مطالعه تغییرات ساختاری و دینامیکی پروتئین GSK3β در حضور لیگاند CHIR99021 با استفاده از شبیه سازی و داکینگ مولکولی

کاظمی, جواد; شاهسوارانی, حسین; پاکزاد, پرویز; شکرگزار, محمد علی

مطالعه تغییرات ساختاری و دینامیکی پروتئین GSK3β در حضور لیگاند CHIR99021 با استفاده از شبیه سازی و داکینگ مولکولی

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

جواد کاظمی ¹

حسین شاهسوارانی ²

پرویز پاکزاد ¹

محمد علی شکرگزار ³

¹ گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شمال، تهران، ایران

² گروه زیست شناسی سلول و مولکولی، دانشکده علوم و فناوریهای زیستی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران

³ انستیتو پاستور-رییس بانک سلولی

چکیده

گلیکوژن سنتاز کیناز 3 بتا (GSK3β) یک سرین/ترئونین کیناز چند عملکردی است که بعنوان یک پروتئین اصلی در مسیر پیام رسانی WNT در عملکرد های مختلف سلول های بنیادی پرتوان (PSCs) شامل؛ خودنوزایی، بقا و تمایز ایفای نقش می کند. از آنجایی که مهار GSK3β سبب تمایز PSCs می شود استفاده از مهار کننده های مناسبی که در غلظت کمتر باعث مهار GSK3β شود می تواند به لحاظ اقتصادی مقرون بصرفه باشد. CHIR99021 یکی از مهمترین مهار کننده های GSK3β است که با استفاده از سرور Way2drug روند این مهار مورد پیش بینی قرار گرفت تا بتواند جهت بهبود سیستم های کشت و تمایز PSCs مورد استفاده قرار گیرد. در مطالعه حاضر، رویکرد های مختلف شبیه سازی دینامیک مولکولی (MD) در حضور و عدم حضور CHIR99021 نیز مورد ارزیابی قرار گرفت و علاوه بر آن بمنظور بررسی دقیق تر برهمکنش لیگاند-پروتئین با استفاده از داکینگ انعطاف پذیر با سرور سوئیس داک انجام شد و میزان پایداری و تغییرات ساختاری پروتئین GSK3β شبیه سازی شد. نتایج این مطالعات نشان داد که CHIR99021 از طریق ایجاد پیوند هیدروژنی و واندروالسی در جایگاه فعال GSK3β متصل می شود و اثر مهار کنندگی خود را ایجاد می کند و در نتیجه سبب ناپایداری ساختار GSK3β می شود. همچنین نتایج داکینگ و شبیه سازی دینامیکی روشن ساخت این ترکیب به نحو موثرتری می تواند برای القای تمایز سلول های بنیادی پرتوان مورد استفاده قرار گیرد و به لحاظ اقتصادی مقرون به صرفه است.

کلیدواژه‌ها

سلول های بنیادی پرتوان

CHIR99021

دینامیک مولکولی

داکینگ مولکولی

20.1001.1.23832738.1402.36.3.1.6

موضوعات

بیوانفورماتیک

عنوان مقاله English

Study of structural and dynamic changes of GSK3β protein in the presence of CHIR99021 ligand using molecular simulation and docking

نویسندگان English

Javad Kazemi ¹

Hosein Shahsavarani ²

Parviz Pakzad ¹

Mohammadali Shokrgozar ³

¹ Department of Cellular and Molecular Biology, Faculty of Biological Sciences, North Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran

² Faculty of Life Science and Biotechnology, Shahid Beheshti University, Tehran, Iran

³ Department of National Cell Bank, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran

چکیده English

Glycogen synthase kinase 3 beta (GSK3β) is a multifunctional serine/thronine kinase that play as a bottleneck protein in the WNT signaling pathway in various functions of pluripotent stem cells (PSCs) such as Self-renewal, survival and differentiation. Since the inhibition of GSK3β leads to the differentiation of PSCs, the use of appropriate inhibitors that inhibit GSK3β at lower concentrations can be economically affordable. One of the most important inhibitors is CHIR99021, which can improve the culture and differentiation systems of PSCs. Present study aimed to investigate the molecular dynamics (MD) simulation such as Root Means Square Deviation (RMSD), Root Means Square fluctuation (RMSF), number of hydrogen bonds, principal component analysis (PCA), radius of gyration, Gibbs free energy landscape, in the presence and absence of CHIR99021 were evaluated and the stability and structural changes of GSK3β protein were simulated using GROMACS 2021.1 software. In addition, the pharmacokinetic properties of this compound were predicted using Schrӧdinger, LLC, New York, NY, Release 2015-2 software. The results of these studies showed that CHIR99021 binds to the active site of GSK3β through hydrogen bonding and produces its inhibitory effect, thus causing instability of the GSK3β structure. Docking and computational analysis confirmed that this chemical compound can be effectively used for directing cell fate and differentiation of PSCs.

کلیدواژه‌ها English

pluripotent stem cells (PSCs)

CHIR99021

molecular dynamics simulation

Molecular docking

مطالعه تغییرات ساختاری و دینامیکی پروتئین GSK3β در حضور لیگاند CHIR99021 با استفاده از شبیه سازی و داکینگ مولکولی

جواد کاظمی¹، حسین شاهسوارانی^2،3*، پرویز پاکزاد¹و محمد علی شکرگزار^3،4*

¹ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شمال، دانشکده علوم زیستی، گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی

²ایران، تهران، دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده علوم و فناوریهای زیستی، گروه زیست شناسی سلولی و مولکولی

³ ایران، تهران، انستیتو پاستور ایران، آزمایشگاه طب بازساختی و نوآوری های پزشکی

⁴ ایران، تهران، انستیتو پاستور ایران، گروه بانک سلولی

تاریخ دریافت: 14/08/1400 تاریخ پذیرش: 08/01/1401

چکیده

گلیکوژن سنتاز کیناز 3 بتا (GSK3β) یک سرین/ترئونین کیناز چند عملکردی است که بعنوان یک پروتئین اصلی در مسیر پیام رسانی WNT در عملکرد های مختلف سلول های بنیادی پرتوان (PSCs) شامل؛ خودنوزایی، بقا و تمایز ایفای نقش می کند. از آنجایی که مهار GSK3β سبب تمایز PSCs می شود استفاده از مهار کننده های مناسبی که در غلظت کمتر باعث مهار GSK3β شود می تواند به لحاظ اقتصادی مقرون بصرفه باشد. CHIR99021 یکی از مهمترین مهار کننده های GSK3β است که با استفاده از سرور Way2drug روند این مهار مورد پیش بینی قرار گرفت تا بتواند جهت بهبود سیستم های کشت و تمایز PSCs مورد استفاده قرار گیرد. در مطالعه حاضر، رویکرد های مختلف شبیه سازی دینامیک مولکولی (MD) مثل ریشه میانگین مجذور انحراف (RMSD)، ریشه میانگین مجذور نوسانات (RMSF)، تعداد پیوند هیدروژنی، آنالیز مؤلفه اصلی (PCA)، چشم انداز انرژی آزاد گیبس، شعاع ژیراسیون در حضور و عدم حضور CHIR99021 نیز مورد ارزیابی قرار گرفت و علاوه بر آن بمنظور بررسی دقیق تر برهمکنش لیگاند-پروتئین با استفاده از داکینگ انعطاف پذیر با سرور سوئیس داک انجام شد و میزان پایداری و تغییرات ساختاری پروتئین GSK3β با استفاده از نرم افزار GROMACS 2021.1 شبیه سازی شد. به علاوه، خصوصیات فارماکوکینتیکی این ترکیب با استفاده از نرم افزار افزارSchrӧdinger, LLC, New York, NY, Release 2015-2 پیش بینی شد. نتایج این مطالعات نشان داد که CHIR99021 از طریق ایجاد پیوند هیدروژنی و واندروالسی در جایگاه فعال GSK3β متصل می شود و اثر مهار کنندگی خود را ایجاد می کند و در نتیجه سبب ناپایداری ساختار GSK3β می شود. همچنین نتایج داکینگ و شبیه سازی دینامیکی روشن ساخت این ترکیب به نحو موثرتری می تواند برای القای تمایز سلول های بنیادی پرتوان مورد استفاده قرار گیرد و به لحاظ اقتصادی مقرون به صرفه است.

واژه های کلیدی: سلول های بنیادی پرتوان، CHIR99021، GSK3β، ADMET، دینامیک مولکولی(MD)، داکینگ مولکولی

* نویسندگان مسئول، پست الکترونیکی: hosein.shahsavarani@gmail.com و mashokrgozar@pasteur.ac.ir

مقدمه

گلیکوژن سنتاز کیناز 3 بتا (GSK3β)، یک کیناز پروتئین چندعملکردی است که بعنوان تنظیم کننده اصلی خود نوزایی و تمایز سلول های بنیادی پرتوان (PSCs) عمل می کند. بعلاوه، این پروتئین با چندین بیماری شایع از جمله سرطان، دیابت و التهاب ارتباط دارد و در انواع عملکرد های فیزیولوژیکی مثل بیان ژن، تمایز سلول، تکثیر، متابولیسم و بقای سلول نقش دارند [1, 2]. در حالیکه فعال سازی مسیر پیام رسانی WNTو در نهایت فعال سازی GSK3β، فعالیت خودنوزایی سلول های بنیادی را القاء می کند و سلول های بنیادی را به سمت خاموش شدن سوق می دهد، مهار این مسیر پیام رسانی سبب آغاز تمایز سلول های بنیادی به سلول های تمایز یافته می شود [3]. مسیر پیام رسانی WNTیکی از مهم ترین مسیرهای پیام رسانی در تمایز PSCsبه انواع مختلف سلول است. تنظیم این مسیر پیام رسانی با کمک ریز مولکول ها (Small Molecules) نقش مهمی در تمایز in vitroسلول های بنیادی ایفا می کند. ریزمولکول ها، ترکیبات آلی با وزن مولکولی کم (<900 دالتون) می باشند که در تنظیم فرآیندهای بیولوژیکی، با اندازه ای در حدود 1 نانومتر نقش دارند. ریز مولکول ها مزایای عمده ای نسبت به پروتئین های اصلی تنظیم کننده ی مسیر پیام رسانی WNTمثل DKK1و Noggin دارند. ریز مولکول ها می توانند از طریق انتشار ساده از عرض غشاء سلول عبور کنند و به بخش های مختلف سلول برسند و نسبت به پروتئین های نوترکیب مقرون به صرفه تر هستند[4] . با این حال گزارش شده است، یک سری از ریز مولکول ها مهار کننده ی GSK3β وجود دارند که در صنعت پزشکی بازساختی مورد استفاده قرار می گیرند.

فعال سازی مسیر پیام رسانی WNTاز طریق ریز مولکول های CHIR99021منجر به تمایز PSCsبه رده های مزودرمی می شوند [5, 6]. CHIR99021فعالیت مسیر پیام رسانی WNTرا از طریق مهار GSK3β، تحت تأثیر قرار می دهد. در نتیجه PSCs را به سمت رده های مزودرمی سوق می دهد [7, 8]. فاکتور مؤثر اصلی در پیام رسانی WNT، β-کاتنین است. غیر فعال سازی مسیر WNT سبب تخریب β-کاتنین می شود و منجر به کاهش سطح β-کاتنین در سیتوزول می شود. به محض فعال شدن مسیر پیام رسانی WNT، β-کاتنین در سیتوزول تجمع می یابند و به هسته منتقل می شوند و با فاکتورهای رونویسی خاص برهمکنش می کنند [9, 10].

شبیه سازی دینامیک مولکولی (MD) مولکول های زیستی اغلب در حوزه ی شیمی محاسباتی طبقه بندی می شود اما ریشه علمی این تکنیک به شیمی پلیمر و زیست شناسی ساختار در دهه 1970 برمی گردد جایی که برای مطالعه فیزیک، خواص مکانی مولکولی شامل؛ انعطاف پذیری، واپیچش (distortion)، پایداری و شل شدن ساختارها، ساختار های اولیه اشعه ایکس پروتئین ها در مقیاس های کوتاه مدت استفاده می شد [11]. بطور کلی شبیه سازی مولکولی پیشتر در فیزیک پیشگام بود [12]. حوزه شبیه سازی مولکولی از آن زمان تا کنون بسیار پیشرفت کرده است و در حال حاضر شبیه سازی ها به طور مکرر در مقیاس چند میلی ثانیه انجام می شود که در این زمان کوتاه می توان چندین بار پروتئین را تا کرد [13]، برهمکنش بین گیرنده ها [14] و ویژگی های عملکردی گیرنده ها را پیش بینی کرد و حتی حالت های انتقالی حدواسط پروتئین هایی مانند پروتئین های غشایی، را ثبت کرد [15]. این نوع شبیه سازی کلاسیک طولانی مدت همچنان حائز اهمیت است زیرا روش هایی برای مشاهده مستقیم فرآیند های مولکولی که به راحتی از طریق سایر ابزار ها قابل مشاهده نیست، ارائه می دهد. با این حال بسیاری از مطالعات کنونی بطور فزاینده ای به مجموعه های بزرگ شبیه سازی تکیه می کنند که تا حدی با افزایش روز افزون مدل های ساختاری امکان پذیر شده است که با توالی یابی و ژنومیک ساختاری و همچنین تکنیک های جدید برای برآورد خواص پیچیده مولکولی با استفاده از هزاران شبیه سازی کوتاه تر امکان پذیر کرده است [16]. مطالعات جهش های ژنی از این پس می توانند به آسانی مدل سازی شوند و شبیه سازی های کوتاه برای صدها ژن جهش یافته انجام شود. شبیه سازی دینامیک مولکولی کلاسیک بر اساس مدل های تجربی نقش مهمی ایفا می کنند زیرا بیشتر ویژگی های مورد نظر توسط انرژی آزاد تعریف می شود که معمولا به نمونه برداری گسترده ای نیاز دارد و روش های شیمی کوانتومی سنتی نمی توانند برای سیستم های بزرگ کارایی داشته باشند. این پیشرفت ها بدون تلاش تحقیقاتی مهم در الگوریتم های شبیه سازی، بهینه سازی و موازی سازی امکان پذیر نبود. ظهور بسته های نرم افزاری استاندارد مدل سازی مولکولی مانند CHARMM [17]،GROMOS [18]، Amber [19]، NAMD [20]،GROMACS [21] مهم بوده است زیرا این نرم افزار ها به تحقیقات شبیه سازی و مدل سازی مولکولی کمک شایانی کرده است و تکنیک ها را در اختیار محققان علوم زیستی که متخصص شبیه سازی نیستند قرار داده است. ابزار GROMACSیکی از اهداف اصلی توسعه بلند مدت برای دست یابی به بالاترین شبیه سازی ممکن در آزمایشگاه های تحقیقاتی است. از سال 2009 تاکنون GROMACS 4 در حال توسعه است به طوری که تعدادی از ویژگی های جدید به آن اضافه شده است که منجر به انتشار نسخه 4.5 این نرم افزار شده است و عملکرد و کارایی برنامه های موازی به طور قابل توجهی بهبود یافته است. هدف اصلی این مطالعه برررسی خصوصیات فیزیکی- شیمیایی CHIR99021 بعنوان فعال کننده های مسیر پیام رسانی WNT از طریق مهار GSK3β با استفاده از داکینگ مولکولی جهت انتخاب گزینه مناسب برای تمایز PSCs با استفاده از شبیه سازی دینامیک مولکولی (MD) و ارزیابی چندین خصوصیت فارماکودینامیک یا پیش بینی پارامترهای ADMET بترتیب با کمک نرم افزار GROMACS 2021.1و ابزارQikProp نسخه 4.4از بسته نرم افزاریMaestro (schrӧdinger suite, LLC, New York, NY, Release 2015-2) انجام شد.

مواد و روشها

1-ساختارها

ساختار کریستال پروتئین در حالت کمپلکس با لیگاند با کد5HLN از بانک اطلاعاتی پروتئین (PDB) بدست آمد (www.rcsb.org). مطالعات ساختار با استفاده از نرم افزارهای Swiss-PDB viewer 4.10 و Chimera انجام شد.

2-پارامتریزاسیون مولکول های لیگاند

برای پارامتریزاسیون مولکول لیگاند از نرم‌افزار Antechamber موجود در بسته نرم‌افزار AmberTools استفاده گردید و در نهایت پارامترهای ایجاد شده با استفاده از اسکریپت ACPYPE به فرمت GROMACS تبدیل شدند.

3-شبیه سازی دینامیک مولکولی

پروتئین تنها و در حالت کمپلکس به عنوان ورودی برای شبیه سازی دینامیک مولکولی مورد استفاده قرار گرفتند. شبیه سازی دینامیک مولکولی با استفاده از نرم افزار GROMACS 2021.1 انجام شد. ساختارهای ورودی با میدان نیروی ff99SB+ILDN آماده سازی شدند. وضعیت صحیح هیدروژن هیستیدین ها برای تمامی هیستیدین های پروتئین در ساختار ایجاد و پیوندهای دی سولفید (در صورت وجود) برای آنزیم تعریف شد. سپس بار سطحی ساختار با افزودن چند یون سدیم و کلر خنثی گردید. پروتئین در لایه ای از مولکولهای آب TIP3P به ضخامت 8 آنگستروم در جعبه مکعبی (cubic) با استفاده از نرم افزار gmx solvate قرار داده شد [22-24].

کاهش انرژی بر روی ساختارها با 1000 گام با روش steepest descent به منظور حذف اندرکنش های واندروالس و تشکیل پیوندهای هیدروژنی بین مولکولهای آب و کمپلکس صورت گرفت. در مرحله بعد، دمای سیستم به تدریج از 0 تا 310 کلوین به مدت 200 پیکوثانیه در حجم ثابت افزایش یافت و پس از آن در فشار ثابت به مدت ۲۰۰ پیکوثانیه سیستم به حالت تعادل رسانده شد. شبیه سازی دینامیک مولکولی در دمای ۲۹۸ کلوین و در مدت زمان 100 نانوثانیه به انجام رسید. میانکنش های غیرپیوندی با فاصله 10 آنگستروم به روشPME محاسبه گردید. برای افزایش سرعت محاسبات از الگوریتم SHAKE برای محدود کردن پیوندهای درگیر در اتم هیدروژن استفاده گردید . در نهایت اطلاعات شبیه سازی در فواصل ۸ پیکوثانیه برای انجام آنالیز ذخیره شد.

4-داکینگ مولکولی

با استفاده از سرور سوئیس داک فرآیند داکینگ مولکولی انجام شد و نتایج آن ثابت کرد که لیگاند CHIR99021 توانایی مهار پروتئین GSK3β را دارد. نتایج اسکور های داکینگ (جدول 1) نشان می دهد که این لیگاند توانایی برهمکنش بالایی با پیوند های هیدروژنی که با جایگاه فعال این پروتئین ایجاد می کند نقش کلیدی در مهار پروتئین GSK3β ایجاد می کند و مسیر های پیام رسانی WNT نیز در پی آن فعال می شوند.

شکل1- پیش بینی خواص لیگاند CHIR99021 با سرور Way 2 drug

5-آنالیز

خصوصیات مرتبط با ADMETیا فارماکوکینتیک

خصوصیات ADMET(جذب، متابولیسم، پراکنش، دفع و سمیت) [25, 26] ترکیب شیمیایی ریز مولکول CHIR99021 با استفاده از پارامترهای قرار دادی پروتوکل QikPropنسخه 4.4 از بسته نرم افزاری Maestro (Schrӧdinger, LLC, New York, NY, Release 2015-2) [27] آنالیز شد. پارامتر های in silico فیزیکی-شیمیایی که از طریق مدول QikProp قابل پیش بینی هستند عبارتند از: وزن مولکولی(MV)، تعداد پیوندهای هیدروژنی دهنده، تعداد پیوند هیدروژنی گیرنده، تعداد پیوند های قابل چرخش (Rot)، مساحت کل سطح قابل دسترس حلال (SASA)، حجم مولکولی (بر حسب آنگستروم مکعب)، مساحت سطح قطب پیوند واندروالسی (PSA)، میزان کرویت (globularity)، درصد جذب ریز مولکول از دهان انسان (%HOA)، حلالیت در آب ( log s : که S برحسب mol dm^-3است و نشان دهنده ی غلظت حل شونده در محلول اشباع است). مهار کانال های HERG K⁺: log IC₅₀، log Khsa اتصال به پروتئین سرم، قانون Lipinski’s rule of five شامل: 500 دالتون > وزن مولکولی، QPlog Po/w<5، ≤ 5 پیوند هیدروژنی دهنده، ≤ 10 پیوند هیدروژنی گیرنده [28]، قانون Jorgensen’s rule of three شامل: QPlogS > -5. 7، QPlog PCaco > 22 nm/s و <7 تعداد متابولیت های اولیه.

نتایج و بحث

1-آنالیز نتایج داکینگ مولکولی

نتایج پیش بینی خواص لیگاند با استفاده از سرور Way2drug انجام شد تأثیر این مولکول آلی بر روی تارگت های مختلف نیز بدست آمد، که در این بین توانایی مهار پروتئین کیناز با احتمال 56 درصد بهترین تارگت برای مولکول آلی مورد نظر است (شکل 1).

الف-انتخاب پروتئین هدف

پروتئین هدف با شماره دسترسیHLN5 بر اساس رزولوشن مناسب و همچنین کمترین میزان رزیدو گم شده انتخاب شد و سپس با استفاده از نرم افزار کایمرا (Chimera) پروتئین به حالت طبیعی و خالص خود درآمد و تمام لیگاند های غیر مرتبط حذف شدند. در نهایت این پروتئین به همراه فایل لیگاند به سرور سوئیس داک که بر اساس الگوریتم ab-initio فعالیت می کند قرار گرفت و فرآیند داکینگ انجام شد. نتایج حاصل از اسکور داکینگ در جدول 1 نشان داده شده است.

ب-بررسی برهمکنش لیگاند و پروتئین

بهترین حالت قرار گیری لیگاند در درون جایگاه فعال پروتئین در حالت اول بررسی گردید و پیوند های هیدروژنی آن نیز نمایش داده شد (شکل2).

2-آنالیز نتایج شبیه سازی دینامیک مولکولی

نتایج شبیه سازی حاصل از نرم افزار GROMACS به صورت ریشه میانگین مجذور انحراف ها (RMSD)، ریشه میانگین مجذور نوسانات (RMSF)، شعاع ژیراسیون و ساختار دوم با استفاده از ماژول های gmx rms، gmx rmsf، gmx gyrate مورد بررسی قرار گرفت. برای آنالیز PCA و انرژی آزاد گیبس بترتیب از ماژول هایgmx covar، gmx anaeig و gmx sham استفاده شد.

جدول1- نتایج اسکور داکینگ

شکل2- بررسی نتایج برهمکنش لیگاند و پروتئین با نرم افزار کایمرا

محاسبه RMSD بین ساختارهای بدست آمده و یک ساختار

مرجع مهمترین روش برای ارزیابی پایداری شبیه سازی دینامیک مولکولی در طول زمان می باشد. برای مطالعه حرکات اصلی در سیستم، RMSD برای اتم های کربن آلفا بدست آمد. همچنین انعطاف پذیری ساختار بر اساسRMSF اتم های کربن آلفا محاسبه شد. شعاع ژیراسیون نیز که یکی از پارامترهای تعیین کننده در میزان تراکم ساختار می باشد، در طول مدت شبیه سازی بدست آمد.

الف- انحراف ریشه میانگین مربعات (RMSD)

انحراف ریشه میانگین مربعات RMSD بین ساختارهای ایجاد شده در طول شبیه سازی دینامیک مولکولی در بعد زمان معیاری مناسب و رایج جهت اطمینان از پایداری ساختاری پروتئین های طبیعی و جهش یافته می باشد. بنابراین تغییرات RMSD مربوط به اتم های کربن آلفای پروتئین در هر دو شبیه سازی (در حضور و عدم حضور لیگاند) در طی زمان شبیه سازی (100 نانو ثانیه) نسبت به ساختار اولیه محاسبه و استخراج شد. نتایج این محاسبه برای تمام شبیه سازی ها در شکل 3 نمایش داده شده است. همانطور که در شکل 3 مشاهده می‌شود در ابتدای شبیه سازی هر دو نمودار روند صعودی را نشان داده‌اند. طبق این شکل نمودار RMSD مربوط به پروتئین در عدم حضور لیگاند (Protein)، بعد از زمان حدود ۱۵۰۰۰ پیکوثانیه به مقدار 2/0 نانومتر رسیده است و بعد از این زمان مقدار آن مجددا کاهش یافته و در زمان ۳۹۰۰۰ پیکوثانیه به مقدار 18/0 نانومتر رسیده است. در ادامه مقدار RMSD مربوط به این نمودار مجدد افزایش نسبی را نشان می‌دهد و در انتهای شبیه سازی مجددا به مقدار 2/0 نانومتر رسیده است. در‌واقع می‌توان چنین نتیجه‌گیری کرد که از زمان ۱۵۰۰۰ پیکوثانیه تا انتهای شبیه سازی نمودار حول مقدار 2/0 نانومتر نوسان بسیار مختصری را نشان می دهد. در نمودار مربوط به پروتئین در حالت اتصال به لیگاند (Complex)، در زمان ۱۰۰۰۰ پیکوثانیه مقدار RMSD به حدود 15/0 نانومتر رسیده است و تا زمان ۳۸۰۰۰ پیکوثانیه روی این مقدار ثبات نسبی را نشان می دهد. بعد از این زمان مقدار RMSD افزایش ناگهانی داشته و در زمان ۴۲۰۰۰ پیکوثانیه به مقدار 19/0 نانومتر رسیده است و تا زمان ۵۹۰۰۰ پیکوثانیه روی این مقدار باقی می‌ماند و بعد از این زمان شروع به کاهش مجدد می‌کند و در زمان ۸۰۰۰۰ پیکوثانیه مجددا به مقدار 15/0 نانومتر می‌رسد و تا انتهای شبیه سازی روی این مقدار ثابت باقی می ماند. از این دو نمودار می‌توان چنین نتیجه‌گیری کرد که در هر دو شبیه سازی بعد از زمان ۸۰۰۰۰ پیکوثانیه پروتئین به تعادل رسیده است.

ب-انعطاف پذیری ساختار (RMSF)

رفتار دینامیکی اتم های کربن آلفا در ساختار، حاوی اطلاعات کافی جهت بررسی حرکت های مهم در پروتئین ها بوده و منعکس کننده حرکت های کلی ساختار است. بنابراین ریشه میانگین مربعات نوسان (Root Mean Square Fluctuation) اتم های کربن های آلفا جهت بررسی حرکت ها و انعطاف پذیری ساختاری در نظر گرفته شد. در این قسمت یک مقایسه انعطاف پذیری ساختاری بین دو حالت پروتئین در حضور و عدم حضور لیگاند صورت گرفت (شکل4). لازم به ذکر است که Protein نشان دهنده پروتئین در عدم حضور لیگاند و Complex مربوط به نمودار پروتئین در حالت کمپلکس می باشد. در هر دو شبیه سازی مقدار RMSF از ناحیه پایدار (۲۰ نانوثانیه انتهایی شبیه سازی) محاسبه شد. همانطور که در شکل4 مشاهده می شود در حضور لیگاند مقدار انعطاف پذیری در برخی نواحی از پروتئین به شکل چشمگیری کاهش یافته است و تنها در ناحیه آمینواسیدهای شماره ۲۵۵-۲۴۸ مقدار انعطاف پذیری پروتئین در حضور لیگاند نسبت به پروتئین تنها افزایش یافته است. نواحی از پروتئین که در حضور لیگاند میزان انعطاف پذیری آنها نسبت به پروتئین آزاد کاهش یافته است عبارتند از: آمینواسیدهای شماره ۷۰-۶۰ و ۱۵۲-۱۴۲. جهت مطالعه بیشتر دلیل کاهش انعطاف پذیری نواحی مذکور در حالت کمپلکس، این نواحی در ساختار سه بعدی پروتئین (شکل 5) نشان داده شده اند. همانطور که در شکل5 مشاهده می شود دو ناحیه دارای انعطاف پذیری پایین در ناحیه اتصالی لیگاند قرار دارند و درواقع می توان چنین گفت که اتصال لیگاند به پروتئین باعث کاهش انعطاف پذیری این نواحی شده است.

شکل 3- تغییرات RMSD پروتئین در حضور و عدم حضور لیگاند در طول زمان شبیه سازی دینامیک مولکولی

شکل 4- مقایسه میزان انعطاف پذیری (RMSF) آمینواسیدهای پروتئین در حضور و عدم حضور لیگاند

شکل 5- نواحی دارای انعطاف پذیری پروتئین در حالت کمپلکس نسبت به حالت آزاد

ج-شعاع ژیراسیون (Radius of Gyration)

شعاع ژیراسیون یکی از پارامترهای های مهم در بررسی و مطالعه تغییرات فشردگی پروتئین در طول زمان شبیه سازی دینامیک مولکولی می باشد. هرقدر که در طول شبیه سازی دینامیک مولکولی میزان شعاع ژیراسیون کاهش پیدا کند نشان دهنده فشرده تر شدن پروتئین می باشد و بالعکس با افزایش میزان شعاع ژیراسیون اندازه پروتئین نیز بیشتر شده و به تعبیری پروتئین بازتر می باشد. در شکل6 تغییرات اندازه پروتئین در طول زمان شبیه سازی دینامیک مولکولی برای پروتئین در حضور و عدم حضور لیگاند نشان داده شده است. همانطور که در شکل ۶ مشاهده می‌شود شعاع ژیراسیون پروتئین در حضور و عدم حضور لیگاند تغییر چشمگیری را نداشته و بعد از زمان حدود ۸۰۰۰۰ پیکوثانیه دو نمودار کاملا روی هم منطبق شده اند. همچنین اندازه متوسط پروتئین در هر دو شبیه سازی در حالت تنها و کمپلکس بترتیب برابر با 144/2 و 140/2 نانومتر می باشد. در‌واقع مقایسه اندازه میانگین شعاع ژیراسیون نشان می‌دهد که در حضور لیگاند اندازه شعاع ژیراسیون پروتئین تغییر محسوسی را نشان نمی دهد.

د-تعداد پیوندهای هیدروژنی بین پروتئین و لیگاند در طول شبیه سازی

بالا بودن تعداد میانکنش های گیرنده با لیگاند نشان دهنده پایداری لیگاند در جایگاه خود روی پروتئین می باشد.

شکل ۶- تغییرات شعاع ژیراسیون پروتئین در حضور و عدم حضور لیگاند در طول شبیه سازی دینامیک مولکولی

به همین دلیل یکی از فاکتورهای مهم در پایداری لیگاند در جایگاه اتصالی روی پروتئین، بررسی تعداد میانکنش های هیدروژنی می باشد. میانکنش هیدروژونی در واقع بین یک گروه عاملی دهنده هیدروژن و یک گروه گیرنده هیدروژن تشکیل می شود. در اتصال لیگاند به پروتئین در ابتدای شبیه سازی دینامیک مولکولی، لیگاند تا زمانی تغییر جایگاه می دهد که بتواند بیشترین میانکنش را با پروتئین برقرار کند. این میانکنش ها شامل میانکنش واندروالس، الکترواستاتیک و هیدروژنی می باشد. در شکل ۷ تغییرات تعداد میانکنش های هیدروژنی بین پروتئین و لیگاند در طول زمان شبیه سازی دینامیک مولکولی نشان داده شده است. همانطور که در شکل ۷ مشاهده می‌شود تعداد میانکنش های هیدروژنی بین پروتئین و لیگاند در اکثر مواقع شبیه سازی بین ۱ و ۲ عدد میانکنش نوسان را نشان می دهد. همچنین طبق این نمودار در برخی از زمان تعداد میانکنش ها به ۳ و در مواقع کم نیز به ۴ و ۵ میانکنش رسیده است و به طور میانگین 12/1 میانکنش در زمان پایدار شبیه سازی دینامیک مولکولی (۲۰۰۰۰پیکوثانیه انتهای شبیه سازی) تشکیل شده است.

ه-آنالیز حرکت های اصلی درون مولکولی (Principal Component Analysis)

شبیه سازی دینامیک مولکولی به ما این امکان را می دهد که بتوانیم رابطه بین دینامیک و عملکرد پروتئین ها را مورد ارزیابی و مطالعه قرار دهیم. عوامل مختلف مانند تغییرات دمایی، جهش زایی و سایر فاکتورها می توانند روی حرکات قسمت های مختلف پروتئین تأثیر گذار باشند. برای بررسی حرکات اصلی و ضروری درون مولکولی، آنالیز تجزیه به مؤلفه های اصلی (PCA) یکی از قویترین و مهمترین تکنیک های موجود می باشد. در ادامه برای آنالیز دقیق تر شبیه سازی پروتئین در حضور و عدم حضور لیگاند، و همچنین پیش بینی حرکات هماهنگ بزرگ (large-scale collective motions) روش PCA مورد استفاده قرار گرفت. مؤلفه های اصلی (PC) پروتئین به وسیله ماتریکس کوواریانس بردارهای ویژه و تغییر در طول تراژکتوری حاصل از شبیه سازی تعریف می شود.

شکل ۷- تغییرات تعداد میانکنش های هیدروژنی بین پروتئین و لیگاند در طول زمان شبیه سازی دینامیک مولکولی

در شکل ۸ نمودار مقادیر ویژه (eigenvalue) بدست آمده از مورب سازی (diagonalization) ماتریکس کوواریانس نوسان های اتم های بدنه (back bone) در پروتئین در حضور و عدم حضور لیگاند برای هر بردار ویژه (eigenvector) نشان داده شده است.

همانطور که در شکل ۸ مشاهده می شود مقادیر eigenvalue مربوط به حرکات هماهنگ و بزرگ بوده که به سرعت دامنه آن کاهش یافته و در بردار های ویژه بعدی نشان دهنده حرکات محدود و محلی کوچک در پروتئین می باشد. همانطور که در بالا ذکر شده است به هر کدام از مقادیر eigenvalue به ازای هر بردار ویژه یک PC گفته می شود. همانطور که در شکل ۸ مشاهده می‌شود در دو PC اول که PC1 و PC2 گفته می شود بیشترین دامنه حرکات ممکن مشاهده می شود. طبق این شکل دامنه حرکات در PC1 برای پروتئین در دو شبیه سازی در حالت آزاد و کمپلکس بترتیب برابر با 61/1 و 942/0 نانومتر مربع می‌باشد و این در حالی است که در PC2 در هر دو شبیه سازی مقدار دامنه حرکات تقریبا یکسان بوده و بترتیب برابر با 412/0 و 425/0 نانومتر مربع می باشد. در‌واقع از نمودار می‌توان چنین نتیجه‌گیری کرد که دامنه حرکات در PC1 در عدم حضور لیگاند بسیار بالا می‌باشد.

در ادامه جهت بررسی بهتر دامنه و گستردگی حرکتی پروتئین در حضور و عدم حضور لیگاند در فضای فاز (phase space)، تراژکتوری های بدست آمده از دو PC اول (PC1 و PC2) به صورت نمودار دو بعدی و تصاویر سه بعدی در شکل ۹ نشان داده شده است. فضای فاز به فضایی گفته می شود که در آن تمام حالت های ممکن برای یک سیستم (پروتئین در حضور و عدم حضور لیگاند) نشان داده می شود. در شکل ۹ الف (ستون سمت چپ) نیز تمام حالت های ممکن برای پروتئین در حضور و عدم حضور لیگاند در دو حالت PC1 و PC2 نشان داده شده است. همانطور که در این شکل مشاهده می شود پروتئین در حضور و عدم حضور لیگاند رفتار نسبتا متفاوتی را نشان می دهد. طبق این شکل، پروتئین در عدم حضور لیگاند در محور PC1 در دو کلاستر بزرگ مشاهده می‌شود و در PC2 تنها در یک کلاستر بزرگ پخش شده اند. همچنین طبق این شکل میزان پخش شدگی کنفورماسیون های مختلف پروتئین در دو PC بسیار بالا می‌باشد و این در حالی است که در حضور لیگاند درPC1 در دو کلاستر و در PC2 در سه کلاستر نزدیک به هم مشاهده می شود. در‌واقع در حضور لیگاند کلاسترها بسیار متمرکز می‌باشند و میزان پخش شدگی بسیار پایین می باشد.

در شکل ۹ ب (ستون سمت راست) نواحی دارای دامنه حرکتی بالا در ساختار سه بعدی پروتئین نشان داده شده است. همانطور که در این شکل مشاهده می‌شود در عدم حضور لیگاند، دمین کوچک پروتئین (با دایره نشان داده شده است) دامنه حرکتی بسیار بالایی را نشان می‌دهد، این در حالی است که حضور لیگاند در این دمین تنها در دو ناحیه 127-117 و 96-87 دامنه حرکتی بالا می‌باشد و در بقیه نواحی این دمین دامنه حرکتی آمینواسیدها بسیار پایین هست. مقایسه دمین بزرگ پروتئین در دو حالت (حضور و عدم حضور لیگاند) نشان می‌دهد که در عدم حضور لیگاند اکثر نواحی دامنه حرکتی نسبتا بالایی را نشان می‌دهند و این در حالی است که در حضور لیگاند تنها در دو ناحیه 279-263 و 304-210 دامنه حرکتی بسیار بالا می‌باشد و در سایر نواحی دامنه حرکتی بسیار پایین هست. درواقع از این تصاویر می‌توان چنین استنتاج کرد که در عدم حضور لیگاند اکثر نواحی پروتئین دامنه نوسان بالایی را دارا می‌باشد و در حضور لیگاند نواحی پرحرکت در نواحی مشخصی متمرکز شده است و درواقع همین عوامل باعث شده‌اند که در عدم حضور لیگاند کنفورماسیون های مختلف پروتئین در فضای فاز بسیار پخش باشند و در حضور لیگاند در کلاسترهای بسیار متمرکز قرار گیرند (شکل ۹ الف). همچنین در شکل ۱۰مقدار انعطاف پذیری آمینواسیدها در فضای PC1 نشان داده شده اند. همانطور که در شکل۱۰مشاهده می‌شود در عدم حضور لیگاند آمینواسیدهای 115-35 انعطاف پذیری بسیار بالایی را نشان می‌دهند. همچنین آمینواسیدهای شماره 150-135، 210-180 و 295-275 مقدار انعطاف پذیری نسبتا بالایی را نسبت به حالت کمپلکس نشان می دهند. در حالت کمپلکس تنها در ۴ ناحیه (که در شکل ۹ ب نیز اشاره شده است) مقدار انعطاف پذیری پروتئین بسیار بالا می باشد.

ع-چشم انداز

انرژی آزاد گیبس (Gibbs Free Energy Landscape)

چشم انداز انرژی آزاد گیبس یکی از بهترین فاکتورها برای نشان دادن کنفورماسیون پایدار سیستم های شبیه سازی می باشد. همانطور که در شکل 11 مشاهده می شود نقاط آبی رنگ مربوط به نواحی با کمترین انرژی می باشند و هر چقدر که به سمت قرمز حرکت می کنیم از مقدار پایداری کاسته می شود. همانطور که در این شکل مشاهده می‌شود در پروتئین آزاد کنفورماسیون های پایدار (رنگ آبی) در دو کلاستر به صورت پخش شده می‌باشند و این در حالی است که در حالت کمپلکس در سه کلاستر و در نقاط نزدیک هم قرار گرفته اند. همچنین طبق این شکل در حالت آزاد کنفورماسیونهای زیادی در نواحی زرد رنگ پخش شده اند. در‌واقع از این نمودار می‌توان چنین نتیجه گرفت که اتصال مولکول لیگاند باعث کاهش انعطاف پذیری (شکل 10) و افزایش پایداری پروتئین شده است.

خ-بررسی ساختار دوم

بررسی و مطالعه تغییرات ساختار دوم پروتئین یکی از فاکتورهای مهم در آنالیز تاثیرپذیری در حضور عوامل مختلف می باشد. هر چقدر میزان تغییر ساختار دوم پروتئین ها کمتر باشد نشان دهنده پایداری پروتئین است. ساختارهای دوم به دو نوع منظم و نامنظم تقسیم می شوند که ساختار دوم منظم شامل مارپیچ آلفا، صفحه بتا، مارپیچ پای و غیره می باشد. در حال حاضر یکی از دقیق ترین نرم افزارها در آنالیز ساختار دوم، نرم افزارDSSP می باشد. این نرم افزار به ما این امکان را می دهد که بتوانیم تغییرات ساختاری در طول زمان در شبیه سازی دینامیک مولکولی مورد سنجش قرار دهیم. در این بخش تغییرات ساختار دوم آمینواسیدهای مختلف در ساختار پروتئین در طول زمان مورد آنالیز قرار گرفتند (شکل 12). ساختارهای دومی که در این بخش مورد مطالعه قرار گرفته اند عبارتند از: مارپیچ آلفا، صفحات بتا، مارپیچ پای، مارپیچ 310، Turn، bend، beta-bridge و coil.

شکل ۸- نمودار مقادیر ویژه در برابرشاخص بردار ویژه مربوطه که از ماتریکس کوواریانس نوسان اتم های بدنه در طول شبیه سازی بدست آمده است

شکل الف

شکل ب

شکل ۹- نمودار PCA مربوط به فضای فاز پروتئین در حضور و عدم حضور لیگاند در PC1 و PC2

همانطور که در شکل 12 مشاهده می شود اکثر آمینواسیدها در ساختار پروتئین دارای ساختار دوم منظم مانند مارپیچ آلفا (رنگ آبی) و صفحات بتا (رنگ قرمز) هستند.

بر اساس این شکل تنها نقاط محدودی از پروتئین در حضور و عدم حضور لیگاند، دارای ساختاری coil (رنگ سفید) و turn (رنگ زرد) می باشد. طبق شکل 12 در هیچکدام از حالت ها ساختار دوم پروتئین تغییر محسوسی نشان نمی دهد. در جدول 2 میانگین ساختار دوم پروتئین در حضور و عدم حضور لیگاند نشان داده شده است. همانطور که در جدول 2 مشاهده می شود تفاوت محسوسی بین فراوانی ساختار دوم در حضور و عدم حضور لیگاند مشاهده نمی شود.

شکل 10- نمودار RMSF پروتئین در PC1 در حضور و عدم حضور لیگاند

شکل 11- چشم انداز انرژی آزاد گیبس برای دو مولفه اصلی (PC1 و PC2) حاصل از آنالیز PCA درپروتئین در حضور و عدم حضور لیگاند

جدول 2- فراوانی ساختار دوم مختلف پروتئین در حضور و عدم حضور لیگاند

3Helix	A-Helix	Turn	Bend	B-Bridge	B-Sheet	Coil	Structure
0/05	0/28	0/13	0/10	0/00	0/19	0/26	0/59	پروتئین
0/06	0/27	0/14	0/10	0/01	0/18	0/25	0/59	کمپلکس

شکل 12- تغییرات ساختار دوم پروتئین در حضور و عدم حضور لیگاند در طول زمان شبیه سازی

ل-پارامترهای ترمودینامیکی

انرژی آزاد اتصال بین لیگاند با پروتئین در ناحیه پایدار نمودار RMSD مورد محاسبه قرار گرفت. با توجه به نمودارRMSD (شکل 3)، بعد از اینکه ساختار به پایداری رسید از مرحله production و طی دوره پایدار،۴۰۰ ساختار جهت محاسبه انرژی اتصال در نظر گرفته شدند که نتایج آن در جدول 3 آورده شده است. آنالیز جزئی تر از اجزای انرژی نشان داد که انرژی واندروالس بیشترین سهم را در اتصال لیگاند به پروتئین دارد. در این جدول، اجزای مختلف انرژی اتصال مانند انرژی واندروالس، الکترواستاتیک، حلال پوشی قطبی و غیره نشان داده شده است. همانطور که در جدول 3 مشاهده می شود مقدار انرژی واندروالس برابر با 359/224- کیلوژول بر مول می باشد که نشان دهنده نقش مهم این نوع میانکنش در اتصال لیگاند به پروتئین می باشد. همچنین طبق این جدول مقدار انرژی الکترواستاتیک برابر با 710/33- کیلوژل بر مول است که در مقایسه با میانکنش های واندروالسی نقش مختصری را در اتصال دارا می باشد. همچنین طبق این جدول مقدار انرژی حلال پوشی قطبی938/119 کیلوژول بر مول می باشد. مقدار انرژی حلال پوشی غیرقطبی نیز برابر با 313/20- کیلوژول بر مول می باشد. در شکل 13 نیز تغییرات کنفورماسیونی مولکول لیگاند قبل و بعد از شبیه سازی نشان داده شده است. همانطور که در شکل 13 مشاهده می‌شود در انتهای شبیه سازی مولکول لیگاند تغییر مختصری را نسبت به حالت شروع نشان می‌دهد و در‌واقع اندکی به سمت پایین حرکت کرده است.

جدول 3- انرژی آزاد اتصال بین لیگاند و پروتئین

kJ/mol	∆G_vdw	∆G_elec	∆G_solv-polar	∆G_solv-nonpol	∆G_MMPBSA
کمپلکس	359/224-	710/33-	938/119	313/20-	445/158-

شکل13- تغییرات کنفورماسیونی لیگاند قبل (قرمز) و بعد (آبی) از شبیه سازی دینامیک مولکولی

3-پارامتر های ADMET ریز مولکول CHIR99021

در ارزیابی های ADMET برخی از خصوصیات فارماکوکینتیک ریز مولکول های CHIR99021 اعم از میزان انحلال پذیری در آب، میزان جذب از روده، قابلیت نفوذپذیری از پوست (QPlog Kp) پیش بینی شده است. سایر خصوصیات فارماکوکینتیک کلیدی ترکیب CHIR99021 در جدول 4 خلاصه شده است.

نتیجه گیری

ترکیبات شیمیایی ریز مولکول که قادر به مهار فعل و انفعالات بین پروتئین های خاص هستند، مدتهاست که به یک رویکرد امیدبخش برای تنظیم سرنوشت سلولهای بنیادی و تمایز مستقیم برای اهداف بالینی تبدیل شده اند. پیش بینی برهمکنش این ترکیبات و بررسی خصوصیات فارماکوکینتیک این ریز مولکول ها با پروتئین های هدفشان از طریق شبیه سازی دینامیک مولکولی (MD) می تواند مکانیسم دقیق عملکرد آنها را شناسایی کرده و راه را برای انتخاب مهارکننده های قوی و مناسب هموار سازد. بدین ترتیب، ما نشان دادیم که اتصال CHIR99021 به پروتئین GSK3β دارای یک کنفورماسیونی است که از کنفورماسیون ساختار پروتئین در حالت آزاد متفاوت است. تجزیه و تحلیل شبیه سازی in silico نشان داد که ترکیب CHIR99021 اثرات دارویی خود را از طریق برهمکنش با ریشه های اسید آمینه اصلی اعمال می کند و ایده ای در مورد شبیه سازی انرژی آزاد CHIN99021 در محل عملکردی GSK3β ارائه می دهد. داده های ارائه شده در اینجا نشان می دهد که کمپلکس لیگاند-پروتئین سبب کاهش انعطاف پذیری پروتئین در دو ناحیه اصلی در جایگاه فعال پروتئین GSK3β شامل Tyr60-Val70 و Val142-Thr152 و در نتیجه سبب مهار فعالیت بیولوژیکی آن می شود. علاوه بر این، برهمکنش واندروالس نقش اصلی را در اتصال CHIR99021 به GSK3β داشت. قانون Jorgensenʼs Rule of 3 violations (برای پیش بینی و بهینه سازی فعالیت ترکیب شیمیایی) برای CHIR99021 کمتر از 1 بود که نشان دهنده مناسب بودن آن برای فعالیت های بیولوژیکی است.

جدول 4-خصوصیات ADMET یا فارماکوکینتیک ریز مولکول های CHIR99021

ADMET خصوصیّات	CHIR99021	خصوصیّات 95% داروها
Molecular Weight	465.344	130.0- 725.0
Total SASA (Solvent Accessible Surface Area)	673.371	300.0 -1000.0
Hydrophobic SASA	167.492	0.0 - 750.0
Hydrophilic SASA	142.113	7.0 - 330.0
Carbon Pi SASA	269.187	0.0 - 450.0
Weakly Polar SASA (WPSA)	94.580	0.0 -175.0
Molecular Volume (Å³)	1282.826	500.0 - 2000.0
vdW Polar SA (PSA)(Å²)	106.551	7.0 - 200.0
No. of Rotatable Bonds	8.000	0.0 - 15.0
Solute Globularity (Sphere = 1)	0.848	0.75 - 0.95
log P for hexadecane/gas	14.363	4.0 -18.0
log P for octanol/gas	23.281	8.0 -35.0
log P for water/gas	13.695	4.0 - 45.0
log P for octanol/water	3.847	-2.0 - +6.5
log S for aqueous solubility (mol.dm^-3)	-6.017	-6.5 - +0.5
log K hsa Serum Protein Binding	0.356	-1.5 - +1.5
log BB for brain/blood barier	-1.004	-3.0 - +1.2
No. of Primary Metabolites	3	1.0 -8.0
HERG K+ Channel Blockage: log IC50	-5.277	concern below -5
Apparent Caco-2 Permeability (nm/s)	444	<25 poor, >500 great
Apparent MDCK Permeability (nm/s)	679	<25 poor, >500 great
log Kp for skin permeability (Kp in cm/h)	-2.422
Jm, max transdermal transport rate (μg/cm².h)	0.002
Lipinskiʼs Rule of 5 Violations	0	maximum is 4
Jorgensenʼs Rule of 3 Violations	1	maximum is 3
% Human Oral Absorption in gastrointestinal (GI)	97	<25% is poor
Total QPlog Po/w (Lipophilicity)	3.847
Total -log S	6.017
Total log P MDCK (Madin-Darby Canine Kidney)	2.832

براساس قانون 5 گانه لیپینسکی، CHIR99021 دارای فعالیت زیست شناسی دارویی خاصی است تا در مقایسه با سایر مهارکننده های GSK3β به یک ترکیب فعال عملکردی تبدیل شود. در مجموع، می توان نتیجه گرفت که اتصال CHIR99021 به GSK3β اثر قابل توجهی بر میزان سختی پروتئین و مهار خواص عملکردی زیستی آن دارد. این یافته یک الگوی جدید برای تأثیر CHIR99021 بر روی ساختار GSK3β تعیین می کند و امکان طراحی یک ریز مولکول اختصاصی تر برای GSK3β را فراهم می کند.

1. Krishnankutty, A., et al., In vivo regulation of glycogen synthase kinase 3β activity in neurons and brains. Scientific reports, 2017. 7(1): p. 1-15.

2. Racaud-Sultan, C. and N. Vergnolle, GSK3β, a Master Kinase in the Regulation of Adult Stem Cell Behavior. Cells, 2021. 10(2): p. 225.

3. Patel, P. and J.R. Woodgett, Glycogen synthase kinase 3: a kinase for all pathways? Current topics in developmental biology, 2017. 123: p. 277-302.

4. Liu, K., et al., Chemical modulation of cell fate in stem cell therapeutics and regenerative medicine. Cell chemical biology, 2016. 23(8): p. 893-916.

5. Laco, F., et al., Selection of human induced pluripotent stem cells lines optimization of cardiomyocytes differentiation in an integrated suspension microcarrier bioreactor. Stem cell research & therapy, 2020. 11(1): p. 1-16.

6. Qiu, X.X., et al., Rapamycin and CHIR 99021 Coordinate Robust Cardiomyocyte Differentiation From Human Pluripotent Stem Cells Via Reducing p53‐Dependent Apoptosis. Journal of the American Heart Association, 2017. 6(10): p. e005295.

7. Huang, J., et al., Activation of Wnt/β-catenin signalling via GSK3 inhibitors direct differentiation of human adipose stem cells into functional hepatocytes. Scientific reports, 2017. 7(1): p. 1-12.

8. Wang, H., J. Hao, and C.C. Hong, Cardiac induction of embryonic stem cells by a small molecule inhibitor of Wnt/β-catenin signaling. ACS chemical biology, 2011. 6(2): p. 192-197.

9. Tortelote, G.G., et al., Complexity of the Wnt/β‑catenin pathway: Searching for an activation model. Cellular Signalling, 2017. 40: p. 30-43.

10. Kadari, A., et al., Robust generation of cardiomyocytes from human iPS cells requires precise modulation of BMP and WNT signaling. Stem cell reviews and reports, 2015. 11(4): p. 560-569.

11. Alder, B.J. and T.E. Wainwright, Phase transition for a hard sphere system. The Journal of chemical physics, 1957. 27(5): p. 1208-1209.

12. Bennett, C.H., Efficient estimation of free energy differences from Monte Carlo data. Journal of Computational Physics, 1976. 22(2): p. 245-268.

13. Berendsen, H., Report of CECAM Workshop: models for protein dynamics. Orsay, May, 1976. 24.

14. Bowers, K., et al., Proceedings of the ACM/IEEE Conference on Supercomputing (SC06). Tampa, Florida, November, 2006: p. 11-17.

15. Bowman, G.R., V.A. Voelz, and V.S. Pande, Atomistic folding simulations of the five-helix bundle protein λ6− 85. Journal of the American Chemical Society, 2011. 133(4): p. 664-667.

16. Boyce, S.E., et al., Predicting ligand binding affinity with alchemical free energy methods in a polar model binding site. Journal of molecular biology, 2009. 394(4): p. 747-763.

17. Case, D.A., et al., The Amber biomolecular simulation programs. Journal of computational chemistry, 2005. 26(16): p. 1668-1688.

18. Chong, L.T., et al., Molecular dynamics and free-energy calculations applied to affinity maturation in antibody 48G7. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999. 96(25): p. 14330-14335.

19. Christen, M., et al., The GROMOS software for biomolecular simulation: GROMOS05. Journal of computational chemistry, 2005. 26(16): p. 1719-1751.

20. Duan, Y. and P.A. Kollman, Pathways to a protein folding intermediate observed in a 1-microsecond simulation in aqueous solution. Science, 1998. 282(5389): p. 740-744.

21. Essmann, U., et al., A smooth particle mesh Ewald method. The Journal of chemical physics, 1995. 103(19): p. 8577-8593.

22. davari, k., et al., Inhibitor discovery against beta lactamase CTX-M-9 from E.coli by molecular docking, MM/PBSA and molecular dynamics studies. Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology), 2019. 32(1): p. 19-31.

23. Abidi, M., The effect of pH changes on the unfolding force of titin immunoglobulin domain I27 using steered molecular dynamic simulation. Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology), 2019. 32(2): p. 219-229.

24. Mehrnejad, F., et al., Molecular Dynamics Simulation of Acetylcholinesterase in the Presence of Gold Nanoparticles. Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology), 2020: p. -.

25. Bocci, G., et al., ADME-Space: a new tool for medicinal chemists to explore ADME properties. Scientific reports, 2017. 7(1): p. 1-13.

26. Doogue, M.P. and T.M. Polasek, The ABCD of clinical pharmacokinetics. 2013, Sage Publications Sage UK: London, England.

27. QikProp, version 4.4, Schrӧdinger, LLC, New York, NY, Release 2015-2

28. Lipinski, C.A., et al., Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Advanced drug delivery reviews, 1997. 23(1-3): p. 3-25.