ارزریابی عملکرد دو پپتید نشانه از گیاهان اطلسی ((Petunia × hybrida و اسفناج (Spinacia oleracea) به منظورانتقال پروتئین های نوترکیب به اندامک کلروپلاست

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 پژوهشگاه ملی مهنسی ژنتیک و زیست فناوری

2 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

3 عضو هیات علمی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

چکیده

به منظور انتقال و بیان ژن در کلروپلاست ، می توان از توالی-های پپتید نشانه برای اطمینان از انتقال پروتئین‌های نوترکیب خارجی به کلروپلاست بهره جست. در این مطالعه، در دو مرحله آنالیزهای بیوانفورماتیکی و سپس آزمایشگاهی با هدف انتخاب پپتیدهای نشانه مناسب کلروپلاستی، روی توالی‌های مختلف انجام گرفت. بدین منظور ابتدا 160 پپتید نشانه از ژن-ها و میزبان‌های مختلف جهت بررسی جایگاه برش، احتمال انتقال به کلروپلاست و بررسی آبگریزی آنها مورد آنالیز بیوانفورماتیکی قرار گرفتند. در مرحله بعد، پپتیدهای نشانه ژن epsps از گیاه اطلسی ((Petunia × hybrida و نیز پپتید نشانه ژن pcaDاز گیاه اسفناج (Spinacia oleracea) با طراحی آغازگرهای اختصاصی و انجام PCR از ژنوم گیاهان جداسازی و به توالی ژن گزارش گر gus متصل شدند. انتقال سازه ها به آگروباکتریوم تومفاسینس جهت تراریختی گیاهان توتون (Nicotiana tabacum) صورت گرفت. پس از تراریختی و باززایی گیاهان تراریخت، سنجش کیفی و کمی آنزیم β-glucuronidase به روش فلوریمتری بر روی کلروپلاست‌های جدا شده از برگ های سبز و جوان نشان داد که محصول ژن gus با موفقیت به کلروپلاست‌های گیاه هدفمند شده است و پپتید نشانه ژن epsps جدا شده از گیاه اطلسی کارایی بالاتری را در انتقال پروتئین نوترکیب به کلروپلاست‌ها داشته است. توالی مذکور می-تواند کاندیدی برای استفاده درگیاهان تراریخته تجاری در راستای هدفمندی محصول پروتئینی در ساختارهای پلاستیدی و نهایتاً افزایش بروز صفت مورد نظر و یا ذخیره سازی و خالص سازی بهتر محصولات پروتئینی باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Functional study of two signal peptides derived from Petunia (Petunia × hybrida) and Spinach (Spinacia oleracea) for expressing recombinant proteins in chloroplast

نویسندگان [English]

  • Marjan Adigozali Behrouz 1
  • Amir mousavi 2
  • Ali Hatef Salmanian 3

1 national institute of genetic engineering and biotechnology

2 National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB)

3 Faculty member/ NIGEB

چکیده [English]

There can be found many benefits of chloroplast transformation including gene overexpression without any environmental issues. Signal peptides, specific sequences at the N-terminus of non-processed proteins, are a key player for effectively transferring genes into the genome of the chloroplast to express. The functions of signal peptides to express the β-glucuronidase gene (gus) as a reporter gene in chloroplasts were studied by in silico and in vitro tools. First, the cleavage sites of the restriction enzymes, the ability of the transport into the chloroplast, and hydrophobia of 16 signal peptides were analyzed by bioinformatic tools such as Targetp, Tppred, PredSL, and Protoscale. The second structures of transcriptions of reporter gene bond these signal peptides were also predicted. Signal peptides of pcaD and epsps genes derived respectively from Spinach (Spinacia oleracea) and Petunia (Petunia × hybrida) were chosen. β-glucuronidase gene and two signal peptides were synthesized and bond together by SOEing PCR. These chimeric fragments were cloned to pJET1.2 vector, then to pBI121 containing CaMV35S promoter for overexpression. The fragments were transferred into tobacco (Nicotiana tabacum) as a plant model by Agrobacterium tumefaciens, LBA4404. Chloroplasts were extracted from transgenic young and green leaves. Then, β-glucuronidase gene expression was assayed qualitatively by histochemical analysis and quantitatively by fluorimetry technique. As a results, gus was expressed in chloroplasts and the signal peptide of epsps is more effective than the pcaD signal peptide. In conclusion, the sequence can be used to produce recombinant proteins.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Chloroplast
  • Signal Peptide
  • Gene Transformation
  • SOEing PCR
  • Quantitative and qualitative evaluation of gus

مقالات آماده انتشار، پذیرفته شده
انتشار آنلاین از تاریخ 11 مرداد 1401
  • تاریخ دریافت: 20 تیر 1400
  • تاریخ بازنگری: 09 فروردین 1401
  • تاریخ پذیرش: 18 خرداد 1401
  • تاریخ اولین انتشار: 11 مرداد 1401