نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه زیستشناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران
2 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران
چکیده
مقدمه: امروزه پپتیدهای زیست فعال یکی از ابزارهای مهم در بهبود سلامت انسان هستند. پروتئینهای ریزجلبکی شاید بتوانند جایگزین خوبی به جای منابع گرانقیمت مانند گوشت و شیر بهعنوان پیشساز تولید پپتیدهای زیست فعال باشند. RuBisCO یک آنزیم هگزادکامریک است که از هشت زیر واحد بزرگ و هشت زیر واحد کوچک تشکیل شده است و 2 تا 10 درصد از کل پروتئین سلولی را تشکیل میدهد.
روش: پروتئین RuBisCO متعلق به سه ریزجلبک (Arthrospira plantensis (Spirulina) ،Dunaliella salina ، Haematococcus pluvialis) بهصورتin silico هضم آنزیمی شد. خواص آنتی اکسیدانی ، مهار آنزیم مبدل آنژیوتانسین و دیپپتیدیل پپتیداز -4 و فعالسازی پروتئولیز با واسطه یوبیکوتین پپتیدهای حاصله با محصولات پپتیدی پروتئینهای متداول مانند گوشت و شیر با استفاده از پایگاه های اطلاعاتی بیوانفورماتیکی مختلف مانندBIOPEP ،ProtParam ، PeptiDeranker، Pepcalc و ToxinPred مقایسه شد.
نتایج و بحث: طیف وسیعی از پپتیدهای فعال زیستی با قابلیتهای متعدد طی هضم زیرواحدهای بزرگ و کوچک RuBisCO با آنزیمهای گوارشی انسانی، گیاهی و میکروبی پیشبینی شد. نتایج موید رتبهبندی بالا و سمیت پایین پپتیدهای مشتق از RuBisCO در مقایسه با پپتیدهای مشتق از پروتئینهای گوشت و شیر است.
نتیجهگیری: بهنظر میرسد که پپتیدهای فعال مشتق از RuBisCO از ریزجلبکها عملکرد خوبی بهعنوان آنتیاکسیدان، ضد سرطان، ضدحساسیت و ضد آترواسکلروتیک دارند. این برتری به ترکیب اسیدآمینههای آن مربوط است. احتمالاً تهیه یک محصول، متشکل از پپتیدهای حاصل از آنزیم RuBisCO سه ریزجلبک، مکمل غذایی مناسبی برای پیشگیری و درمان برخی بیماریها باشد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
In silico comparison of bioactive peptides derived from three microalgae RuBisCO enzyme with commonly consumed proteins
نویسندگان [English]
1 Department of Biology, Faculty of Sciences, Azarbaijan Shahid Madani University
2 Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Azarbaijan Shahid Madani University, Tabriz, Iran
چکیده [English]
Introduction Nowadays, bioactive peptides are one of the important tools in improvement of human health. Microalgae proteins may be a good alternative to expensive sources such as meat and milk as precursors for production of bioactive peptides. RuBisCO is a hexadecameric enzyme composed of eight large subunits and eight small subunits, and accounts for 2 to 10 percent of the total cell protein.
Methods RuBisCO protein belonging to three microalgae (Arthrospira plantensis (Spirulina), Dunaliella salina, Haematococcus pluvialis) were in silico digested enzymatically. The antioxidant properties, inhibition of angiotensin-converting enzyme and dipeptidyl peptidase-4, activation of ubiquitin mediated proteolysis of resulted peptides were compared with peptides products of commonly used proteins such as meat and milk by using various bioinformatics databases such as BIOPEP, ProtParam, PeptiDeranker, Pepcalc and ToxinPred.
Results& Discussion a wide range of bioactive peptides with multiple capabilities were predicted during digestion of large and small subunits of RuBisCO with human, plant and microbial digestive enzymes. The results confirm high rank and low toxicity of these RuBisCO derived peptides in comparison with peptides derived from meat and milk proteins.
Conclusion It seems that the RuBisCO derived active peptides of microalgae have a good function as antioxidant, anti-cancer, anti-allergy and anti-atherosclerotic. This advantage is due to the composition of its amino acids. Probably, preparation of a complement product consisting of the three microalgae peptides will be a perfect supplement for the treatment of some diseases.
کلیدواژهها [English]
مقایسه In silico پپتیدهای زیستفعال حاصل از آنزیم روبیسکو سه ریزجلبک با پروتئینهای متداول مصرفی
لیلا زرندی میاندوآب*، سیده فهیمه رضوی، فرشاد پوریوسف و نادر چاپارزاده
ایران، تبریز، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی
تاریخ دریافت: 07/06/1400 تاریخ پذیرش: 28/11/1400
امروزه پپتیدهای زیست فعال یکی از ابزارهای مهم در بهبود سلامت انسان هستند. پروتئینهای ریزجلبکی شاید بتوانند جایگزین خوبی به جای منابع گرانقیمت مانند گوشت و شیر بهعنوان پیشساز تولید پپتیدهای زیست فعال باشند. RuBisCO یک آنزیم هگزادکامریک است که از هشت زیر واحد بزرگ و هشت زیر واحد کوچک تشکیل شده است و 2 تا 10 درصد از کل پروتئین سلولی را تشکیل میدهد. روش: پروتئین RuBisCO متعلق به سه ریزجلبک (Arthrospira plantensis (Spirulina) ،Dunaliella salina ، Haematococcus pluvialis) بهصورتin silico هضم آنزیمی شد. خواص آنتی اکسیدانی، مهار آنزیم مبدل آنژیوتانسین و دیپپتیدیل پپتیداز -4 و فعالسازی پروتئولیز با واسطه یوبیکوتین پپتیدهای حاصله با محصولات پپتیدی پروتئینهای متداول مانند گوشت و شیر با استفاده از پایگاه های اطلاعاتی بیوانفورماتیکی مختلف مانندBIOPEP ،ProtParam ، PeptiDeranker، Pepcalc و ToxinPred مقایسه شد. طیف وسیعی از پپتیدهای فعال زیستی با قابلیتهای متعدد طی هضم زیرواحدهای بزرگ و کوچک RuBisCO با آنزیمهای گوارشی انسانی، گیاهی و میکروبی پیشبینی شد. نتایج موید رتبهبندی بالا و سمیت پایین پپتیدهای مشتق از RuBisCO در مقایسه با پپتیدهای مشتق از پروتئینهای گوشت و شیر است. بهنظر میرسد که پپتیدهای فعال مشتق از RuBisCO از ریزجلبکها عملکرد خوبی بهعنوان آنتیاکسیدان، ضد سرطان، ضدحساسیت و ضد آترواسکلروتیک دارند. این برتری به ترکیب اسیدآمینههای آن مربوط است. احتمالاً تهیه یک محصول، متشکل از پپتیدهای حاصل از آنزیم RuBisCO سه ریزجلبک، مکمل غذایی مناسبی برای پیشگیری و درمان برخی بیماریها باشد.
واژه های کلیدی: پپتیدهای فعالزیستی، آنزیم روبیسکو، ریزجلبک، ارتقاء سلامت.
* نویسنده مسئول، تلفن: 04133816856 ، پست الکترونیکی: zarandi@azaruniv.ac.ir
به گواهی اولین سند پزشکی موجود از تمدن بشری، کتاب سینوهه پزشک مصری، از ابتدای شکلگیری تاریخ تاکنون انسان به ارتباط مستقیم بین سلامتی و تغذیه پیبرده است. منابع تغذیه انسان از مجموعه بزرگی شامل موجودات گیاهی و جانوری تشکیل شده است. از آنجا که به فرمایش امام صادق (ع) «غذای تو، دوای تو باید باشد» همیشه بشر سعی در استفاده از غذاهای مفیدتر و موثرتر در امر بهبود سلامت و درمان داشته است. گیاهان و جلبکها بهعنوان موجودات فتوسنتز کننده که قادر به بیوسنتز طیف وسیعی از ترکیبات و متابولیتهای ثانویه، علاوه بر متابولیتهای اولیه، هستند در این امر که نقش دارو داشته باشند، پیشقدم هستند. اخیراً علاوه بر اثرات مفید ترکیبات مذکور موجود در زیست تودههای گیاهی و جانوری، که به روشهای مختلف مورد استفاده انسان قرار میگیرند، ترکیبات نوظهوری به نام "زیست فعال" مورد توجه قرارگرفتهاند.
تاکنون ترکیبات زیست فعال زیادی از ماکروبیومولکولها مثل انواع پروتئین و لیپیدها گزارش شده است، با این وجود ترکیبات مشتق شده از پروتئینها جزء مهمترین و متداولترین انواع مورد مطالعه هستند (36). همچنین در سالهای اخیر، چندین مطالعه بر روی تولید و تشخیص عملکرد پپتیدهای حاصل از پروتئینهای رژیم غذایی و استفاده از این پپتیدها بهعنوان عوامل عملکردی و فعالیتهای مشابه دارو متمرکز شده است (39). پپتیدها در توالی اسیدآمینه پروتئین والد غیرفعال هستند ولی میتوانند پس از آزادسازی توسط پروتئازها و پپتیدازهای درونزا و برونزا در طی هضم فیزیولوژیکی یا فرآوری موادغذایی مانند تخمیر و فرآوری گوشت فعال شوند (40). بسته به توالی اسیدهایآمینه، اندازه مولکولی، بار خالص و شکل فضایی، پپتیدهای زیست فعال میتوانند فرآیندهای متابولیکی متنوع را در سیستم ایمنی، قلبی عروقی، دستگاه گوارش و عصبی تنظیم کنند (20).
ریبولوز 1و5 بیس فسفات کربوکسیلاز / اکسیژناز (RuBisCO) آنزیم اصلی در فتوسنتز و تنفس نوری در گیاهان و ارگانیسمهای فتوسنتزی دیگر شامل باکتریها و جلبکها است (39). این آنزیم بهعنوان فراوانترین پروتئین زمین، با تخمین سهم بیش از نیمی از کل پروتئینهای محلول در برگ گیاهان، معرفی شده است. ساختار پروتئینی روبیسکو متشکل از هترو هگزادکامر (شکل 1) با وزن 540 کیلودالتون است که 8 زیر واحد بزرگ با وزن (هر زنجیره 50 تا 55 کیلودالتون) و 8 زیر واحد کوچک با وزن (هر زنجیره 12 تا 18 کیلودالتون) دارد (4). بنابراین، روبیسکو میتواند یک منبع جذاب و پایدار از پپتیدهای زیستفعال باشد (41). این آنزیم گیاهی در مرحله محدود کننده چرخه کالوین، دیاکسیدکربن بیوسفر را به کربن آلی تبدیل میکند. این واکنش به طور خاص کربوکسیلاسیون دی ریبولوز 1 و 5 بیس فسفات را کاتالیز میکند تا یک ماده 6 کربن ناپایدار ایجاد کند (33).
شکل 1- ساختار کلی روبیسکو از Chlamydomonas reinhardtii، نما از سمت پایین است. 4 تا از زیر واحدهای بزرگ (L) با رنگ خاکستری تیره و 4 تای دیگر با رنگ خاکستری روشن نشان داده شده است. زیر واحدهای کوچک (S) به رنگ زرد نشان داده شدهاند. حلقههای βA-βB زیر واحد کوچک به رنگ قرمز نشان داده شدهاند. قسمت نمای نزدیک سمت راست پایین شکل، محل حلقههای زیر واحد کوچک اسفناج را نشان میدهد (37).
جلبکهای تکسلولی و چندسلولی برای تولید پپتیدهای فعال زیستی به دلیل مقدار قابل توجه پروتئین (تقریباً %15 تا 47% وزن خشک) گزینههای بسیار باارزشی هستند (16). لازم به ذکر است که زیست توده جلبک دارای تعداد زیادی اسیدآمینه ضروری و بقایای اسیدآمینههایی است که در پروتئینها دیده نمیشوند (6). با این وجود، اکثر جلبکها دارای دیواره سلولی سفت و سختی هستند که جداسازی پروتئینهای درون سلولی را با مشکل مواجه می کند. بنابراین، محققان روشهای مختلف فیزیکی و شیمیایی را در این جهت بررسی میکنند. با این حال، هنوز چالشهای زیادی در مورد استفاده از پپتیدهای فعال قبل از ورود به آزمایشات بالینی وجود دارد. مدلسازی محاسباتی مفصلی برای کشف ساختار و روابط عملکردی قطعات پپتیدی از ریزجلبکها مورد نیاز است (35).
ابزارها و پایگاههای بیوانفورماتیکی بهعنوان یک استراتژی قدرتمند برای صرفهجویی در هزینه و وقت، همچنین توانمند در استخراج گسترده پپتیدهای فعال زیستی از پیشسازهای انواع پروتئین و کشف سیستمهای پروتئولیتیک کارآمد برای آزادسازی آنها در چند سال اخیر بسیار مورد استفاده قرار گرفتهاند (21). هدف از این مطالعه تجزیه و تحلیل توالی اسیدآمینههای زیرواحد بزرگ و کوچک پروتئین روبیسکو موجود در ریزجلبکهای Dunaliella salina، Spirulina،Haematococcus pluvialis و مقایسه میزان و تنوع عملکرد پپتیدهای زیستفعال موجود در آنها با پپتیدهای زیستفعال موجود در پروتئینهای مصرفی روزانه سبد غذایی انسان شامل: گلوبولین سویا، آلبومین تخممرغ، بتاکازئین شیر، بتالاکتوگوبولین و میوزین گوشت گاو توسط ابزارهای بیوانفورماتیکی بود.
توالی زیرواحدهای بزرگ و کوچک پروتئین روبیسکو در ریزجلبکها و توالی پروتئینهای مصرفی روزانه: توالی زیرواحدهای بزرگ و کوچک پروتئین روبیسکو در ریزجلبکهای Dunaliella salina به ترتیب با کدهای دسترسی (D0FXZ7 و Q5XR40) و Spirulina (D4ZVW7 وD4ZVW5) و Haematococcus pluvialis (B7U6F7وA0A699Y6H1) و همچنین توالی پروتئینهای مصرفی روزانه شامل Soy Globulin، Egg Albumin، Bovine Beta Casein، Bovine Beta Lactoglobulin، Bovine Myosin Heavy Chain به ترتیب با کدهای دسترسی P13917،P01012 ، P02666، P0275، Q9BE40 از پایگاه داده UniProtKB/Swiss-Prot به آدرس (www.uniprot.org) به دست آمد.
فراوانی وقوع پپتید های زیست فعال در زیر واحد های روبیسکو ریزجلبکها و پروتئینهای مصرفی روزانه: اگر متصور شویم "N" تعداد کل باقیمانده اسیدهای آمینه در پروتئین و "a" نشان دهنده تعداد پپتیدهای فعال زیستی پنهان در یک توالی پروتئینی باشد، آنگاه فراوانی وقوع قطعات پپتیدی زیست فعال در توالی اولیه (A) در هر زیر واحد روبیسکو و همچنین پروتئین های سبد غذایی روزانه را از طریق پایگاه BIOPEP میتوانیم بهعنوان A = a / N گزارش کنیم (11). در این مطالعه فعالیتهای زیستی مرتبط با سلامت انسان شامل توانایی مهارAngiotensin-converting enzyme (ACE) ،Dipeptidyl peptidase 4 و همچنین فعالیت Antioxidative وActivating ubiquitin-mediated proteolysis ، مورد بررسی قرار گرفت. برای هر فعالیت زیستی، مقادیر A برای زیر واحدهای روبیسکو در ریزجلبکها و پروتئینهای مصرفی روزانه مقایسه و نتایج در جدول 1 ارائه شد.
فعالیت های زیستی و تجزیه پروتئین به وسیله انواع آنزیم: آنزیمهای پروتئازی گوارشی مانند کیموتریپسین، تریپسین و پپسین و همچنین آنزیمهای میکروبی و گیاهی برای هیدرولیز روبیسکو انتخاب شد. فراوانی وقوع قطعات با فعالیت معین توسط آنزیمها (AE) و فراوانی نسبی وقوع قطعات با فعالیت داده شده توسط آنزیمها (W) به صورت W = AE/A محاسبه و نتایج در جدول های 2و3 ارائه شد.
تجزیه و تحلیل silico in ترکیب اسید آمینه پروتئینهای مورد آزمایش: ترکیبات اسیدآمینه توالی پروتئین روبیسکو ریزجلبکها و پروتئینهای مصرفی روزانه انتخاب شده با استفاده از ابزار ProtParam به آدرس (http://web.expasy.org/protparam) تعیین شد. ابزار ProtParam یک برنامه تجزیه و تحلیل silico in است که خواص فیزیکو شیمیایی یک پروتئین یا پپتید را از توالی اسیدآمینههای آن محاسبه میکند (34). مجموع اسیدهایآمینه، وزن مولکولی و نقطه ایزوالکتریک (pI) از پروتئینهای انتخابی نیز مورد بررسی قرار گرفت و نتایج در جدول 4 ارائه شد.
درخت فیلوژنتیک: درخت فیلوژنتیک رابطه ژنتیکی از UniProt بین زیر واحد بزرگ و کوچک RuBisCOموجود در ریزجلبکها به ترتیب با کدهای دسترسی Dunaliella salina (D0FXZ7 و Q5XR40) و Spirulina (D4ZVW7 وD4ZVW5) و Haematococcus pluvialis (B7U6F7 و A0A699Y6H1) از طریق پایگاه UniProt دریافت شد.
جدول 1 - میزان وقوع پپتیدهای فعال پنهان در زیر واحدهای روبیسکو را برای فعالیتهای زیستی انتخاب شده
Food Proteins |
Uniprotkb Swiss-Prot |
ACE inhibitor |
Activating ubiquitin-mediated proteolysis |
Anti inflammatory |
Antiamnestic |
Antioxidative |
Dipeptidyl peptidase iv inhibitor |
Hypotensive |
Dipeptidyl peptidase iii inhibitor |
Hmg-coa reductase inhibitor |
Alpha-glucosidase inhibitor |
Soy globulin |
P13917 |
0.4239 |
0.0187 |
0.0047 |
0.0094 |
0.0515 |
0.6628 |
* |
0.0749 |
0.0023 |
0.0094 |
Egg albumin |
P01012 |
0.0207 |
0.0078 |
0.0026 |
0.0026 |
0.0959 |
0.6192 |
0.0052 |
0.0803 |
* |
0.0492 2 |
Bovine beta casein |
P02666 |
0.7354 |
0.0135 |
0.0135 |
0.0493 |
0.1390 |
0.8430 |
* |
0.0942 |
* |
0.0538 1 |
Bovine beta lactoglobulin |
P02754 |
0.5225 |
0.0225 |
* |
* |
0.2697 |
0.6573 |
* |
0.0955 |
* |
0.0281 5 |
Bovine myosin heavy chain |
Q9BE40 |
0.4035 |
0.0144 |
0.0046 |
0.0015 |
0.0697 |
0.5872 |
* |
0.0717 |
* |
0.0279 6 |
Microalgae/large subunit |
|||||||||||
Dunaliella salina |
D0FXZ7 |
0.4989 |
0.0189 |
0.0063 |
0.0105 |
0.0842 |
0.6295 |
0.0021 |
0.1116 |
0.0021 |
0.0274 7 |
Spirulina |
D4ZVW7 |
0.4979 |
0.0168 |
0.0042 |
0.0105 |
0.0924 |
0.6303 |
0.0021 |
0.1092 |
0.0021 |
0.0315 4 |
Haematococcus pluvialis |
B7U6F7 |
0.4958 |
0.0210 |
0.0063 |
0.0105 |
0.0903 |
0.6450 |
* |
0.1134 |
0.0021 |
0.0273 8 |
Microalgae/small subunit |
|||||||||||
Dunaliella salina |
Q5XR40 |
0.4316 |
0.0053 |
0.0053 |
0.0053 |
0.0684 |
0.7000 |
* |
0.0421 |
0.0053 |
0.0263 9 |
Spirulina |
D4ZVW5 |
0.4685 |
* |
0.0180 |
* |
0.0541 |
0.6577 |
* |
0.0901 |
* |
0.0360 3 |
Haematococcus pluvialis |
A0A699Y6H1 |
0.4545 |
0.0160 |
0.0053 |
* |
0.0856 |
0.7059 |
* |
0.0642 |
* |
0.0160 |
*: اطلاعاتی در پایگاه BIOPEP در این خصوص موجود نبود.
جدول 2 - مقادیر پارامترهای توصیف کننده میزان پیشبینی شده اثر مهارکننده ACE قطعات آزاد شده از روبیسکو در Dunaliella salina ، Spirulina و Haematococcus pluvialis
Microalgae/large subunit |
Uniprotkb swiss-prot |
Bromelain |
Thermolysin |
Papain |
Chymotrypsin |
Trypsin |
Pepsin |
|
|
Dunaliella salina |
D0FXZ7 |
0.4808 |
0.4806 |
0.4806 |
0.4806 |
0.4823 |
0.4804 |
||
Spirulina |
D4ZVW7 |
0.4756 |
0.4753 |
0.4755 |
0.4753 |
0.4767 |
0.4744 |
||
Haematococcus pluvialis |
B7U6F7 |
0.4776 |
0.4777 |
0.4777 |
0.0223 |
0.4767 |
0.4766 |
||
Microalgae/small subunit |
|||||||||
Dunaliella salina |
Q5XR40 |
0.4185 |
0.4180 |
0.4182 |
0.4184 |
* |
0.4180 |
||
Spirulina |
D4ZVW5 |
0.4513 |
0.4538 |
0.4512 |
0.4511 |
0.4512 |
0.4514 |
||
Haematococcus pluvialis |
A0A699Y6H1 |
0.4351 |
0.4349 |
0.4351 |
0.4351 |
0.4369 |
0.4351 |
||
*: اطلاعاتی در پایگاه BIOPEP در این خصوص موجود نبود.
جدول 3 - مقادیر پارامترهای توصیف کننده میزان پیشبینی شده اثر مهارکننده DPP4 قطعات آزاد شده از روبیسکو در Dunaliella salina ، Spirulina و Haematococcus pluvialis
Microalgae/large subunit |
Uniprotkb swiss-prot |
Bromelain |
Thermolysin |
Papain |
Chymotrypsin |
Trypsin |
Pepsin |
Dunaliella salina |
D0FXZ7 |
0.6011 |
0.6014 |
0.6009 |
0.6014 |
0.6000 |
0.6000 |
Spirulina |
D4ZVW7 |
0.6019 |
0.6020 |
0.6018 |
0.6016 |
0.6035 |
0.6039 |
Haematococcus pluvialis |
B7U6F7 |
0.6163 |
0.6162 |
0.6163 |
0.6163 |
0.6165 |
0.6144 |
Microalgae/small subunit |
|||||||
Dunaliella salina |
Q5XR40 |
0.6685 |
0.6681 |
0.6684 |
0.6681 |
0.6710 |
0.6710 |
Spirulina |
D4ZVW5 |
0.6466 |
0.6461 |
0.6460 |
0.6241 |
* |
0.6463 |
Haematococcus pluvialis |
A0A699Y6H1 |
0.6735 |
0.6737 |
0.6734 |
0.6737 |
* |
0.6753 |
*: اطلاعاتی در پایگاه BIOPEP در این خصوص موجود نبود.
جدول 4 - ترکیب اسیدآمینه، وزن مولکولی و پیش بینی تئوری pI پروتئین های انتخاب شده.
Microalgae/large subunit |
microalgae/small subunit |
|||||
Amino acid composition |
Dunaliella salina |
Spirulina |
Haematococcus pluvialis |
Dunaliella salina |
Spirulina |
Haematococcus pluvialis |
Ala (A) |
43 |
39 |
44 |
20 |
5 |
26 |
Arg (R ) |
29 |
29 |
31 |
11 |
7 |
13 |
Asn (N) |
15 |
16 |
13 |
11 |
2 |
8 |
Asp (D) |
26 |
27 |
28 |
7 |
3 |
7 |
Cys (C) |
11 |
11 |
11 |
5 |
3 |
5 |
Gln (Q) |
12 |
13 |
11 |
13 |
9 |
11 |
Glu (E) |
31 |
34 |
29 |
6 |
10 |
4 |
Gly (G) |
50 |
45 |
49 |
7 |
4 |
6 |
His (H) |
15 |
15 |
15 |
0 |
2 |
0 |
Ile (I) |
19 |
23 |
20 |
8 |
5 |
7 |
Leu (L) |
40 |
38 |
38 |
9 |
11 |
9 |
Lys (K) |
23 |
24 |
21 |
10 |
5 |
6 |
Met (M) |
11 |
15 |
13 |
6 |
3 |
6 |
Phe (F) |
20 |
25 |
19 |
8 |
6 |
7 |
Pro (P) |
21 |
23 |
23 |
16 |
7 |
11 |
Ser (S) |
17 |
17 |
18 |
11 |
6 |
20 |
Thr (T) |
31 |
32 |
30 |
12 |
8 |
10 |
Trp (W) |
8 |
9 |
8 |
4 |
2 |
4 |
Tyr (Y) |
18 |
14 |
18 |
10 |
6 |
9 |
Val (V) |
35 |
27 |
37 |
16 |
7 |
18 |
Total number of aa |
475 |
476 |
476 |
190 |
111 |
187 |
Molecular weight (kda) |
52.45 |
53.27 |
52.51 |
21.43 |
13.08 |
20.61 |
Theoretical PI |
6.33 |
6.04 |
6.32 |
9.34 |
6.1 |
9.45 |
رتبهبندی پپتید: پتانسیل پپتیدهای مهارکننده ACE و DPP4 توسط ابزار PeptideRanker پیشبینی و نتایج در جدولهای 5 و6 ارائه شد. این پایگاه یک سرور مبتنی بر وب است که احتمال فعالیت بیولوژیکی یک پپتید را پیشبینی میکند. این ابزار نمره هر پپتید را در محدوده صفر تا یک ارائه میدهد، این اعداد مربوط به احتمال بیشترین و کمترین فعالیت پپتید زیست فعال است (28).
ویژگی های فیزیکو شیمیایی پپتیدها: ویژگیهای فیزیکو شیمیایی پپتیدهای مهارکننده ACE و DPP4 مشتق از پروتئینهای مورد بررسی با استفاده از ابزارهای آنلاین مورد ارزیابی قرار گرفت. وزن مولکولی، نقطه ایزوالکتریک، بار پپتید در اسیدیته 7، حلالیت تخمینی این پپتیدها با نرم افزار آنلاینPepcalc (http://pepcalc.com/) برآورد شد.
پیشبینی سمیت پپتیدها: در پیشبینی سمیت پپتیدهای مهارکننده ACE و DPP4مشتق شده از پروتئینهای مورد بررسی با استفاده از ابزار آنلاینToxinPred (http://www.imtech.res.in/raghava/toxinpred/index.html) مورد بررسی قرار گرفت. روش پیشبینی مبتنی بر support vector machine (SVM) با مقدار آستانه 0/0 انتخاب شد. مقدار آستانه (0/0) برای جداسازی پپتیدهای سمی و غیرسمی استفاده شد.
جدول 5 - مقایسه قابلیت مهار AEC (الف) و ضد DPP4 (ب) پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی در پروتئینهای مصرفی روزانه.
الف ACE inhibitor |
Chymotrypsin |
Trypsin |
Pepsin |
Thermolysin |
Papain |
Bromelain |
Bovine beta casein |
PL(0.81),IL (0.39),VY(0.09) |
GPFPIIV(0.81),EMPFPK(0.76) AVPYPQR (0.56),VK(0.03) |
PL(0.81),IL (0.39),HL(0.37) YQEPVL(0.23) |
FP(0.99),LGP(0.78),IPP(0.76)YP(0.73) FPPQS(0.70),VPP (0.51),VRGP(0.40) VM(0.32),LN(0.25),VP(0.23),LEE(0.03) |
AF(0.97),PP(0.88),PG(0.87) PL(0.81),AVPYP (0.58),AR(0.39) IL(0.39)HL(0.37),QK (0.06) |
MF(0.99),MG (0.94),PG(0.87) PL(0.81)IL(0.39),HL(0.37) |
BOVIN Beta-lactoglobulin |
SF(0.94),RVY(0.16) |
ALPMHIR(0.62),FDK(0.58) IPAVFK(0.49),GLDIQK(0.17) IIAEK(0.07) |
SF(0.94) |
AP(0.62),FDK(0.58),IP(0.58),LR(0.56) IR(0.33),LEK(0.04) |
SF(0.94),MKG(0.55),AG(0.54) VR(0.11) |
PL(0.81),MKG (0.55),DA(0.13) KA(0.09) |
large chain Dunaliella salina |
GF(0.99),RW (0.97),DF(0.94) VF(0.81),GL (0.80),VW(0.80) RL(0.62),EF (0.59),GH(0.53) IAY(0.26),DY (0.24),AH(0.21) KY(0.17),VAY (0.10) |
GR(0.76),YK (0.14) |
GF(0.99),DF (0.94),GL(0.80) RL(0.62),EF (0.59) |
FG(0.99),FR(0.98),YP(0.73),LG(0.71) VMP(0.57),LR(0.56),AG(0.54),VP(0.23) AH(0.21),LQ(0.19),YK(0.14),VE(0.02) |
AF(0.97),DF(0.94),EF(0.59),AG(0.54) AR(0.39),DG(0.39)KL(0.23)AIYK(0.22) VG(0.16),EG(0.10),ER(0.07),AV(0.06) |
DF(0.94),PG (0.87),EF(0.59) DG(0.39),IR (0.33),KL(0.23) EG(0.10),KA (0.09)YV(0.08) ER(0.07),EA (0.04),EV(0.02) |
ب Inhibitor DPP-4 |
Chymotrypsin |
Trypsin |
Pepsin |
Thermolysin |
Papain |
Bromelain |
Bovine beta casein |
PF(0.99),PL(0.81),AL(0.43)IL(0.39) SL(0.33),TL(0.14),VY(0.09) |
MK (0.45),VK (0.33) |
PL(0.81),PQNIPPL(0.80) AL(0.43),IL (0.39),HL (0.37) SL(0.33),TL (0.14) |
FP(0.99),LP(0.79),YP(0.73),MK(0.45) LH(0.33),VM(0.32),LN(0.25),VP(0.23) IQ(0.12) |
PF(0.99),AF(0.97),PP(0.88),PG(0.87) PL(0.81),AL(0.43),IL(0.39),HL(0.37) SL(0.33),QT(0.05),ES(0.03) |
MF(0.99),PF(0.99),MG(0.94) PG(0.87),PL(0.81),PQNIPPL(0.80) MA(0.69),IL(0.39),HL(0.37),PV(0.20) QS(0.08),QT(0.05),NV(0.04) ES(0.03),KV(0.03) |
Small chain Haematococcus pluvialis |
GW(0.99),PM (0.95),SF(0.94) PPL(0.89),VW (0.80),SY(0.26) DN(0.10) |
NO PEPTID |
PPL(0.89) |
AP(0.62),AG(0.54),AD(0.13),VR(0.11) AT(0.07),VS(0.04),VD(0.04),VQ(0.04) VK(0.03) |
AF(0.97),PPL(0.89),AP(0.62),AG(0.54) AL(0.43),NG(0.38)MV(0.31),AD(0.13) QI(0.13),AS(0.12),AT(0.07),SV(0.05) QV(0.04) |
PPL(0.89),MA(0.69),YL(0.57),PA(0.53) NG(0.38),MV(0.31),KR(0.21),IA(0.18) QA(0.11),NA(0.11),KA(0.09),YV(0.08) QV(0.04) |
جدول 6 - رتبهبندی پپتیدهای با قابلیت مهار AEC حاوی اسیدآمینه های F , G و ضد DPP4 حاوی اسیدامینهP مشتق شده از پروتئین های انتخابی پس از هضم in silico
Proteins |
ACE-inhibitory |
Proteins
|
DPPH4-Inhibitory |
||
Peptide sequence |
Peptide rank |
Peptide sequence |
Peptide rank |
||
Bovine beta casein |
FP |
0.99 |
Bovine beta casein
|
PF |
0.99 |
AF |
0.97 |
FP |
0.99 |
||
MG |
0.94 |
PP |
0.88 |
||
PG |
0.87 |
PG |
0.87 |
||
GPFPIIV |
0.81 |
PL |
0.81 |
||
LGP |
0.78 |
PQNIPPL |
0.80 |
||
EMPFPK |
0.76 |
LP |
0.79 |
||
FPPQS |
0.70 |
YP |
0.73 |
||
VRGP |
0.40 |
VP |
0.20 |
||
Bovine beta lactoglobulin |
SF |
0.94 |
PV |
0.20 |
|
FDK |
0.58 |
SMALL SUBUNIT RuBisCO Haematococcus pluvialis |
PM |
0.95 |
|
MKG |
0.55 |
PPL |
0.89 |
||
AG |
0.55 |
AP |
0.62 |
||
IPAVFK |
0.49 |
PA |
0.53 |
||
GLDIQK |
0.17 |
|
|||
Large subunit Dunaliella salina
|
GF |
0.99 |
|||
FG |
0.99 |
||||
FR |
0.98 |
||||
AF |
0.97 |
||||
DF |
0.94 |
||||
PG |
0.87 |
||||
VF |
0.81 |
||||
GL |
0.80 |
||||
GR |
0.76 |
||||
LG |
0.71 |
||||
EF |
0.59 |
||||
AG |
0.54 |
||||
GH |
0.53 |
||||
DG |
0.39 |
||||
VG |
0.16 |
||||
EG |
0.10 |
استخراج، شناسایی و مطالعه بر روی ترکیبات زیست فعال از منابع متعدد گیاهی (1) و جانوری (2) موضوع نسبتا جدیدی در زیست شناسی کاربردی و استفاده از موجودات زنده برای دستیابی به ترکیبات مفید در پیشگیری و درمان بیماریها، تولید مکملهای غذایی و مواد آرایشی بهداشتی میباشد.
در این مطالعه زیرواحدهای بزرگ و کوچک پروتئین روبیسکو در ریزجلبکهای Dunaliella salina، Spirulina وHaematococcus pluvialis که بطور معمول بهعنوان غذای اولیه انسان مورد استفاده قرار نمیگیرند، بررسی شده است. همترازی توالی زیرواحد روبیسکو در ریزجلبکها در پایگاه UniProt نشان داد که زنجیرههای بزرگ اکثراً یکسان هستند (78% همسانی توالی). با این حال، زنجیرههای کوچک دارای نواحی کمتر محافظت شده با 21% شباهت هستند. این تفاوتها میتواند منجر به ایجاد پپتیدهای متنوع بیشتری شود (شکل 2).
جدول1، میزان وقوع پپتیدهای فعال پنهان در زیر واحدهای روبیسکو را برای فعالیتهای زیستی انتخاب شده نشان میدهد. بیشتر پپتیدهای موجود در زیر واحدهای بزرگ و کوچک ریزجلبکها و پروتئینهای مصرفی روزانه دارای قابلیت مهارکنندههای ACE و Dipeptidyl peptidase 4 بودند.
شکل 2 - همترازی زیرواحد بزرگ (الف) و کوچک (ب) روبیسکو در 3 ریزجلبک Dunaliella salina، Spirulina وHaematococcus pluvialis.
زیرواحدهای بزرگ روبیسکو در ریزجلبکها در مجموع دارای ارزش مهارکننده ACE بیشتر از گلوبولین سویا و آلبومین تخممرغ و میوزین گاو، اما کمتر از کازئین و بتالاکتوگلوبولین هستند، که دارای ارزش بالاتری از A در مقایسه با سایر پروتئینهای غذایی میباشند. علاوه بر این، فرکانس وقوع پپتیدهای مهار کننده ACE در زنجیره بزرگ پروتئین روبیسکو ریزجلبکها عمدتاً مشابه بودند، که انتظار میرفت با توجه به ساختارهای اولیه بسیار همولوگ آنها باشد. این در حالی است که زیر واحدهای کوچک روبیسکو تفاوت قابل توجهی در ارزش A خود داشتند و در این خصوص زیر واحد کوچک پروتئین روبیسکو ریزجلبک Spirulina بهترین چشمانداز و Dunaliella salina کمترین مقدار را بهعنوان منبع پپتیدهای مهار کننده ACE نشان دادند، هر چند ارزش A زیرواحدهای کوچک ریزجلبکها بسیار قابل مقایسه با سایر پروتئین های غذایی ارزیابی شده بجز بتا کازئین و بتا لاکتوگلوبولین هستند. آنزیم ACE فشار خون را در سیستم رنین- آنژیوتانسین تنظیم میکند (42). این آنزیم نقش مهمی در آسیبشناسی بیماریهای قلبی عروقی دارد. مهارکنندههای ACE میتوانند با جلوگیری از تولید آنژیوتانسین II، منقبضکننده قدرتمند عروق و افزایش قدرت عمل گشادکنندگی عروق Bradykinin، فشار خون بالا را به طور بالقوه کاهش دهند (24). پپتیدهای دارای فعالیت بازدارنده ACE توسط هیدرولیز آنزیمی از عصاره پروتئینی Spirulina در چندین مطالعه استخراج و مورد بررسی قرار گرفتند (14 و 42)، برای مثال نتایج آزمایشاتSuetsuna و همکارانش بر روی مصرف خوراکی پروتئین Spirulina platensis توسط موشهایی که فشار خون خود به خودی بالا داشتند، فعالیت پپتیدهای ضد فشارخون مشتق شده از این پروتئین را نشان داد (42). همچنین نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل silico in مطالعات به فعالیت پپتیدهای ضد فشارخون بالا مشتق شده از پروتئین روبیسکو Spirulina و سایر ریزجلبکها اشاره میکنند (35). نتایج مطالعه ما نشان داد زیر واحد بزرگ و کوچک هر سه ریزجلبک Dunaliella salina، Spirulina، Haematococcus pluvialis دارای پپتیدهای ضد فشار خون بالا هستند، حتی حضور تری پپتید مشهور ضد فشار خون بالاIle-Pro-Pro و Val-Pro-Pro (27 و 39) موجود در زیر واحد بزرگ Dunaliella salina (Val-Pro-Pro 48-50) و Haematococcus pluvialis (Val-Pro-Pro 48-50) و همچنین (Ile-Pro-Pro 144-146) و Spirulina (Val-Pro-Pro 49-51) مشاهده شد. لذا میتوان نتیجه گرفت، استفاده از پروتئین روبیسکو ریزجلبکها روش دیگری برای تولید پپتیدهای ضد فشار خون بالا ارائه میدهد، در نتیجه، تأکید زیاد بر پیشسازهای پروتئینی گران قیمت مانند بتا کازئین شیر، که همچنان ماده اولیه محبوب تولید لاکتو تری پپتیدهای ضد فشار خون بالا است را کاهش میدهد.
زیر واحد کوچک روبیسکو ریزجلبکها به طور کلی مقدار بالاتری از A نسبت به زیر واحدهای بزرگ برای پپتیدهایی با خاصیت مهارکنندگی DPP-4 نشان دادند (جدول1). در واقع، فراوانی وقوع پپتیدهای مهار کننده DPP-4 در زیرواحدکوچک روبیسکو Haematococcus pluvialis بیشتر از پروتئینهای گیاهی و حیوانی است که مورد ارزیابی قرار گرفتهاند (به جز کازئین). کازئین و گلوبولین سویا در سبد غذایی پروتئینهای روزمره دارای بیشترین فراوانی پپتیدهای مهار کننده DPP-4 با مقادیر A به ترتیب 8430/0 و 6628/0 محاسبه شد و با یک مقایسه طبق جدول1 مقادیر بدست آمده برای روبیسکو پروتئینهای ریزجلبکها را میتوان اعداد بالایی در نظر گرفت. همان طور که برای خاصیت مهار ACE مشاهده شد، تفاوت قابل توجهی در مقادیر A برای زنجیره بزرگ روبیسکو وجود نداشت و آنها پتانسیل بهتری برای پپتیدهای مهار کننده DPP-4 نسبت به پروتئین آلبومین تخممرغ و میوزین دارند. DPP-4 یک سرین پروتئاز است که دی پپتیدهای موجود در انتهایN ترمینال سوبسترا را در بخشهای دارای Pro وAla ، Xaa-Pro و Xaa-Ala میشکافد (9 و 21). این آنزیم واسطه غیر فعال شدن شبه گلوکاگون پپتید -1 (GLP-1) و پلیپپتید بازدارنده معده (GIP) میشود. هر دو این هورمونهای اینکرتینی، ترشح انسولین را افزایش میدهند و تحمل گلوکز را بهبود میبخشند (13 و 25). مهار DPP-4 نیمه عمر GLP-1 و GIP را در بدن افزایش میدهد، منجر به افزایش ترشح انسولین و بهبود تحمل گلوکز میشود (7 و 26). همچنین غذای حاوی پروتئین با مهارکنندههای DPP-4 میتواند رژیم مناسبی برای بیماران مبتلا به دیابت باشد. بنابراین، پپتیدهای مهارکننده DPP-4 میتوانند ساختارها و عملکردهای GLP-1 و GIP را حفظ کرده و عوامل عملکردی امیدوار کنندهای برای درمان دیابت نوع 2 در نظر گرفته شوند (25 و 32). باتوجه به جدول1، فراوانی بالای وقوع پپتیدهای مهار کننده DPP-4 در توالی روبیسکو ریزجلبکها، بستر امیدوارکنندهای را برای تولید عوامل ضد دیابت قوی مبتنی بر پپتید فراهم میکند.
در مورد فعالیت آنتیاکسیداتیو، زیر واحدهای بزرگ روبیسکو در Dunaliella salina، Spirulina، Haematococcus pluvialis با وجود شباهت توالی زیاد، به ترتیب مقادیر A 0842/0 ، 0924/0 و 0903/0 را نشان میدهند، ممکن است این موضوع نشان دهنده 22 درصد مناطق متفاوت اسیدآمینه های کدکننده آنتیاکسیدان موجود در زنجیره بزرگ باشد که سبب بروز این تفاوت شدهاند (جدول1). به طور کلی، پپتیدهایی با وزن مولکولی کم و دارای اسیدآمینههای آبگریز و آروماتیک در ساختار خود دارای فعالیت آنتیاکسیدانی بهتری هستند، لذا نوع اسیدهای آمینه موجود در توالی پپتیدها تأثیر عمدهای بر فعالیت آنها دارد (43). بهعنوان مثال مشخص شد که اسیدهای آمینه آبگریز با گروههای غیرقطبی آلیفاتیک به طور موثر رادیکالها را در غذاهایی با محتوی لیپید بالا از بین میبرند، لذا سبب افزایش قدرت آنتیاکسیدانی پپتید میشوند (29). همچنین نتایج یک آزمایش نشان داد حضور پرولینها (هرچه بیشتر، بهتر) به افزایش فعالیت آنتیاکسیدانی پپتید کمک میکند (17) و یا بررسیهای Udenigweو همکارانش مبین آن بود که وجود باقیماندههای Pro و Met به شدت در رتبهبندی قدرت آنتیاکسیدانی پپتیدهای پنهان توالی زیر واحد بزرگ پروتئین روبیسکو در غلات تاثیرگذار است (39)، در مطالعه ما با مقایسه توالی زنجیره بزرگ پروتئین روبیسکو مشاهده شد باقیماندههای 142Pro و 116Met در Spirulina و Haematococcus pluvialis جایگزین اسیدآمینههای سرین و لوسین در Dunaliella salina شدند (شکل2) و احتمالاً این نتایج مبین اختلاف مقادیر A در Dunaliella salina با Spirulina و Haematococcus pluvialis در خاصیت آنتیاکسیداتیو باشد. مشابه بررسی فعالیت مهارACE، زیر واحدهای کوچک به طور کلی مقادیر کمتری از A را برای پپتیدهای آنتیاکسیدانی نسبت به زنجیرههای بزرگ نشان میدهند (جدول1).
پروتئولیز با واسطه یوبیکویتین از آنجا که در چندین فرایند سلولی مانند تنظیم چرخه سلولی، پاسخ سلولی به استرس خارجی، تعدیل گیرندههای سطح سلول و کانالهای یونی، ترمیم DNA، تنظیم پاسخهای ایمنی و التهابی و تشکیل سلولهای اندامک نقش کلیدی دارد، به یک هدف مهم برای انواع بیماریها تبدیل شده است (8). در خصوص الگوی ارزش A برای توانایی فعالسازی پروتئولیز با واسطه یوبیکویتین، زیر واحد بزرگ Haematococcus pluvialis مقادیر بیشتری از A را در مقایسه با سایر ریزجلبکها نشان داد و البته در مقایسه با پروتئینهای رومزه نیز بعد از لاکتوگلوبولین، به ترتیب زیر واحد بزرگ Haematococcus pluvialis و Dunaliella salina چشم انداز بهتری نسبت به سایر پروتئینها داشتند. مقادیر A برای این فعالیت زیستی در Spirulina یافت نشد که میتواند به تعداد محدود پپتیدهای فعال موجود در پایگاه داده نسبت داده شود.
دیپپتیدیلپپتیداز (DPP 3) III یک آنزیم تجزیهکننده مهم انکفالین (یک پنتاپپتید است که در تنظیم درد در بدن نقش دارد) است و مهارکنندههای آن انتظار میرود در مدیریت درد نقش بسزایی ایفا کنند (19). دردهای حاد و مزمن شرایط ناتوان کنندهای هستند و بهبود آنها برای بیماران مبتلا به سرطان و اختلالات عصبی از اولویت بالایی برخوردار است (38). اعصاب انتهای سیستم عصبی مرکزی (CNS) و مدولا آدرنال، برخی از مواد شبیه به مورفین مانند لو-انکفالین و مت-انکفالین را آزاد میکنند. مانند سایر نورو پپتیدها، انکفالینها مولکولهایی با طول عمر کوتاه هستند که پس از آزاد شدن در سیناپس به سرعت هیدرولیز میشوند. درCNS ، چندین پپتیداز در تخریب انکفالین در مکانهای مختلف نقش دارند اما Dipeptidyl peptidase-3 (DPP-III) یکی از مهمترین آنزیمهای تجزیه کننده انکفالین است (30). بنابراین، انتظار میرود که مهارکنندههای DPP-3 باعث طولانی شدن زمان عمل انکفالین شوند (10). در خصوص توانایی مهار آنزیم DPP-3، زیر واحد بزرگ Haematococcus pluvialis بالاترین الگوی ارزش A با فراوانی 1134/0 را نشان داد. همچنین بهنظر میرسد بهترین انتخاب بهعنوان پیشساز پپتیدهای زیست فعال مهارکننده آنزیم DPP-3 در این مقایسه، مختص به زیر واحد بزرگ پروتئین روبیسکو ریزجلبکها باشد (جدول1). در این مطالعه بر اساس یافتهها، به طور کلی روبیسکو موجود درHaematococcus pluvialis بدون در نظر گرفتن نوع فعالیت زیستی و نوع زیر واحد در مقایسه با سایر ریزجلبکها، به نظر میرسد بهترین چشم انداز را بهعنوان پیشساز پپتیدهای زیست فعال بر اساس فراوانی وقوع آنها برای فعالیتهای زیستی درنظر گرفته شده نشان میدهد. البته شایان ذکر است که وقوع توالیهای فعال زیستی در روبیسکو در دسترس بودن آنها را تضمین نمیکند، زیرا پپتیدهای پنهان در ساختار اولیه غیرفعال هستند و برای اعمال عملکردهای بیولوژیکی خود باید آزاد شوند (39).
بیشترین میزان الگوی ارزش A طبق جدول 1برای فعالیتهای ACE inhibitor و Dipeptidyl peptidase 4 inhibitor مشاهده شد. در مرحله بعد، هضم پروتئولیتیک روبیسکو توسط ابزار BIOPEP و آنزیمهای گیاهی: برومولئین، پاپائین و آنزیمهای گوارشی کیموتریپسین، تریپسین، پپسین و آنزیم میکروبی ترمولیزین انجام شد و پارامتر (A=AE/W) A برای هر آنزیم در هر زیر واحد محاسبه و نتایج در جداول 2 و 3 ارائه شده است. طبق تعاریف پایگاه BIOPEP، " W " فرکانس نسبی آزادسازی قطعات با فعالیت داده شده توسط آنزیم های انتخاب شده، "AE " فراوانی انتشار قطعات با فعالیت داده شده توسط آنزیم های انتخاب شده و "A" فراوانی وقوع قطعات زیست فعال در توالی پروتئین است. به طور کلی از میان آنزیمهای بررسی شده، پروتئازهای گوارشی تریپسین و پروتئاز میکروبی ترمولیزین، بیشترین توانایی را در آزادسازی پپتیدهای فعال ضدفشارخون بالا به ترتیب از زیر واحد بزرگ (Dunaliella salina) وکوچک (Spirulina) روبیسکو بر اساس فراوانی وقوع A دارند. در خصوص این فعالیت، به صورت کلی آنزیم تریپسین و آنزیم کیموتریپسین به ترتیب بالاترین و کمترین توانایی را بدون در نظر گرفتن نوع زیرواحد در میان سه ریزجلبک، نشان دادند (جدول2).
یافتهها در خصوص آزادسازی انواع پپتید با فعالیت dipeptidyl peptidase 4 inhibitor توسط 6 آنزیم معرفی شده در جدول3 نشان دهنده این است که به ترتیب در زیرواحد بزرگ (Haematococcus pluvialis) و کوچک (Haematococcus pluvialis) آنزیمهای گوارشی تریپسین و پپسین بیشترین توانایی را از خود نشان دادند. لذا به نظر میرسد آنزیمهای گوارشی تریپسین و پپسین کارآمدترین پروتئازها برای آزادسازی پپتیدهای فعال زیستی ACE inhibitor وdipeptidyl peptidase 4 inhibitor در میان ریزارگانیسمهای مدنظر هستند. همچنین به نظر میرسد قدرت اثر آنزیمها بر زیرواحدهای بزرگ پروتئین روبیسکو و تولید پپتیدهای ضد فشار خون بالا نسبت به زیر واحد کوچک ریزجلبکها بیشتر باشد، این موضوع برای آزادسازی پپتیدهایی با توانایی مهار دی پپتیدیل پپتیداز 4 کاملاً بالعکس مشاهده شد. بنابراین، پردازش روبیسکو ریزجلبکهای مذکور با آنزیمهای تریپسین و پپسین چشماندازهای بهتری در انتشار پپتیدهای زیستی نسبت به سایر آنزیمها نشان داد. البته ممکن است الگوهای برش متنوع شش پروتئاز ارزیابی شده به اندازه کافی گسترده نبودهاند تا همه توالیهای پپتیدی فعال موجود در زیر واحدهای روبیسکو را آزاد کنند.
مشخصات اسیدآمینه پپتیدهای کوچک مسئول فعالیت بیولوژیکی آنها است. همچنین میزان فعالیت توالی پپتیدی به دو عامل اصلی موقعیت اسیدآمینه در توالی پپتیدی و ترکیب آن پپتید بستگی دارد (28). برای بررسی رتبهبندی پپتیدهای زیست فعال گزارش شده از پایگاه Biopep، از آنجایی که دو فعالیت چشمگیر در مقایسه پروتئین روبیسکو ریزجلبکها و پروتئینهای مصرفی روزانه، فعالیت مهارکنندگی ACE و DPP4 گزارش شد (جدول1)، پپتیدهای مربوط به پروتئین بتاکازئین، بتالاکتوگلوبولین و زیر واحد بزرگ پروتئین روبیسکو Dunaliella salina به سبب بالاترین ارزش A در جهت سنجش رتبه پپتیدی برای فعالیت ACE inhibitor انتخاب شدند. همچنین رتبه پپتیدهای مشتق شده از بتاکازئین شیر و زیر واحد کوچک Haematococcus pluvialis بر اساس جدول1، برای فعالیت dipeptidyl peptidase 4 inhibitor انتخاب شدند. به خوبی مشخص شده است که پپتیدهای کوتاه حاوی فنیلآلانین به احتمال زیادی بهعنوان پپتید زیست فعال مهار کننده ACE پیشبینی میشوند. با وجود این حقایق، تعداد گلایسین در توالی پپتیدها با نمره PeptideRanker آن نیز ارتباط بالایی دارد (22، 28 و 34). پس از پروتئولیز پروتئینهای مورد مطالعه در این بخش توسط هر 6 آنزیم برومولئین، پاپائین، کیموتریپسین، تریپسین، پپسین و ترمولیزین، به طور کلی حداکثر رتبه پپتیدهای مهارکننده ACE مشتق شده از پروتئینهای مورد بررسی در توالیهای حاوی فنیلآلانین و گلیسین مشاهده شد. حداکثر نمرات PeptideRanker (99/0) برای پپتیدهای مهارکننده ACE توسط دیپپتیدهای FG وGF وFP نشان داده شد. Dunaliella salina هر دو پپتید FG وGF مهارکننده ACE را نشان داد، درحالی که بتاکازئین تنها پپتیدFP و لاکتوگلوبولین هیچ کدام را نشان نداد. به طور کلی پپتیدهای شامل اسیدآمینههای فنیلآلانین و گلایسن مشتق شده از پروتئین بتالاکتوگلوبولین در مقایسه با Dunaliella salina و بتاکازئین کمتر بودند (جدول های 5 و 6). همچنین بیشترین تعداد پپتیدهای زیست فعال در مقایسه با بتاکازئین و بتا لاکتوگلوبولین مربوط به Dunaliella salina بود (جدول5). نتایج Chia-Ling Jao و همکارانش نشان داد که فعالیت مهاری DPP-4 پپتید ها توسط ترکیب و ترتیب اسیدهای آمینه به جای طول آنها تعیین میشود (18). همچنین از مقالات چنین استنباط میشود که پپتیدهای موثر دارای فعالیت dipeptidyl peptidase 4 inhibitor حداقل دارای یک اسیدآمینه پرولین در توالی خود (عمدتاً در انتهای N ترمینال) هستند (3). در جدول5 و جدول6 پپتیدهای پروتئولیز شده با 6 آنزیم مورد مطالعه از زیر واحد بزرگ روبیسکو Haematococcus pluvialis و پروتئین بتاکازئین برای بررسی رتبهبندی پپتید جمع آوری شدند. بر این اساس حداکثر نمرات PeptideRanker (99/0) برای پپتیدهای مهار کننده DPP4 توسط دی پپتیدهای FP وFP نشان داده شد. همچنین در بعضی مقالات مشخص شد که پپتیدهایی با خاصیت مهار DPP4، در توالی خود عمدتاً از بقایای اسیدآمینههای آبگریز مانند آلانین، گلیسین و پرولین تشکیل شده بودند (15). با توجه به جداول 5 و جدول 6 در این مطالعه نیز مشخص شد حضور سایر اسیدآمینههای آبگریز مانند والین، متیونین، لیزین، لوسین و ایزولوسین در توالی یک پپتید میتواند قدرت مهارکنندگی DPP4 آن را مانند ,PM(0.95) PPL(0.89), PG(0.87) AP(0.62) افزایش ببخشد. از آنجا که مطالعات این بخش به طور کامل بر دادههای موجود در مورد توالیهای پپتیدی مهاری DPP-4 در زیرواحد کوچک روبیسکو Haematococcus pluvialis و پروتئین بتاکازئین وفعالیت ضد ACE در کازئین و لاکتوگلوبولین و زیرواحد بزرگ روبیسکو Dunaliella salina متکی بود، ممکن است قطعات دیگر از پروتئینهای دیگر مورد مطالعه، فعالیت بازدارندگی بهتری را ارائه بدهند. علاوه بر این، توالیهای پپتیدی احتمالی باید از پروتئینهای مادر آزاد شوند تا فعال شوند. لذا تجزیه و تحلیلIn silico برای پیشبرد هدف طراحی پپتیدهای فعال مطلوب ضد ACE و یا ضد DPP-4 در فضای آزمایشگاهی از پروتئین های انتخابی با بازدهی بهتر مفید خواهد بود.
همچنین جدول 4، مشخصات اسیدآمینههای تشکیل دهنده زیرواحد بزرگ و کوچک پروتئین روبیسکو ریزجلبکهای انتخاب شده را با استفاده از ابزارProtParam مشخص میکند و توسط این ابزار آنلاین، ترکیب 22 اسیدآمینه مورد بررسی قرار گرفت. نتیجه این مطالعه نشان داد که گلایسین فراوانترین اسیدآمینه موجود در زیر واحد بزرگ پروتئین روبیسکو هر سه ریزجلبک مورد مطالعه است و به طور کلی این زیر واحد به ترتیب سرشار از اسیدآمینههای گلایسین، آلانین، لوسین، والین، ترئونین، اسیدگلوتامیک، آرژنین و آسپارتیکاسید است. با این حال آلانین در Dunaliella salina و Haematococcus pluvialis و لوسین در Spirulina، فراونترین اسیدآمینههای موجود در زیر واحد کوچک بودند. تفاوت چشمگیر مقدار اسیدآمینههای گوناگون تاییدی بر حضور نواحی کمتر محافظت شده در زیر واحدکوچک نسبت به زیر واحد بزرگ ریز جلبکها است. وزن مولکولی زیرواحد بزرگ در Dunaliella salina، Spirulina و Haematococcus pluvialis به ترتیب تقریباً 52، 53 و52 کیلو دالتون مشاهده شد. زیرواحدهای کوچک با وزن مولکولی کمتر به سبب کمتر بودن طول توالی به ترتیب تقریباً 13، 21 و 20 کیلو دالتون گزارش شدند. مقادیرPi، پروتئین روبیسکو زیر واحد کوچک Dunaliella salina و Haematococcus pluvialis در pH قلیایی و بقیه موارد در pH اسیدی پیشبینی میشوند.
برای پیشبینی ویژگیهای مختلف فیزیکوشیمیایی پپتیدهای جدول 6، از پایگاه pepcalcاستفاده شد. وزن مولکولی پپتیدهای مهارکننده ACE از پروتئینهای بتاکازئین، بتالاکتوگلوبولین و زیرواحد بزرگ روبیسکو Dunaliella salina از g/mol14/146 تا g/mol 9/747 بود.
به طور کلی پپتیدهای مهارکننده ACE حاوی وزن مولکولی تقریباً300 و بیشتر نقطه ایزوالکتریک قلیایی را نشان دادند. با این حال، پپتیدهای با وزن مولکولی تقریباً 200 و کمتر نقطه ایزوالکتریک اسیدی را نشان دادند. نتایج این بخش نشان میدهد که اکثر پپتیدهای مهارکننده ACE دارای وزن مولکولی پایینی هستند. نقاط ایزوالکتریک پیشبینی شده پپتیدهای مهارکننده ACE در محدودهpH (68/0 تا 9/10 ) قرار دارند (جدول7).
جدول 7 - پیش بینی ویژگی های فیزیکوشیمیایی، سمیت پپتیدهای با قابلیت مهار AEC (http:// pepcalc.com/)
Proteins |
Peptides |
Molecular weight (g/mol) |
Isoelectric point ph |
Net charge at ph 7 |
Estimated solubility |
Toxicity prediction |
Bovine beta casein |
FP |
262.3 |
3.57 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
AF |
236.27 |
3.77 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
MG |
206.27 |
3.37 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
PG |
172.18 |
4.06 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
GPFPIIV |
741.92 |
3.65 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
LGP |
285.34 |
3.82 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
EMPFPK |
747.9 |
6.85 |
0 |
Good water solubility |
Non-Toxin |
|
FPPQS |
574.63 |
3.48 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
VRGP |
427.5 |
10.81 |
1 |
Good water solubility |
Non-Toxin |
|
Bovine beta lacto globulin
|
SF |
252.27 |
3.43 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
FDK |
408.45 |
6.39 |
0 |
Good water solubility |
Non-Toxin |
|
MKG |
334.44 |
9.88 |
1 |
Good water solubility |
Non-Toxin |
|
AG |
146.14 |
3.69 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
IPAVFK |
673.84 |
10.14 |
1 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
GLDIQK |
672.77 |
6.63 |
0 |
Good water solubility |
Non-Toxin |
|
large subunit RuBisCO Dunaliella salina
|
GF |
222.24 |
3.37 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
FG |
222.24 |
3.37 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
FR |
321.37 |
10.9 |
1 |
Good water solubility |
Non-Toxin |
|
AF |
236.27 |
3.77 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
DF |
280.28 |
0.76 |
-1 |
Good water solubility |
Non-Toxin |
|
PG |
172.18 |
4.06 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
VF |
264.32 |
3.67 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
GL |
188.22 |
3.63 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
GR |
231.25 |
10.84 |
1 |
Good water solubility |
Non-Toxin |
|
LG |
188.22 |
3.62 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
EF |
294.3 |
0.99 |
-1 |
Good water solubility |
Non-Toxin |
|
AG |
146.14 |
3.69 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
GH |
212.21 |
7.81 |
0.1 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
DG |
190.15 |
0.68 |
-1 |
Good water solubility |
Non-Toxin |
|
VG |
174.2 |
3.59 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
EG |
204.18 |
0.9 |
-1 |
Good water solubility |
Non-Toxin |
حلالیت، که عمدتاً به حلالیت آبی برای پپتیدها اشاره دارد، نیز مهم است. لذا هنگام ارزیابی پپتیدها، باید مورد توجه قرار گیرد. این ویژگی بر جذب، توزیع و حذف پپتیدها در بدن تاثیر میگذارد. همچنین، گزارش شده است که حلالیت ضعیف ترکیبات ممکن است سمیت و سایر عوارض جانبی آنها را پنهان کند (5). از این رو، مسئله حلالیت برای کشف یک ماده عملکردی و همچنین پپتیدهای زیست فعال اساسی است. در خصوص این مهم، به طور کلی پپتیدهای مهارکننده ACE در نقطه ایزوالکتریک قلیایی حاوی حلالیت خوبی در آب بودند، در حالی که نقطه ایزوالکتریک اسیدی حاوی پپتیدهایی با حلالیت کمتر در آب بود (جدول7). وزن مولکولی پپتیدهای مهارکننده DPP4 از پروتئینهای بتاکازئین و زیرواحدکوچک پروتئین روبیسکو Haematococcus pluvialis از 18/172 تا 91/777 گرم برمول گزارش شد. جدول8 نشان میدهد که اکثر پپتیدها دارای وزن مولکولی پایینی هستند (در مجموع سبک ترین پپتیدهای مهارکننده ACE) بهطور کلی پپتیدهای مهارکننده DPP4 همگی نقطه ایزوالکتریک اسیدی را نشان دادند. همچنین کلیه پپتیدها در نقطعه ایزوالکتریک اسیدی حلالیت کمی را در آب از خود نشان دادند (جدول8).
جدول 8 - پیش بینی ویژگی های فیزیکوشیمیایی، سمیت پپتیدهای با قابلیت ضد DPP4 (http:// pepcalc.com/)
Proteins |
Peptides |
Molecular weight (g/mol) |
Isoelectric point ph |
Net charge at ph 7 |
Estimated solubility |
Toxicity prediction |
Bovine beta casein
|
PF |
262.3 |
4.15 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
FP |
262.3 |
3.57 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
PP |
212.25 |
4.26 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
PG |
172.18 |
4.06 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
PL |
228.29 |
4.08 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
PQNIPPL |
777.91 |
4.08 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
LP |
228.29 |
3.82 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
YP |
278.3 |
3.53 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
VP |
214.26 |
3.76 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
PV |
214.26 |
4.1 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
Small subunit RuBisCO Haematococcus pluvialis |
PM |
246.33 |
4.16 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
PPL |
325.4 |
4.08 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
AP |
186.21 |
3.88 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
|
PA |
186.21 |
4.07 |
0 |
Poor water solubility |
Non-Toxin |
سمیت پپتیدهای مهارکننده ACE ممکن است از توسعه مصرف پپتیدهای فعال بهعنوان مواد غذایی مفید جلوگیری کند (12). در این مطالعه، پپتیدهای مهارکننده ACE از پروتئینهای گیاهی و جانوری مشتق شدهاند و آنزیمهای مورد استفاده برای انتشار این پپتیدها از منابع گیاهی یا حیوانی و میکروبی به دست میآید که اغلب در چندین صنایع فرآوری مواد غذایی بدون هیچ گونه خطری برای سلامتی که قبلاً گزارش شده است، مورد استفاده قرار میگیرد. پپتیدهای با وزن مولکولی پایین غیرسمی هستند و در مقایسه با پروتئینهای native خود حساسیت کمتری دارند (23 و 31). در مطالعه حاضر نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل ToxinPred پیشبینی کرد که پپتیدهای مهارکننده ACE غیرسمی هستند (SVMscores <0) (جدول 7). والین، ترئونین، آرژینین، گلوتامین، متیونین، لوسین، لیزین، ایزولوسین، فنیلآلانین و آلانین اجزای اولیه پپتیدهای غیرسمی هستند (12). پپتیدهای مهارکننده ACE مشتق از بتاکازئین، بتالاکتوگلوبولین و زیرواحد بزرگ روبیسکو Dunaliella salina حاوی بقایای اسیدهایآمینه هستند که معمولاً در پپتیدهای غیرسمی یافت میشوند. همچنین با توجه به جدول8، تمامی پپتیدهای مهارکننده DPP4 نیز غیرسمی گزارش شدند. بنابراین، این پپتیدها میتوانند بهعنوان گزینه مناسبی در سنتز غذایی یا دارویی و عملکردی برای مصارف انسانی، در شرایط آزمایشگاهی و غیره باشند، البته این محصولات باید بیشتر بررسی شده و از دستور العملهای بین المللی خاصی پیروی کنند (23).
بر اساس تجزیه و تحلیل in silico پروتئین روبیسکو ریزجلبکها، میتوان نتیجه گرفت که زیر واحدهای کوچک و بزرگ دارای چشم اندازهای خوبی بهعنوان پیشساز پپتیدهای فعال زیستی در مقایسه با پروتئینهای غذایی معمول مصرف شده، به جز پروتئینهای شیر هستند (البته در خصوص dipeptidyl peptidase 4 inhibitor ریزجلبکها حتی از پروتئینهای شیر هم کارآمد تر بودند). ریزجلبکها با توجه به پایداری و فراوانی طبیعی RuBisCO، برای تولید و استخراج پپتیدهای زیستفعال چشمانداز بسیار مناسبی هستند که وابستگی شدید به پروتئینهای معمولی گرانقیمت را کاهش میدهد. پروتئازهای گوارشی پپسین و تریپسین بهترین پتانسیل را برای استخراج و آزادسازی توالیهای فعال زیستی پنهان از روبیسکو در خصوص فعالیتهای بررسی شده نشان دادند. بهویژه اگر محصولی متشکل از پپتیدهای حاصل از روبیسکو هر سه ریزجلبک تهیه شود، مکمل بسیار با ارزش و کارآمدی در راستای بهره گیری از اثرات فیزیولوژیک آنها خواهد بود. پپتیدهای حاصل از اثر آنزیمها دارای عملکردهای بیولوژیکی مربوط به مدیریت و درمان بیماریهای انسانی، مانند دیابت، بیماریهای قلبی عروقی، کنترل درد و بیماریهای عصبی هستند. زیر واحد بزرگ روبیسکو میزان همولوژی بالاتری را نسبت به زیر واحد کوچک از خود نشان میدهد و ممکن است تفاوتهای قابل توجه در زنجیره کوچک، باعث ایجاد پروفایل پپتیدهای زیستفعال منحصر به فرد هر ریزجلبک باشد. این یافتهها، لزوم مطالعات بیشتر تجربی برای بررسی کشت و پرورش ریزجلبکها بهعنوان منابع روبیسکو و پپتیدهای زیست فعال (جهت تولید مواد مغذی مبتنی بر پپتید برای مصرف و سلامت انسان) را آشکار میکند.
1- خواجه پور زاوه ع, آسوده ا, نادری منش ح. استخراج و شناسایی یک پپتید فعال زیستی جدید حاصل از هیدرولیزات کرم سفید ریشه. پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران). 2021.
2- زرندی میاندوآب ل, زاده حسینقلی ا. تجزیه و تحلیل آماری پپتیدهای ضدسرطان گیاهی با استفاده از محیطR. پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران). 2018;31(3):312-24.