ارزیابی اثر سیتوتوکسیسیتی متابولیتهای ترشحی و عصاره سلولی بیفیدوباکتریوم­های جداسازی شده از محصولات لبنی بر رده سلولی سرطان کولون (SW1116) و نرمال کلیه (HEK 293)

مریم ثریا و الهام معظمیان^*

ایران، شیراز، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شیراز، دانشکده علوم، کشاورزی و فناوری های نوین، گروه میکروب شناسی.

تاریخ دریافت: 18/04/1399          تاریخ پذیرش: 24/10/1399

چکیده

پروبیوتیکها مکمل خوراکی میکروبی زنده هستند و با افزایش غلظت باکتریهای مفید مثل لاکتوباسیلوس و بیفیدوباکتریوم و کاهش سطح میکروبهای بیماری­زا، میکروفلور روده را تغییر می­دهند. پروبیوتیکها توانایی قابل توجهی در درمان سرطان کولون دارند و ممکن است نقش مهمی در پیشگیری از سرطان داشته باشند. هدف از انجام این پژوهش جداسازی و شناسایی بیفیدوباکتریوم­ها و تأثیر متابولیتها و عصاره سلولی باکتری بر رده نرمال کلیه(HEK298) و رده سرطان  کولون (SW1116) می باشد. در این تحقیق 100 نمونه محصولات لبنی سنتی جمع آوری و جهت جداسازی بیفیدوباکتریوم­­ها روی محیط بیفیدوباکتریوم آگار کشت داده شد. پس از شناسایی باکتری به روش بیوشیمیایی و مولکولی، اثر سیتوتوکسیسیتی متابولیت ترشحی و عصاره سلولی باکتری بر روی رده­های سلولی سرطان کولون  و نرمال کلیه از طریق تست ام تی تی (MTT)
(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) ارزیابی گردید. در این تحقیق بیفیدوباکتریوم های جداسازی شده گونه بیفیدیوم شناسایی شد. نتایج نشان داد که متابولیت ترشحی بیفیدوباکتریوم بیفیدیوم(Bifidobacterium bifidum)  دو جدایه 2 و 3 بیشترین  اثر سیتوتوکسیسیتی (95 درصد) بر روی رده سرطان کولون نشان دادند. متابولیت ترشحی جدایه های 2 و 3 بر روی HEK-293 به ترتیب 12 درصد و 81 درصد اثر سیتوتوکسیسیتی نشان دادند. اثر سیتوتوکسیسیتی متابولیت ترشحی بیفیدوباکتریوم بیفیدیوم جدایه 2 بر روی رده نرمال HEK-293 بسیار کمتر از تاثیر آن بر روی رده سرطانی SW1116 می باشد. بنابراین می­توان با انجام مطالعه‌های بیشتر از این باکتری به عنوان یک محصول پروبیوتیک ضدسرطان، در درمان و پیشگیری از سرطان کولون استفاده نمود.

واژه های کلیدی: پروبیوتیک، بیفیدوباکتریوم بیفیدیوم، متابولیت ترشحی، عصاره سلولی باکتری ، رده سلولی SW1116 و .HEK-293

* نویسنده مسئول، تلفن: 09177110994  ، پست الکترونیکی: elhammoazamian@gmail.com 

مقدمه

فلور روده انسان حاوی انواعی از باکتریهاست. بسیاری از این باکتریها برای گوارش بهینه غذا مفیدند. دسته ای از این باکتریها که به باکتریهای پروبیوتیک معروف هستند، علاوه بر کمک به گوارش مولکولهای پیچیده، ترکیباتی مانند ویتامینها و آنتی بیوتیکهای مختلف را تولید می­کنند که برای بدن مفید می باشند. یکی از مهم­ترین منابع باکتریهای پروبیوتیک شیر و فرآورده های لبنی هستند (16 و 20). پروبیوتیکها با اتصال و ساکن شدن در دستگاه گوارش، باعث مهار رشد باکتریهای بیماری­زا می­شوند و تعادل میکروبی روده را بهبود می­بخشند و باعث ارتقا عملکرد سد مخاطی دستگاه گوارش می­شوند. مطالعات حیوانی و آزمایشگاهی و همچنین مطالعات همه‌گیر شناسی نقش مثبت باکتریهای پروبیوتیک در مقابل سرطان را نشان داد‌ه‌اند. اکثر مکانیسمهای پیشنهاد شده درگیر در مشخصات ضد سرطانی باکتریهای پروبیوتیک با حذف مواد سرطان‌زا، تولید مواد ضدتومورزا یا ضد جهش‌زا و افزایش ایمنی میزبان، درحال تغییر فعالیتهای متابولیکی میکروفلور روده و شرایط فیزیکی و شیمیایی کولون هستند. مرسوم­ترین گونه­های باکتریایی که به عنوان پروبیوتیک استفاده می­شود باکتری­های اسید لاکتیک­ می باشد که معروفترین آنها از جنسهای لاکتوباسیلوس و بیفیدوباکتریوم می­باشند. باکتریهای اسیدلاکتیک ارگانیسمهای پروبیوتیک مفیدی هستند که به بهبود تغذیه، تعادل میکروبی، افزایش ایمنی در درمان و فعالیت ضد­توموری به خوبی کمک می­کنند (2 و 19). محققان حدس می زنند که کاهش سطح  پی اچ (pH) کولون توسط بیفیدوباکتریوم­ها می­تواند علت مهار سرطان­زاها باشد. باکتریهای پروبیوتیک با ایجاد حالت اسیدیته، از رشد و تکثیر باکتریهای بیماری زای موجود در کولون جلوگیری می­نمایند و در سطح آنزیمهای باکتریایی مانند (بتاگلوکورونیدازها) که باعث تبدیل پیش سرطان­زاها به سرطان­زاها می­شوند، تعادل ایجاد می­کنند (5 و 26). مطالعات اخیر نشان می­دهند که عصاره سیتوپلاسمی و پپتیدوگلیکان مشتق شده از باکتریهای اسید لاکتیک سبب مهار تکثیر سلولهای سرطانی می­شوند (24 و 25). هدف از انجام این مطالعه ارزیابی تأثیر متابولیت ترشحی و عصاره سلولی بیفیدوباکتریوم بر رده های سلولی سرطان کولون  (SW1116) و نرمال کلیه (HEK-293) می باشد.

مواد و روشها

جمع آوری نمونه: این مطالعه تجربی به منظور جداسازی سویه­های بیفیدوباکتریوم از محصولات لبنی سنتی استان فارس در جنوب ایران انجام گرفت. در مجموع 100 نمونه محصولات لبنی سنتی جمع آوری و در فالکونهای استریل در درون بسته­های یخی به آزمایشگاه منتقل شد و تا شروع آزمایش در دمای یخچال نگهداری شد.

جداسازی و  شناسایی  باکتری  بیفیدوباکتریوم:  ابتدا  از

نمونه­های جمع آوری شده رقت سازی در سرم فیزیولوژی صورت گرفت و از نمونه رقت سازی شده جهت غنی سازی در محیط کشت اختصاصی بیفیدوباکتریوم آگار(BFM) (از شرکت مرک آلمان) تلقیح گردید و در شرایط بی­هوازی در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد.  پس از 72 ساعت کلونیهای مشکوک به بیفیدوباکتریوم با استفاده از تستهای مورفولوژی کلنی، رنگ آمیزی گرم، تستهای بیوشیمیایی شامل کاتالاز، اکسیداز  و تست تخمیر قندها (گلوکز، مانوز، اینوزیتول، سوربیتول، ساکارز، آمیلوز، آرابینوز) ارزیابی شد (11).  

شناسایی مولکولی: استخراج دی ان آ (DNA) با استفاده از دستورالعمل کیت (یکتا طب تجهیز، ایران) انجام شد. برای بررسی کیفیت  دی ان آ (DNA) استخراج شده از ژل آگارز یک درصد برای الکترفورز استفاده شد. سپس واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) با استفاده از پرایمرهای اختصاصی بیفیدوباکتریوم شامل FBif520 (5`GGG TGG TAA TGC CGG ATG3`) و RBif520 5`CCA CCG TTA CAC CGG GAA3`)) انجام شد. جهت تنظیم نمودن برنامه دمایی دستگاه ترموسایکلر از سویه استاندارد بیفیدوباکتریوم انیمالیس با کد PTCC1736 کلکسیون میکروبی ایران (سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران)، استفاده گردید. واکنش زنجیرة پلیمرازی با چرخه های واسرشته سازی اولیه در 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه، 30 چرخه با مرحله واسرشته سازی در 94 درجه سانتی گراد به مدت 1 دقیقه، مرحله اتصال آغازگر در دمای 57 درجه سانتی گراد به مدت 1 دقیقه، بسط در 72 درجه سانتی گراد به مدت 2 دقیقه و نهایتا یک چرخه بسط نهایی در 72 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه انجام شد. پس از انجام PCR ، به منظور بررسی وجود یا عدم وجود محصول مورد نظر و ا طمینان از انجام کامل و صحیح واکنش محصول PCR با استفاده از ژل آگارز 5/1% الکتروفورز گردید. در نهایت جهت تعیین گونه باکتری تعیین توالی محصول PCR به شرکت فرست بیس base)  (1^th کشور مالزی ارسال گردید. نتایج حاصل از توالی محصولات PCR با توالی­های موجود در بانک ژنی با برنامه بلاست  (BLAST) مقایسه گردید و میزان تشابه نمونه­های تعیین توالی شده با توالی موجود در بانک ژن مقایسه شد (3).

تهیه متابولیت ترشحی و عصاره سلولی بیفیدوباکتریوم­ها: به منظور جداسازی متابولیت ترشحی بیفیدوباکتریوم، باکتریهای جداسازی شده به محیط بیفیدوباکتریوم براث تلقیح گردید و به مدت 120 ساعت تحت شرایط بی هوازی در دمای 37 درجه سانتی گراد در انکوباتور گرمخانه شد. پس از آن نمونه ها را با دور 4000 به مدت نیم ساعت سانتریفیوژ و سپس مایع رویی جمع آوری شد. برای اطمینان از عدم حضور باکتری از فیلتر 2/0 میکرومتری استفاده گردید. متابولیت ترشحی جداسازی شده را در دمای 65 درجه سانتی گراد درون آون به مدت یک هفته نگهداری و تغلیظ  گردید. سپس وزن کرده و غلظت میلی گرم بر میلی لیتر با استفاده از پی بی اس (PBS) تهیه شد (18). برای تهیه عصاره سلولی بعد از کشت باکتری و انجام سانتریفیوژ رسوبهای جدا شده را با دستگاه سونیکاتور به منظور لیز تمام اجزاء باکتری عمل سونیکیشن انجام گردید. نمونه­ها را وزن کرده و با استفاده از نرمال سیلین اضافه کرده و با در دست داشتن وزن، غلظت آنها محاسبه گردید (1 و 2).

کشت سلول: در این تحقیق رده سلول سرطانی کولون SW1116 که شبیه اپی تلیال می باشد و رده نرمال HEK293 که از سلولهای کلیه جنین انسان گرفته شده از انستیتو پاستور تهیه شد. رده سلولی SW1116 به فلاسک حاوی محیط کشت سلولی  آر پی ام آی 1640 (RPMI) و رده سلولی HEK293 به محیط کشت  دی ام ای ام (DMEM) حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی، گلوتامین، پنی سیلین و استرپتومایسین کشت داده شدند. فلاسک حاوی سلول در داخل انکوباتور 37 درجه با 5 درصد  دی اکسید کربن به مدت 72 ساعت انکوبه شد. بعد از 72 ساعت برای ادامه رشد و پاساژ سلولها، با استفاده از  تریپسین 1X تریپسینه شده و پاساژ داده شدند. سوسپانسیون حاصل در 1500 دور در دمای 25 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. رسوب حاصل از سانتریفیوژ در آر پی ام آی 1640 تعلیق شده و تعداد سلولها با استفاده از رنگ تریپان بلو و لام نئوبار در 1 میلی لیتر شمارش شد (10).

تاثیر متابولیت ترشحی و عصاره سلولی حاصل از بیفیدوباکتریوم­ها بر سلولهای رده سرطانی SW1116 و نرمال HEK-293: 90 میکرولیتر از محیط کشت حاوی  1×10⁴سلول به هر خانه از پلیت 96 خانه ای اضافه کرده و به مدت 24 ساعت انکوبه گردید. پس از 24 ساعت سلولها با 10 میکرولیتر از متابولیت ترشحی و عصاره  سلولی به ترتیب با غلظتهای 03/0 و 04/0 میلی گرم بر میلی لیتر تیمار شدند. هر تست سه بار تکرار گردید و با کنترل منفی (سلول بدون تیمار) و کنترل مثبت تیمار شده بادی ام اس او (DMSO) به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد در مجاور  5 درصد دی اکسید کربن انکوبه و نتایج ثبت گردید. اثر سیتوتوکسیک متابولیتها و عصاره سلولی جدایه هایی که بیشترین تاثیر کشندگی را بر روی رده سلولی SW1116 داشتند، بر روی رده نرمال HEK-293 نیز مورد بررسی قرار گرفت (3 و 4).

آنالیز آماری: جهت تعیین مقدار IC50 از نرم افزار کرو اکسپرت (Curve expert) استفاده شد. برای انجام آنالیز اطلاعات گروههای آزمایشی مختلف از نرم افزار  اکسل و اس پی اس اس (SPSS) شماره 18 استفاده گردید. نتایج گروههای مختلف با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. از آزمون آماری آنوا (ANOVA) و  مجذور کای(Chi Squre) برای به دست آوردن واریانس داده ها جهت تعیین معنی دار بودن یا نبودن استفاده گردید.

نتایج

جداسازی و شناسایی بیفیدوباکتریوم: در شناسایی باکتری از نظر صحت جنس و گونه، کلونیهای گرد، محدب، سفید و پر انتخاب شده، و بعد ار رنگ آمیزی گرم در زیر میکروسکوپ به صورت باکتریهای گرم مثبت که به صورت Y یا V  شکل و به رنگ بنفش جداسازی شدند (شکل 1). تست کاتالاز منفی بود و در نهایت نتایج تست تخمیر قندها و مقایسه با جدول برگی برابر با بیفیدوباکتریوم بیفیدیوم  بود (شکل 2).

شکل1- کلونیهای بیفیدوباکتریوم روی محیط BFM آگار (سمت چپ) و رنگ آمیزی گرم بیفیدوباکتریوم (سمت راست).

شکل 2- نتایج الکتروفورز. ستونهای 7-1: جدایه های بیفیدوباکتریوم، ستون 9: مارکر 100 جفت بازی سینا ژن، ستون 8:  کنترل مثبت، ستون 10: کنترل منفی.

ارزیابی اثر سیتوتوکسیسیتی متابولیت ترشحی و عصاره سلولی جدایه­های بیفیدوباکتریوم بر رده سلولی سرطان کولون: نتایج ارزیابی اثر متابولیت ترشحی جدایه­های بیفیدوباکتریوم بعد از کشت 120 ساعته  بر روی رده سلولی SW1116 در کشت 24 ساعته و درصد زنده ماندن سلولهای سرطانی کولون در شکل (3) آمده است. متابولیت ترشحی دو جدایه 2 و 3 با غلظت 03/0 میلی گرم بر میلی لیتر بیشترین اثر سیتوتوکسیسیتی روی رده سلولی کولون دارا بودند که به ترتیب 9/94 درصد و2/94 درصد می باشد.

نتایج ارزیابی اثر عصاره سلولی جدایه­های بیفیدوباکتریوم بعد از کشت 120 ساعته  بر روی رده سلولی SW1116 در کشت 24 ساعته و درصد زنده ماندن سلولهای سرطانی کولون در شکل 4 آمده است. دو جدایه  6 و 17  با غلظت 04/0 میلی گرم بر میلی بیشترین اثر سیتوتوکسیسیتی بر روی رده سلولی کولون به ترتیب با 43 درصد و 32 درصد حاصل گردید.

شکل 3- ارزیابی درصد سلولهای زنده تیمار شده توسط متابولیتهای جدا سازی شده از جدایه­های بیفیدوباکتریوم.(کنترل منفی (بدون تیمار): Neg Crl،کنترل مثبت (DMSO):Pos Crl ، متابولیت ترشحی: S).

شکل4- ارزیابی درصد سلولهای زنده تیمار شده توسط عصاره سلولی بیفیدوباکتریوم های جدا سازی شده. (کنترل منفی (بدون تیمار): Neg Crl،کنترل مثبت (DMSO):Pos Crl ، عصاره سلولی باکتری: P).

تعیین 50 درصد کشندگی (IC50):ایزوله هایی که بیشترین اثر کشندگی را داشتند، IC50 آنها محاسبه گردید. خاصیت ضدسرطانی متابولیتها و عصاره سلولی ذکر شده در غلظتهای مختلف بررسی و نتایج بعد از 24 ساعت انکوباسیون ثبت گردید. بهترین اثر کشندگی متابولیتها در غلظت اولیه 03/0 گرم بر میلی لیتر و بهترین اثر کشندگی عصاره باکتری 04/0 گرم بر میلی لیتر می باشد. 50 درصد کشندگی متابولیت ترشحی  دو جدایه 2 و 3 و عصاره سلولی جدایه 6 با استفاده از نرم افزار Curve Expert محاسبه گردید. نتایج نشان داد که IC50 متابولیت ترشحی دو جدایه 2 و 3 و عصاره سلولی جدایه 6 به ترتیب 006/0 و 008/0 و 049/0 میلی گرم بر میلی لیتر به دست آمد.

ارزیابی اثر سیتوتوکسیسیتی متابولیت ترشحی و عصاره سلولی جدایه های موثر بر روی ردهHEK293: نتایج ارزیابی اثر متابولیت ترشحی جدایه­های 2 و 3 و عصاره سلولی جدایه­های 6 و 17 بعد از کشت 120 ساعته  بر روی رده سلولی HEK293 در کشت 24 ساعته و درصد زنده ماندن سلولهای نرمال کلیه در شکل(5) آمده است. عصاره سلولی جدایه 6 با غلظت 04/0 میلی گرم بر میلی لیتر و متابولیت ترشحی جدایه 2  با غلظت 03/0 میلی گرم بر میلی لیتر  بیشترین اثر سیتوتوکسیسیتی روی رده سلولی کولون و کمترین اثر را برروی سلولهای نرمال دارا بودند.

شکل 5- اثر سیتوتوکسیسیتی متابولیت ترشحی و عصاره سلولی جدایه های موثر بر روی ردهHEK293 . (کنترل منفی: Neg Crl، متابولیت ترشحی: S، عصاره سلولی: P).

نتایج توالی یابی و آنالیز BLAST: جدایه هایی که بیشترین اثر سیتوتوکسیسیتی را بر روی رده سلولی سرطان کولون داشتند تعیین توالی شدند. آنالیز داده ها نشان داد که جدایه 2  مربوط به باکتری بیفیدوباکتریوم بیفیدوم سویهTMC3115  با 99 درصد شباهت  و جدایه 3 مربوط به باکتری بیفیدوباکتریوم بیفیدوم سویه JCM 7004 با 99 درصد شباهت مشاهده گردید.

بحث

در جهان مطالعات زیادی در زمینه جداسازی و شناسایی باکتریهای پروبیوتیک صورت گرفته است. مارمول  و همکاران با بررسی چشم اندازهای اینده سرطان کولون بیان کردند که پروبیوتیکها یک درمان بالقوه برای سرطان کولون هستند و پروبیوتیکها میکروارگانیسمهای بادوامی هستند که بیفیدوباکتر و لاکتوباسیلوس از جمله مهمترین پروبیوتیکها در درمان سرطان کولون هستند. نقش حفاظتی پروبیوتیک بر این فرضیه استوار است که دیس بیوسیز دلیل اصلی سرطان کولون است (14 و 21). با توجه به اثرات درمانی متفاوت باکتریهای مختلف پروبیوتیک، باید سویه­ها و دوز موثر در درمان هر بیماری مشخص شود تا بتوان از پروبیوتیکها به عنوان درمان کمکی به همراه درمانهای رایج بیماریهای گوارشی استفاده کرد (3 و 27). نقش فلور میکروبی روده و باکتریهای اسید لاکتیک در پیشگیری از سرطان روده بزرگ از طریق افزایش باکتریهای مفید، کاهش سطح پاتوژن، تغییر سوخت و ساز بدن، فعالیت آنزیمی، کاهش التهاب و افزایش عملکرد سیستم ایمنی به دفاع در مقابل سرطان کمک می­کند (7 و 28). کو(Ku)  و همکاران با تحقیقی بر روی بیفیدوباکتریوم­ها دریافتند که آنها دارای سطح بالایی از کربوهیدراتهای میکروبی هستند که دارای فعالیت ضد توموری می­باشند و اثبات مهار انتخابی در سلولهای سرطانی با درمان پروبیوتیک با توجه به غربالگری و انتخاب مواد ضدسرطانی حیاتی است (16). سیروبا (Ciorba) و همکاران به منظور جلوگیری از عوارض گوارشی (موکوزیت و اسهال) در درمان سرطان از پروبیوتیکها استفاده نمودند که نتایج سودمندی به دنبال داشت (9). در سال 2012 پورجعفر و همکاران نقش باکتریهای پروبیوتیک را در پیشگیری از سرطان بررسی کردند و این نتایج حاصل شد که سویه­های بیفیدوباکتریوم و لاکتوباسیلوس از مهم­ترین میکروارگانیسمهای پروبیوتیک می­باشند و با تولید ترکیبات ضد سرطانی و ضد جهش زا در بدن انسان نقش اساسی در پیشگیری از سرطان را دارند (24). در مطالعه حاضر، بیفیدوباکتریوم بیفیدیوم به عنوان یک عامل بازدارنده از سرطان کولون استفاده شد و اثرات ضد سرطانی آن به اثبات رسید. همچنین اثر ضد سرطانی و افلاتوکسین زدایی پروبیوتیکهای اسید لاکتیک از طریق بهبود تعادل میکروبی دستگاه گوارش توسط کاسمانی(Kasmani)  و همکاران در سال 2010 انجام شد که دستگاه گوارش میزبان را به طور سودمندی تحت تاثیر قرار داد (12). پروبیوتیک و پربیوتیک در مراقبت­های اولیه سرطان کولون از طریق مکانیسمهای عمل مختلف از جمله: تحریک پاسخ ایمنی، کاهش التهاب به طور مستقیم برای مهار تشکیل تومور عمل می­کنند و باعث جلوگیری از سرطان کولون می شوند (9). بررسی کاهش امکان سرطان با استفاده از چند سویه پروبیوتیک در مقابل برخی مواد کارسینوژن در سال توسط مهرابیان و همکاران انجام شد و این نتیجه حاصل شد که کشت های پروبیوتیک اثر ضد جهشی و ضد سرطانی قوی دارند (22). در این تحقیق اثر متابولیت ترشحی و عصاره سلولی باکتری بیفیدوباکتریوم بیفیدیوم بر روی سلولهای سرطانی SW1116 و رده نرمال HEK293 مورد بررسی قرار گرفت و نتایج به دست آمده نشان داد که متابولیتهای ترشحی باکتری توانایی بیشتری نسبت به عصاره باکتری در مهار سرطان کولون را دارد. بر طبق مطالعات چو (Choi) بنیادی و همکاران در سال 2006 بر روی تعداد زیادی لاکتوباسیل­ها که توسط حرارت کشته شده بودند نشان داد که سبب کاهش درصد زیستایی رده های سلولهای سرطانی می باشد. آنها از رده سلولی HT-29 به عنوان رده سرطانی و از سلولهای فیبروبلاست انسانی به عنوان رده نرمال استفاده کردند و اثر سایتوتوکسیکی کمتری بر رده نرمال نسبت به رده سرطانی گزارش کردند(8). ی و همکاران نیز بر روی اثر سیتوتاکسیک باکتری پروبیوتیک کشته شده توسط حرارت و القا آپوپتوزیس بر رده سلولی HT-29 سرطان کولون و مقایسه آن با رده سلولی نرمال HEK-293  کار کردند و نتیجه گرفتند لاکتوباسیلوس برویس، اثر سیتوتوکسیک و القا آپوپتوزیس بر روی رده سلولی HT-29  نشان داد و اثر سایتوتوکسیک کمتری در رده سلولیHEK-293 نسبت به رده  HT-29 مشاهده کردند (6). در این تحقیق نشان داده شد اثر سیتوتوکسیسیتی متابولیت ترشحی بیفیدوباکتریوم بیفیدوم جدایه 2 بر روی رده نرمال HEK-293 بسیار کمتر از تاثیر آن بر روی رده سرطانی SW1116 می باشد. مطالعات نشان داده است که اجزای متفاوتی از باکتریها نظیر دیواره سلولی، پپتیدوگلیکان، عصاره سیتوپلاسم و حتی باکتری کامل کشته شده توسط حرارت همه دارای اثرات پیشگیرانه در برابر رده سلولهای سرطانی می باشند. باکتری کشته شده ایمن تر و با ثبات تر بوده و دارای اثری متشابه با انواع زنده آن است (27). لازم به ذکر است که فعالیت ضد تکثیری بسیار وابسته به سویه باکتری می باشد و از یک سویه به سویه دیگر متفاوت می­باشد، همچنین به کارگیری اجزای مختلف باکتری که قبلا به آن اشاره شد نیز نتایج متفاوتی در مهار تکثیر سلولهای سرطانی دارند. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که متابولیتهای ترشحی باکتری تاثیر بیشتری نسبت به عصاره باکتری بر روی رده سرطان کولون داشتند. زارعی و همکاران در سال 1396 اثرات مستقیم عصاره دیواره سلولی باکتری بیفیدوباکتریوم بیفیدوم بر تکثیر رده­ سلولی سرطانی اریترومیلوئیدی انسانی K562 را بررسی کردند و به این نتیجه رسیدند که عصاره­ باکتری منجر به مرگ بیشتر سلولهای سرطانی شده است (1). لی (Lee) و همکاران در تحقیقی گزارش کردند که عصاره سیتوپلاسمی باکتریهای لاکتوباسیلوس و بیفیدوباکتریوم  تاثیر مستقیمی بر مهار رشد رده سلولهای سرطانی داشته است (18). در تحقیق حاضر نتایج ارزیابی اثر عصاره سلولی ایزوله­های بیفیدوباکتریوم بیفیدیوم، بر روی رده سلولی SW1116 و درصد زنده ماندن سلولهای سرطانی کولون مورد بررسی قرار گرفت و بررسیها نشان داد عصاره سلولی دو جدایه بیفیدوباکتریم 6 و 17 بیشترین اثر سیتوتوکسیسیتی روی رده سلولی کولون دارا بودند که به ترتیب با 43 درصد و 32 درصد اثر کشندگی داشتند. کیم (Kim) و همکاران تاثیر اجزای سلولی ده نوع پروبیوتیک مختلف را بر یازده نوع رده سرطانی بررسی کردند. نتایج این محققان حاکی از تاثیر پروبیوتیکها بر مهار رده های سرطانی بود و این اثر را به پپتیدوگلیکان های آنها نسبت دادند (15). یوو  (You) و همکاران نشان دادند که سلول و عصاره سیتوپلاسمی بیفیدوباکتریوم بیفیدوم جداسازی شده از مدفوع انسانی می تواند اثر مهاری روی سلولهای سرطانی داشته باشد و همین طور قطعات پلی ساکاریدی جدا شده از بیفیدوباکتریوم بیفیدوم روی رشد سلولهای سرطانی در شرایط آزمایشگاهی (in vitro)  نقش مهاری دارد(29). در این تحقیق نیز نتایج ارزیابی اثر متابولیتهای ترشحی ایزوله بیفیدوباکتریوم بر روی رده سلولی SW1116 و درصد زنده ماندن سلولهای سرطانی مورد بررسی قرار گرفت که متابولیت ترشحی دو جدایه ی 2 و 3  بیشترین اثر سیتوتوکسیسیتی روی رده سلولی کولون دارا بودند که به ترتیب با درصدهای 1/5 درصد و8/5 درصد توان زنده ماندن را داشتند. در یک ارزیابی فعالیت ضد میکروبی مایع رویی کشت باکتریهای اسید لاکتیک مشاهده شد متابولیتهای ترشحی از رشد باکتریهای بیماری زا جلوگیری کردند و نقش مثبت این باکتریها در سلامت انسان به اثبات رسید (13). طی ارزیابی تاثیر متابولیتهای لاکتوباسیلوس رامونسوس جی جی بر روی رده سلولی سرطان کولون در سال 2012 مشخص شد. سه فاکتور زمان، غلظت و pH بر روی تاثیر مایع رویی کشت در مهار رشد سلولهای سرطانی اثر دارد (23). بنیادی و همکاران در رابطه با تاثیر پروبیوتیکها بر سرطان بررسیهایی انجام داد که نشان می دهد که باکتریهای پروبیوتیک ممکن است خطر سرطان را از طریق کاهش بروز آنها و سر کوب تومورها کاهش دهند. همچنین طبق مطالعات بالینی، مصرف پروبیوتیکها فعالیت سلولهای کشنده طبیعی و سطح ایمنوگلوبین ها را افزایش می دهد. او نتیجه گرفت که پروبیوتیکها پتانسیل خوبی دارند تا به عنوان یک استراتژی جدید برای درمان سرطان معرفی شوند (6). بررسی اثر بیفیدوباکتریوم بیفیدوم بر روی رده سلولهای سرطانی روده بزرگ در سال 2013 توسط محمودی اصل زاده مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این تحقیق نشان داد که اثر مهاری وابسته به غلظت بوده و غلظت 30 میکرولیتری تا 80 در صد از رشد سلولهای توموری را مهار کرده است (3). در تحقیق حاضر نیز اثر کشندگی با افزایش غلظت افزایش یافت و در غلظت 03/0 میلی گرم بر میلی لیتر بیشرین اثر متابولیت باکتری و در غلظت 04/0 میلی گرم بر میلی لیتر بیشترین اثر کشندگی عصاره باکتری بر روی رده سرطانی کولون مشاهده شد. با کاهش غلظت در هر دو نمونه اثر کشندگی کاهش یافت که با نتایج محمودی اصل زاده مطابقت دارد. پس می توان نتیجه گرفت اثر مهاری وابسته به غلظت می باشد.  نتایج این تحقیق نشان داد متابولیت ترشحی بیفیدوباکتریوم بیفیدیوم جدایه 2 به میزان زیادی باعث کاهش تکثیر سلولهای سرطانی می شود. بنابراین با توجه به اثرات مثبت متابولیت ترشحی و عصاره سلولی بیفیدوباکتریوم بر روی رده سلولی SW1116 و میزان سمیت کم بر روی بر روی رده نرمال HEK293 می توان پروبیوتیکها را به عنوان عاملی برای پیشگیری از سرطان کولون معرفی کرد. اما تحقیقات بالینی بیشتری برای فهم مکانیسم های اصلی که پروبیوتیکها در سرطان کولون ایفا می کنند نیاز است.