بررسی میانکنش نانوذره اکسید آهن (Fe₂O₃) با آلبومین سرم انسانی با استفاده از

تکنیک­های  فلورسانس و دورنگ نمایی دورانی

علی ریاحی مدوار¹، علیرضا قاسمی نسب²،  فرشید برزگری دهج³، فاطمه رضائی⁴ و زهرا زمانی⁵

¹ ایران، بجنورد، دانشگاه کوثر بجنورد، دانشکده علوم پایه، گروه زیست­شناسی سلولی و مولکولی.

² ایران، کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، دانشکده علوم و فناوری­های نوین، گروه بیوتکنولوژی.

³ ایران، کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی.

⁴ ایران، مشهد، دانشگاه فردوسی، دانشکده علوم، گروه زیست­شناسی.

⁵ ایران، کرمان، دانشگاه شهید باهنر، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی.

تاریخ دریافت: 14/01/1400          تاریخ پذیرش: 1/06/1400

چکیده

نانوذرات کاربردهای وسیعی در صنایع مختلف دارند، بنابراین می­توان انتظار داشت که آنها راهی را برای ورود به محیط زیست پیدا کنند و حیات موجودات زنده را با عواقب غیر قابل پیش­بینی تحت تاثیر قرار دهند. با توجه به کاربردهای گسترده نانوذره اکسید آهن nFe₂O₃)) در صنایع مختلف، در این مطالعه، میانکنش این نانوذره در غلظت­های مختلف با یکی از فراوانترین پروتئین­های موجود در خون، یعنی آلبومین سرم انسانی (HSA) با استفاده از روش­های فلورسانس ذاتی در دماهای مختلف، فلورسانس خارجی و دورنگ نمایی حلقوی (CD)، مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که با افزایش غلظت نانوذره در محیط و در تمام دماها، نشر فلورسانس ذاتی پروتئین کاهش می­یابد. بر اساس ثابت سرعت خاموشی، مشخص گردید که مکانیسم برهمکنش بین HSA و nFe₂O₃ از نوع پایا می­باشد. پارامترهای ترمودینامیکی نشان داد که آنتالپی (H∆) و آنتروپی (S∆) هر دو منفی می­باشند که این مساله نشان دهنده نقش پیوندهای هیدروژنی و نیروهای واندروالسی در این میانکنش می­باشند. منفی بودن تغییرات انرژی آزاد واکنش (G°∆)، بیانگر انرژی­زا بودن و خودبخودی بودن این واکنش می­باشد. از طرف دیگر، نشر فلورسانس خارجی ANS در حضور HSA میانکنش داده با نانوذره نسبت به HSA بیشتر افزایش می­یابد. علاوه بر این، طیف­های ناحیه دور دورنگ­نمایی حلقوی، نشان دهنده تغییر در ساختار دوم پروتئین پس از میانکنش با نانوذره می­باشد. این نتایج در مجموع، نشان دهنده تغییراتی در ساختار پروتئین بعد از در معرض قرار گرفتن با این نانوذره می­باشد که می­تواند عملکرد آن را تحت تاثیر قرار دهد.

واژه­های کلیدی: آلبومن سرم انسانی، فلورسانس،  دورنگ نمایی دورانی، نانو ذره اکسید آهن.

* نویسنده مسئول، تلفن: 05832262863 ، پست الکترونیکی: Riahi.ali@gmail.com

مقدمه

در سال‌های اخیر استفاده از نانوذرات در محصولات تجاری و صنعتی با توجه به ویژگی­های منحصر به ­فرد آن­ها از قبیل اندازه و ابعاد آن­ها افزایش چشمگیری داشته است (33). نانوذرات در صنایع مختلف (از قبیل صنایع غذایی، میکروالکترونیک، نساجی، نظامی و ساختمان سازی)، بیوتکنولوژی (انتقال ژن و طراحی نانوبیوسنسورها) و پزشکی (ساخت داروی خاص، غربال­گری دارو، طراحی روش­های دارو رسانی و تصویر برداری از سلول­ها­ و بافت­ها) کاربردهای بسیار زیادی دارند (15 و 48). بطور کلی به ذرات و ترکیبات که ابعاد آن­ها کمتر از 100 نانومتر باشند نانو ذره گفته می­شود (6 و 32).

فناوری نانوذرات آهن یکی از اولین نسل‌های فناوری‌های محیطی در مقیاس نانو است (44). در طی چند سال گذشته، تکنیک‌های مختلفی برای ساخت و تولید این نانوذرات (54)، تغییر خواص سطحی (39) و افزایش کارایی برای واکنش‌پذیری آن‌ها ایجاد شده است (54). مطالعات گسترده آزمایشگاهی نشان داده است که ذرات آهن در مقیاس نانو برای انتقال دامنه وسیعی از آلودگی‌های زیست محیطی مانند حلال‌های زیستی اشباع از کلر (54)، آفت‌کش‌های ارگانوکلراید (39)، رنگ‌های آلی، ترکیبات غیرآلی مختلف و یون‌های فلزی مانند As(III)،Pb(II) ،Cu(II) ، Ni(II) و Cr(VI) (4) کارامد هستند. علاوه بر آن، نانوذرات اکسید آهن به طور گسترده به عنوان حامل­هایی برای دارورسانی به دلیل خاصیت مغناطیسی و زیست سازگاری (2) در درمان چندین نوع سرطان بکار گرفته شده­اند (14). خواص منحصر به فرد نانوذرات مثل سطح ویژه بالا، جایگاه سطحی فعال و تحرک می­تواند منجر به خطرات زیست محیطی یا سلامتی شود. گزارش های متعددی از سمیت نانوذرات بر موجودات مختلف از جمله  سلول­های ریه (50)، سلول­های قرمز خون (35)، گیاهان (26)، موش­ها (55)، ماهی­ها (19) و حتی رده­های سلولی پستانداران (10) و خرچنگ­ها (7)  ثابت شده است.

بررسی میانکنش نانوذرات و سلول‏های زنده می­تواند منجر به توانایی­های تشخیصی و درمانی جدیدی مانند ژن درمانی و دارو­رسانی هدفمند شود (30). برای مثال، به دلیل خاصیت مغناطیسی و زیست سازگاری نانوذرات اکسید آهن (2)، این نانوذره به طور گسترده به عنوان حامل­هایی برای دارو رسانی در درمان چندین نوع سرطان مورد استفاده قرار گرفته­اند (14). مطالعات مختلفی به منظور بررسی میانکنش نانوذرات با پروتئین­ها انجام شده است (9، 31، 1، 36 و 53).

آلبومین سرم انسانی (HSA)، پروتئین کروی با 585 اسید­آمینه می­باشد. این پروتیئن با غلظت 42 گرم بر لیتر فراوان‌ترین پروتئین موجود در پلاسمای خون و بیشترین تاثیر (حدود 80 درصد) را بر فشار اسمزی خون دارد (27) و همچنین ‌در انتقال برخی ترکیبات داخلی و خارجی از قبیل داروها، هورمون‌ها و اسیدهای چرب، نقش مهمی بر عهده دارد (29 و 45).  تا کنون از روش­های مختلفی جهت مطالعه تاثیر مواد بر ساختار پروتئین­ها استفاده شده است، که از مهمترین آنها می­توان به روش­های طیف­سنجی فلورسانس، طیف­سنجی مرئی- ماورای بنفش، دورنگ نمایی حلقوی (CD) و رزونانس مغناطیس هسته­ای (NMR)  اشاره نمود (24 و 47). از بین روش‌های مذکور، فلورسانس به دلیل حساسیت بالا، انتخابگری و سهولت کاربرد آن به صورت گسترده­تری مورد استفاده قرار گرفته است (13). میانکنش HSA با Ciprofloxacin (ماده­ای با خاصیت ضد باکتریایی) در حضور و عدم حضور با نانوذرات نقره با استفاده از طیف­سنجی فلورسانس مورد بررسی قرار گرفت و نشان داد شد که در حضور Ciprofloxacin، نشر فلورسانس این پروتئین با مکانیسم پایا خاموش ولی در حضور نانوذرات نقره، میانکنش HSA با این ماده متفاوت می­باشد (23). در اتصال لیگاند به پروتئین اساساً چهار نوع میانکنش غیر­کوالانسی (پیوندهای هیدروژنی، میانکنش­های هیدروفوبی، نیروی واندروالسی و الکتروستاتیک­) نقش دارند. نوع نیروی دخیل در این  میانکنش­ها را می توان با توجه به علامت و بزرگی پارامترهای ترمودینامیکی شامل آنتالپی (H°∆) و آنتروپی (S°∆) در یک واکنش مشخص نمود. اگر پارامترهای آنتالپی و آنتروپی هر دو بزرگتر از صفر باشند، میانکنش هیدروفوب و اگر هر دو پارامتر مذکور کوچکتر از صفر ­باشند، میانکنش­های واندروالسی و پیوند هیدروژنی و اگر آنتروپی بزرگتر از صفر و آنتالپی کوچکتر از صفر باشند، میانکنش­های الکتروستاتیک در اتصال پروتئین با لیگاند دخالت دارند (34). بررسی میانکنش بین نانوذرات نقره با سرم آلبومین گاوی (BSA) نشان داد که میانکنش­­های هیدروفوب و الکتروستاتیک در این میانکنش دخالت دارند و واکنش از طریق مکانیسم پویا انجام می­شود (36). بررسی میانکنش بین نانوذرات مس با BSA توسط Bhogale و همکاران در سال 2014 (9) نشان داد  که میانکنش­های هیدروفوب از طریق مکانسیم پایا انجام می­گیرد. مطالعات انجام شده نشان داد  که میانکنش بین نانوذرات مس با سرم آلبومین انسانی از طریق مکانسیم پایا و با استفاده از میانکنش­های الکتروستاتیک صورت می­گیرد (1). همچنین بررسی مکانیسم­­­های برهمکنش HSA با نانو حامل مغناطیسی غیر آلی حاوی L-Dopa با استفاده از طیف سنجی فلورسانس نشان داد که با افزایش دما، ثابت استرن-ولمر (Ksv) کاهش می­یابد. همچنین  طیف سنجی UV-vis و CD نشان داد که برهم کنش HSA با این نانوذره برخی از تغییرات ساختاری را در HSA اعمال می­کند (41). علاوه بر این، برهمکنش نانوذره اکسید منیزیم (MgO NPs) با HSA با استفاده از طیف­سنجی فلورسانس و CD نشان داد که میانکنش این نانوذره با HSA از طریق میانکنش آبگریز صورت می­گیرد (8). در این تحقیق، با استفاده از روش­های طیف­سنجی فلورسانس و دورنگ نمایی حلقوی،  میانکنش آلبومین سرم انسانی با غلظت­های مختلف نانوذره Fe₂O₃ در شرایط شبه فیزیولوژیک مورد بررسی قرار داده شد.

مواد و روشها

در این مطالعه، مواد مورد استفاده شامل نانوذره اکسید آهن (nFe₂O₃) با درصد خلوص 2/99%، مساحت سطح m²g^-1 55 و  میانگین اندازه40 نانومتر از شرکت ناباند تکنولوژی (NaBond Technologies Co., Ltd., China) خریداری شد. سرم آلبومین انسانی (HSA) و8-Anilinonaphthalene-1-sulfonic acid (ANS) از شرکت سیگما تهیه شدند. KH₂PO₄ و K₂HPO₄ از شرکت مرک خریداری گردید. طیف های فلورسانس HSA در حضور و عدم حضور نانو دره از دستگاه اسپکتروفلوریمتر (Cary-Eclipse luminescence spectrophotometer apparatus;Varian, Australia) ثبت گردید.

آماده­سازی مواد: یک استوک از سرم آلبومین انسانی (غلظت 5/0 میلی­مولار) در بافر فسفات پتاسیم 50 میلی­مولار با  4/7pH= تهیه گردید. استوک nFe₂O₃ با غلظت یک میکرومولار در بافر فسفات پتاسیم 50 میلی­مولار (4/7pH=) تهیه شد. از دستگاه سونیکاتور جهت تهیه سوسپانسیونی یکنواخت از نانوذره اکسید آهن (پنج دقیقه با فاصله زمانی یک دقیقه استراحت) استفاده شد.

اندازه­گیری تغییرات شدت فلورسانس ذاتی HSA در میانکنش nFe₂O₃ : طیف­های فلورسانس مربوط HSA در حضور و عدم حضور nFe₂O₃  درطول موج تحریک   295 و محدوده طول موج نشری 500-300 نانومتر ثبت شدند. سرعت اسکن (Scan Speed) ثبت طیف­ها برابر 500 نانومتر بر دقیقه و پهنای باند نور ثبت شده یا تابیده شده توسط دتکتور ((Slit 5 نانومتر بود. در این مطالعه، پس از اضافه کردن پروتئین با غلظت 5 میکرومولار و نانوذره با محدوده غلظت­های 4-0 نانومولار (صفر، 4/0، 8/0، 2/1، 6/1 ، 0/2 ، 4/2، 8/2، 2/3، 6/3 و 4 ) در سل کوارتز با طول مسیر عبور نور یک سانتی­متری، حجم نهایی محلول، با بافر فسفات پتاسیم 50 میلی­مولار با pH برابر 4/7، به 5/2 میلی­لیتر رسانده شد و پس از انکوبه شدن محلول مورد نظر در دماهای 298، 303 و 310  درجه کلوین به مدت 10 دقیقه، طیف فلورسانس ذاتی HSA در طول موج  تحریک 295 نانومتر ثبت گردید (1). مطالعات قبلی نشان داده است که HAS در محدوده دمایی 298، 303 و 308 درجه کلون، تغییر ساختاری بارزی پیدا نمی­کند (12 و 42). مطالعات نشان داده شده است که در دمای بالاتر از 333 درجه کلوین، ساختار HSA تغییر می‍کند (46)، لذا در دماهای بالاتر از این دما، مطالعات فلورسانس جهت بررسی تغییرات اتصال لیگاند به این پروتئین پیشنهاد نمی­شود.

بررسی نوع مکانیسم میانکنش HSA با nFe₂O₃ و تعداد جایگاه اتصال: جهت تعیین نوع میانکنش HSA با nFe₂O₃ نمودار استرن-ولمر مربوط به شدت فلورسانس (در طول موج 340 نانومتر) بر غلظت نانوذره، ترسیم گردید. بر اساس معادله 1،  ثابت­های خاموشی بدست آمد.

معادله 1             

F شدت‌ فلورسانس پروتئین در حضور و  F₀در عدم حضور خاموش کننده می­باشند. K_SV؛ ثابت خاموشی دینامیک استرن- ولمر می­باشد که از رگرسیون خطی نمودار F0/F در مقابل غلظت خاموش کننده (Q)  بدست می­آید، k_q؛ ثابت سرعت خاموشی پروتئین، [Q]؛ غلظت خاموش کننده (18، 25، 16) و ؛ متوسط نیمه عمر پروتئین بدون خاموش کننده (5 نانوثانیه) می­باشند (51). علاوه بر این، براساس معادله 2 مقدار k_q محاسبه گردید.

معادله  2               

ثابت اتصال و همچنین تعداد جایگاه­های اتصال پروتئین به نانوذره بر اساس معادله 3 مشخص گردید.

 معادله 3

در این معادله F شدت‌ فلورسانس پروتئین در حضور و  F₀در عدم حضور خاموش کننده، n؛ تعداد جایگاه‌های اتصال HSA برای nFe₂O₃ و KA؛ ثابت اتصال برحسب مولار می­باشد (22).

تعیین پارامترهای ترمودینامیکی: براساس معادله 4، پارامترهای ترمودینامیکی شامل آنتالپی و آنتروپی بمنظور تشخیص نیروهای دخیل در میانکنش HSA با nFe₂O₃  تعیین شدند.

معادله 4

در این معادله؛ DH⁰ وDS⁰ بترتیب آنتالپی واکنش (بر حسب کالری بر مول بر درجه کلوین) و آنتروپی واکنش (ژول بر مول.کلوین) میباشند و همچنین R: ثابت گازها (مول.کلوین بر ژول) و K : ثابت استرن ولمر در دماهای مختلف (برحسب عکس مولار) می­باشند (13 و 37).

براساس معادله 5، مقدار انرژی آزاد گیبس (کیلو­کالری بر مول) محاسبه گردید.

معادله 5

اندازه­گیری فلورسانس ANS : فلورسانس ANS با غلظت 30 میکرومولار در بافر فسفات پتاسیم 50 میلی­مولار (4/7 pH=) حاوی غلظت یک میکرومولار HSA در عدم حضور (غلظت صفر نانو­ذره) و حضور nFe₂O₃ (4/0 نانومولار) با شرایط زیر اندازه­گیری شد.

طیف­های فلورسانس مربوط ANS در حضور و عدم حضور nFe₂O₃ در طول موج تحریک 350 و محدوده طول موج نشری600-400  نانومتر ثبت شدند. سرعت اسکن طیف­ها و پهنای باند نور ثبت شده مشابه اندازه­گیری تغییرات شدت فلورسانس ذاتی بود.

مطالعه برهمکنش HSA با nFe₂O₃ با استفاده از مطالعات CD : بمنظور بررسی ساختار دوم پروتئین سرم آلبومین انسانی در برهمکنش با nFe₂O₃ از دستگاه اسپکتروپلاریمتر (AVIV Spectropolarimeter, model 215, USA) استفاده شد. طیف­ها،  در محدوده 190 تا 250 نانومتر (Far-UV CD) در محلول پروتئین با غلظت 3/0 میلی­گرم بر میلی­لیتر در حضور و عدم حضور نانوذره  (2 نانومولار) پس از 10 دقیقه انکوبه کردن در دمای اتاق، ثبت شدند.

در نهایت نتایج به صورت بیضی واری مولی، [θ] (deg²cm²dmol^-1)⁴ بر اساس میانگین وزن اسید­آمینه  (MRW; 113.9) ارائه شد. این پارامتر با فرمول زیر محاسبه گردید.

[θ]λ = (θ×100MRW)/(cl)

C غلظت پروتئین برحسب ، L طول مسیر نور (cm) از کووت حاوی نمونه و  پارامتر بیضی‌واری اندازه‌گیری ‌شده برحسب درجه در طول موج  خاص می‌باشند.

دستگاه توسط Comphorsolphpnic 10- (+) با فرض ^1-=7820 deg cm² dmol‌[θ] ₂₉₁ توسط استاندارد JASCO  بنام Comphorsulphonte-10- (+) nonhyodroscopic ammunium با فرض ^-=7820 deg cm² dmol [θ] 290.5 کالیبر گردید (38).

نتایج

تغییرات فلورسانس ذاتی  HSAدر حضور nFe₂O₃ در دماهای مختلف 298، 303 و 308 درجه کلوین: نتایج مربوط به طیف فلورسانس ذاتی HSA در حضور غلظت­های مختلف نانوذره اکسید آهن و در دماهای مختلف در شکل­ 1 بیانگر این است که شدت فلورسانس با افزایش غلظت نانوذره در محیط کاهش می­یابد.  علاوه بر این، نتایج بدست آمده از معادله استرن-ولمر مربوط به این طیف­ها (شکل­ 2) نشان دهنده کاهش خطی نشر فلورسانس ذاتی پروتئین HSA با افزایش غلظت نانوذره در محیط در تمامی دماها می­باشد. شیب معادله استرن-ولمر مربوط به HSA در حضور غلظت­های مختلف Fe₂O₃ بیانگر این است که با افزایش دما، شدت فلورسانس کمتر کاهش یافته است (شکل­ 2).

شکل 1- فلورسانس ذاتی HSA در عدم حضور و حضور غلظت­های مختلف nFe₂O₃ (بافر فسفات 50 میلی­مولار، 4/7pH=). (A) دمای 298 ، (B) دمای 303 و (C) دمای 310  درجه کلوین.

شکل 2- مقایسه نمودار استرن-ولمر برهمکنش پروتئین HSA با غلظت­های مختلف nFe₂O₃ در دمای­های 298 (♦)،303 (¾) و 310 (▲) درجه کلوین.

تعیین نوع میانکنش HSA و Fe₂O₃ : با توجه به معادله مربوط به نمودارهای استرن-ولمر، K_sv و  K_q محاسبه و در جدول 1 نشان داده شد. همانطور که در جدول قابل مشاهده است، ثابت خاموشی استرن-ولمر (K_sv) با افزایش دما کاهش یافته است و روند مشابهی برای ثابت سرعت خاموشی فلورسانس (K_q) نیز مشاهده می­گردد.

تعیین پارامترهای ترمودینامیکی در میانکنش HSA و Fe₂O₃ : محاسبه پارامترهای ترمودینامیکی میانکنش  nFe₂O₃با HSA بر مبنای معادله خط بدست آمد از نمودار وانت هوف (شکل 3) و بر اساس معادله 4، بیانگر این است که علامت هر دو پارامترهای آنتالپی و آنتروپی منفی می­باشد (جدول 2). از طرف دیگر، محاسبه مقدار انرژی آزاد بر اساس معادله 5 برای این میانکنش در دماهای مختلف بیانگر این است که علامت این انرژی منفی بوده و همچنین با افزایش دما افزایش یافته است.

جدول 1- ثابت­های خاموشی میانکنش HSA با nFe₂O₃

شکل 3- نمودار وانت هوف مربوط به میانکنش نانوذره اکسید آهن با آلبومین سوم انسانی.

جدول 2- پارامترهای ترمودینامیکی میانکنش nFe₂O₃ با آلبومین سوم انسانی.

تعیین ثابت اتصال و جایگاه­های اتصال Fe₂O₃ بر روی HSA : براساس نتایج جدول 3، مقادیر K_a و n برای برهمکنش نانوذره اکسید آهن با پروتئین سرم آلبومین انسانی بیانگر این است که با افزایش دما،  میزان  n و ثابت اتصال کاهش می­یابد.

فلورسانس ANS در حضور و عدم حضور نانو ذره اکسید آهن : همانطور که در شکل 4 قابل مشاهده است، شدت فلورسانس ANS در حضورHSA (در حضور و عدم حضور نانوذره) افزایش یافته است. این افزایش در حضور HSA میانکنش داده با نانوذره اکسید آهن،  بیشتر می­باشد.

جدول 3- ثابت اتصال و تعداد جایگاه برای nFe₂O₃ با HSA.

نتایج طیف­سنجی دورنگ نمایی دورانی: شکل 5، طیف مربوط به دورنگ­­نمایی دورانی در ناحیه فرابنفش دور پروتئین HSA واکنش داده با نانوذره اکسید آهن را در مقایسه با پروتئین HSA نشان می­دهد. براساس شکل، میزان بیضوی­واری در پروتئین میانکنش داده با نانوذره، افزایش یافته است (شکل 5).

شکل 4- طیف فلورسانس خارجی ANS (به تنهایی) و در حضور HSA  و HSA میانکنش داده با غلطت 4/0 نانومولار nFe₂O₃.

شکل 5- طیف دو رنگ­نمایی دورانی پروتئین سرم آلبومین انسانی با غلظت 2 نانومولار nFe₂O₃ در ناحیه فرابنفش دور (بافر پتاسیم فسفات 50 میلی مولار، 4/7pH=، دمای 298 درجه کلوین).

بحث

آزاد شدن نانوذرات در محیط زیست به دلیل افزایش تولید و کاربرد زیاد آن‌ها امری اجتناب ناپذیر است. بسیاری از نانوذرات در نهایت در مقیاس وسیع به محیط زیست رها سازی می­شوند (28)، در حالیکه سمیت و ضرر آن‌ها برای موجودات زنده و ارگانیسم­ها نا­شناخته مانده است. آلبومین نقش­های مهمی در انتقال، پخش داروها و تنظیم pH خون دارد (11). مطالعه میانکنش داروها با این پروتئین اطلاعاتی راجع به موقعیت، انتقال، متابولیسم و اثر بخشی داروها در خون می­دهد. بنابراین، اهمیت مطالعه اتصال مولکول­های کوچک به این پروتئین مورد توجه قرار گرفته است (13). بمنظور بررسی میانکنش مولکول­های کوچک با پروتئین­ها، روش فلورسانس یک ابزار قدرتمند به دلیل دقت و حساسیت به حساب می­آید (49). فلورسانس ذاتی HSA به دلیل وجود یک مولکول تریپتوفان در موقعیت 214 در ساختار آن می­باشد (20).

همانطور که در نتایج (شکل­ 1)  نشان داده شده است، شدت فلورسانس در تمامی دماها با افزایش غلظت نانوذره در محیط کاهش می­یابد. از معادله استرن-ولمر مربوط به این طیف­ها، مشخص می­شود که بین شدت خاموشی فلورسانس و غلظت نانوذره در محیط رابطه خطی وجود دارد. این نتایج با مطالعات انجام شده توسط Sun و همکارانش همخوانی دارد (43). آنها نشان دادند که یک رابطه خطی بین افزایش غلظت نانوذره اکسید آلومینیوم با کاهش نشر فلورسانس HSA در محیط وجود دارد. علاوه بر این، مطالعات انجام شده بر روی این پروتئین در تیمار با نانوذره اکسید مس نیز نشان داد، که بین کاهش نشر فلورسانس ذاتی HSA و غلظت نانوذره اکسید مس رابطه مستقیمی وجود دارد (1) که با نتایج حاصل از این تحقیق مطابقت دارد. از طرف دیگر، تغییر جزئی در انتقال ماکزیمم طول موج نشری در حضور نانوذره به سمت ناحیه آبی (blue shift)، ­می­تواند دلیلی به تغییر قطبیت محیط اطراف تریپتوفان باشد (33).

ثابت خاموشی استرن-ولمر (Ksv) بیانگر کارایی خاموشی می­باشد (21)، همانطور که در جدول 1 نشان داده شده است، با افزایش دما، این ثابت کاهش می­یابد که نشان دهنده کاهش تمایل اتصال لیگاند به HSA با افزایش دما می­باشد. روند مشابه­ای در برهمکنش نانوذره اکسید مس با پروتئین سرم آلبومین انسانی گزارش شده است که با نتایج حاصل از این تحقیق کاملاً همخوانی دارد (1). علاوه بر این، نتایج مشابهی در اتصال CdTe:Zn2+  به HSA  گزارش گردیده است (23). از آنجائیکه، ثابت سرعت خاموشی در تمامی دماها، بالاتر از Kq مربوط به این ملکول زیستی (2.0×1010L mol-1 s-1) می­باشد، پیشنهاد می­گردد که مکانیسم میانکنش بین HSA و nFe2O3 از نوع پایا می­باشد (13، 18 و 23). بر اساس نتایج گزارش شده در جدول 2 انرژی آزاد (G∆) منفی است که بیانگر آزاد شدن انرژی طی انجام این واکنش و خودبه­خودی واکنش می­باشد (23).

بر اساس نتایج، آنتالپی و آنتروپی هر دو کوچکتر از صفر می­باشند که نشان دهنده نقش پیوند هیدروژنی و نیروهای واندروالس در این میانکنش می­باشد. نتایج مشابهی در میانکنش آنزیم بتا گالاکتوزیداز با نانوذرات اکسید مس نیز گزارش شده است (31). این مشاهدات با نتایج گزارش شده در میانکنش HSA با نانوذره اکسید مس (با اندازه متوسط 60 نانومتر) مطابقت ندارد، مشخص شده بود که میانکنش­های الکتروستاتیک عامل اصلی اتصال نانوذره اکسید مس با پروتئین HAS  می­باشد (1). مطالعات انجام شده بمنظور بررسی تغییر اندازه نانوذره نقره توسط ایرانفر و همکاران در سال 2012 (23) نشان داده شده است که ثابت معادله استرن-ولمر و همچنین ثابت سرعت خاموشی با تغییر و افزایش اندازه نانوذره نقره در حضور Ciprofloxacin افزایش می­یابد. لذا بنظر می­رسد که اندازه، ماهیت و همچنین غلظت نانوذره می­تواند به نوع نیروهای دخیل در اتصال و همچنین مکانسیم اتصال نیز تاثیر بگذارد.

همانطور که در جدول 3 قابل مشاهده می­باشد، تعداد جایگاه­های اتصال (n) برای برهمکنش این نانودره با HSA با افزایش دما، کاهش می­یابد، این نتایج با گزارشات مربوط به میانکنش HSA با نانوذره اکسید مس مغایرت دارد (1). از طرف دیگر، نتایج نشان داد که در میانکنش HSA با نانوذره اکسید آهن، ثابت اتصال (K_a) کاهش می­یابد که با نتایج بدست آمده از میانکنش  HSAبا نانوذره اکسید مس مغایرت (1) و با میانکنش HAS با  ترکیب جدیدی از آکریدین (N-{[N-(2-dimethylamino) ethyl] acridine-4-carboxamide}-a-alanine [N-(ACR-4-CA)-a-ALA]) مطابقت دارد (13). در هر صورت، تغییر در ثابت اتصال نانوذره اکسید آهن (با اندازه متوسط 40 نانومتر) و نانوذره اکسید مس (با اندازه متوسط 60 نانومتر) می­تواند به دلیل اندازه متفاوت این ذرات باشد (23).

ANS  به علت اینکه یک فلوروفور هیدروفوب است، نشر آن پس از اتصال به محیط­های هیدروفوب افزایش می­یابد (5 و 52). براساس شکل 4، شدت نشر فلورسانس ANS در حضور HSA افزایش یافته است، ولی شدت نشر در زمانیکه پروتئین به نانوذره متصل می­باشد بیشتر می­شود. با توجه به افزایش بیشتر شدت نشر ANS در پروتئین میانکنش داده با نانوذره، پیشنهاد می­شود که نانوذره با پروتئین میانکنش داده و باعث افزایش پاکت­های هیدروفوب دردسترس می­شود (31). نتایج حاصل از میانکنش HSA با نانوذره اکسید آهن با نتایج  مربوط به افزایش نشر فلورسانس ANS در HSA میانکنش داده با نانوذره اکسید مس، مطابقت دارد (1). افرایش نشر افزایش نشر فلورسانس ANS  و همچنین کاهش نشر فلورسانس ذاتی HSA در کمپلکس با نانوذره اکسید آهن، می­تواند نشان دهند باز شدن  (فشرده­گی کمتر) ساختار این پروتئین پس از اتصال به نانوذره باشد (3).

همانظور که در شکل 5 قابل مشاهده است، پیک­ها در دو طول موج 208 و 222 نانومتر مینیمم می­باشد که نشان دهنده محتوی بالای آلفا هلیکس در این پروتئین­ها می­باشد. در میانکنش HSA با نانوذره، میزان باند منفی در این دو طول موج افزایش می­یابد که پیشنهاد می­شود، محتوای آلفا هلیکس در میانکنش با این ذره افزایش یافته است (33 و 17).

میانکنش این نانو­ذره با HSA  منجر به تغییراتی در ساختار دوم این پروتئین می­شود که با مشاهدات Sen و همکاران مطابقت دارد (40). آنها گزارش کردند که ساختار دوم HSA پس از اتصال به نانو ذرات طلا تغییر می­کند. مجموع مطالعات فلورسانس ذاتی، ANS و دورنگ نمایی دورانی نشان دهنده تغییر ساختار پروتئین پس از اتصال به nFe₂O₃ می­باشد. لذا حضور این مواد در طبیعت و وارد شدن احتمالی آنها به داخل بدن موجودات زنده به ویژه انسان، می­تواند ساختار و عملکرد پروتئین­ها را تحت تاثیر قرار دهد و حیات آنها را مختل نماید. بنابراین درنظر گرفتن جنبه­های زیستی محیطی و ایمنی استفاده از نانومواد در مراحل اولیه از اهمیت بالایی برخوردار است (7).

تشکر و قدردانی

این پژوهش با حمایت مالی، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته با شماره  قررداد 4031/1 انجام شده است. لذا مجری و همکاران مراتب سپاس و قدردانی خود را از آن مجموعه محترم اعلام می­دارند.