بررسی اثرات ورزش میان‌مدت در پاسخ القاء شده توسط تیمروزال در مسیر آتوفاژی بخش پری فرونتال موش نرِ نژاد ویستار

مونا  سوسنی راد¹، مجید نوائیان¹ و محمد ناصحی²

¹ ایران، شهر ری، دانشگاه آزاد اسلامی واحد یادگار امام خمینی (ره) شهر ری، دانشکده علوم پایه ،گروه زیست شناسی

² ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران پزشکی، پژوهشکده علوم اعصاب

تاریخ دریافت: 23/10/1399          تاریخ پذیرش: 30/08/1400

چکیده

در افراد مبتلا به اوتیسم، ارتباط، تعامل اجتماعی و بازی تخیلی به طور مشخص آسیب دیده است. تیمروزال که به طور رایج مرتیولات شناخته می­شود، یک ترکیب ارگانوجیوه با خواص ضدقارچی و آنتی سپتیک است. ارتباط بین احتمال ایجاد اوتیسم به وسیله واکسنهای تیمروزال در سالهای اخیر عمدتاً توسط رسانه­های عمومی مطرح شده است. پژوهش حاضر، تغییرارت رفتاری وابسته به دُز را بعد از مواجهه زودهنگام با تیمروزال طبق الگوی زمانی واکسیناسیون کودکان در موشهای نر صحرایی مورد بررسی قرار داد.  ابتدا به موشهای تازه به دنیا آمده در روزهای 7، 9، 11 و 15 مقدار 300 میکروگرمی تیمروزال تزریق شد. سپس از روز 31 تا روز 80 پس از تولد، پروتکلهای مختلف ورزشی 1 و 2 اعمال شد، بلافاصله پس از انجام پروتکلها، در مدت زمان کمتر از 30 ثانیه مغز از درون جمجمه خارج و پری فرونتال مغز بسرعت استخراج شد. در نهایت، جهت سنجش تام پروتئینها با استفاده از تکنیک وسترن بلات، زیرواحدهای ژن ATG8 و ATG10 در پری فرونتال مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد، موشهای دریافت کننده تیمروزالی که پروتکلهای ورزشی انجام دادند، بویژه موشهایی که پروتکل اول ورزشی + پروتکل دوم ورزشی را انجام دادند، میزان بیان ژنهای ATG8 و ATG10 به طور معناداری نسبت به گروه کنترل کمتر است. بنابراین با توجه به اینکه ATG8 و ATG10  از فاکتورهای اصلی در اتوفاژی هستند و در بسیاری از مسیرهای مولکولی دیگر مثل سیگنالینگ های نورونی و نقل و انتقالات نورونی نقش دارند، می توان نتیجه گرفت ورزش میان‌مدت در رفع اثرات سوء تیمروزال در بیان ژنهای آتوفاژیک مؤثر است.

واژه های کلیدی: اوتیسم، تیمروزال، پروتکلهای ورزشی، ATG8 و ATG10

* نویسنده مسئول، تلفن: 09125159882 ، پست الکترونیکی:  ایمیل: majid-navaian@yahoo.com

مقدمه

اختلال اوتیسم (ASD) (Autism spectrum disorder) یک اصطلاح عمومی برای طیفی از اختلالات عصبی در افراد مبتلا به اوتیسم است که به همراه مجموعه­ای از ناهنجاریهای رفتاری شامل رفتارهای تکراری و کلیشه‌ای، نقص در تکلم و ارتباطات و عدم توانایی شرکت در تعاملات اجتماعی متقابل، در سن دو تا سه‌ سالگی شناسایی می‌شود(16و41). عوامل خطر احتمالی، تعدادی از فاکتورهای ژنتیکی، اپی‌ژنتیکی و محیطی هستند. احتمالاً فاکتورهای ژنتیکی به ایجاد آمادگی برای ASD نسبت به اثرات مضر فاکتورهای محیطی کمک می‌کنند (23) .در این اختلال اتصال ساختاری و عملکردی مغز نیز غیرنرمال است. پیشنهاد شده که در این بیماری، مکانیسمهای غیرطبیعی ساخت سیناپس و عملکرد چندین سیستم انتقال‌دهنده عصبی می‌توانند نقش داشته باشند(5 و14). همچنین این نوع از اختلال عصبی با انواع مختلفی از مشکلات دیگر همبستگی دارد که عبارت از: صرع، اسکیزوفرنی، مشکلات جسمی مانند آلرژی، اختلالات دستگاه گوارش، یا بیماریهای خود ایمنی. در میان اینها ناتوانی ذهنی مهمترین ریسک فاکتور شناخته شده است (24).

یکی از راههای ابتلا به اختلال اوتیسم، واکسیناسیون است؛ به علاوه بسیاری از واکسنها حاوی تیمروزال هستند و این ترکیب حاوی 49 درصد جیوه‌ است که به‌عنوان ضدمیکروب موضعی مورد استفاده قرار می‌گیرد. تیمروزال با نام رایج مرتیولات، شناخته می­شود، یک ترکیب ارگانوجیوه که خواص ضدقارچی و آنتی سپتیک دارد. به طور گسترده فعالیت ضدمیکروبی تیمروزال منجر به استفاده آن در محصولات دارویی شامل واکسن ها و سایر محصولات بیولوژیکی تزریقی از دهه 1930 شده است (4). تیمروزال و سایر ترکیبات ارگانیک جیوه در واکسن­های زنده به دلیل واکنش منفی با ماده فعال استفاده نمی­شوند. با این وجود در واکسن های غیرفعال، آنها ممکن است در طول بعضی از مراحل تولید اضافه شوند. در اواخر دهه 1990، اداره غذا و دارو ایالت متحده پس از تحقیق کامل، بیانیه ای صادر کرد که متذکر شد که نوزادان در طول شش ماهه اول زندگی واکسینه شده براساس برنامه توصیه ای ایالت متحده ممکن است مقدار جیوه ای که دریافت می کنند بیش از حد مجاز آژانس حفاظتی محیط زیست برای در معرض گرفتن جیوه (mg/kg-day 0001/0) باشد (10). اتیل مرکوری(H3C‑(CH2)‑Hg‑ [Et‑Hg‑])   شکلی از جیوه است که در تیمروزال (نمک سدیم Et‑Hg‑“thiosalicylate) وجود دارد، ترکیبی که هنوز به‌عنوان نگهدارنده در بسیاری از واکسنها و سایر ترکیبات بهداشتی و آرایشی استفاده می‌شود (32).

همان طور که مطالعات نشان دادند، بیماران ASD، در مکانیسمهای سم‌زدایی به‌ویژه Glutathione-S-transferase (GST) اختلال دارند و این بیماران دارای غلظت پایین‌تری از گلوتاتیون می‌باشند (25). فلزات سنگین ممکن است سبب التهاب و آسیب اکسیداتیو در مغز شوند و متعاقباً منجر به تغییر در رشد و پیشرفت سیستم عصبی گردند. برخی کودکان مستعد ابتلا به اوتیسم، هنگامی که در معرض جیوه هستند سخت‌تر می‌توانند آن را حذف کنند؛ بنابراین دُزهای پایین جیوه می‌تواند در بدن آنها تجمع کند و عوارض جانبی داشته باشد (11). ارتباط بین احتمال ایجاد اوتیسم به وسیله واکسنهای تیمروزال در سالهای اخیر عمدتاً توسط رسانه های عمومی مطرح شده است. که ماهیت بیولوژیکی آنها از اتیل مرکوری و متیل مرکوری گرفته شده است و در مطالعات منتشر شده وجود ترکیبات جیوه، ریسک بالقوه اثرات توکسیک ناشی از جذب و تجمع در مغز را نشان دادند (18). از طرفی ترکیبات جیوه  می تواند به طور غیر مستقیم باایجاد التهاب مغزی ناشی از  انتشار قطعه های عصبی آسیب دیده وکاهش سطح گلوتاتیون مغزمنجر به کاهش نورونها گردد. بقایای حاصل از اثرات مستقیم ترکیبات جیوه با سطح کاهش یافته گلوتاتیون می تواند منجر به التهاب عصبی پایدار گردد. در شرایط التهاب پایدار با گذر زمان، میکروگلیا می تواند شروع به تخریب بافت سالم بویژه سیناپس نماید (36).

در بدن به‌طور معمول یک تعادل بین سیستم سنتز پروتئین و تخریب پروتئین وجود دارد. اتوفاژی به معنی خودخواری، یک فرآیند سلولی است که محتوای سیتوپلاسمی (پروتئینهای پیر و اندامکهای آسیب‌دیده)  در داخل وزیکولهای دوغشایی محصور و بعد از ملحق شدن به لیزوزوم تجزیه می‌شوند و تولید انرژی می‌کنند (30و44). به نظر می‌رسد اثرات مضر تیمروزال بر روی سلولها و بافتها به دلیل اثر بر طیف وسیعی از آنزیمها توسط تیمروزال روی سطح و داخل سلول باشد. اتوفاژی تحت شرایط استرس، عفونت پاتوژنی و در شرایط پاتولوژیکی مختلف شامل سرطان و بیماریهای دژنراسیون مغزی فعال می‌شود. به طور معمول القاء کننده اتوفاژی، ROS است.زیرا اتوفاژی برای کاهش آسیب اکسیداتیو عمل می‌کند. اتوفاژی سیستم بازیافت درون سلولی در یوکاریوت‌هاست که از وزیکولهای کوچک به‌منظور انتقال پروتئینهای سیتوزولی و ارگانلها به واکوئلها جهت تجزیه استفاده می‌کند. از آنجاکه تشکیل وزیکول وابسته به اتصال دو پلی پپتید شبه یوبیکویتینی Atg8 و Atg12 به فسفاتیدیل اتانول آمین و پروتئین Atg5 به ترتیب می‌باشد. علاوه براین، Atg10 جهت کنژوگاسیون Atg12 ضروری است و ازطرفی کنژوگه Atg12-Atg5 جهت تشکیل وزیکولهای اتوفاژیک ضروری می‌باشد (35). Atg8-فسفاتیدیل آمین احتمالاً پروتئین داربستی است که گسترش غشا را پشتیبانی می‌کند و مقدار حاضر به سایز اتوفاگوزوم مرتبط است (17). بنابراین پروتئینهای Atg8 و Atg10 نقش مهمی را جهت اتوفاژی در سلولهای یوکاریوتی برعهده دارند.

از دیگر نشانه­های اوتیسم، تغییرات حافظه و یادگیری است. حافظه اصطلاح جامعی است که تمام انواع اطلاعات را در زمانهای متفاوت در خود نگه می دارد و به شکلهای متفاوتی پاسخ می دهد. سه ساختمان مغزی مهم برای حافظه در ساختار مغز شامل قسمت میانی لوب تمپورال، هسته دیانسفالیک و قسمت پایانی مغز قدامی است.

قسمت میانی لوب تمپورال مثل هیپوکمپ است که شبکه درازی از نورورنهای درگیر حافظه را تشکیل می دهد. آمیگدال نیز نزدیک انتهای قدامی هیپوکمپ قرار دارد و در واقع مسئول سنجش میزان تجربه هیجانی وارد شده است و بدین ترتیب، سطح فعالیت هیپوکمپ را تنظیم می کند. لذا یک تجربه شدید هیجانی برای همیشه در حافظه حک می شود ولی حرکات نامربوط سریعا از حافظه رد می‍شوند (27).

بنظر می رسد تمرینات هوازی می تواند باعث بهبود مهارتهای اجتماعی، ارتباطی و حرکتی و نیز کاهش رفتارهای کلیشه ای کودکان اوتیسم و رفتارهای خود تحریکی آنها گردد (15). بنابراین از عوامل مداخله گر در درمان اوتیسم می توان به ورزش میان مدت اشاره کرد. تحریکات حسی کنترل شده بصورت فعالیتهای نرمال و معنی دار که بر نقش نیازهای بیولوژیک جهت انگیزش رفتار، تاکید اساسی دارد (38). بنظر می رسد تمرینات هوازی می تواند باعث پردازش بهتر محرکهای حسی دریافتی از جانب کودک شود (33). سرعتچی و همکاران اثربخشی تمرینات هوازی بر مهارتهای حرکتی درشت و ظریف را در کودکان مبتلا به اوتیسم نشان دادند (39).

پژوهش حاضر، تغییرارت رفتاری وابسته به دُز را بعد از مواجهه زودهنگام با تیمروزال طبق الگوی زمانی واکسیناسیون کودکان در موش های نر صحرایی مورد بررسی قرار داده است.

مواد و روشها

حیوانات مورد آزمایش: در این مطالعه تجربی از 8 راس ماده موش صحرایی جوان و حاصل از یک نژاد، 60 موش نر با میانگین وزنی 250 تا 300 گرم متولد شدند. حیوانات در درجه حرارت کنترل شده 2±22 و شرایط نوری 12 ساعت نور و 12 ساعت تاریکی (12:12) نگهداری شدند. در این پژوهش آزمونهای رفتاری نیز در چرخه روشنایی انجام پذیرفت و هر حیوان فقط یکبار مورد آزمایش قرار گرفت.

گروه­های آزمایشی: موشهای مورد بررسی به طور تصادفی به 8 گروه، 7 تایی تقسیم شدند:

1. گروه اول (کنترل): این گروه تیمروزال دریافت نکردند و از روز 80-21 بچه موشها بدون تحرک روی دستگاه تردمیل قرار گرفتند.
2. گروه دوم (تیمروزال): این گروه تحت تزریق (300 میکروگرم تیمروزال) قرار گرفتند و از روز 80-21 هیچ گونه تحرکی نداشتند.
3. گروه سوم (پروتکل اول ورزشی): این گروه از روز 50-21 تحت پروتکل اول ورزشی قرار گرفتند.
4. گروه چهارم (پروتکل اول ورزشی + تیمروزال): این گروه تحت تزریق (300 میکروگرم تیمروزال) قرار گرفتند و از روز 50-21 تحت پروتکل اول ورزشی قرار گرفتند.
5. گروه پنجم (پروتکل دوم ورزشی): این گروه از روز 80-51 تحت پروتکل دوم ورزشی قرار گرفتند.
6. گروه ششم (پروتکل دوم ورزشی + تیمروزال): این گروه تحت تزریق (300 میکروگرم تیمروزال) قرار گرفتند و از روز 80-51 تحت پروتکل دوم ورزشی قرار گرفتند.
7. گروه هفتم (پروتکل اول ورزشی + پروتکل دوم ورزشی): این گروه از روز 50-21 تحت پروتکل اول ورزشی و از روز 80-51 تحت پروتکل دوم ورزشی قرار گرفتند.
8. گروه هشتم (پروتکل اول ورزشی + پروتکل دوم ورزشی + تیمروزال): این گروه از روز 50-21 تحت پروتکل اول ورزشی و از روز 80-51 تحت پروتکل دوم ورزشی قرار گرفتند.

در گروه­هایی که نیاز به تزریق بود، ماده تیمروزال به میزان 300 میکروگرم و بصورت درون عضلانی، در عضله glutei maximi تزریق گردید(45).

پروتکلهای ورزشی: پروتکل اولیه: موشها 50-21 روز پس از تولد، از روز یکشنبه تا پنجشنبه و در ساعتهای 9 تا 14:30، مطابق جدول 1، بر روی تردمیل تحت پروتکل اول ورزشی قرار گرفتند.

پروتکل دوم: موشها 50-21 روز پس از تولد، از روز یکشنبه تا پنجشنبه و در ساعتهای 9 تا 14:30، مطابق جدول 2، بر روی تردمیل تحت پروتکل دوم ورزشی قرار گرفتند (3).

جدول1- پروتکل اولیه ورزشی

جدول2- پروتکل دوم ورزشی

خارج کردن مغز و تثبیت بافت: بلافاصله پس از انجام آزمونها، ابتدا موش با اتر کاملا بیهوش شده و توسط گیوتین مخصوص آزمایشگاه سر حیوان جدا شد. سپس پوست سر با استفاده از تیغ جراحی شکافته شده و به کمک استخوان شکن، استخوانهای پیشانی، آهیانه و پس سری جمجمه به دقت برداشته شد.  مغز کمتر از 30 ثانیه از دورن جمجمه خارج، ناحیه پری فرونتال به سرعت استخراج شده و در پتری دیش حاوی نرمال سالین 4 درجه سانتی گراد با نیتروژن مایع فریز شده. بافت جدا شده تا زمان انجام آزمایشات در فریزر 80- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.

بررسی میزان بیان ژنها با تکنیک وسترن بلات: یکی از روشهای تایید و بررسی بیان ژنها، تکنیک وسترن بلات است. در این مطالعه با استخراج پروتئینهای حاصل از ژنهای ATG8 و ATG10، میزان بیان این ژن­ها مورد بررسی قرار گرفت.

استخراج پروتئین: با استفاده از بافر لیزکننده RIPA، استخراج پروتئین از بافت مغز انجام شد. به طوری که در هر میکروتیوب یک بید به قطر mm1، 200 میلی گرم بافت و700 میکرولیتر محلول RIPA قرار داده شد. قبل از شروع فرآیند استخراج به محلول RIPA، مهارکننده پروتئاز و فسفاتاز اضافه گردید. سپس میکروتیوب­ها به مدت 60-40 ثانیه در دستگاه لایزر با ارتعاش 50 هرتز قرار گرفتند.

محلول هموژن بافت، برای 10 دقیقه بر روی یخ در فضای آزمایشگاه قرار گرفت و سپس در سانتریفیوژ یخچال دار با دور 17000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. محلول رویی با دقت جدا شد و سریعاً به فریزر 20- درجه سانتی گراد انتقال یافت. در نهایت نیز غلظت پروتئینها به کمک دستگاه پیکودراپ اندازه گیری شدند.

وسترن بلات: برای تعیین غلظت بافتی پروتئینهای مورد بررسی از تکنیک وسترن بلات بـر اساس پروتکل استاندارد استفاده شد (21). به منظور باز شدن ساختار پروتئین­های نمونه و سهولت حرکت بر روی ژل SDS PAGE (12 درصد)، از بافر نمونه (10 میلی لیتر تریس، 12.5 میلی لیتر گلیسرول، 2.5 میلی لیتر بتامرکاپتواتانول، 0.01 گرم بروموفنول بلو و 25 میلی لیتر SDS 10 درصد) استفاده شده. مخلوط نمونه و بافر نمونه با نسبت 1:4 به مدت 5-3 دقیقه در 100+ درجه سانتیگراد حرارت داده شدند و در چاهکها بارگذاری شدند. پروتئینها توسط نانودراپ به کاغذ غشایی PVDF منتقل شدند. سپس با استفاده از آنتی بادیهای اختصاصی، مقادیر و غلظت پروتئینهای مورد بررسی، ارزیابی شدند. از روش برادفورد و نانودراپ برای تعیین غلظت پروتئین استفاده شد و در نهایت با کیت ECL از باندهای پروتئینی عکس تهیه شد، همچنین چگالی باندهای پروتئینی نیز با کمک نرم افزار image j آنالیز شدند.

مطالعات نشان دادند که میزان بیان پروتئین بتا-اکتین در سلول ثابت است (21). بنابراین از آنتی بادی پروتئین بتا-اکتین نسبت به آنتی بادیهای مورد پژوهش، برای حذف خطای بارگذاری در چاهکها اسـتفاده شـد.

آنالیزهای آماری: یافته­های این پژوهش با استفاده از نرم افزار SPSS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. جهت مقایسه متغیرهای مورد مطالعه در گروه کنترل و پروتکلهای مختلف ورزشی و گروه غریبه 1 و غریبه 2 با پروتکلهای مختلف ورزشی از آزمون تی مزدوج 2 (paired-samples t-test) استفاده گردید و جهت آزمون تاثیرگذاری پروتکل های مختلف ورزشی نسبت به گروه کنترل از آزمون one – way و   ANOVA Post – hoc Tukey‟s استفاده شد. تمامی p-value به صورت دو دامنه در نظر گرفته شد و سطح معناداری حداقل p<0.05 در نظر گرفته شد.

نتایج

بیان پروتئین ATG8 و ATG10 : تغییرات قابل مشاهده ایجاد شده در بیان پروتئین ATG8 و ATG10 تفاوت آماری معناداری در محدوده P <0.05  تا  P <0.0001بین گروه بدون تحرک و گروه بدون مداخله ایجاد کرد. همان طور که شکل 1 نشان می­دهد، دامنه تغییرات در گروهی که پروتکل اول ورزشی + پروتکل دوم ورزشی را انجام دادند، بارزتر بوده است (P <0.0001).

تاثیر تیمروزال بر بیان ژن ATG8 و ATG10 : در گروه کنترل از روز 80-21 بچه موش ها بدون تحرک روی دستگاه تردمیل قرار گرفتند، و گروه دوم از روز 80-21 هیچ گونه تحرکی نداشتند، تفاوت آماری معنی داری (P <0.0001) یافت شد. به عبارت دیگر، در گروه دوم نسبت به گروه اول، بیان ژن ATG8، 3 برابر و بیان ژن ATG10، 5 برابر بود (شکل2).

تاثیر پروتکل اول ورزشی بر بیان ژن ATG8 و ATG10 : یافته­ها تفاوت آماری معنی داری را (P < 0.05) در بیان ژن ATG8 و ATG10 ، بین گروه کنترل که از روز 80-21 بچه موش ها بدون تحرک روی دستگاه تردمیل بودند و گروه سوم (پروتکل اول ورزشی) که از روز 50-21 تحت پروتکل اول ورزشی بودند، نشان دادند (شکل3). به طوری که، بیان ژن ATG8، در گروه هفتم نسبت به گروه کنترل،  1.5 برابر بود و بیان ژن ATG10 در گروه سوم نسبت به گروه کنترل، 2 برابر بود.

تاثیر پروتکل دوم ورزشی در بیان ژن ATG8 و ATG10: همچنین بین گروه کنترل و گروه پنجم (پروتکل دوم ورزشی) که از روز 80-51 تحت پروتکل دوم ورزشی بودند، تفاوت آماری معنی داری (P < 0.05) مشاهده شد. بر اساس یافته­ها، بیان ژن ATG8، در گروه هفتم نسبت به گروه کنترل،  1.5 برابر بود و بیان ژن ATG10 در گروه پنجم نسبت به گروه کنترل، 2 برابر بود (شکل4).

تاثیر پروتکل اول ورزشی + پروتکل دوم ورزشی بر بیان ژن ATG8 و ATG10 : در بین گروه کنترل و گروه هفتم (پروتکل اول ورزشی + پروتکل دوم ورزشی) که از روز 50-21 تحت پروتکل اول ورزشی و از روز 80-51 تحت پروتکل دوم ورزشی بودند، تفاوت آماری معنی داری (P < 0.05) دیده شد. بر اساس نتایج ارائه شده، بیان ژن ATG8، در گروه هفتم نسبت به گروه کنترل،  1.5 برابر بود و بیان ژن ATG10 در گروه هفتم نسبت به گروه کنترل، 2 برابر بود (شکل5).

تاثیر پروتکل اول ورزشی بر بیان ژن ATG8 و ATG10 در موشهای دریافت کننده تیمروزال: بین گروه دوم که از روز 80-21 هیچ گونه تحرکی نداشتند و گروه چهارم (پروتکل اول ورزشی + تیمروزال) یعنی موشهایی که تحت تزریق (300 میکروگرم تیمروزال) بودند و از روز 50-21 تحت پروتکل اول ورزشی بودند، تفاوت آماری معنی داری (P <0.001) مشاهده شد. به عبارتی در گروه چهارم  نسبت به گروه دوم، بیان ژن ATG8، 28.57 درصد کاهش بیان ژن دیده شد و در گروه چهارم  نسبت به گروه دوم، بیان ژن ATG10، 20 درصد کاهش پیدا کرد (شکل6).

تاثیر پروتکل دوم ورزشی بر بیان ژن ATG8 و ATG10 در موشهای دریافت کننده تیمروزال: نتایج مشاهده شده بین گروه دوم (تیمروزال) و گروه ششم (پروتکل دوم ورزشی + تیمروزال) تفاوت آماری معنی داری (P <0.001) را نشان می دهد. به طوری که کاهش بیان، در گروه ششم  نسبت به گروه دوم، برای ATG8، 14.28 درصد و برای ATG10، 20 درصد، بوده است (شکل7).

تاثیر پروتکل اول ورزشی + پروتکل دوم ورزشی بر بیان ژن ATG8 و ATG10 در موش های تیمروزال دریافت کرده: بین گروه دوم و گروه هشتم (پروتکل اول ورزشی + پروتکل دوم ورزشی + تیمروزال) یعنی موش هایی که از روز 50-21 تحت پروتکل اول ورزشی و از روز 80-51 تحت پروتکل دوم ورزشی بودند، تفاوت آماری معنی داری (P <0.0001) دیده شد.  نتایج نشان دادند که در گروه هشتم  نسبت به گروه دوم، بیان ژن ATG8، 57.14% و بیان ژن ATG10، 40%، کاهش پیدا کرد (شکل8).

بحث

اختلال طیف اوتیسم (ASD)، حداقل با تأخیر یا کارکرد ناهنجار در یکی از حوزه‌های تعامل اجتماعی، زبان ارتباطات اجتماعی و بازی تخیلی، ظهور می‌یابد. کودک مبتلا به اختلال طیف اوتیسم در دنیای درون خود زندگی می‌کند و از آنجا که برقراری ارتباطات مناسب اجتماعی نیازمند دریافت و پردازش صحیح اطلاعات حسی و اتخاذ رفتار مقتضی، مبتنی بر این اطلاعات است، در این دنیای درونی شده، ارتباط وی با دنیای بیرون قطع می‌شود و به دلیل نقصان دریافت و ادراک محرکات حسی خارجی، فرآیند یادگیری و ارتباطات مناسب اجتماعی وی را مختل می‌کند. پژوهشگران دریافته‌اند، ارتباطی بین اوتیسم و تیمروزال که یک ماده محافظت‌کننده از واکسنها و حاوی جیوه است، وجود دارد.

در مطالعه­ای بر روی تمام کودکان واکسینه شده که برای حفاظت واکسنها از تیمروزال یا اتیل مرکوری استفاده شده بود، مشاهده شد، کودکانی که تا سن ۱۰ ماهگی با ۲۵۰ میلی‌گرم تیمروزال و تا ۱۵ ماهگی ۴۵۰ میلی‌گرم تیمروزال تماس داشتند، میزان شیوع اوتیسم در بالاترین میزان خود قرار داشت. همچنین، برنارد و همکارانش مشابهتهایی بین علائم اوتیسم و مواجهه با جیوه را گزارش نمودند و تغییرات مغزی مشترک بین این دو اختلال را شرح دادند (6).

گزارش وسیعی از استفاده ایمن و مؤثر تیمروزال در جلوگیری از آلودگی قارچی و باکتریایی واکسنها منتشر شده است، همچنین مشخص شده است که تیمروزال به اتیل مرکوری و  thiosalicylate متابولیزه می‌شود (22). اما پیشنهاد شده است که تماس زیاد با اتیل مرکوری به دلیل تعداد افزایش یافته ایمونیزاسیون توصیه شده در سه سال زندگی ممکن است موجب افزایش شیوع اوتیسم گردد. واکسن حاوی تیمروزال (TCV) یکی از منابع اصلی تماس جیوه برای جمعیت عمومی است (8 و 9). وقایع نوروتوکسیک متعاقب تماس انسانها با متیل مرکوری و تأثیر آن بر تکامل مغز به خوبی در وقایع مسمومیت در مطالعات ثابت شده است (2و20). اتیل مرکوری نسبت به متیل مرکوری  سریع‌تر به جیوه معدنی متابولیزه می‌شود و این تفاوت در متابولیسم ممکن است منجر به آسیب کلیوی ناشی از مقادیر سمی باشد. همچنین درحالی که افزایش استرس اکسیداتیو و القای آپوپتوز مشاهده شده in vitro با دُزهای بالا (مثل 405 μg/L تا 101 mg/L) از تیمروزال ممکن است اثرات نوروتوکسیک آن را توضیح دهد، اثرات اتیل مرکوری دُز کم به طورکامل تعریف نمی‌شود (9).

براساس این مطالعات، بسیاری از علائم بالینی ناشی از مسمومیت با جیوه مثل اختلال در روابط اجتماعی، افسردگی، اضطراب، تماس چشمی محدود، از دست دادن توانایی های گفتاری، مشکلات حسی و حرکتی و نقایص بارز شناختی و رفتارهای تکراری و کلیشه ای با علائم اختلال طیف اوتیستیک مشترک است و در عین حال مشابهت های بیوشیمیایی سیستم ایمنی و نوروشیمیایی بسیاری نیز وجود دارد. از آن زمان روز به روز شواهد گسترده ای از ارتباط ما بین اوتیسم و جیوه آشکار گردیده است. با وجود مکانیسمهای پیچیده پاتوفیزیولوژیک اختلالات عصبی اوتیسم، ارتباط آن با اتوفاژی نیز اثبات شده است. درک مسیر مولکولی اتوفاژی با شناسایی چندین ژن (ATG) از مخمر تا پستانداران حاصل شده است. اتوفاژی به چندین مرحله اساسی برای تخریب لیزوزوم نیاز دارد که شامل القا، تشکیل غشای ایزوله، ایجاد اتوفاگوزوم و بلوغ اتوفاگوزوم می باشد. چندین ATG در هر مرحله از اتوفاژی نقش دارند و جهش در این ژنها در چندین بیماری انسانی یافت شده است (37). جهت تشکیل اتوفاگوزوم، دو سیستم کنژوگه شبیه یوبیکویتین: ATG12-ATG5-ATG16L1 (ATG12، ATG7، ATG10، ATG5 و ATG16L1) و LC3-PE (زنجیره سنگین مربوط به میکروتوبول 3- فسفاتیدیل اتانول آمین; مجموعه LC3, ATG4, ATG7, and ATG3) درگیر می شود. به عبارت دیگر، مجموعه ATG12-ATG5 در گسترش غشای فاگوفور جهت ایجاد اتوفاگوزوم از طریق تعامل با سایر پروتئینهای PI3P همکاری می کند (46، 30.43).

از طرف دیگر، Atg7 و Atg10 به پروتئینهای شبه E1 و E2 که میانجی گر اتصال Atg8 به فسفاتیدیل اتانول آمین می‌باشند، مرتبط هستند. هر دو Atg12–Atg5 و Atg8 تشکیل اتوفاگوزوم را مهیا می‌کنند. کنژوگه Atg12–Atg5 لیپیدسازی را تسهیل می‌کند و شکل‌گیری زیرسلولی آن را هدایت می‌کند. Atg8-فسفاتیدیل آمین احتمالاً پروتئین داربستی است که گسترش غشاء را پشتیبانی می‌کند و مقدار حاضر به سایز اتوفاگوزوم مرتبط است (16.34)

در تحقیق حاضر، نتایج بیان ATG8 و ATG10 در موشهایی که تیمروزال دریافت کرده بودند، نشان داد که میزان بیان پروتئین ATG8 و ATG10 نسبت به گروه کنترل، افزایش معناداری پیدا کرده است.

در مطالعه حاضر، ژن ATG8 در پروتکل 1 ورزشی، پروتکل 2 ورزشی و پروتکل 1و 2 ورزشی تغییر به وجود آورده و کاهش یافته که نشان دهنده اثر هر دو پروتکل ورزشی است. بنابراین ATG8 در موش سالم و مواجهه با تیمروزال متفاوت است. در واقع تیمروزال، بر روی پاسخی که پروتکلهای مختلف ورزشی برجای می گذارد، اثرگذار است. چرا که در موشهای نرمال این روند افزایشی است. در حالی که در موشهای مواجهه با تیمروزال روند کاهشی داشته است. علاوه براین، در ژن ATG10 نیز، در پروتکل 1 ورزشی، پروتکل 2 ورزشی و پروتکل 1و 2 ورزشی تغییر بوجود آورده و کاهش یافته که نشان دهنده اثر هر دو پروتکل ورزشی است. بنابراین ATG10 در موش سالم و مواجهه با تیمروزال متفاوت است. در واقع تیمروزال، بر روی پاسخی که پروتکلهای مختلف ورزشی برجای می‍گذارد، اثرگذار است. چرا که در موشهای نرمال این روند افزایشی است. در حالی که در موشهای مواجهه با تیمروزال روند کاهشی داشته است.  

مقدار ATG8 سطح اتوفاژی را با تعدیل اتوفاگوزوم ها تنظیم می کند، گرچه بر تعداد اتوفاگوزوم ها بی تاثیر است. علاوه براین، ATG8 که شبیه یوبیکویتین است، در تشکیل اتوفاگوزوم نقش مهمی دارد (40). ATG8 تازه سنتز شده بوسیله سیستئین پروتئاز، ATG4 جهت نمایش کربوکسیل ترمینال گلایسین، پردازش می شود. سپس توسط آنزیم فعال شده E1-like (ATG7) و آنزیم کنژوگه شده E2-like (ATG3) به فسفاتیدیل اتانول آمین کنژوگه می شود. ATG8 کنژوگه شده می تواند توسط ATG4 دکنژوگه گردد (18). یک مجتمع پروتئینی تشکیل شده از ATG5، ATG12، و ATG16 کنژوگاسیون ATG8 را با خدمت به عنوان آنزیم E3-like تسهیل می کند (42). در مطالعه حاضر، تیمروزال موجب افزایش بیان ATG8 و متعاقباً اوتوفاژی شد. به طوری که در موشهایی که تیمروزال دریافت کردند نسبت به گروه کنترل، افزایش بیان 5 برابری ATG8 مشاهد شد (47و 48).

انقباض عضلات ناشی از ورزش می تواند یک استرس پرانرژی ایجاد کند که منجر به تغییر در پیام رسانهای مولکولی مانند کلسیم، AMP، NAD⁺  و  ROS (گونه های اکسیژن فعال) شود. این پیام رسانها سپس، آبشار پایین دست سیگنالینگ را فعال می کنند که منجر به پاسخ اتوفاژی دوفازی با هدف بازگرداندن هموستازی می گردند (27). همچنین تمرین ورزشی می تواند متابولیسم پروتئینها، گلوکز و اسیدهای چرب را تسریع کند، باعث بهبود بیوژنز میتوکندری و ترویج آنژیوژنز شود و پیری ماهیچه های اسکلتی را به تأخیر بیندازد. این اثرات ممکن است مربوط به اتوفاژی ناشی از تمرینات ورزشی باشد. در مطالعه حاضر ورزش پروتکل 1 باعث کاهش بیان ژنهای ATG8  و ATG10 شده، و علاوه براین، پروتکل 2 ورزشی نیز باعث کاهش بیان ژنهای ATG8 و ATG10 شد. از طرفی این دو پروتکل 1 و 2 ورزشی با اثر سینرژیستی باعث کاهش بیش از حد ژنهای مربوط به اتوفاژی ATG8  و ATG10 گردیدند.

در مطالعه ای توسط Brandt و همکارانش در 2018، گزارش شده که ارتفاعات بالا ممکن است باعث ایجاد اتوفاژی و میتوفاژی شود تا بتواند کیفیت عضلات اسکلتی را حفظ کرده و میتوکندری های ناکارآمد را از بین ببرد، در نتیجه حفظ راندمان بالای متابولیسم انرژی برای پاسخگویی به تقاضای بیشتر انرژی است (7). اگرچه، در مطالعه ای دیگر که در سال 2012 انجام شد، Kim و همکارانش به بررسی اثر تمرین ورزشی بر روی اتوفاژی پرداختند و بیان پروتئینهای مرتبط به اتوفاژی شامل پروتئین مربوط به میکروتوبول زنجیره سبک 1b (LC3)، Beclin-1، Atg7، کنژوگیشن از ATG12 تا ATG5، پروتئین غشایی مربوط به لیزوزوم (LAMP2a) بعد از تمرین تردمیل را بررسی کردند. آنها شاهد کاهش معنادار پروتئینهای مربوط به اتوفاژی ذکر شده نسبت به گروه شاهد (موشهایی که تمرین تردمیل نداشتند) بودند (28). بنابراین، می توان نتیجه گرفت که ممکن است نوع و شدت تمرینات ورزشی بر اثرات اتوفاژی موثر باشد.

اگرچه رفتار درمانی باعث به وجود آمدن تغییرات معنی داری در کودکان مبتلا به اوتیسم می شود، اما پژوهشهای جدید و تجربیات برخی والدین نشان دهنده فوایدی دال بر سودمند بودن درمانهای دیگر، مانند: ورزش، بازی، و حرکات بدنی است که باعث بهبود نشانه ها، رفتارها و بالا بردن کیفیت زندگی افراد مبتلا به اوتیسم می شود. ورزش علاوه بر کاهش وزن و تناسب اندام، عملکرد حرکتی افراد مبتلا به اوتیسم را افزایش می دهد. ورزشهایی مانند ژیمناستیک و ایروبیک، سبب کاهش رفتارهای منفی و خودانگیخته شایع در مبتلایان به اوتیسم می شود. ورزشهایی مانند، شنا و ورزشهای آبی یا دویدن در صورت تداوم و تکرار می توانند توجه مبتلایان به اوتیسم را از رفتارهای تکراری یا خودانگیخته منحرف کند. ورزش همچنین باعث کاهش رفتارهای پرخاشگرانه و خودزنی و افزایش میزان توجه و کاهش رفتارهای کلیشه ای می شود (12).

با توجه به اینکه اغلب فعالیتهای ورزشی کودکان به صورت بازیهای تفریحی و فعالیتهای بدون ساختار و غیررسمی شکل گرفته است. این امکان وجود دارد که کودکان اوتیسمی با افزایش سن امکان حضورشان در زمینهای بازی کمتر شود، برنامه های ورزشی و فعالیتهای جسمانی، پیچیده و رقابتی شده و نیازمند مهارتهای جسمانی پیچیده تری شوند و با افزایش سن بیشتر در معرض چاقی و خطرهای ناشی از آن قرار گیرند (31). از طرفی ورزش می­تواند، در تعاملات اجتماعی افراد مبتلا به اوتیسم نیز سودمند باشد.

نتایج پژوهشها، نشان می‌دهد تمرین بدنی نه‌تنها باعث بهبود وضعیت جسمی می‌شود بلکه رفتارهای ناسازگارانه اوتیسم را نیز کاهش می‌دهد. کودکان اوتیستیک نسبت به کودکان معمولی در عین اینکه فعالیت کمتری دارند، بیشتر هم در معرض خطر هستند چراکه شیوه زندگی بی‌حرکتی دارند که خطرات ناشی از بیماریهای قلبی، دیابت و چاقی را در آنها افزایش می‌دهد. از آنجا که ثابت شده ورزش در جمعیت عادی وسیله‌ای موثر برای جلوگیری از این مشکلات است، این احتمال وجود دارد که در جمعیت اوتیسم نیز موثر باشد. تحقیقات نشان می‌دهد تمرین فیزیکی باعث بهبود مهارتهای اجتماعی، ارتباطی و حرکتی، کاهش رفتارهای کلیشه‌ای کودکان اوتیسم و رفتارهای خودتحریکی آنها می‌شود. در مجموع آنچه روشن است، فعالیت‌های ورزشی یکی از موثرترین راهها برای غلبه بر ناتوانی است (13).

فواید فعالیتهای فیزیکی برای اکثر کودکان مبتلا به اوتیسم عبارت اند از:

کم شدن رفتارهای تکراری، عملکرد مثبت اجتماعی، افزایش تمرکز وکاهش خطر ابتلا به چاقی و بیماریهای قلبی در بزرگسالی.

به طور کلی میزان فعالیت بدنی در این جمعیت پایین تر است و آنها را در معرض چاقی قرار می دهد و همچنین اختلالات حرکتی ممکن است افراد را از شرکت در فعالیتهای بدنی منع کند. انجام فعالیت بدنی منظم، وضعیت جسمانی افراد دارای اوتیسم را بهبود می بخشد و همچنین نقص الگوهای رفتاری را کاهش داده است. به طور ویژه، مطالعات انجام شده، نشان داده است، مشارکت در فعالیت بدنی متوسط و شدید هر دو عامل روانشناختی و فیزیولوژیک را در کودکان دارای اوتیسم بهبود داده اند (26).

همچنین نشان داده است که فعالیت ورزشی بر نتایج فکری و اجتماعی، عزت نفس و خوشبختی تاثیر مثبت دارد. به طور خاص ورزش هوازی در افراد دارای اوتیسم، شاخصهای BMI را کاهش داده و ترکیب بدن را به طور کلی بهبود می بخشد و همچنین رفتارهای آسیب رساننده به خود، رفتار پرخاشگرانه و رفتارهای غیرمخرب و ناخوشایند را کاهش می دهد (1).

نتیجه ­گیری

در گروههای سالم، پروتکل 1 ورزشی، پروتکل 2 ورزشی و پروتکل 1+2 ورزشی، افزایش بیان هر دو ژن ATG8 و ATG10 مشاهده شد. در صورتی که موشهای دریافت کننده­ی تیمروزال، پروتکل 1 ورزشی، پروتکل 2 ورزشی و پروتکل 1+2 ورزشی، کاهش بیان ژنهای ATG8 و ATG10 را نشان دادند.