تأثیر فاکتورهای القایی مختلف رشد بر توان رشد، کلون­زایی و الگوی ژنتیکی سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی ماهی آزاد دریای خزر در شرایط آزمایشگاهی

سمانه پورسعید¹، محمد رضا کلباسی^1*، سیده نفیسه حسنی²، گرو یوشیزاکی³ و حسین بهاروند^2*

¹ ایران، نور، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم دریایی و منابع طبیعی، گروه شیلات.

² ایران، تهران، پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و فناوری سلولهای بنیادی جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات علوم سلولی، گروه سلولهای بنیادی و زیست شناسی تکوینی.

³ ژاپن، توکیو، دانشگاه علوم دریایی و تکنولوژی توکیو، گروه زیست شناسی دریا.

تاریخ دریافت: 30/07/1398          تاریخ پذیرش: 24/02/1399

چکیده

کشت سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی در شرایط آزمایشگاهی، منابع با ارزشی را برای انجام مطالعات پایه­ای و کاربردی در زمینه بیوتکنولوژی تولیدمثل فراهم می کند. لذا، این مطالعه با هدف بررسی اثر فاکتور­های مختلف رشد بر میزان تکثیر، کلون­زایی و بیان برخی از ژنهای اختصاصی­ سلولهای اسپرماتوگونی ماهی آزاد دریای خزر در شرایط آزمایشگاهی انجام پذیرفت. سلولهای اسپرماتوگونی پس از جداسازی از بافت بیضه بچه ماهیان آزاد دریای خزر با استفاده از روش هضم آنزیمی و تخلیص از طریق حذف تمایزی، به مدت چهارده روز در محیط کشت حاوی ترکیبی از فاکتورهای مختلف رشد (bFGF، GDNF، IGF-I، EGF و LIF) کشت یافتند. مساحت کلونیها در روز چهاردهم در هر گروه اندازه­گیری شد. از رنگ­آمیزی ایمنوفلورسنت برای بررسی کیفی و کمی نشانگر DDX4/VASA در بین گروههای مختلف استفاده گردید. همچنین بیان ژنهای Vasa و Gfrα1 در گروههای مختلف اندازه گیری شدند. اندازه کلونیهای اسپرماتوگونی در گروهی که تحت تاثیر چهار فاکتور رشد (bFGF+GDNF+IGF-1+EGF) قرار داشتند، از سایر گروهها بالاتر بود (001/0>P). با این وجود، در حضور LIF، اثر معنی داری بر روی تکثیر سلولهای اسپرماتوگونی مشاهده نشد. رنگ­آمیزی ایمنوفلورسنت نشان داد که کلونیهای سلولی در گروههای مختلف برای نشانگر DDX4/VASA مثبت بودند و به جز گروه LIF اختلاف معنی­داری در بین سایر گروهها مشاهده نشد (05/0<P). اختلاف معنی داری در سطح بیان ژنهای Vasa و Gfrα1 بین گروههای مختلف آزمایشی مشاهده نشد (05/0<P). بر اساس نتایج حاضر به نظر می­رسد افزودن فاکتورهای مختلف رشد نوترکیب انسانی اثر معنی­داری بر تکثیر سلولهای اسپرماتوگونی ماهی آزاد دریای خزر در شرایط آزمایشگاهی نداشته باشد.

واژه­های کلیدی: سلول زایای نر، فاکتور رشد، کشت in vitro، بیان ژن، Salmo caspius.

* نویسندگان مسئول، تلفن:  09124921752  ، پست الکترونیکی: mkalbassi@gmail.com و baharvand@royaninstitute.org

مقدمه

سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی پایه و اساس فرآیند اسپرماتوژنز و باروری در ماهیان نر هستند. این سلولها با پتانسیل ویژه خودنوزایی و تمایز به سایر رده­های سلولهای زایا، تنها سلولهای بنیادی بزرگسالان در بدن هستند که قادرند اطلاعات ژنتیکی را از نسلی به نسل دیگر منتقل کنند. استفاده کاربردی از ویژگیهای این سلولها برای نخستین بار توسط Brinster و همکارانش (4) بر روی موش ارائه شد که با پیوند تعلیق سلولی از موش هتروژنوس به لوله­های منی ساز موش عقیم، منجر به اسپرم­زایی در موش پذیرنده پیوند شدند. موفقیت در پیوند سلولهای اسپرماتوگونی در جوندگان باعث شد که کاربرد آن در سایر علوم از جمله آبزی­پروری مورد توجه قرار گیرد (7، 8، 19، 26، 27 و 28). به طوری که امروزه این سلولها منبع ارزشمندی جهت مطالعات بیولوژیکی فرآیند اسپرم زایی، حفظ ذخایر ژنتیکی گونه­های کمیاب و تولید حیوانات تراریخته از طریق دستورزی ژنتیکی سلولهای زاینده محسوب می­شوند (3، 6، 11 و 35). با این وجود، استفاده از سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی به دلایلی چون تعداد بسیار کم آنها در بافت بیضه و نبود نشانگر­های اختصاصی سطحی برای شناسایی و جداسازی امری دشوار است (17، 20، 22). بنابراین، بکارگیری روشهایی که بتوان این سلولها را به طور خالص و به میزان زیاد تهیه کرد همواره مورد توجه بوده است. اولین قدم برای استفاده از این سلولها دستیابی به یک سیستم کشت بهینه است که در آن سلولها به میزان زیادی تکثیر یافته و به صورت تمایز نیافته باقی بمانند.

در بافت بیضه سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی کاملاً توسط سلولهای سرتولی احاطه شده اند که علاوه بر حمایت فیزیکی و تغذیه­ای، با ترشح بسیاری از عوامل رشد و سایتوکاین­ها تعادل بین تکثیر و تمایز سلولهای بنیادی را تنظیم می­کند (5 و 30). به همین منظور محققین در گونه­های مختلف اثر عوامل مختلف رشد را به صورت مجزا و یا ترکیبی بر حفظ و تکثیر سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی مورد بررسی قرار داده­اند. از جمله فاکتوری که به صورت پاراکرین و یا اتوکرین بر عملکرد سلولهای زایا موثر است و باعث فعال شدن مسیر­های پیام­رسان داخل سلولی می­شود می­توان به فاکتور رشد فیبروبلاستی (FGF) اشاره کرد که به عنوان یک فاکتور میتوژن توسط بسیاری از سلولهای بافت بیضه تولید می شود (18). مطالعات انجام شده بر روی قزل­آلای رنگین­کمان و گورخر ماهی نشان داده است که افزودن bFGF به محیط کشت، خودنوزایی سلولهای اسپرماتوگونی را افزایش می دهد (9، 21، 31). یکی از فاکتور های مهم دیگر در تکثیر و بقای سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی، فاکتور نوروتروفیک مشتق از دودمان سلولی گلیالی (GDNF) می باشد که با اتصال به گیرنده های  اختصاصی خود (Gfrα و گیرنده تیروزین کیناز) در سطح سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی باعث پاسخهای درون سلولی می­شود (10 و 23). مطالعه انجام شده بر روی موش نشان داده است که در غیاب GDNF، سلولهای اسپرماتوگونی مسیر تمایزی را پیش می گیرند، درحالی که مقادیر زیاد به خودنوزایی این سلولهای بنیادی کمک می‍کند (23). علاوه بر عوامل فوق الذکر، فاکتور رشد شبه انسولینی (IGF) که از پروتئینهای تنظیمی محسوب می شود نیز قادر است رشد، تمایز و بقای سلولها را در بافتها مختلف از جمله بافت بیضه تنظیم کند (2، 30). Kawasaki و همکارانش (15) با مطالعه بر روی کشت سلولهای اسپرماتوگونی گورخر ماهی نشان دادند که IGF-I در ترکیب با bFGF و GDNF تکثیر سلولهای مذکور را افزایش می­دهد. یکی دیگر از عوامل رشد، فاکتور رشد اپیدرمی (EGF) است که باعث تقسیم سلولهای اسپرماتوگونی شده و فرآیند تولید استروئید، شکل گیری اسپرم، تقسیم سلولهای لیدیگ و فعالیت سلولهای سرتولی را به دو شکل اتوکرین و یا پاراکرین تنظیم می کند (29). اطلاعات اندکی از اثرات EGF بر میزان تکثیر و بقا سلولهای اسپرماتوگونی ماهیان در دسترس است که در این مورد می­توان به بررسیهای انجام شده بر روی قزل­آلای رنگین­کمان و گورخرماهی اشاره کرد (15، 21 و 32). فاکتور مهار کننده لوکمیا (LIF) یک سایتوکین با اثرات چندگانه تنظیمی بر روی انواع مختلف بافتها و سلولها ا‌ست که به منظور القاء تکثیر و افزایش توان زیستی سلولهای بنیادی به محیط­ کشت اختصاصی افزوده می­شود (12-11، 36). اثرات مثبت LIF در خودنوزایی و حفظ بقای سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی گورخرماهی گزارش شده است (37). با این وجود، افزودن LIF نوترکیب قزل­آلای رنگین­کمان به محیط کشت، اثری بر تکثیر و زنده­مانی سلولهای اسپرماتوگونی قزل­آلای رنگین­کمان نداشت (32). علی­رغم مطالعات انجام شده، هنوز اطلاعات اندکی از محیط کشت مناسب برای حفظ و تکثیر سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی ماهی در دسترس است و با توجه به تفاوتهای بین گونه­ای هنوز ابهامات زیادی باقی مانده است.

ماهی آزاد دریای خزر (Salmo caspius) یک گونه بومی و با ارزش از نظر اکولوژی و اقتصادی محسوب می شود که در سالهای اخیر ذخایر آن در دریای خزر به دلیل آلودگی دریاها و منابع آبی، موانع موجود در مسیر مهاجرت از دریا به رودخانه به هنگام تخم ریزی، ورود فاضلابهای شهری به آب رودخانه و همچنین حضور صیادان غیر مجاز در معرض تهدید قرار گرفته است. بنابراین حفاظت از ذخایر ژنتیکی این گونه امری مهم و ضروری است. پیوند سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی و تولید ماهی کایمر، تکنیک نسبتا جدیدی در حوزه حفاظت از ذخایر ژنتیکی ماهیان محسوب می شود که موفقیت آن به میزان زیادی به تعداد سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی در تعلیق سلولی در زمان پیوند بستگی دارد (3، 6). لذا به منظور تکثیر سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی و دستیابی به تعداد قابل ملاحظه از سلولها با هدف نهایی تولید ماهی کایمر،  مطالعه حاضر به بررسی اثر فاکتور­های مختلف رشد (bFGF، GDNF، IGF-I، EGF و LIF) بر میزان رشد، کلون­زایی و الگوی ژنتیکی سلولهای اسپرماتوگونی ماهی آزاد دریای خزر در شرایط آزمایشگاهی می­پردازد.

مواد و روشها

گونه مورد مطالعه: مطالعه حاضر روی 80 قطعه ماهی آزاد نر 8 ماهه (نابالغ) با شاخص گنادوسوماتیک کمتر از 08/0 درصد و میانگین وزنی 2/0 ± 9/5 (میانگین ± خطای استاندارد) گرم و میانگین طولی 1/0 ± 1/9 سانتیمتر انجام شد. آزاد ماهیان مورد استفاده در این مطالعه از مرکز تکثیر و پروش شهید باهنر (کلاردشت، مازندران، ایران) تهیه شدند. ماهیان در پژوهشکده سلولهای بنیادی پژوهشگاه رویان (تهران، ایران) در مخازن پلاستیکی با ظرفیت 200 لیتر با هوادهی دائم نگهداری شدند. در طی این دوره دمای آب به طور پیوسته 10 درجه سانتی گراد بود. ماهیان تحت شرایط نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند. ماهیان در طول نگهداری یک نوبت در روز با استفاده از غذای تجاری فرادانه (شهرکرد، ایران) به صورت دستی غذادهی شدند. 96 ساعت قبل از شروع آزمایش، غذادهی به ماهیان متوقف شد.

جداسازی و کشت سلولهای اسپرماتوگونی: برای جداسازی سلولها، ابتدا ماهیان با دُز بالای روغن گل میخک (باریج، کاشان، ایران) کشته شدند و تحت شرایط استریل بافت بیضه آنها خارج شد. بعد از شستشو با محول بافر فسفات (PBS) حاوی آنتی بیوتیک (پنی سیلین با غلظت 100 واحد به ازای هر میلی لیتر، استرپتومایسین با غلظت 100 میکروگرم به ازای هر میلی لیتر و جنتامایسین با غلظت 10 میکروگرم به ازای هر میلی لیتر)، بافت بیضه در محلول آنزیمی کلاژناز نوع IV (Gibco) با غلظت 2 میلی گرم در لیتر به طور مکانیکی قطعه قطعه شدند. سپس به مدت 6 ساعت در دمای 14 درجه سانتی­گراد انکوبه شدند. جهت هضم بیشتر و جدا کردن سلولها از لوبولها، پس از شستشو با محلول PBS مرحله دوم هضم آنزیمی با تریپسین 25/0 درصد (Invitrogen) به مدت 30 دقیقه تحت همان شرایط انجام شد. سپس با استفاده از محیط کشت Leibowitz’s L-15 (Sigma-Aldrich; L15) حاوی 10 درصد سرم جنین گوساله (FBS, Hyclone™)، آنزیم تریپسین خنثی گردید. سوسپانسیون سلولی حاصل به مدت 5 دقیقه با دور g 300 در دمای 14 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شد. سوسپانسیون سلولی بدست آمده حاوی سلولهای اسپرماتوگونی، سرتولی و فیبروبلاست بود. به منظور تخلیص سلولهای اسپرماتوگونی بنیادی از روش حذف تمایزی استفاده شد (32). تعلیق سلولی حاضر به مدت 48 ساعت در دمای 14 درجه سانتی­گراد در ظروف کشت 48 خانه پوشیده با ژلاتین 1 درصد کشت یافتند. پس از طی زمان انکوباسیون، سلولهای آزاد در تعلیق جمع­آوری و به ظروف جدید 48 خانه پوشیده با ژلاتین 1 درصد انتقال یافتند.

فاکتور­های رشد مورد مطالعه: بعد از جداسازی، سلولها در محیط کشت مخصوص سلولهای اسپرماتوگونی (جدول 1) همراه با فاکتور­های رشد به مدت 14 روز کشت داده شدند. در طی این مدت، تعویض محیط کشت سلولها هر 3 روز یکبار انجام شد.

جدول 1- ترکیبات و غلظت مواد موجود در محیط کشت سلولهای اسپرماتوگونی.

فاکتور­های رشد و غلظتهای مورد استفاده بر اساس تأثیر مثبتی که بر بقا و تکثیر سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی در سایر گونه­­ها داشتند، انتخاب شدند (13، 16 و 25). برای انجام این مطالعه شش گروه آزمایشی (گروه کنترل و گروههای حاوی فاکتور رشد) به شرح ذیل و سه تکرار برای هر گروه در نظر گرفته شد:

1-  گروه کنترل (N): در گروه کنترل محیط کشت فاقد هرگونه فاکتور رشدی بود.

2- گروه bFGF (B): محیط کشت حاوی فاکتور رشد bFGF نوترکیب انسانی (Royan, Iran) با غلظت 10 نانوگرم در میلی لیتر بود.

3- گروه bFGF و GDNF (BG): محیط کشت حاوی دو فاکتور رشد bFGF با غلظت 10 نانوگرم در میلی لیتر و GDNF   نوترکیب   انسانی   (R&D, USA)  با  غلظت  20

نانوگرم در میلی لیتر بود.

4- گروه bFGF، GDNF و IGF-I (BGI): IGF-I نوترکیب انسانی (Royan, Iran) با غلظت 10 نانوگرم در میلی لیتر به ترکیب BG اضافه گردید.

5- گروه bFGF، GDNF، IGF-I و EGF (BGIE): EGF نوترکیب انسانی (Royan, Iran) با غلظت 20 نانوگرم در میلی لیتر به ترکیب BGI اضافه گردید.

6- گروه bFGF، GDNF، IGF-I، EGF و  LIF(BGIEL): LIF نوترکیب موشی (Royan, Iran) با غلظت 1000 واحد در میلی لیتر به ترکیب BGIE اضافه شد.

ارزیابی ریخت­شناسی سلولهای کشت شده و کلون­زایی در سلولهای اسپرماتوگونی: به منظور ارزیابی اثر فاکتور­های رشد، میزان تکثیر سلولهای اسپرماتوگونی با استفاده از ارزیابی کلون­زایی بررسی شد. به این منظور ریخت­شناسی سلولها به صورت روزانه با استفاده از میکروسکوپ معکوس مدل CKX41 (Olympus, Philippines) مجهز به دوربین تصویر برداری مدل DP72 (Olympus, Japan) ارزیابی شد. از کلونیها مشتق شده از سلولهای اسپرماتوگونی تصویر تهیه شد و مساحت کلونیها توسط نرم افزار Photoshop CS5 Adobe اندازه­گیری شد (32).

تأیید ماهیت سلولهای اسپرماتوگونی با روش ایمنوسیتوشیمی: برای تأیید ماهیت سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی، بیان پروتئین سطحی DDX4/VASA که نشانگر اختصاصی سلولهای زایاست، مطابق روش Lacerda و همکاران ارزیابی شد (20). بدین ترتیب که پس از مرحله تثبیت، تسهیل نفوذ پذیری آنتی­بادی و حذف اتصالات غیر اختصاصی، به نمونه­ها آنتی بادی اولیه DDX4/VASA (Rabbit anti-DDX4/VASA; GeneTex, USA) با رقت 300/1 اضافه شد و به مدت 18 ساعت در دمای 4 درجه سانتی­گراد نگهداری شدند. بعد از شستشو، به نمونه­ها آنتی بادی ثانویه (FITC conjugated anti-rabbit IgG; Invitrogen, USA) با رقت 500/1 به سلولها اضافه شد. پس از شستشو، هسته سلولها به مدت یک دقیقه با DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) رنگ آمیزی شد. سپس نمونه­ها با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت معکوس مجهز به دوربین عکسبرداری شدند. عکسهای منتخب توسط Photoshop CS5 Adobe با یکدیگر ادغام شدند. برای تعیین درصد سلولهای مثبت، نواحی مختلف یک پلیت کشت به طور تصادفی انتخاب، عکسبرداری و سپس شمارش شد.  نسبت سلولهای مثبت به کل سلولها به عنوان شاخص مقایسه­ای بین گروههای مختلف انتخاب شد.

بررسی مولکولی سلولهای اسپرماتوگونی با روش Real-Time RT-PCR: بررسی بیان ژنهای اختصاصی سلولهای اسپرماتوگونی (Vasa و Gfrα1) در 14 روز پس از کشت در گروههای مختلف مورد مطالعه انجام شد. RNA از سلولهای کشت یافته (حداقل سه تکرار زیستی برای هر گروه) مطابق دستورالعمل کیتNucleospin® RNA XS  (Macherey-Nagel, Dȕren, Germany) استخراج شد. ساخت cDNA از روی RNA استخراج شده با استفاده از آغازگر هگزامر تصادفی و کیت RevertAidTM H Minus First Strand cDNA synthesis (Thermo Scientific, USA) انجام شد. واکنش Real-Time RT-PCR با cDNA سنتز شده، آغازگر­های پیشرو و معکوس اختصاصی برای هر ژن (جدول 2) و سایبرگرین (Takara, Japan) در طی 40 چرخه با استفاده از دستگاه StepOne Plus thermocycler ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA) انجام شد.  ژن هدف در هر نمونه با ژن مرجع (-actinβ) نرمال سازی شد. بیان ژن در گروه کنترل به عنوان کالیبراتور در نظر گرفته شد. سپس بیان نسبی ژنها با روش ^CTΔΔ-2 محاسبه شد (38).

تجزیه و تحلیل آماری: ابتدا نرمال بودن داده ها با استفاده از آزمونها Shapiro-Wilk و همگنی واریانسها با استفاده از آزمون Levens بررسی شد. برای تجزیه و تحلیل داده­ها از آنالیز واریانس یک طرفه (One-Way ANOVA) و برای مقایسه معنی­داری بین میانگینها، از آزمون چند دامنه Tukey در سطح اعتماد 5 درصد استفاده شد. از نرم افزار SPSS (Chicago, IL, USA, version 15) برای آنالیز آماری داده ها و از Excel (Microsoft, USA, version 10) برای رسم نمودار استفاده شد. داده­های درون متن به صورت میانگین ± خطای معیار (SE) بیان شده­اند.

نتایج

ارزیابی ریخت­شناسی سلولهای کشت یافته: پس از جداسازی سلولها از بافت بیضه طی هضم مکانیکی و دو مرحله هضم آنزیمی، تعلیق سلولی حاصل به مدت 14 روز در محیط کشت حاوی فاکتور­های رشد بر روی بستر ژلاتین کشت یافتند.

جدول 2- مشخصات آغازگر­های طراحی شده جهت بررسی بیان ژنهای Vasa و Gfrα1.

سلولهای سوماتیک عمدتاً با ساختار دوکی شکل و یا ساختار مدور با زوائد سیتوپلاسمی کشیده مشخص بودند. این سلولها به صورت یک لایه به کف پلیت کشت متصل شدند در حالی که سلولهای اسپرماتوگونی با ساختار مدور بر روی سلولهای سوماتیک و یا در لابه­لای آنها قرار گرفتند و کلونی ایجاد کردند (شکل 1). از نظر ریخت­شناسی، افزودن فاکتورهای رشد bFGF و GDNF تأثیر معنی­ داری بر روی روند کشت سلولها نداشت. در حالی که افزودن فاکتور­های رشد IGF و EGF باعث شد که سرعت رشد سلولهای سوماتیک در مقایسه با سایر گروهها افزایش یابد. بررسیها میکروسکوپی نشان داد زمانی که فاکتور رشد LIF به محیط کشت اضافه می­شود رشد سلولها در مقایسه با گروههای دیگر کاهش می­یابد.

شکل 1- کشت اولیه سلولهای اسپرماتوگونی ماهی آزاد دریای خزر تحت تأثیر فاکتور­های رشد 14 روز بعد از جداسازی. N: محیط کشت فاقد فاکتور رشد، B: محیط کشت حاوی bFGF (ng/ml 10)، BG: محیط کشت حاوی bFGF (ng/ml 10) و GDNF (ng/ml 20)، BGI: IGF (ng/ml 10)  به محیط BG اضافه شد، BGIE: EGF (ng/ml 20) به محیط BGI اضافه شد و BGIEL: LIF (U/ml 1000) به محیط BGIE اضافه شد. سر پیکان نشان­دهنده کلونیهای اسپرماتوگونی و پیکان نشان­دهنده سلولهای سوماتیک است. بزرگنمایی 200. مقیاس برابر 50 میکرومتر (تکرار زیستی 6= n).

نتایج حاصل از بررسی کمی کلون­زایی سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی در محیط آزمایشگاهی: با افزودن فاکتورهای مختلف رشد به محیط کشت سایز کلونیهای اسپرماتوگونی افزایش یافت به طوری که بیشترین رشد سلولها در گروه BGIE مشاهده شد که مساحت کلونیها در این گروه تقریباً 5/2 برابر گروه کنترل بود (001/0 >P). با این وجود، افزودن فاکتور رشد LIF به ترکیب BGIE تأثیری بر رشد سلولها نداشت (شکل 2).

شکل 2- اثر فاکتور­های رشد بر توان کلون زایی سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی ماهی آزاد دریای خزر. کنترل: محیط کشت فاقد فاکتور رشد، B: محیط کشت حاوی bFGF (ng/ml 10)، BG: محیط کشت حاوی bFGF (ng/ml 10) و GDNF (ng/ml 20)، BGI: IGF (ng/ml 10)  به محیط BG اضافه شد، BGIE: EGF (ng/ml 20) به محیط BGI اضافه شد و BGIEL: LIF (U/ml 1000) به محیط BGIE اضافه شد. حروف a و b بیانگر اختلاف معنی­دار بین میانگینها در گروههای مختلف کشت است (05/0 >P). ستونهای دارای حداقل یک حرف مشترک فاقد اختلاف معنی دار هستند (05/0 <P). داده­ها به صورت میانگین ± خطای معیار ارائه شده اند (تکرار زیستی 3= n).

نتایج حاصل از ایمنوسیتوشیمی: کلونیهای در گروههای آزمایشی مختلف برای نشانگر­ DDX4/VASA مثبت بودند و پروتئین مذکور در سیتوپلاسم سلولهای اسپرماتوگونی بیان می­شود (شکل 3).

کمی سازی میزان بیان پروتئین DDX4/VASA نشان داد که افزودن فاکتور­های مختلف رشد اثر معنی­داری بر تکثیر سلولهای اسپرماتوگونی نداشت و صرفاً در گروهی که فاکتور رشد LIF افزوده شد اثر منفی بر میزان بیان مشاهده شد به طوری که شدت بیان این پروتئین به نصف کاهش یافت و به طور معنی داری از سایر گروه­های آزمایشی کمتر بود (شکل 4؛ 001/0 >P).

نتایج حاصل از مقایسه بیان ژنهای اختصاصی سلولهای اسپرماتوگونی در گروههای مختلف: با وجود اینکه میزان بیان ژن Vasa در گروه­های فاکتور رشد از گروه کنترل بالاتر بود اما اختلاف معنی داری مشاهده نشد (شکل 5؛ 05/0 <P). روند مشخص و معنی­داری در شدت بیان ژن Gfrα1 در گروه­های مختلف فاکتور رشد مشاهده نشد (05/0 <P). 

بحث

نتایج این مطالعه نشان داد با وجود اینکه سایز کلونیها در گروه تحت تیمار شده با فاکتور رشد ترکیبی BGIE به مراتب بالاتر از سایر گروههای آزمایشی بود، اما اختلاف معنی­داری در میزان بیان ژنهای زایا و میزان بیان پروتئین DDX4/VASA مشاهده نشد.

شکل 3- اثر فاکتور­های رشد بر بیان پروتئین­ DDX4/VASA سلولهای اسپرماتوگونی ماهی آزاد دریای خزر. ستون اول از سمت چپ تصاویر مربوط به رنگ آمیزی با نشانگر­های اختصاصی، ستون دوم تصاویر مربوط به رنگ آمیزی هسته­ای با استفاده از DAPI و ستون سوم از سمت چپ تصاویر تلفیق شده رنگ آمیزی مربوط به نشانگر اختصاصی و DAPI است. ردیف اول: تصاویر گروه کنترل (محیط کشت فاقد فاکتور رشد)، ردیف دوم (B): تصاویر محیط کشت حاوی bFGF (ng/ml 10)، ردیف سوم (BG): تصاویر محیط کشت حاوی bFGF (ng/ml 10) و GDNF (ng/ml 20)، ردیف چهارم (BGI): تصاویر محیط کشت IGF (ng/ml 10) همراه با BG، ردیف پنجم (BGIE): تصاویر محیط کشت EGF (ng/ml 20) همراه با BGI و ردیف ششم (BGIEL): تصاویر محیط کشت LIF (U/ml 1000) همراه با BGIE.. بزرگنمایی 200. مقیاس برابر 50 میکرومتر. (تکرار زیستی 3= n).

شکل 4- اثر فاکتور­های رشد بر میزان بیان پروتئین DDX4/VASA در سلولهای اسپرماتوگونی ماهی آزاد دریای خزر. کنترل: محیط کشت فاقد فاکتور رشد، B: محیط کشت حاوی bFGF (ng/ml 10)، BG: محیط کشت حاوی bFGF (ng/ml 10) و GDNF (ng/ml 20)، BGI: محیط کشت IGF (ng/ml 10) همراه با BG، BGIE: محیط کشت EGF (ng/ml 20) همراه با BGI و BGIEL: محیط کشت LIF (U/ml 1000) همراه با BGIE. حروف a و b بیانگر اختلاف معنی­دار بین میانگینها در گروههای مختلف کشت است (05/0 >P). ستونهای دارای یک حرف مشترک فاقد اختلاف معنی دار هستند (05/0 <P). داده­ها به صورت میانگین ± خطای استاندارد ارائه شده اند (تکرار زیستی 3= n).

شکل 5- اثر فاکتور­های رشد بر بیان ژن Vasa و Gfrα1 در سلولهای اسپرماتوگونی ماهی آزاد دریای خزر. نرمال سازی سطوح بیان بر پایه β-actin به عنوان ژن کنترل داخلی و متعادل سازی بر پایه گروه کنترل (فاقد فاکتور­های رشد) اجرا شد. کنترل: محیط کشت فاقد فاکتور رشد، B: محیط کشت حاوی bFGF (ng/ml 10)، BG: محیط کشت حاوی bFGF (ng/ml 10) و GDNF (ng/ml 20)، BGI: IGF (ng/ml 10)  به محیط BG اضافه شد، BGIE: EGF (ng/ml 20) به محیط BGI اضافه شد و BGIEL: LIF (U/ml 1000) به محیط BGIE اضافه شد. داده­ها به صورت میانگین ± خطای استاندارد ارائه شده اند (تکرار زیستی 3= n).

در مطالعه­ای مشابه بر روی گورخر ماهی، اثرات سینرژیک چهار فاکتور­ رشد نوترکیب انسانی (BGIE) با غلظت 100 نانوگرم در میلی­لیتر، در افزایش تعداد سلولهای اسپرماتوگونی گزارش شده بود (15). با این وجود، در مطالعه فوق بین گروههای مختلف آزمایشی از نظر میزان بیان ژنها و پروتئینها مقایسه­ای انجام نشد و صرفاً به صورت کیفی گزارش گردید که پروتئینهای VASA و سایر پروتئینهای مربوط به سلولهای زایا در کلونیهای اسپرماتوگونی گورخر ماهی بعد از کشت به مدت یک ماه بیان می­شود.

در مطالعه­ای بر روی قزل­آلای رنگین­کمان، اثر فاکتور­های مختلف رشد نظیر bFGF انسانی، GDNF نوترکیب رت، EGF نوترکیب موشی و LIF نوترکیب قزل­آلای رنگین­کمان در غلظت­های متفاوت بر روی بقاء و تکثیر سلولهای اسپرماتوگونی در محیط آزمایشگاهی مورد بررسی قرار گرفت (32-31). یافته­های آنها نشان داد که به غیر از bFGF، سایر فاکتورهای رشد به تنهایی و یا در ترکیب با یکدیگر اثر معنی­داری بر بقا و تکثیر سلولها ندارد. اثرات مثبت bFGF بر بقا و فعالیت میتوزی سلولهای اسپرماتوگونی در مطالعات دیگر نیز گزارش شده است (9، 21). Hong و همکارانش (9) با افزودن bFGF با غلظت ng/ml 10 به محیط کشت، توانستند سلولهای اسپرماتوگونی مداکا را به مدت دو سال در شرایط آزمایشگاه نگهداری کنند. این در حالی بود که یافته­های مطالعه حاضر نشان داد که استفاده از bFGF با غلظت ng/ml 10 بر روی رشد سلولهای اسپرماتوگونی ماهی آزاد دریای خزر و بیان ژنهای زایا اثر معنی­داری ندارد.

گیرنده­های FGF بر روی سلولهای سوماتیک (سرتولی و لایدیگ) و سلولهای زایا شناسایی شدند (18). بنابراین این فاکتور رشد به طور مستقیم و از طریق اتصال به گیرنده­های خود بر روی سلولهای زایا و با فسفریله کردن مسیر MAPK و AKT، تکثیر میتوزی را افزایش می­دهد (14) و یا به شکل غیر مستقیم از طریق سلولهای سوماتیک پاسخهای درون سلولی را القا می­کند. در این مطالعه، میزان رشد سلولهای سوماتیک در گروهی تیمار شده با bFGF بیشتر از گروه کنترل بود. بنابراین به نظر می­رسد هم­کشتی سلولهای اسپرماتوگونی با سلول­سوماتیک باعث شده است که اثرات bFGF بر روی سلولهای زایا نمایان نشود.  

مطالعات انجام شده بر روی پستانداران نشان داده است که GDNF فاکتور­ مهم خودنوزایی SSCs است که با اتصال به گیرنده­های نظیر خود GFRα باعث القاء پاسخهای درون سلولی می­شود (1، 10، 11، 23). با وجود اینکه اثرات سینرژیک GDNF و bFGF در تکثیر SSCs در موش گزارش شده بود (33)، اما در مطالعه حاضر چنین اثری مشاهده نشد. این یافته با مطالعه قبلی بر روی قزل­آلای رنگین­کمان که نشان داد GDNF بر فعالیت میتوزی سلولهای اسپرماتوگونی تاثیری ندارد، مطابقت دارد (32). بررسی­های انجام شده بر روی قزل­آلای رنگین­کمان نشان داد که بر خلاف پستانداران، GDNF در ماهیان توسط سلولهای سرتولی ترشح نمی­شود و بیان آن در سلولهای زایا (از اسپرماتوگونی تا اسپرماتوسیت) نشان­دهنده عملکرد آن به عنوان یک فاکتور اتوکرین در حفظ و تکثیر سلولهای بنیادی زایا است (24). بنابراین نبود اختلاف معنی­دار بین تیمار BG با سایر گروههای آزمایشی در پارامتر­های بررسی شده ممکن است به دلیل عدم نیاز سلولهای اسپرماتوگونی به GDNF موجود در محیط کشت باشد، اما تایید این فرضیه نیازمند به تحقیقات بیشتر در این زمینه با استفاده از GDNF نوترکیب ماهی می­باشد.

نتایج این مطالعه همچنین نشان داد که IGF1 در ترکیب با bFGF و GDNF اثر معنی­داری بر تکثیر سلولهای اسپرماتوگونی و میزان بیان ژنهای زایا ندارد. در حالی که Bahadorani و همکارانش (2) با مطالعه­ بر روی سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی بز بیان کردند که IGF1 اثرات فاکتور­های رشد bFGF و GDNF را در حفظ بنیادی بودن و تکثیر سلولها تشدید می­کند. بررسی انجام شده بر روی گورخر ماهی نیز نشان داده بود که ترکیب سه فاکتور رشد IGF1، bFGF و GDNF تکثیر سلولهای اسپرماتوگونی را در محیط کشت افزایش می­دهد (15). گزارشاتی نیز در مورد نقش IGF1 در تکثیر سلولهای اسپرماتوگونی قزل­­آلای رنگین­کمان و تیلاپیای نیل در محیط آزمایشگاهی وجود دارد (21، 34). چنین اختلافاتی با نتایج این مطالعه می­تواند به نوع گونه، دوز مصرفی فاکتور­های رشد و شرایط کشت مرتبط باشد.

افزایش اندازه کلونیها در گروه BGIE در مطالعه حاضر احتمالاً به دلیل تاثیر خاصیت القا کنندگی تقسیم توسط EGF بود. EGF به دو شکل مختلف عمل می­کند؛ به طور مستقیم با اثر بر روی سلولهای زایا و یا به شکل غیر مستقیم از طریق اثر بر روی سلولهای سرتولی (29). بنابراین با توجه به عدم تغییر در میزان بیان ژنها و بیان پروتئین DDX4/VASA با گروه کنترل به نظر می­رسد که افزایش اندازه کلونیها به دلیل افزایش در تکثیر سلولهای سوماتیک باشد.

یافته­های این مطالعه نشان داد که افزودن LIF به ترکیب BGIE، منجر به کاهش اندازه کلونی­ها و کاهش تعداد سلول بیان­کننده پروتئین DDX4/VASA می­شود. نتایج متناقضی در مورد اثر فاکتور رشد LIF بر روی رشد سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی ماهیان گزارش شده است. Shikina و Yoshizaki (32) با مطالعه بر روی سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی قزل­آلای رنگین­کمان نشان دادند که LIF اثری بر بقا و تکثیر سلولهای اسپرماتوگونی­تمایز نیافته ندارد. در مقابل، مطالعه انجام گرفته بر روی سلولهای اسپرماتوگونی گورخر ماهی نشان داد سلولهایی که بر روی لایه مغذی ترشح کننده دو فاکتور رشد bFGF و LIF و یا ترکیبGDNF  و LIF کشت یافته بودند، در مقایسه با گروه کنترل سرعت رشد بیشتری داشتند (37). دلیل قطعی کاهش بیان DDX4/VASA در این مطالعه مشخص نیست اما به نظر می­رسد LIF اثرات آنتاگونیستی در ترکیب BGIE روی سلولهای اسپرماتوگونی داشته باشد.

به طور کلی، عدم کارآیی فاکتور­های رشد به کار گرفته شده در این مطالعه بر روی سلولهای اسپرماتوگونی ممکن است به دلیل شباهت کم پروتئینهای انسانی با ماهی باشد (34/77 درصد برای bFGF، 8/45 درصد برای GDNF، 9/54 درصد برای IGF1 و 5/44 درصد برای EGF) که با توجه به تکامل مولکولی سریع فاکتورهای رشد (22)، این احتمال وجود دارد که فاکتورهای رشد نوترکیب انسانی نتوانسته باشند به گیرنده­های خود بر روی سلولهای اسپرماتوگونی ماهی آزاد دریای خزر متصل شوند و مسیر­های پیام­ رسان درون سلولی را فعال کنند. البته اثرات حضور سلولهای استرومایی بافت بیضه در کشت سلولی و رشد سریع آنها در حضور فاکتور­های مختلف رشد را نمی­توان نادیده گرفت. از این رو، یکی دیگر از دلایل احتمالی نبود اختلاف معنی­دار بین گروه­های آزمایشی را می­توان به اثرات هم­کشتی با سلولهای سوماتیک نسبت داد که به نظر می­رسد در مقایسه با فاکتور­های رشد نوترکیب انسانی تاثیر بیشتری بر روی سلولهای اسپرماتوگونی داشت. بنابراین مطالعات تکمیلی با استفاده از فاکتور­های رشد نوترکیب ماهی آزاد دریای خزر در محیط کشت فاقد سلولهای سوماتیک پیشنهاد می­شود. 

تشکر و قدردانی: این مطالعه با حمایت مالی پژوهشگاه رویان و دانشگاه تربیت مدرس در قالب طرح تحقیقاتی مصوب انجام شده است و نویسندگان مقاله بدین وسیله مراتب تقدیر را به عمل می آورند.