیپ‌های M1 با CH4 (12/0) کمترین تشابه را داشتند. تجزیه خوشه‌ای بر اساس نشانگر RAPD و ISSR ژنوتیپ‌ها را به ترتیب در پنج و سه دسته گروه‌بندی کرد. به طورکل نتایج نشان داد که تنوع ژنتیکی کافی در بین ژنوتیپ‌های گوآوا وجود دارد و نشانگرهای RAPD و ISSR در شناسایی نواحی چند شکل و تخمین فاصله ژنتیکی و مدیریت ذخایر ژنتیکی درختان گوآوا نشانگرهای سودمندی هستند.

کلیدواژه‌ها

تجزیه خوشه‌ای

شاخص مولکولی

ماتریس تشابه

هتروزیگوسیتی

20.1001.1.23832738.1402.36.3.5.0

موضوعات

بیولوژی سلولی

عنوان مقاله English

Evaluation of genetic diversity of Guava (Psidium guajava) by RAPD and ISSR markers

نویسندگان English

mohammad zabet ¹

hamed naseri ²

zohreh alizadeh ³

¹ university of birjand

² Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, university of Birjand

³ Assistant Professor in Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, university of Birjand

چکیده English

Understanding the genetic diversity and the relationships between species and plant ecotypes is an important step to preserve genetic resources. In this study, the genetic diversity of 15 Guava (Psidium guajava) genotypes was investigated using Rapid and ISSR markers in the molecular breeding laboratory of the Faculty of Agriculture, University of Birjand. Nine out of 36 RAPD primers and six out of seven ISSR primers showed polymorphism. In total, RAPD and ISSR primers amplified 80 and 35 bands, respectively, which 54 out of 80 (67.5%) and 25 out of 35 (71.42%) bands were amplified by RAPD and USSR primers, were polymorphic, respectively. The lowest and highest polymorphic information content was observed in RAPD marker in OPAB09 primer (0.13) and OPAB17 primer (0.40) and in ISSR primer in ISSR3 primer (0.19) and ISSR5 primer (0.37), respectively. According to the RAPD marker, genotypes M5 with M4 (0.83) had the highest and genotypes CH5 with R4 (0.19) had the least similarity, respectively. According to ISSR marker, genotypes R2 with R3 (0.86) had the highest and M1 with CH4 (0.12) had the least similarity, respectively. The Cluster analysis classified genotypes according to RAPD marker into five groups and according to ISSR marker into three groups, respectively. In total, the results showed that there is sufficient genetic diversity among Guava genotypes and RAPD and ISSR are useful markers in identifying polymorphic regions and estimating genetic distance and managing genetic resources of Guava.

کلیدواژه‌ها English

Cluster analysis

Heterozygosity

Molecular Index

Similarity matrix

ارزیابی تنوع ژنتیکی گوآوا (Psidium guajava) با استفاده از نشانگرهای

مولکولی RAPD و ISSR

محمد ضابط^*، حامد ناصری و زهره علیزاده

ایران، دانشگاه بیرجند، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت واصلاح نباتات

تاریخ دریافت: 26/08/1400 تاریخ پذیرش: 11/03/1401

چکیده

آگاهی از میزان تنوع ژنتیکی و درک روابط موجود در بین گونه‌ها و توده‌های گیاهی گام مؤثری در راستای حفظ ذخایر ژنتیکی می‌باشد. در این مطالعه تنوع ژنتیکی 15 ژنوتیپ گوآوا (Psidium guajava) با استفاده از نشانگرهای مولکولی RAPD و ISSR در آزمایشگاه به‌نژادی مولکولی دانشکده کشاورزی دانشگاه بیرجند مورد بررسی قرار گرفت. 9 تا از 36 آغازگر RAPD و 6 تا از 7 آغازگر ISSR آغازگر چندشکلی نشان دادند. در کل آغازگرهای RAPD و ISSR به ترتیب 80 و 35 نوار تکثیر نمودند و در مجموع، 54 نوار از 80 نوار تکثیر شده توسط آغازگرهای RAPD (5/67 درصد) و 25 نوار از 35 نوار تکثیر شده توسط آغازگرهای ISSR (42/71 درصد) دارای چندشکلی بودند. کمترین و بیشترین میزان محتوای اطلاعات چندشکلی در نشانگر RAPD به ترتیب در آغازگر OPAB09 (13/0) و OPAB17 (40/0) و در نشانگر ISSR به ترتیب در آغازگر ISSR3 (19/0) و آغازگر ISSR5 (37/0) مشاهده شد. بر اساس نشانگر RAPD ژنوتیپ‌های M5 با M4 (83/0) بالاترین و ژنوتیپ‌های CH5 با R4 (19/0) کمترین تشابه را داشتند. بر اساس نشانگر ISSR ژنوتیپ‌های R2 با R3 (86/0) بالاترین و ژنوتیپ‌های M1 با CH4 (12/0) کمترین تشابه را داشتند. تجزیه خوشه‌ای بر اساس نشانگر RAPD و ISSR ژنوتیپ‌ها را به ترتیب در پنج و سه دسته گروه‌بندی کرد. به طورکل نتایج نشان داد که تنوع ژنتیکی کافی در بین ژنوتیپ‌های گوآوا وجود دارد و نشانگرهای RAPD و ISSR در شناسایی نواحی چند شکل و تخمین فاصله ژنتیکی و مدیریت ذخایر ژنتیکی درختان گوآوا نشانگرهای سودمندی هستند.

واژه های کلیدی: تجزیه خوشه‌ای، شاخص مولکولی، ماتریس تشابه، هتروزیگوسیتی

* نویسنده مسئول، پست الکترونیکی: mzabet@birjand.ac.ir

مقدمه

گوآوا (Psidium guajava) یا اَمرود متعلق به خانواده میرتاسه (Myrtaceae) و جنس پسیدیوم (Psidium) دارای فرمول ژنومی 2n=2x=22 می‌باشد. نوعی درخت گرمسیری که بومی آمریکای جنوبی و مرکزی است. میوه آن شبیه زیتون و آن را خام یا پخته می‌خورند و برگ، پوست تنه و میوه آن استفاده دارویی دارد. در مناطق جنوب ایران به آن زیتون محلی می‌گویند. یکی از مهم‌ترین محصولات تجاری است که در مناطق استوایی و نیمه استوایی به طور وسیع مورد کشت و کار قرار می‌گیرد (31، 16، 15، 12).

تنوع ژنتیکی نقش بسیار مهمی در پیشبرد برنامه‌های به‌نژادی و حفاظت از ذخایر ژنتیکی دارد (27). کاهش تنوع ژنتیکی در ارقام مانع از افزایش عملکرد می شود و بنابراین لازم است سازگاری ارقام بهبود و گستره ژنتیکی آنها افزایش یابد (24). تنوع مبنای همه انتخاب‌ها در به‌نژادی است و با بالا رفتن تنوع ژنتیکی دامنه انتخاب وسیع‌تر می‌شود. تعیین مشخصات و گروه‌بندی ذخایر ژنتیکی این امکان را می‌دهد تا در نمونه‌گیری از جمعیت‌ها، از دوباره‌کاری خودداری کنند. در صورت نبود تنوع ژنتیکی امکان بدست آوردن هتروزیس وجود ندارد (5). تخمین تنوع ژنتیکی مجموعه‌های ژنتیکی و قرابت بین آن‌ها معمولا بر اساس ارزیابی صفات زراعی و مورفولوژی و یا نشانگرهای مولکولی مبتنی بر تکنیک‌های DNA انجام می‌شود (29، 35). نشانگرهای مولکولی DNA دارای توارث‌پذیری، چندشکلی، سهولت در ارزیابی و اندازه‌گیری می‌باشند و لذا کاربرد و اهمیت چشم‌گیری برای بررسی تنوع ژنتیکی، تشخیص محل ژن‌ها و ترسیم نقشه‌های ژنی پیدا کرده‌اند (6).

مطالعات مولکولی نشان داده است که نشانگر RAPD به‌خوبی می تواند تغییر در سطح ژنوم با تغییر در فنوتیپ گیاه را مطابقت بدهد (7، 32) و نشانگر ISSR نیز در شناسایی نواحی چندشکل و مدیریت ذخایر ژنتیکی نشانگر سودمندی است (30، 21). در بررسی تنوع مولکولی 41 ژنوتیپ گوآوا از هند شامل تعداد 93 قطعه با 8 آغازگر تصادفی RAPD تکثیر شد. براساس تجزیه خوشه‌ای کلیه افراد به دو دسته اصلی تقسیم شدند. این مطالعه نشان داد که پایه ژنتیکی این گوآواها از تنوع کم تا متوسط برخوردار است و ارقام تریپلوئید گوآوا از نظر ژنتیکی یکسان نیستند و منشاء مستقلی دارند (28). از نشانگرهای RAPD و DAMD برای بررسی تنوع ژنتیکی و ارتباط بین 22 نمونه گوآوا استفاده شد. حداکثر فاصله ژنتیکی بین گوآوای بنفش و الله آباد صفدا مشاهده شد و تجزیه خوشه‌ای بیشتر ارقام و نمونه‌های نشأت گرفته از دشت‌های هندوگنگتی را در یک گروه قرار داد. در این بررسی DAMD نشانگر خوبی برای خوشه بندی ارقام تشخیص داده شد (3). در مطالعه‌ای دیگر تنوع ژنتیکی یازده گونه پسیدیوم با استفاده از روش‌های مورفولوژیکی و SPAR ( RAPD و ISSR) مورد بررسی قرار گرفت. سه آغازگر RAPD و چهار آغازگر ISSR صد درصد چندشکلی نشان دادند. میانگین چندشکلی در دو نشانگر RAPD و ISSR ، 77 و 6/81 درصد بود. تجزیه خوشه‌ای یک الگوی کمابیش مشابه را نشان داد (23). به طور کل تجزیه‌های مولکولی میزان بالایی از تنوع در ژنوتیپ‌های گوآوای مورد مطالعه را نشان می دهد که می تواند در برنامه بهبود گوآوا استفاده شود. در تعیین تنوع ژنتیکی 22 رقم Psidium guajava و 2 گونه دیگر از بین 29 آغازگر RAPD مورد استفاده 10 مورد یک‌شکل و 19 مورد چندشکل بودند. تعداد آللهای تشخیص داده شده بین 2 تا 11 با میانگین 6 و محتوای اطلاعات چندشکلی بین 49/0-89/0 نشان داد که نشانگر RAPD کاملاً اطلاع دهنده بود (33). در بررسی روابط ژنتیکی Psidium guajava با استفاده از آغازگرهای SSR در چین میانگین اطلاعات چندشکلی نشانگرها 60/0، تنوع ژنتیکی نی برابر با 29/0 و شاخص شانون 44/0 و دامنه تغییرات ضریب تشابه ژنتیکی 37/0-99/0 بدست آمد (36). در مطالعه‌ای دیگر تنوع ژنی بین 0377/0-6681/0 با میانگین 2766/0 متغیر بود. تجزیه PCA و تجزیه خوشه‌ای تنوع فنوتیپی و ژنتیکی قابل توجهی در بین ارقام موجود نشان داد. حداکثر تنوع در صفات برگ مانند طول برگ، عرض برگ، طول دمبرگ و دمبرگ مشاهده شد (20).

منابع ژنتیکی تأمین کننده ژن‌های مطلوب هستند که در صورت بهره‌‌برداری صحیح از آنها می‌توان ارقام جدید و مطلوب را تولید نمود (4). جهت بررسی و میزان تنوع ژنتیکی در گیاهان، روش‌های بسیار زیادی وجود دارد. در بین انواع روش‌ها، استفاده از روش‌های مبتنی بر دی‌اِن‌اِی دقیق‌ترین و مطمئن‌ترین روش‌ها برای تعیین و شناسایی تنوع ژنتیکی می‌باشد و همراه با روش‌های آماری چند متغیره آماری، پتانسیل قابل توجهی جهت بررسی روابط خویشاوندی، سیر تکاملی و تنوع ژنتیکی گیاهان دارند (26). تاکنون به دلیل عدم شناخت ذخایر ژنتیکی، برنامه اصلاحی قابل توجهی بر روی گیاهان بومی ایران انجام نشده است (1). در ایران گوآوا در هرمزگان و سیستان و بلوچستان کشت و به دلیل بازارپسندی و قیمت خوبی که در کشورهای حاشیه خلیج‌فارس دارد، صادر و از نظر ارزآوری حائز اهمیت است. ارزیابی تنوع ژنتیکی پیش نیاز توسعه ژنوتیپ‌ها از طریق برنامه‌های به‌نژادی است. شناسایی به کمک نشانگرهای مولکولی در گوآوا تا کنون در ایران انجام نشده و با توجه به کاربرد آسان و سریع نشانگرهای مولکولی RAPD و ISSR هدف از این پژوهش گروه‌بندی، تعیین همبستگی بین ژنوتیپ‌های مختلف و شناسایی بهترین والدین جهت تلاقی در برنامه‌های به‌نژادی آینده می‌باشد.

مواد و روشها

در این آزمایش تنوع ژنتیکی 15 ژنوتیپ گوآوا با استفاده از نشانگرهای RAPD و ISSR بررسی شد. در اوایل بهار 1394 نمونه‌های برگی جوان از 15 مکان مربوط به دو استان هرمزگان (میناب و رودان) و سیستان و بلوچستان (چابهار) جمع‌آوری (جدول 1) و پس از گذاشتن بر روی یخ خشک به آزمایشگاه به‌نژادی مولکولی دانشکده کشاورزی دانشگاه بیرجند منتقل شد.

جدول1- ژنوتیپ‌های مورد بررسی گوآوا

شماره نمونه	مکان جمع‌آوری	مختصات جفرافیایی	خصوصیت	شماره نمونه	مکان جمع‌آوری	مختصات جفرافیایی	خصوصیت	شماره نمونه	مکان جمع‌آوری	مختصات جفرافیایی	خصوصیت
M1	میناب	27° 11′53″ N 54° 22′ 7″ E	گرد، متوسط، شیرین	R1	رودان	27° 26′ 7″ N 57° 11′ 3″ E	بزرگ، گلابی شکل	CH1	چابهار	25° 17′ 31″ N, 60° 38′ 35″ E	گلابی شکل، گوشت صورتی
M2	میناب	27° 11′53″ N 54° 22′ 7″ E	گرد، متوسط، گس	R2	رودان	27° 26′ 7″ N 57° 11′ 3″ E	لیمویی شکل	CH2	چابهار	25° 17′ 31″ N, 60° 38′ 35″ E	گرد، گوشت صورتی
M3	میناب	27° 11′53″ N 54° 22′ 7″ E	کوچک، گلابی شکل	R3	رودان	27° 26′ 7″ N, 57° 11′ 3″ E	متوسط، گلابی شکل	CH3	چابهار	25° 17′ 31″ N, 60° 38′ 35″ E	گرد، شیرین
M4	میناب	27° 11′53″ N 54° 22′ 7″ E	کوچک، گرد، گس	R4	رودان	27° 26′ 7″ N, 57° 11′ 3″ E	گرد، متوسط	CH4	چابهار	25° 17′ 31″ N, 60° 38′ 35″ E	کوچک، گرد، صورتی
M5	میناب	27° 11′53″ N 54° 22′ 7″ E	متوسط، گلابی شکل	R5	رودان	27° 26′ 7″ N, 57° 11′ 3″ E	گرد، بی‌دانه، گوشت صورتی	CH5	چابهار	25° 17′ 31″ N, 60° 38′ 35″ E	گرد، گس

^*مختصات جغرافیایی برگرفته از سایت https://geohack.toolforge.org

استخراج DNA با استفاده از روش تغییریافته CTAB انجام شد (8). کمیت و کیفیت DNA استخراج‌شده با استفاده از دستگاه نانودراپ و الکتروفورز با ژل آگارز یک درصد در بافر 0.5XTBE تعیین شد. از 36 آغازگر RAPD و 7 آغارگر ISSR استفاده گردید (جدول 2).

آغازگرها به صورت خشک فریز شده از شرکت دنازیست آسیا خریداری شدند. PCR با استفاده از دستگاه ترموسایکلر و مطابق با چرخه حرارتی زیر اجرا شد (جدول 3).

جدول 2- مشخصات آغازگرهای RAPD و ISSR

ISSR		RAPD
نام آغازگر	توالی آغازگر	نام آغازگر	توالی آغازگر	نام آغازگر	توالی آغازگر	نام آغازگر	توالی آغازگر
ISSR1	5'- (AG)8T-3'	OPA02	5'-TGCCGAGCTG-3'	OPAB03	5'-TGGCGCACAC-3'	OPB11	5'-GTAGACCCGT-3'
ISSR2	5'- (GA)8T-3'	OPA03	5'-AGTCAGCCAC-3'	OPAB04	5'-GGCACGCGTT-3'	OPB17	5'-AGGGAACGAG-3'
ISSR3	5'- (CT)8RG-3'	OPA05	5'-AGGGGTCTTG-3'	OPAB08	5'-GTTACGGACC-3'	OPB18	5'-CCACAGCAGT-3'
ISSR4	5'- (AG)8RC-3'	OPA06	5'-GGTCCCTGAC-3'	OPAB09	5'-GGGCGACTAC-3'	OPB20	5'-GGACCCTTAC-3'
ISSR5	5'- (AG)8YT-3'	OPA08	5'-GTGACGTAGG-3'	OPAB17	5'-TCGCATCCAG-3'	OPC5	5'-GATGACCGCC-3'
ISSR6	5'-(TC)9C-3'	OP 09	5'-GGGTAACGCC-3'	OPAB18	5'-CTGGCGTGTC-3'	OPC18	5'-TGAGTGGGTG-3'
ISSR7	5'-(CT)8T-3'	OPA10	5'-GTGATCGCAG-3'	OPAB19	5'-ACACCGATGG-3'	OPC19	5'-GTTGCCAGCC-3'
		OPA11	5'-CAATCGCCGT-3'	OPAB20	5'-CTTCTCGGAC-3'	OPD18	5'-GAGAGCCAAC-3'
		OPA12	5'-TGGGCGATAG-3'	OPAC04	5'-ACGGGACCTG-3'	OPG6	5'-GTGCCTAACC-3'
		OPA18	5'-AGGTGACCGT-3'	OPAC06	5'-CCAGAACGGA-3'	OPG19	5'-GTCAGGGCAA-3'
		OPA20	5'-GTTGCGATCC-3'	OPAC07	5'-GTGGCCGATG-3'	OPJ1	5'-CCCGGCATAA-3'
		OPAB02	5'-GGAAACCCCT-3'	OPAC20	5'-ACGGAAGTGG-3'	OPJ4	5'-CCGAACACGG-3'

جدول 3- اجزای PCR و برنامه دمایی اجراء شده در نشانگر RAPD و ISSR

اجزای PCR			RAPD				ISSR
مواد	غلظت نهایی	مقدار در 15 میکرولیتر	نام مراحل	دما (C°)	زمان (min/s‎)	تعداد چرخه	دما (C°)	زمان (min/s‎)	تعداد چرخه
آب دو تقطیر	....	µl5/5	واسرشت سازی اولیه	94	4 دقیقه	1	94	4 دقیقه	1
مسترمیکس	X1	µl5/7	واسرشت سازی	94	1 دقیقه	45	94	45 ثانیه	40
آغازگر	mµ 5/1	µl1	اتصال	35	1 دقیقه	45	5 - دمای ذوب	45 ثانیه	40
دی‌ان‌ای الگو	ng/µl 30	µl1	بسط (گسترش)	72	2 دقیقه	45	72	55 ثانیه	40
			بسط نهایی	72	6 دقیقه	1	72	شش دقیقه	1

محصول حاصل از PCR در ژل آگارز 2/1 درصد و در بافر 0.5TBE الکتروفورز و پس ‌از آن رنگ‌آمیزی ژل به‌منظور قابل ‌رؤیت شدن انجام گرفت. قطعات تکثیر ‎یافته DNA توسط ژل‌داک زیر نور فرابنفش مشاهده و عکس‎برداری شد. اطلاعات حاصل از نوارهای بدست آمده به‌صورت ماتریس صفر (عدم حضور نوار) و یک (حضور نوار) نمره دهی شد. باتوجه به اطلاعات جغرافیایی، ژنوتیپ‎های جمع‎آوری شده از میناب و رودان از استان هرمزگان در یک جمعیت و ژنوتیپ‌های چابهار از استان سیتان وبلوچستان در جمعیت دیگر تقسیم‎بندی و تجزیه داده‌ها صورت گرفت. پس از تجزیه، شاخص‎های مولکولی درصد چندشکلی، محتوای چندشکلی، نسبت چندشکلی یا EMR ‎ ، شاخص نشانگر یا MI و قدرت تفکیک و پارامترهای ژنتیکی جمعیت مانند تعداد آلل‎ها (Na)، تعداد آلل‎های مؤثر (Ne)، شاخص تنوع ژنی نی (H)، شاخص اطلاعاتی شانون (I)، هتروزیگوسیتی درون جمعیت‎ها (Hs)، هتروزیگوسیتی بین جمعیت‎ها (Dst)، هتروزیگوسیتی کل (Ht=HS+Dst) و تخمین جریان ژنی (Nm) نیز محاسبه گردید. با استفاده ازHt و Hs بدست آمده شاخص Fst با توجه به فرمول Fst= 1- Hs/Ht محاسبه شد. در گام بعدی از تجزیه خوشه‌ای و تجزیه به مختصات اصلی جهت بررسی تنوع ژنتیکی و گروه‌بندی افراد و جمعیت‌ها استفاده شد (14). قبل از انجام تجزیه خوشه‌ای ماتریس تشابه محاسبه شد. در ‎این تحقیق چهار ضریب تشابه نی و لی یا دایس، جاکارد، تطابق ساده و UN1 محاسبه شد (34، 25، 13). در تجزیه خوشه‌ای از الگوریتم های مختلفی مانند لینکاژ منفرد، لینکاژ کامل و میانگین تشابه میان زوج نمونه‏‎ها (UPGMA)( Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean) استفاده شد که از میان این روش ها روش UPGMAبه دلیل دارا بودن بالاترین ضریب همبستگی انتخاب شد. برای بررسی کارایی الگوریتم در تجزیه خوشه‎ای ضریب همبستگی کوفنتیک (r) تعیین گردید. همبستگی بین عناصر ماتریس کوفنتیک با عناصر ماتریس فاصله اولیه معیاری از برازش تجزیه خوشه‌ای است. در صورتی که r بالاتر از 9/0 برازش خیلی خوب، بین 9/0 –8/0 برازش خوب و کمتر از 8/0 نشان دهنده برازش ضعیف است (19). از تجزیه به مختصات اصلی (PCoA) به منظور کاهش داده‏‎های به دست آمده و یافتن ترکیباتی از چند متغییر جهت ‎ایجاد شاخص‏‎های مستقل (اندازه‌گیری جنبه‏‎های متفاوتی از داده‏‎ها) و تجزیه و تحلیل بهتر داده‏‎ها استفاده شد (10). تجزیه خوشه‎ای، ضریب کوفنتیک و تجزیه به مختصات اصلی توسط نرم افزار NTSYSPC_2.2 و محاسبه پارامترها و شاخص‌های ژنتیکی با نرم‎افزار POPGEN_3.1 و Excel انجام شد. در نهایت برای مطالعه ساختار ژنتیکی جمعیت‌ها تجزیه واریانس مولکولی (9) با استفاده از نرم‎افزار GENALEX 6.0 انجام شد.

نتایج

شاخص‌ها و پارامترهای ژنتیکی: از 36 آغازگر RAPD نه و از هفت آغازگر ISSR شش تا چندشکلی نشان دادند (شکل 1). از مجموع نه آغازگر RAPD 80 نوار تکثیر شد که 26 نوار (5/32 درصد) یک‌شکل و 54 نوار (5/67 درصد) چندشکل بودند (شکل 1 الف). درصد چندشکلی از تقسیم تعداد نوارهای چندشکل بر کل نوارها بدست آمد. به طور میانگین تعداد 9/8 نوار به ازای هر آغازگر بدست آمد که تعداد شش نوار از آن‌ها چندشکل بودند. بیشترین درصد چندشکلی مربوط به آغازگر OPG6 (6/91 درصد) و کمترین آن متعلق به آغازگر OPAB08 (25 درصد) بود (جدول 4). از مجموع شش آغازگر ISSR 35 نوار تکثیر شد که 10 نوار (6/28) یک‌شکل و 25 نوار (4/71) چندشکل بودند (شکل 1 ب). به طور میانگین تعداد 8/5 نوار به ازای هر آغازگر بدست آمد که تعداد 2/4 نوار از آن‌ها چندشکل بودند. بیشترین درصد چندشکلی مربوط به آغازگر ISSR1 (3/83 درصد) و کمترین آن مربوط به آغازگر ISSR4 (60 درصد) بود (جدول 4).

شکل1- الگوی نواری DNA گوآوا با استفاده از آغازگر OPAB17 (RAPD)و آغازگر ISSR3 (ISSR)

جدول 4- شاخص‌های مولکولی محاسبه شده برای نشانگرهای RAPD و ISSR در ژنوتبپ‌های گوآوا

آغازگر

تعداد نوارهای تشکیل شده

تعداد نوارهای چندشکل

درصد چندشکلی

شاخص محتوای چندشکلی

شاخص نسبت چندشکلی

شاخص نشانگر

قدرت تفکیک

آغازگر

تعداد نوارهای تشکیل شده

تعداد نوارهای چندشکل

درصد چندشکلی

شاخص محتوای چندشکلی

شاخص نسبت چندشکلی

شاخص نشانگر

قدرت تفکیک

RAPD

ISSR

OPA 18

5/62

27/0

12/3

84/0

20/11

ISSR1

33/83

32/0

17/4

33/1

53/6

OPAB04

4/44

19/0

8/1

34/0

40/14

ISSR2

41/71

27/0

57/3

97/0

40/10

OPAB08

13/0

5/0

07/0

13/14

ISSR3

19/0

68/2

51/0

60/9

OPAB09

4/71

24/0

57/3

87/0

53/8

ISSR4

24/0

8/1

43/0

87/5

OPAB17

5/87

40/0

13/6

45/2

80/8

ISSR5

37/0

2/3

18/1

8/6

OPC5

1/57

20/0

29/2

46/0

87/9

ISSR6

25/0

68/2

67/0

87/9

OPD18

7/72

27/0

18/5

05/1

07/15

میانگین

8/5

2/4

46/71

27/0

02/3

85/0

17/8

OPG6

6/91

36/0

6/3

47/13

OPG19

32/0

4/6

05/2

94/14

میانگین

9/8

8/65

26/0

4/33

30/1

27/12

شاخص محتوای چندشکلی (PIC) هر آغازگر با فرمول PIC=1-Σpi2 محاسبه شد که Pi فراوانی نشانگر i ام می‏باشد، نسبت چندشکلی یا EMR ‎ از ضرب درصد چندشکلی در تعداد نوارهای چندشکل، شاخص نشانگر یا MI از ضرب شاخص نسبت چندشکلی در محتوای چندشکلی، شاخص نشانگر یا MI از ضرب شاخص نسبت چندشکلی در محتوای چندشکلی و قدرت تفکیک یا RP=ΣIB که IB=1-[2×(0.5-Pi] و Pi نسبت افراد دارای نوار است. مقدار شاخص PIC نشانگر ISSR (27/0) نسبت به نشانگر RAPD (26/0) اندکی بیشتر بود (جدول 4). میانگین هتروزیگوسیتی کل (Ht)، هتروزیگوسیتی درون جمعیت‌ها (Hs)، هتروزیگوسیتی بین جمعیت‌ها (Dst) و شاخص Fst برای نشانگر RAPD 372/0، 345/0، 027/0 و 069/0 و برای نشانگر ISSR 376/0، 331/0، 044/0 و 054/0 به ترتیب بدست آمد (جدول 5). بیشترین هتروزیگوسیتی کل مربوط به آغازگر OPG19 (437/0) و کمترین مربوط به آغازگر OPAB8 (315/0) بود. بیشترین هتروزیگوسیتی کل مربوط به آغازگر ISSR5 (448/0) و کمترین مربوط به آغازگر ISSR4 (256/0) بود. میانگین تعداد آلل‌ها و آلل‌های مؤثر برای آغازگرهای RAPD 12 و 4/9 و برای آغازگرهای ISSR 3/8 و 4/6 بدست آمد. در نشانگر RAPD کمترین تعداد آلل مربوط به آغازگر OPAB08 و بیشترین مربوط به آغازگر OPG6 و در نشانگر ISSR کمترین تعداد آلل مربوط به آغازگرISSR4 و بیشترین مربوط به آغازگرهای ISSR1 و ISSR2 بود. میانگین شاخص تنوع ژنتیکی نی و شاخص شانون در نشانگر RAPD 3/2 و 4/3 و در نشانگر ISSR 5/1 و 1/2 بود. بالابودن شاخص نی و شانون در نشانگرهای فوق نشان دهنده کارایی بالای ‎ آغازگرهای به‌کار رفته در تمایز ژنوتیپ‎ها بود (جدول 6).

جدول 5- پارامترهای محاسبه شده برای نشانگرهای RAPD و ISSR در ژنوتیپ‌های گوآوا

آغازگر	هتروزیگوسیتی کل	هتروزیگوسیتی درون جمعیت‌ها	جریان ژنی	هتروزیگوسیتی بین جمعیت‌ها	Fst	آغازگر	هتروزیگوسیتی کل	هتروزیگوسیتی درون جمعیت‌ها	جریان ژنی	هتروزیگوسیتی بین جمعیت‌ها	Fst
RAPD						ISSR
OPA18	387/0	327/0	82/111	060/0	155/0	ISSR1	344/0	340/0	34/104	004/0	011/0
OPAB04	393/0	375/0	76/172	018/0	046/0	ISSR2	415/0	323/0	23/36	091/0	044/0
OPAB08	315/0	314/0	87/78	001/0	003/0	ISSR3	349/0	286/0	59/99	063/0	018/0
OPAB09	349/0	331/0	48/105	018/0	052/0	ISSR4	256/0	249/0	54/158	007/0	027/0
OPAB17	391/0	382/0	65/130	009/0	023/0	ISSR5	448/0	443/0	15/43	005/0	012/0
OPC5	347/0	335/0	94/53	012/0	035/0	ISSR6	442/0	350/0	62/5	092/0	208/0
OPD18	366/0	310/0	64/18	056/0	153/0	میانگین	376/0	331/0	58/74	044/0	054/0
OPG6	360/0	343/0	21/370	017/0	047/0
OPG19	437/0	388/0	68/231	049/0	112/0
میانگین	372/0	345/0	56/141	027/0	069/0

جدول 6- پارامترهای ژنتیکی برای نشانگرهای RAPD و ISSR در ژنوتیپ‌های گوآوا

آغازگر	تعداد آلل‎ها	تعداد آلل‎های مؤثر	شاخص تنوع ژنی نی	شاخص اطلاعاتی شانون	نشانگر	تعداد آلل‎ها	تعداد آلل‎های مؤثر	شاخص تنوع ژنی نی	شاخص اطلاعاتی شانون
RAPD					ISSR
OPA18	10	24/8	91/1	87/2	ISSR1	10	84/7	91/1	70/2
OPAB04	8	70/6	56/1	32/2	ISSR2	10	70/6	68/1	55/2
OPAB08	4	3	62/0	97/0	ISSR3	8	42/6	36/1	05/2
OPAB09	10	96/7	72/1	63/2	ISSR4	6	33/4	15/1	33/1
OPAB17	14	24/10	42/2	56/3	ISSR5	8	59/6	54/1	29/2
OPC5	8	29/6	36/1	05/2	ISSR6	8	71/6	42/1	2
OPD18	16	62/11	11/3	57/4	میانگین	33/8	43/6	51/1	15/2
OPG6	22	34/17	02/4	79/5
OPG19	16	54/13	67/3	61/5
میانگین	12	44/9	26/2	37/3

تجزیه واریانس مولکولی: نتایج حاصل از تجزیه واریانس مولکولی نشان داد که از کل تغییرات موجود در ژنوتیپ‌ها، 6 درصد از تغییرات مربوط به بین جمعیت‎ها و 94 درصد مربوط به درون جمعیت‎ها بر اساس نشانگر RAPD (شکل 2 الف) و 10 درصد از تغییرات مربوط به بین جمعیت‎ها و 90 درصد مربوط به درون جمعیت‎ها بر اساس نشانگر ISSR بود (شکل 2 ب).

شکل 2- تجزیه واریانس مولکولی بر اساس نشانگرهای الف- RAPD و ب- ISSR در ژنوتیپ‌های گوآوا

ماتریس تشابه و تجزیه خوشه‌ای: در این بررسی باتوجه به ضرایب بدست آمده از نشانگر RAPD و ISSR ضریب تشابه J (جاکارد) به عنوان بهترین ضریب و الگوریتم UPGMA (میانگین تشابه میان زوج نمونه‏‎ها) به دلیل دارا بودن بالاترین ضریب همبستگی (89/0 و 86/0) به ترتیب در RAPD و ISSR به عنوان بهترین الگوی خوشه بندی انتخاب شدند که نشان‌دهنده برازش مناسب نمودار درختی با ماتریس تشابه می‌باشد (جدول 7).

ماتریس تشابه بر اساس نشانگر RAPD نشان داد (جدول 8) که ژنوتیپ M5 با M4 دارای بالاترین ضریب تشابه (83/0) بودند و ژنوتیپ‌های R2 با R3 و R5 با M4 (70/0)، M1 با M2 (69/0) و R3 با R1 (68/0) دارای تشابه بالایی بودند. کمترین ضریب تشابه بین CH5 با R4 (19/0) بود و ژنوتیپ‌های CH4 با R4 (21/0) و CH4 با CH2 (22/0) دارای تشابه پایینی بودند. ماتریس تشابه بر اساس نشانگر ISSR نشان داد (جدول 9) که ژنوتیپ‌های R2 با R3 (86/0) دارای بالاترین ضریب تشابه بودند و ژنوتیپ‌های M3 با R3 (78/0)، R3 با R4 (74/0)، M3 با R2 (71/0) و M4 با R5 (70/0) دارای تشابه بالایی بودند. ژنوتیپ‌ M1 با CH4 (12/0) کمترین تشابه را نشان داد و ژنوتیپ‌های M1 با M5 (17/0)، M1 با M3 (19/0) و M2 و CH4 (22/0) دارای تشابه پایینی بودند.

جدول 7- ضرایب همبستگی کوفنتیک

الگوریتم	کامل		منفرد		میانگین تشابه میان زوج نمونه‏‎ها
ضریب تشابه	RAPD	ISSR	RAPD	ISSR	RAPD	ISSR
تطابق ساده	^**71/0	^**69/0	^**66/0	^**68/0	^**76/0	^**76/0
جاکارد	^**86/0	^**84/0	^**86/0	^**80/0	^**89/0	^**86/0
دایس	^**84/0	^**81/0	^**72/0	^**77/0	^**87/0	^**83/0
UV1	^**67/0	^**60/0	^**60/0	^**65/0	^**71/0	^**74/0

تجزیه خوشه‌ای بر اساس نشانگر RAPD ژنوتیپ‎ها را در پنج خوشه گروه‌بندی نمود (شکل 3 الف). در خوشه اول دو ژنوتیپ M1 و M2، در خوشه دوم CH2، CH3 در خوشه سوم M3،M4،M5 ، R1، R2، R3 ،R4 ، R5، CH1 در خوشه چهارم CH4 و در خوشه پنجم CH5 قرار گرفتند. تجزیه خوشه‌ای بر اساس نشانگر ISSR ژنوتیپ‌ها را در سه گروه خوشه‎بندی نمود (شکل 3 ب). خوشه اول شامل ژنوتیپ‌های M1 و M2، خوشه دوم شامل M3، M4، M5، R1، R2،R3 ، R4، R5، CH2، CH3، CH4، CH5 و در خوشه سوم ‌CH1 قرار گرفت.

جدول 8- ماتریس تشابه بین ژنوتیپ‌های گوآوا بر اساس نشانگر RAPD

CH5

CH4

CH3

CH2

CH1

R15

ژنوتیپ

69/0

37/0

27/0

54/0

50/0

37/0

83/0

53/0

45/0

25/0

53/0

55/0

61/0

35/0

33/0

57/0

46/0

47/0

60/0

38/0

37/0

70/0

68/0

44/0

45/0

62/0

37/0

35/0

54/0

48/0

52/0

40/0

42/0

43/0

39/0

46/0

45/0

46/0

50/0

47/0

65/0

70/0

48/0

36/0

37/0

58/0

54/0

57/0

50/0

55/0

58/0

67/0

43/0

40/0

CH1

39/0

47/0

49/0

46/0

51/0

42/0

51/0

44/0

41/0

35/0

CH2

57/0

29/0

28/0

39/0

32/0

30/0

34/0

26/0

31/0

27/0

44/0

31/0

CH3

24/0

22/0

27/0

23/0

21/0

26/0

25/0

30/0

27/0

29/0

30/0

31/0

48/0

CH4

42/0

25/0

35/0

36/0

19/0

30/0

35/0

39/0

38/0

35/0

38/0

35/0

28/0

CH5

جدول 9- ماتریس تشابه بین ژنوتیپ‌های گوآوا بر اساس نشانگر ISSR

CH5

CH4

CH3

CH2

CH1

R15

ژنوتیپ

55/0

40/0

19/0

55/0

44/0

21/0

67/0

52/0

33/0

17/0

55/0

58/0

60/0

41/0

24/0

60/0

52/0

55/0

71/0

48/0

39/0

86/0

59/0

60/0

61/0

78/0

48/0

33/0

74/0

60/0

65/0

60/0

61/0

39/0

24/0

68/0

62/0

63/0

60/0

70/0

57/0

40/0

32/0

52/0

50/0

40/0

45/0

40/0

27/0

37/0

33/0

26/0

31/0

CH1

47/0

68/0

65/0

59/0

60/0

56/0

47/0

67/0

52/0

50/0

24/0

CH2

67/0

47/0

52/0

58/0

45/0

39/0

42/0

40/0

29/0

CH3

44/0

30/0

36/0

55/0

50/0

43/0

53/0

44/0

48/0

50/0

22/0

12/0

CH4

50/0

53/0

37/0

43/0

55/0

50/0

42/0

52/0

37/0

33/0

59/0

30/0

27/0

CH5

بحث

در این مطالعه درصد چندشکلی RAPD (5/67 درصد) بیشتر از ISSR (42/71 درصد) بود. میزان بالای چندشکلی بدست آمده از نشانگرهای ISSR و RAPD بیانگر قدرت بالای ‎این نشانگرها در بررسی تنوع مولکولی و همچنین بیانگر تنوع زیاد ژنوتیپ‌های مورد بررسی می‎باشد. بالا بودن میزان چندشکلی در نشانگر ISSR می‎تواند به دلیل فراوانی مناطق تکرار شونده در ژنوم این گیاه دانست. احمد و همکاران (2) با استفاده از 4 آغازگر RAPD درصد چندشکلی کل را 2/33 درصد گزارش نمودند. کیداها و همکاران (17) در بررسی تنوع ژنتیکی گوآوا با استفاده از نشانگر ISSR سطح چندشکلی نشانگر ISSR را بین 51 تا 85 درصد گزارش دادند که با میزان بالای درصد چندشکلی در مطالعه کنونی مطابقت دارد. PIC معیاری به عنوان قدرت تشخیص نشانگر، نه تنها به تعداد نشانگرهای چند شکل در هر جفت آغازگر، بلکه به فراوانی هر نشانگر نیز بستگی دارد. مقدار PIC بالا برای آغازگر نشان دهندة کارآیی بالای آن‌ها در تمایز ژنوتیپ‌های مورد استفاده می‌باشد که می‌توان آن‌ها را جهت مطالعات مشابه پیشنهاد نمود (11). این شاخص‌ نشان دهنده چندشکلی در ‎یک جایگاه نشانگری بوده و در تفکیک و تمایز افراد نقش به‌سزایی دارند و همچنین پتانسیل هر آغازگر را جهت تولید نوار بیشتر مشخص می‎کند. این خصوصیت در نشانگر ISSR می‌تواند به دلیل وجود شرایط دقیق و دمای اتصال بالای آغازگرهای ISSR در مقایسه با RAPD‎ باشد که باعث می‎شود تا دو فردی که از لحاظ وجود ‎یک قطعه با هم متفاوتند به خوبی از ‎یکدیگر تفکیک شوند، در حالی که در نشانگر RAPD امکان اتصال آغازگرها به ‎یکدیگر وجود دارد. مقدار PIC بالا برای آغازگرهای ISSR5 و OPAB17 نشان دهنده‏ی کارآیی بالای آن‎ها در تمایز ژنوتیپ‎های مورد استفاده بوده و می‌توان آن‌ها را برای مطالعه‌های بعدی توصیه نمود.

الف

شکل 3- تجزیه خوشه‌ای ژنوتیپ‌های گوآوا با استفاده از نشانگرهای الف- RAPD و ب- ISSR

میانگین F_st محاسبه شده برای نشانگر RAPD (069/0) و ISSR (054/0) بود که نشان می‌دهد تنوع متوسطی بین جمعیت‌ها وجود داشت. روش‌های زیادی جهت محاسبه تفاوت‌های ژنتیکی درون و بین جمعیت‌ها وجود دارد که‎ یکی از آن‌ها محاسبه شاخص F_st (همبستگی ژن‌های افراد مختلف در ‎یک جمعیت) می‎باشد. زمانی که افراد از نظر فراوانی آللی کاملا مشابه باشند، مقدار ‎این شاخص برابر با صفر و زمانی که افراد از نظر آللی کاملاً متفاوت باشند ‎این مقدار برابر با ‎یک می‌شود. به طور معمول مقدار F_st در اکثر موارد کمتر از‎ یک است، زیرا چندشکلی ناشی از جهش به طور مؤثری میزان F_st را کاهش می‌دهد. پایین بودن میزان F_st نشان از تمایز پایین جمعیت‎هاست که ‎این مطلب می‎تواند به دلیل مهاجرت، شباهت‎های اقلیمی و جغرافیایی و غیره باشد (22).

نتایج حاصل از تجزیه واریانس مولکولی نشان داد که تنوع بین جمعیت‌های مختلف از تنوع درون جمعیت‌ها کمتر است که علت آن وجود افراد با تنوع ژنتیکی بالا در هر جمعیت بود و نتایج حاصل از نشانگر ISSR نتایج RAPD را تأیید نمود. مطالعات کوماری و همکاران (20) نشان داد که تنوع در درون و بین گونه‌های گوآوا وجود دارد و P.guajava نسبت به گونه‌های دیگر شباهت بیشتری با P.guienensis داشت. تجزیه واریانس مولکولی نشان داد، که تنوع درون جمعیتی قابل ملاحظه‌ای در جمعیت‌های این گونه وجود دارد و علی رغم شرایط رویشگاهی متفاوت و فاصله جغرافیایی زیاد جمعیت‌ها از یکدیگر، سطح تمایز ژنتیکی بین جمعیت‌های مورد مطالعه پایین و هتروزیگوسیتی درون جمعیت‌ها بسیار مشابه با یکدیگر است. این مسئله می‌تواند حاکی از سطح بالای برقراری جریان ژن و تبادل ژنتیکی بین جمعیت‌ها باشد (17). پراکاش و همکاران (26) در بررسی تنوع ژنتیکی گوآوا کمترین شباهت ژنتیکی بین رقم میرجاپور و گونه کوادرانگولاریس (P. quadrangularis)(46 درصد) و بیشترین تشابه را بین ژنوتیپ‌های انتخابی SWY-1 و GR-1 Navalur (89 درصد) گزارش نمودند. در مطالعه‌ای دیگر حداکثر فاصله بین گوآوای بنفش و الله آباد صفدا (43 درصد) و حداقل فاصله بین دو ژنوتیپ به‌نژادی HPSI-20 و HPSI-26 (4/5 درصد) بود (3).

تجزیه خوشه‌ای نشان داد که تطابقی بین فاصله ژنتیکی جمعیت‎ها و منشاء جغرافیایی آن‌ها وجود نداشت. به عنوان مثال بر اساس نشانگر RAPD ژنوتیپ‎هایی از جمعیت میناب با رودان و چابهار در یک خوشه (مثلاً سه ژنوتیپ از میناب با 5 ژنوتیپ از رودان و یک ژنوتیپ از چابهار {M3، M4،M5 ، R1، R2، R3 ،R4 ، R5، CH1} در خوشه سوم قرار گرفتند) و حتی یک زیرخوشه (مثلا M3 با R2 در یک زیرخوشه و M4 با R5 در یک زیرخوشه) قرار گرفتند. حتی ژنوتیپ‌های چابهار در دو خوشه متفاوت قرار گرفتند. البته در بعضی زیرخوشه‌ها ژنوتیپ‌هایی از یک جمعیت در کنار یکدیگر قرار گرفتند که این حالت عمومیت نداشت. در مطالعه پراکاش و همکاران (28) 41 ژنوتیپ گوآوا در دو گروه عمده A و B قرار گرفتند. در بررسی آن‌ها بیشتر ژنوتیپ‌های جنوب هند در یک گروه و ژنوتیپ‌های شمال هند در گروه دیگر از هم متمایز شدند که نشان دهنده انطباق تنوع مولکولی بیشتر ژنوتیپ‎ها بر تنوع جغرافیایی آن‎ها بود. تجزیه خوشه‌ای 33 ژنوتیپ گوآوا از سه منطقه در غرب بنگلادش آن‌ها را در دو گروه عمده و زیر گروه‌های مجزا گروه بندی نمود. در این مطالعه فاصله ژنتیکی میان جمعیتها کاملاً با تفاوت‌های مورفولوژی آن‌ها مطابقت داشت (2). در مطالعه کیدا‌ها و همکاران (18) نمودار درختی بدست آمده توده‌های مورد استفاده را در سه گروه عمده با زیر گروه‌هایی قرار داد. در این تحقیق نشانگرهای استفاده شده به طور موفقیت‌آمیزی تنوع ژنتیکی، روابط ژنتیکی و پراکندگی‌ ارقام را به خوبی نشان ‌دادند.

در این تحقیق نشانگرهای استفاده شده، به طور موفقیت‌آمیزی تنوع ژنتیکی، روابط ژنتیکی و پراکندگی ژنوتیپ‌ها را به خوبی نشان دادند. اطلاعات حاصل از پارامترهای ژنتیکی، ماتریس تشابه، تجزیه واریانس مولکولی و گروه‏بندی ژنوتیپ‌ها در دو سیستم نشانگری RAPD و ISSR نشان از وجود تنوع ژنتیکی بین ژنوتیپ‌های مورد بررسی داشت و به‌نژاد‌گران می توانند به طور موثر از این تنوع ژنتیکی در برنامه‌های آتی به‌نژادی استفاده نمایند. به طور کل بین تنوع مولکولی موجود در ژنوتیپ‌های جمع آوری شده و موقعیت جغرافیایی در بیشتر موارد تطابقی وجود نداشت و فقط در بعضی موارد آن‌هم در زیرخوشه‌ها این تطابق دیده شد. به عنوان مثال ژنوتیپ‌های رودان، میناب و چابهار در بعضی از مواقع در یک خوشه و حتی زیر خوشه قرار گرفتند. با توجه به فاصله نسبتاً زیاد بین چابهار با رودان و میناب (به ترتیب 418 و 411 کیلومتر) این امر نشان از عدم تبعیت فاصله ژنتیکی از فاصله جغرافیایی دارد. چنانچه این تبعیت وجود داشت، انتظار می رود که ژنوتیپ‌های رودان در یک خوشه، میناب در خوشه دیگر و چابهار در خوشه سوم قرار گیرد. حتی با وجود فاصله نزدیک بین رودان با میناب (34 کیلومتر) انتظار می رفت که ژنوتیپ‌های رودان و میناب در یک خوشه قرار گیرند که این امر محقق نشد. ﻛﺴﺐ ﺍﻃﻼﻋﺎﺕ ﺩﺭ ﻣﻮﺭﺩ ﺷﺒﺎﻫﺖﻫﺎﻱ ژﻧﺘﻴﻜﻲ ﺑﺮﺍﻱ ﺟﻠﻮﮔﻴﺮﻱ ﺍﺯ ﺗﺒﺪﻳﻞ ﺷﺪﻥ خزانه‌های ژنتیکی خوب به ذخایر ژنتیکی‌ ﻳﻜﻨﻮﺍﺧﺖ ﺿﺮﻭﺭﻱ ﺍﺳﺖ. ﺍﺯ ﺁﻧﺠﺎﻳﻲ ﻛﻪ استفاده از نشانگرهای RAPD ﻭISSR روش‌های ساده‌ای هستند و نیاز به توالی ژنوم گیاه مورد نظر ندارند و در مطالعه کنونی نیز کارایی خود را نشان دادند، لذا اﺳﺘﻔﺎﺩﻩ ﺍﺯ ﺁﻧ‌‌‌‌‌‌ﻬﺎ ﺩﺭ ﺑﺮﻧﺎﻣﻪﻫﺎﻱ به‌نژادی و بهبود روش‌های به‌نژادی مفید می‌باشد. با توجه به اطلاعاتی که ﺩﺭﺑﺎﺭﻩ ﺭﻭﺍﺑﻂ ژﻧﺘﻴﻜﻲ ﻧﺰﺩﻳﻚ ﺩﺭ ﺍﺧﺘﻴﺎﺭ به‌نژادگر ﻗﺮﺍﺭﻣﻲﮔﻴﺮﺩ، برای انجام برنامه‌های به‌نژادی هدف‌دار مانند تولید ارقام متمایز، ژنوتیپ‌های با تنوع ژنتیکی پایه‌ای بالا و بهبود بهره‌وری ارقام موجود، استفاده از تکنیک انگشت نگاری DNA پیشنهاد می‌شود. به‌طورکلی، بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپ‌های گوآوا با استفاده از نشانگرهای RAPD و ISSR نشان داد که این نشانگرها در شناسایی نواحی چند شکلی و مدیریت ذخایر ژنتیکی می‎توانند مفید باشند. بررسی ژنوتیپ‌های گواوا با این نشانگر ها نشان داد که چنانچه در آینده به نژادگر و یا محققین دیگر نیاز به هیبریداسیون بین ژنوتیپ‌ها داشته باشند با صرف اینکه دو ژنوتیپ از دو مکان جغرافیایی متفاوت برداشت شود نمی توان اقدام به هیبریداسیون نمود و انتظار قدرت هیبریدی را داشت.

نتیجه‌گیری

با توجه به نتایج این مطالعه می توان انتظار داشت که از تلاقی بین دو ژنوتیپ از یک منطقه (مثلاً چابهار) هیبریداسیون مشاهده شود ولی از تلاقی دو نمونه متفاوت از دو مکان جغرافیایی (مثلا تلاقی ژنوتیپ‌های بین رودان با چابهار) انتظار هیبریداسیون را نداشت. پیشنهاد می گردد که در آینده محققان با نشانگرهای مولکولی بیشتری نتایج این مطالعه را قطعیت بخشیده تا هر زمان که نیازی به ذخایر ژنتیکی خاصی احساس شد، وقت زیادی برای شناسایی ژنوتیپ‌های کارآمد تلف نگردد. از این مطالعه استنباط می شود که گاهی ژنوتیپ‌های جمع آوری شده از دو منطقه مختلف کاملا مشابه بوده و بنابراین جستجو و واکاوی در مورد یک صفت خاص مثلا مقاومت و یا حساسیت به یک بیماری در دو گونه به ظاهر متفاوت (یکی از چابهار و یکی از رودان) کاری بیهوده خواهد بود. بنابراین به نظر می‎رسد، این نشانگرهای مولکولی ابزاری مفید در بررسی فاصله ژنتیکی و تفاوت بین نمونه‌های مختلف گوآوا و کاهش هزینه ها در بررسی های آینده باشد. به طور کل با توجه به نتایج این تحقیق انتظار می رود که بر اساس نشانگر RAPD چنانچه بین ژنوتیپ شماره 5 چابهار (CH5) با ژنوتیپ شماره 4 رودان (R4) و بر اساس نشانگر ISSR بین ژنوتیپ شماره 1 میناب (M1) با ژنوتیپ شماره 4 چابهار (CH4) تلاقی صورت گیرد انتظار بهترین نوع هیبریداسیون را خواهیم داشت و در کنار این موضوع حتماً بایستی صفات مورفو- فیزیولوژیکی و کمی را نیز مدّ نظر داشت.

1. Abolghasemi, S., Naderi, R., and Fattahi Moghadam, M. R. 2020. Evaluation of genetic diversity in Iranian violet (Viola spp) populations using morphological and RAPD molecular markers. J Genet Resour, 6(2): 157-171.

2. Ahmed, B., Mannan, A., .and Hossain, S. 2011. Molecular characterization of guava (Psidium guajava L.) germplasm by RAPD analysis. International Journal of Natural Sciences 3 (1): 62-67.

3. Bajpai, A., Chandra, R., Rajan, S., and Srivastava, N. 2008. RAPD and minisatellite markers for genetic diversity and relationship in guava varieties. Indian Journal of Genetics and Plant Breeding 68(4): 441-445.

4. Clegg, M. T. 1997. Plant genetic diversity and the struggle to measure selection. Journal of Heredity, 88: 1-7.

5. Condón, F., Rasmusson, D.C., Schiefelbein, E., Velasquez, G., and Smith, K.P. 2008. Effect of advanced cycle breeding on genetic diversity in barley breeding germplasm. Crop Science (48) 1027-1036.

6. Del Rio, A., Bamberg, j., Huaman, Z., Salas, A., and Vega, S. E. 1997. Assessing changes in the genetic diversity of potato gene banks. 2. In situ vs ex situ. Theoretical and Applied Genetics 95 (2): 199-204.

7. Domínguez, Á. J. L., Aguilar, S. G., Nieto, A. D., Legaria, S. J. P., and Pineda, P. J. 2008. Utility of RAPD DNA markers in the selection of grafts of the Mexican Guava cultivar 'Media China' without symptoms of deficiency for iron and zinc. International Symposium on Guava and other Myrtaceae (849): 203-210.

8. Doyle, J. J., and Doyle, J. L. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemistry Bulletin 19(1): 11-15.

9. Excoffier, L., Smouse, P. E., and Quattro, J. M. 1992. Analysis of molecular varianceinferred from metric distance among DNA haplotypes: Application to humanmitochondrial DNA restriction data. Genetics 131: 479-791.

10. Farshadfar, E. 2010. New Topics in Biometrics Genetics. Islamic Azad University of Kermanshah Press. First Edition. p, 848.

11. Garcia, A. A. F., Benchimol, L. L., Barbosa, A. M. M., Geraldi, I. O., SouzaJr, C. L., and Souza, A. P. D. 2004. Comparison of RAPD, RFLP, AFLP and SSR markers for diversity studies in tropical maize inbred lines. Genetics and Molecular Biology 27 (4): 579-588.

12. Hays J. D. 1970. Stratigraphy and evolutionary trends of Radiolaria in North Pacific deep-sea sediments. Geological Society of America Memoirs 126 (1): 185-218.

13. Jaccard, P., 1908. Nouvelles recherches sur la distribution florale. Bulletin de la Société Vaudoise

des Sciences Naturelles 44 223–270.

14. Johnson, R., and Wichern, D. W. 1992. Applied Multivariate Statistical Analysis, 3rd ed. Prentice-Hall, Englewood Cliffs, New Jersey.

15. Joseph, B., and Priya, M. 2011. Review on nutritional, medicinal and pharmacological properties of guava (Psidium guajava L.). International Journal of pharma and bio sciences 2 (1): 53-69.

16. Kamath, V., Rahul, N., Kumar, C. A., and Lakshmi, S. M. 2008. Psidium guajava L.: A review. International Journal of Green Pharmacy 2 (1): 17-21.

17. Khodadost, A., Yousefzadeh, H., Amirchakhmaghi, N., Abdollahi, H., and Hosseinzadeh Colagar, A. 2016. Genetic diversity of malus orientalis in hyrcanian forest using ISSR-PCR markers. Journal of Molecular and Cellular Researches (Iranian Journal of Biology), 29(4): 359-369.

18. Kidaha, L. M., Alakonya, A. E., and Nyende, A. B. 2014. Molecular characterization of guava landraces in Kenya (Western and South Coast). Global Journal of Biology, Agriculture Health Sciences 4 (15): 81-86.

19. Kimber, G., and Feldman, M. 1987. Wild wheat, an introduction. Special Report 353, College of Agriculture, University of Missouri, Columbia. p. 146.

20. Kumari, S., Arumugam, N., Singh, R., Srivastav, M., Banoth, S., Mithra, A. C., Arun, M. B., Goswami, A.K., and Khan, Y. J. 2018. Diversity analysis of guava (Psidium guajava) germplasm collection. Indian Journal of Agricultural Sciences 88 (3): 489–497.

21. Liu, X., and Yang, G. 2012. Assessment of clonal fidelity of micro-propagated guava (Psidium guajava) plants by ISSR markers. Australian Journal of Crop Science (6): 291-295.

22. Lynch, M., and Milligan, B. 1994. Analysis of population-genetic structure using RAPD markers. Molecular Ecology 3 (2): 91-99.

23. Mani, A., Mishra, R., and Thomas, G. 2011. Elucidation of Diversity among Psidium Species using Morphological and SPAR methods. Journal of Phytology 3 (8): 53-61.

24. Nazarzadeh, Z., Onsori, H., and Akrami, S. 2020. Genetic diversity of bread wheat (Triticum aestivum L.) genotypes using RAPD and ISSR molecular markers. J Genet Resour, 6(1): 69-76.

25. Nei, M., and Li, W. H. 1979. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 76 (10): 5269 – 5273.

26. Pandey, S., Kumar, S., Mishra, U., Rai, A., Sing, M. H. & Rai, M. 2008. Genetic diversity in Indian ash gourd (Benincasa hispida) accessions as revealed by quantitative traits and RAPD markers. Scientia Horticulturae, 118: 80-86.

27. Pearce, S., Knox, M., Ellis, T. H. N., Flavell, A. J., and Kumar, A. 2000. Pea Ty1-copia group retrotransposons: transpositional activity and use as markers to study genetic diversity in Pisum. Molecular and General Genetics 263 (6): 898-907.

28. Prakash, D., Narayanaswamy, P., and Sondur, S. N. 2002. Analysis of molecular diversity in guava using RAPD markers. The Journal of Horticultural Science and Biotechnology 77 (3): 287-293.

29. Rahmanpour, S., Abdollahi Mandolkani, B., and Ghadimzadeh, M. 2014. Evaluation of genetic variation of native and hybrid Melon ecotypes using ISSR markers. Journal of Genetics 9 (1): 76-67.

30. Rai, M., Phulwaria, K., Gupta, M., Shekhawat, A. K., and Jaiswal, U. 2012. Genetic homogeneity of guava plants derived from somatic embryogenesis using SSR and ISSR markers. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 111 (2): 259-264.

31. Rodríguez, N., Valdés, J., Rodríguez, J. A, Velásquez, J. B., and Rivero, D. 2010. Genetic resources and breeding of guava (Psidium guajava L.) in Cuba. Biotecnología Aplicada 27 (3): 238-240.

32. Rueda, A., Palacio, D. J., Muñoz, J. E., Muñoz, J. E., Saavedra, R., and Bravo, E. 2006. Caracterización molecular Del banco de germoplasma de guaya ba Psidiums pp Del Centro de Investigación de Corpoica, Palmira. Fitotecnia Colombiana 6 (2): 26-32.

33. Shiva, B., Nagaraja, A., Rakesh, S., and Manish, S. 2017. Genetic diversity of Guava genotypes evaluated using RAPD molecular marker. International Journal of Genetics 9 (5): 271-274.

34. Sneath, P. H., and Sokal, R. R. 1973. Numerical Taxonomy: The principles and practice of numerical classification. W.H. Freeman, San Francisco. p. 573.

35. Zahid NY, Abbasi NA, Hafiz IA, Ahmad Z (2009). Genetic diversity of Indigenus Fennel (Foeniculum Vulgare M.) germplasm in Pakistan assessed by RAPD markers. Pak. J. Bot 41: 1759-1767.

36. Zehua, M., Shunzhi, L., Ziwei, L., Shejin, X., Weirong, H. 2019. Analysis of genetic diversity of 45 Guava germplasm evaluated using SSR markers. International Journal of Fruit Science, DOI: 10.1080/15538362.2019.1640168.