بررسی ایمنوانفورماتیک ‌لیزین‌های کدشده در باکتریوفاژهای موثر بر باکتری‌های جنس سودوموناس

اشکان عباسی فرد سمنانی^۱، شمس الضحی ابوالمعالی^۲، مهدی صادقی^۲ و شکیبا درویش علیپور آستانه^1*

^۱ ایران، سمنان، دانشگاه سمنان، پردیس علوم و فناوری نوین، دانشکده زیست فناوری

^۲ ایران، سمنان، دانشگاه سمنان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 14/11/1399          تاریخ پذیرش: 30/3/1400

چکیده

گونه­های باکتری متعلق به جنس سودوموناس از جمله باکتری‌های فرصت­طلب بیماریزا هستند که بیشترین عامل عفونت­های بیمارستانی را شامل می شود. با توجه به افزایش مقاومت این گروه از باکتری‌ها در برابر اکثر آنتی­بیوتیک‌ها، فاژدرمانی و یا استفاده از لیزین فاژ یکی از جایگزین‌‌‌‌های درمان است. هدف از این مطالعه، شناسایی خانواده­ی باکتریوفاژهای‌ موثر بر جنس سودوموناس و ارزیابی مقدار ایمنی­زایی لیزین این نوع فاژها می‌باشد. در این تحقیق، با استفاده از پایگاه‌های داده بیوانفورماتیک و ایمنوانفورماتیک، ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی خانواده‌های مختلف از فاژهای لیتیک موثر بر جنس سودوموناس، ساختار دوم وسوم لیزین‌های‌ فاژ و میزان القای پاسخ ایمنی سلولی و هومورال میزبان، مورد مطالعه قرار گرفته است. در بین خانواده‌های باکتریوفاژ موثر بر باکتری‌های از جنس سودوموناس، سه خانواده سیفوویریده، میووریده، پودوویریده با جمعیت بیش از ۹۰ درصد، بیشترین فراوانی را نشان داد. همچنین توالی آمینواسیدی اندولیزین هریک از این سه خانواده، تنها در نیمی از کل اسیدآمینه‌ها با امتیاز برابر نصف حدآستانه نرم افزار، دارای خاصیت انتی­ژنی برای سلول‌های لنفوسیت B و تنها در ۱ درصد اسید آمینه‌ها دارای میل اتصال قوی به مولکول‌های حامل MHC برای ارایه به سلول‌های T بودند. هیچ یک از لیزین­های مورد مطالعه خاصیت انتی­ژنی ندارند. با توجه به نتایج بدست آمده از مقدار ایمنی‌زایی پروتئین‌‌‌های لیزین فاژ، آنها می‌توانند جایگزین آنتی‌بیوتیک باشند.

واژه‌های کلیدی: باکتریوفاژ، لیزین‌، ایمنوانفورماتیک، سودوموناس آئروجنوزا

* نویسنده مسئول، تلفن: 02331533197 ، پست الکترونیکی: darvishalipour@semnan.ac.ir

مقدمه

سویه‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک، بدلیل به خطر انداختن سلامت جوامع انسانی درصد فراوانی از عامل مرگ و میرهای بیماری عفونی را به خود اختصاص داده است. از جمله این سویه‌های مقاوم، میتوان به سویه‌های سودوموناس اشاره کرد. با توجه به دامنه وسیع مقاومت به انواع آنتی‌بیوتیک‌ در این سویه‌ها، دانشمندان در پی درمان‌های جایگزین هستند. یکی از این روشها، استفاده از باکتریوفاژها و لیزین آنها می‌باشد (۲2،۳4،۳7). در چندین دهه، فاژ درمانی‌ برپایه استفاده از فاژهای لیتیک بوده است. استفاده از این فاژها برخلاف فاژهای لیزوژن دارای دو مزیت است. نخست اینکه ژن‌های مربوط به مقاومت‌های آنتی‌بیوتیک القا نمی‌شوند. دوم اینکه بیان سریع ژن‌های مرتبط با مرحله لیتیک فاژ سبب می شودکه آنزیم­های محدودکننده باکتریایی توالی مورد نظر خود را شناسایی نکنند(۲،۵). در فاژدرمانی از فاژها به صورت منفرد و یا به صورت کوکتل (تاثیر بیشتر) استفاده می شود و به دلیل اختصاصی بودن عملکرد فاژ برروی باکتری‌های پاتوژن، آسیب به میکروفلور روده میزبان کمتر است. استفاده از فاژها به جهت عدم تحریک سیستم ایمنی، غیر سمی بودن و تولید آسان و ارزان، یکی از گزینه‌ها در درمان می‌باشد (۲4،30). فاژدرمانی در کشورهای مختلف جهان، از جمله امریکا و برخی کشورهای اروپایی نظیر لهستان، آلمان و گرجستان به عنوان یک روش جدید در حال انجام است (۱) و از باکتریوفاژهای خانواده سیفوویریده، میوویریده، پودوویریده، کورتیکوویریده، پلاسماویریده، لیپوتریکس ویریده، اینوویریده، سیستوویریده ولویویریده برای درمان عفونت‌های سودوموناس آئروجنوزآ، استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین، استرپتوکوکاسه و خانواده انتروباکتریاسه از جمله اشرشیاکلی استفاده می شود(۱9،۲5). اندولیزین­ها که لیزین فاژ نیز نامیده میشوند، هیدرولازهای پپتیدوگلیکان، رمزگذاری شده با فاژ هستند که توسط اکثر باکتریوفاژها تولید می شود تا دیواره پپتیدوگلیکان (PG) باکتری میزبان را در انتهای چرخه لیتیک خود تخریب کنند(20). پپتیدوگلیکان­ها که بخش عمده ساختار دیواره­ی سلولی باکتری را تشکیل می دهند، سلول را در برابر فشار داخل سیتوپلاسمی که حدود 3 تا 5 اتمسفر برای باکتری‌های گرم منفی، و20 تا 50 اتمسفر برای باکتری‌های گرم مثبت می باشد حفظ می­کند. ایجاد شکاف در پپتیدوگلیکان توسط لیزین‌ها، منجر به خروج مایع سیتوپلاسمی و مرگ سلول می شود. در داخل سلول باکتری و زمانی که باکتریوفاژها به سلول حمله می‌کنند، با بیان ژنهای تاخیری باکتریوفاژ یعنی حدود 8 تا 10 دقیقه پس از شروع عفونت، اندولیزین‌های فاژی تولید می‌شوند و در سلول تجمع پیدا می‌کنند، اما وجود غشای سیتوپلاسمی مانع از دسترسی آنها به پپتیدوگلیکان دیواره سلولی و عملکرد آنزیم می شود. زیرا بیشتر اندولیزین‌های فاژی برخلاف اتولیزین‌های باکتریایی فاقد سیگنال پپتیدهای لازم برای عبور از غشای سلولی است و برای عبور از غشای سیتوپلاسمی نیازمند پروتئین فاژی دیگری به نام هولین می‌باشند. هولین‌ها با ایجاد حفره در غشای سلولی سبب خروج اندولیزین‌ها از غشا می شود، در نهایت اندولیزین‌ها به پپتیدوگلیکان متصل شده و آن را هیدرولیز میکنند(۳۹). تخریب سلول میزبان عمدتاً توسط دو دسته پروتئین عملکردی هولین و لیزین انجام می‌گیرد. هولین ها در اواخر مراحل عفونت تولید میشوند و پس از رسیدن به غلظت بحرانی، سوراخ‌هایی در غشای سیتوپلاسمی بوسیله الیگومریزاسیون ایجاد می شود و به لیزین که در سیتوپلاسم انباشته است، اجازه می دهد تا به گهرمایه PG دسترسی پیدا کنند(۲7).

مطالعات نشان داده است که لیزین فاژها میتوانند برای درمان عفونت باکتریایی، جایگزین آنتی­بیوتیک  شود، لیزین از سطح خارجی، به دیواره باکتری گرم مثبت دسترسی می‌یابد. برای دسترسی به پپتیدوگلیکان باکتری گرم منفی، معمولا یک شوینده یا آنتی­بیوتیک موثر بر غشا (پلی­میکسین)  استفاده می شود. شوینده غشای خارجی باکتری گرم منفی را تخریب و سپس اندولیزین  دیواره باکتری گرم منفی را لیز میکند(۵)  در برخی موارد آندولیزین­های موثر بر باکتریهای گرم منفی دارای ساختار  آلفا هلیکس با بارمثبت  است که براحتی میتواند غشای خارجی باکتری گرم منفی را مورد حمله قرار دهد (۱۲). برخی از آندولیزین ها قدرت تخریب بیوفیلم و کپسول باکتری را دارند. بطورمثال لیزین SAL-1 در سرم حاوی یون­های کلسیم و Poloxamer 188  در برابر باکتری‌های کپسول دار و تشکیل بیوفیلم، در شرایط آزمایشگاهی، فعالیت لیتیک قوی را داراست. علاوه بر آن بسیاری از فاژها هیدرولازهای پلی ساکاریدی به نام دپولیمراز رمزگذاری میکنند که میتوانند ساختار اصلی کپسول از جنس پلی ساکارید را تخریب کنند(۲9).

برخلاف آنتی بیوتیک‌های ساخته شده شیمیایی، یکی از مزیت‌های اصلی لیزین­های فاژ در این است که برای مقابله با برخی از عفونت های باکتریایی انتخابی عمل میکند و بر فلور طبیعی میزبان تأثیر ندارد(۲8). باتوجه به مزایایی که فاژها در درمان عفونت‌های مقاوم به آنتی بیوتیک دارند، استفاده از فاژ بعنوان جایگزین آنتی­بیوتیک دارای محدودیت‌ هایی است. بطورمثال فاژها برای میزبان باکتریایی بسیار اختصاصی هستند و طیف میزبانی محدودی دارند. قبل از استفاده از روش فاژدرمانی باید به نوع سویه باکتریایی که باعث عفونت می‌شوند، توجه کرد. فاژ ها سیستم ایمنی میزبان را تحریک می­کنند و ممکن است قبل از اینکه در محل عفونت قرار گیرند، توسط سیستم رتیکولولرآندوتلیال از سیستم گردش خون، حذف شوند. از نگرانی­های دیگر فاژ درمانی، توانایی بالقوه باکتریوفاژها برای انتقال DNA خود از یک سلول باکتریایی به دیگری است. این ژن می تواند مسئول انتقال فاکتورهای بیماریزا به میکروفلور باشد. علاوه بر این، تحت شرایط خاص، فاژهای لیتیک به فاژهای لیزوژنیک تبدیل میگردد که این مسئله امکان انتقال عوامل بیماریزا به سایر باکتری‌های میزبان را فراهم می‌آورد. ویژگیهای فارماکوکینتیک فاژها همچون مقدار مطلوب، مسیر تزریق، فراوانی و مدت زمان درمان به خوبی شناخته شده نیست و باید قبل از آزمایشات گسترده بالینی بررسی شود (۵).

در این مطالعه، با توجه به اثرضد میکروبی باکتریوفاژها و لیزین‌های آنها، ابتدا با استفاده از روش‌های بیوانفورماتیک و ایمنوانفورماتیکی اپی­توپ‌های آنتی­ژنی سلول‌های B و T پروتئین لیزین شناسایی گردید، در گام بعدی با بررسی ساختار دوم پروتئین لیزین، فراوانی شاخصهای آلفا هلیکس و صفحات بتا برای ارزیابی تجمع پذیری و کانفورماسیون پروتئین مطالعه و در نهایت با پیشگویی ساختار سوم، و میزان مشابهت آن با پروتئین‌های تعیین ساختار شده، مکانیسم عملکرد پروتئین لیزین مطالعه شد.

مواد و روشها

شناسایی خانواده­ی باکتریوفاژهای موثربر جنسسودوموناس از پایگاه اطلاعاتی: گونه‌های فاژ مرتبط با  جنس سودوموناس با استفاده از پایگاه‌های اطلاعاتی  NCBI شناسایی گردید. برای شمارش تعداد گونه­های فاژ مرتبط از قسمتTaxon  در پایگاه NCBI استفاده شد. خانواده­، نوع و اندازه مولکول وراثتی هر یک از فاژها به صورت منفرد از NCBI مطالعه شدند.

بررسی فاکتورهای فیزیکوشیمیایی لیزین موثربر جنسسودوموناس: شاخص‌های مختلف فیزیکی- شیمیائی  لیزین مانند نقطه ایزوالکتریک، وزن مولکولی، نیمه عمر، شاخص آلیفاتیک موثر بر جنس سودوموناس با اســتفاده از ابزار ProtParam در پایــگاه EXPACY  به نشانی  https://web.expasy.org / /protparam محاسبه گردید (۱۰).

بررسی ساختار دوم لیزین های موثر بر جنس سودوموناس: ساختار دوم پروتئین آندولیزین‌ موثر بر جنس سودوموناس ، شامل مارپیچ آلفا (Alpha helix)، صفحات بتا (Beta sheet) و حلقه (LooP) با استفاده از نرم­افزار Predict protein، ps2، SOPMA نشانی org.https://predictprotein ،  http://ps2.life.nctu.edu.tw ، https://npsa-prabi.ibcp.fr بررسی شدند (۱۱،۱5،31).

پیشگویی ساختار سوم لیزین موثر بر جنس سودوموناس، تعیین کیفیت و شیمی فضایی ساختار: پیشگویی ساختار سوم پروتئین‌های لیزین‌ موثر بر جنس سودوموناس  با استفاده از روش مدل­سازی همولوژی درپایگاه اطلاعاتی  Ps2و Swiss-model به نشانی http://ps2.life.nctu.edu.tw وhttps://swissmodel.expasy.org/  به شکل مقایسه‌ای انجام گرفت، شبیه­ترین ساختارهای سه بعدی ثبت شده برای توالی آمینواسیدی لیزین‌های انتخاب گردید(۳5، ۴).

نرم افزار PS2  با  استفاده از توالی آمینواسید و ساختار ثانویه پروتئین، ساختار سوم را با روش  همولوژی مدلینگ، پیشنهاد می دهد و نرم افزار Swiss-model به مدل­سازی براساس همولوژی پروتئین با توجه به میزان شباهت توالی­ها و درصد حفاظت­شدگی اختصاص دارد. در واقع پیشگویی براساس امتیاز GMQE انجام می شود. این امتیاز در بازه عدد ۰تا ۱ قرار میگیرد. امتیاز هرچه به عدد۱ نزدیکتر باشد، کیفیت مدل  بهتر است.  این امتیاز بیانگر دقت مورد انتظار مدل پیشنهاد شده است  که با توالی هدف ترازبندی می شود.

کیفیت ساختار سه بعدی پروتئین­ از پایگاه PROSA به نشانیhttps://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa. php بررسی‌گردید (۳9).  نرم افزار PROSA با داشتن قابلیت امتیاز دهی به ساختار سوم پروتئین پیشگویی شده کیفیت آن را مورد ارزیابی قرار می‌دهد.  این امتیاز که با Z-score تعریف می شود. نشان دهنده کیفیت کلی پروتئین است. اگر این امتیاز خارج از دامنه باشد. احتمالا ساختار پیشگویی شده صحیح نیست.  مقدار این شاخص در نموداری که در بردارنده‌ی همه‌ی پروتئین‌های تعیین ساختارشده در شرایط آزمایشگاه است، نمایش داده می شود. در یک نمودار z-score ساختارهای مشخص شده با روش‌های متفاوت X-ray و NMR با طیف رنگ‌های متفاوت‌ (ساختار‌های کریستالوگرافی شده با اشعه x به رنگ آبی روشن و ساختار تعیین شده با NMR با آبی تیره) از هم متمایز می‌شوند. هر چه Z-score  ساختار ورودی برنامه به محدوده Z-score پروتئین‌های کریستالوگرافی شده و یا تعیین ساختار شده به روشNMR نزدیک تر باشد، مدل بهتر  و کیفیت بالاتر است. نمودار سبزرنگ کیفیت مدل ورودی را با رسم انرژی برای موقعیت آمینواسیدها نمایش می‌دهد. به طور کلی امتیاز‌های مثبت، مرتبط با قسمتی از ساختار است که کیفیت پایینی دارند. نمودار رسم شده از ساختار پیشگویی شده، برای هر اسیدآمینه دارای نوسان است، بنابراین برای کاهش این نوسانات میانگین کیفیت را برای خطوط ضخیم و نازک محاسبه و به صورت نمودار ارائه می‌دهند. شیمی فضایی ساختار سوم پیشگویی شده، با کمک نقشه راماچاندران از دو نرم افزار PROCHCK مندرج در نشانی https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/PROCHECK  مطالعه شد (40).

بررسی ایمنی زایی با مطالعه اپی توپ­های سطحی ایمنی­زا برای سلول های لنفوسیت B وT: اپی توپ‌های خطی سلول‌های لنفوسیت B از دو پایگاه BCepreds  ، IEDB به نشانی های https://webs.iiitd.edu.in /raghava/bcepred/bcepred_submission.html ، http://tools.iedb.org/bcell/help/ مطالعه گردید(۳2، 21).

برای پیش­بینی اپی‌توپ‌ها و قدرت ایمنی‌زایی از پایگاه IEDB از روش Kolaskar وTongaonkar  استفاده شد. در پایگاه  BCepreds، هفت ویژگی فیزیکی-شیمیایی شامل آب­دوستی، انعطاف­پذیری، تحرک، قابلیت دسترسی،  قطبیت،  ایمنی‌زایی و سطح در معرض اپی‌توپ‌های خطی سلولB بررسی  میگردد.

میزان ‌ایمنی‌زایی اپی‌توپ‌ها خطی ارزیابی و برای پیشگویی اپی­توپ­های فضایی سلول B در توالی امینواسیدی، از پایگاه CBTOPE به نشانی https://webs iiitd.edu.in/ /raghava/cbtope/submit.php استفاده شد. ورودی این نرم­افزار، توالی آمینواسید پروتئین و خروجی آن احتمال اپی­توپ بودن آمینواسیدها در مقیاس عدد ۹-۱ می باشد. این پایگاه توالی اسیدآمینه‌هایی که امتیاز ۴ به بالا دارند، را به عنوان اپی توپ فضایی در نظر میگیرد(۳).

مولکول‌های  MHCدر عرضه آنتی­ژن‌ به لنفوسیتT نقش دارند، در شناسایی اپی‌توپ‌ها توسط لنفوسیتT، میل اتصال پتیدهای متصل شونده به مولکول‌هایMHCI وMHCII  ، از پایگاه IEDB به نشانی http://tools.iedb.org/mhci و http://tools.iedb.org/mhcii/  بررسی گردید.

آلل‌هایی که توسط Esmaeili و همکارانش در سال ۲۰۱۷ با بیشترین فراوانی در بین آلل‌های MHC در جمعیت کشور ایران معرفی شده بودند برای مطالعه انتخاب گردیدند. آلل‌های HLA-A*02 - HLA-  B*35 از مولکول MHCI و آلل­های DRB1*15  و DRB1*13 از مولکولMHC II  به ترتیب با ۲۰ و ۴/۱۶درصد از مولکولMHCI  و فراوانی ۲۰ و ۴/۱۶ درصد از مولکول MHCII دارای بیشترین فراوانی درجمعیت ایران از بین سایر آلل‌ها بودند.

بررسی پپتیدهای متصل شونده لیزین‌های A، B، C  به آلل‌های مولکول‌های MHC  دارای اهمیت زیادی است. برای بررسی پپتیدهای متصل شونده به مولکول‌هایMHCI  پیشگویی درپایگاه IEDB به روش ANN4.0 و پپتیدهای متصل شونده به مولکول‌های MHCII در پایگاهIEDB باروش SMM-align  انجام گرفت. برای بررسی نواحی پپیتدی متصل شونده به مولکول های MHC  آلل HLA-A*02 از مولکول MHCI و آلل DRB1*15  ازمولکول MHCII به دلیل داشتن درصد فراوانی بالاتر انتخاب شدند.  سرور IEDB پپتیدهای دارایIC50  کوچکتر از ۵۰ نانومولار دارای میل اتصالی قوی به مولکول‌های MHCI  و MHCII، و کوچکتر از۵۰۰ نانومولار  میل اتصالی متوسط و زیر ۵۰۰۰ نانومولار دارای میل اتصال ضعیف دارا میباشند (۳8).

پیشگویی توانایی آنتی ژنیسیته لیزین موثر بر جنس سودوموناس : برای تعیین درصد آنتی ژنیسیته پروتئین لیزین از نسخه ۲ نرم افزار Vaxijen به آدرس http://www.ddg-pharmfac.net vaxijen/VaxiJen/VaxiJen / _citation.html استفاده گردید (۸). از آنجا که در این نرم افزار در مدل‌های ویروسی و باکتریایی در حدآستانه ۵/۰ دارای  بیشترین دقت میباشد، لذا حد آستانه ۵/۰ برای بدست آوردن درصد آنتی ژنیسیته انتخاب گردید (۸).

نتایج

بررسی‌ خانواده و گونه‌های باکتریوفاژ موثر برجنس سودوموناس: براساس جستجو در قسمت تاکسونومی در پایگاه آنلاین NCBI، از بین ۵۲۶ گونه و ۱۶۴۳ اطلاعات ژن ثبت شده در پایگاه اطلاعاتی، فراوانی خانواده فاژهای مرتبط با جنس سودوموناس عبارتنداز: میوویریده۳۴%‌، پودوویریده۳۰%، سیفوویریده ۲۷%، اینوویریده۱%، لویویریده کمتر از۱%،  سیستوویریده ۵/۱% و فاژهای  طبقه بندی نشده۵٪ (شکل۱).

شکل 1- فراونی هریک از خانواده های فاژ، موثر بر باکتری جنس سودوموناس

خانواده­های فاژ میوویریده، پودوویریده، سیفوویرریده، اینوویریده دارای محتوای ژنDNA ، سه خانواده  میوویریده، پودوویریده، سیفوویریده دارای DNA دو رشته و اینوویریده دارایDNA  تک رشته و خانواده سیستوویریده و لویویریده دارای محتوای ژنRNA  میباشد، باکتریوفاژهای RNAدارها موثر سودوموناس آئروجنوزآ، شامل ۲درصد کل گونه‌های ثبت شده است.

برای بررسی چرخه زندگی فاژها ۱۰۰ گونه فاژ انتخاب شد که تقریبا از این تعداد ۷۸ % دارای چرخه لیتیک و ۲۲% چرخه معتدل است.

لیزین های سه خانواده فاژ که دارای بیش از ۹۰% فراوانی در گونه‌های فاژ موثر بر جنس سودوموناس بودند، برای مطالعه بیوانفورماتیک انتخاب گردیدند. لیزین از خانواده میوویریده گونهPOR-1 با نام لیزین A، لیزین خانواده پودوویریده گونه gh-1 با نام لیزین B و لیزین خانواده سیفوویریده گونه phi-297 بانام لیزینC   نامگذاری شد.

بررسی فاکتورهای فیزیکوشیمیایی لیزین A، B و Cموثر بر باکتری جنس سودوموناس : مطالعه ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی پروتئین به شناخت نوع عملکرد بیولوژی آن کمک میکند، لیزین‌ نوع A دارای وزن مولکولی ۶۹/۱۸۳۹۱ دالتون،  فرمول مولکولی C₈₁₄H₁₂₇₇N₂₂₅O₂₅₃S₄  و ۹/۸=pI  است. بیشترین فراوانی آمینواسید در توالی پروتئین، گلایسین و آلانین به ترتیب  ۱۶و۲۱عدد از کل آمینواسیدها را تشکیل میدهد. شاخص آلفاتیک آن معادل ۳۶/۷۰، و با آستانه شاخص ناپایداری ۸۴/۲۴، این پروتئین پایدار است.

لیزین B با وزن مولکولی ۶۱/۱۶۲۵۸ دالتون، فرمول مولکولی C₇₂₅H₁₁₃₆N₂₁ O₂₀₃S₅ و ۴/۹=pI، دارای بیشترین فراوانی دراسیدآمینه گلایسین و آلانین است که به ترتیب ۱۳ و ۱۲ عدد از کل آمینواسیدها را  تشکیل میدهد. شاخص آلفاتیک ۴۹/۸۳، با توجه به آستانه  ناپایداری ۹۴/۳۲، بنابراین پروتئین پایدار است.

لیزین C دارای وزن مولکولی ۵۸/۱۷۳۷۴ دالتون، فرمول مولکولی C₇₇₂H₁₂₀₅N₂₂₁O₂₃₁S₃ و ۰۱/۹=pI بیشترین فراوانی در تعداد اسیدآمینه،  گلایسین، لوسین و آلانین است که به ترتیب فراوانی ۱۸، ۱۹ و ۱۹ عدد از کل آمینواسیدها را دارد. شاخص آلفاتیک آن معادل ۸۸/۸۷ که با آستانه شاخص ناپایداری ۰۱/۲۳، این پروتئین نیز پایدار است.

هر سه انزیم با شاخص  هیدروپاتی (hydropathicity) منفی به عنوان یک پروتئین غیرقطبی شناخته می شود. نیمه عمر  هر سه انزیم در میزبان­های مختلف متفاوت است. به طوریکه در میزبان باکتریایی، مخمر و سلول‌های پستانداران به ترتیب نیمه عمر ۱۰، ۲۰، ۳۰ساعت دارد.

بررسی ساختارهای دوم لیزین A، B و Cموثر بر جنس سودوموناس : ساختار دوم  لیزین‌های A، B و  C موثر بر جنس سودوموناس نشان داد، که بیشترین فراوانی مربوط به ساختار لوپ و آلفا هلیکس است، لازم به ذکر است، نتایج نرم افزارهای predict protein، ps2 در پیشگویی شاخص‌های ساختاردوم (آلفا -هلیکس، صفحات بتا،‌ لوپ) مشابه این نتایج است (شکل۲).

شکل 2- پیش بینی فراونی شاخص‌های ساختار دوم در لیزین‌های A، B، C

پیشگویی ساختار سوم بر اساس روش‌های همولوژی مدلینگ

مدل پیشنهادی لیزین A، در نرم افزار PS2 : انزیم گلیکوزیدار از فاژ لامبدا اشرشیاکلی با همترازی ۹۸ درصد و شباهت ساختار ۴۳ درصد، مدل پیشنهادی لیزینB، هیدرولاز لامبدا  اشرشیاکلی، با همترازی ۹۵ درصد، شباهت ساختار ۵۲ درصد، و مدل پیشنهای لیزین C ، گلیکوزیدار لامبدا از  اشرشیاکلی با همترازی ۱۰۰درصد است.

نرم افزار  :SWISS-MODELلیزین A مدل 1am7A (هیدرولاز لامبدا فاژ آلوده کننده باکتری اشرشیاکلی)، شباهت ساختاری ۴۷ درصد و امتیاز  ۷۸/۰ :GMQE،  لیزین B مدل 1lbaA (هیدرولاز لامبدا فاژ آلوده کننده باکتری اشرشیاکلی) با شباهت ساختار ۵۳ درصد و امتیاز ۷۸/۰ :GMQE و در لیزین C مدل 1d9uA (هیدرولاز لامبدا فاژ آلوده کننده باکتری اشرشیاکلی) با شباهت ساختار ۵۹درصد و امتیاز ۷۹/۰ :GMQE معرفی شد.

در ادامه در لیزین A مدل 1am7A با داشتن ۴۴ درصد شباهت ساختاری، لیزین B مدل 1lbaA با داشتن ۵۷ درصد شباهت ساختاری در هر دو نرم افزارPS2،swiss-model و لیزین C مدل 1d9uA با داشتن ۵۹ درصد شباهت ساختاری به عنوان بهترین مدل در نرم افزار swiss-model معرفی گردید (شکل۳).

شکل 3 - الف، ب، ج) بهترین ساختارهای سه بعدی انتخاب شده برای لیزین A، B، C  از بین هر دو نرم افزارps2، swiss-model

شکل 4- ارزیابی کیفیت ساختار سوم پیشگویی شده برای لیزین‌های A، B، C  موثر بر باکتریهای از جنس سودوموناس توسط نرم افزارPROSA در محدوده پروتئین‌های کریستالوگرافی شده و تعیین توالی شده با روش رزونانس مغناطیسی هسته­ای ((NMR

تعیین کیفیت ساختارهای سوم پیشگویی شده توسط نرم افزار PROSA: بهترین الگوهای ساختاری در پایگاه PROSA برای لیزین A الگوی 1am7A به عنوان مدل انتخابی با Z-score=-6/36،  لیزین B الگوی1lbaA به عنوان بهترین مدل، با کیفیت Z-score=-8/4، و الگوی  1d9uA بهترین مدل انتخابی لیزین C، با کیفیت Z-score=-6/72 مشخص گردید (شکل۳).  ساختار سوم پیشگویی شده لیزین‌های A، B و  C در  محدوده پروتئین‌های کریستالوگرافی و تعیین توالی شده با کمک رزونانس مغناطیسی هسته ای ((NMR بود و همچنین با توجه به اینکه منفی تر بودن این شاخص نشان از کیفیت بیشتر ساختار سوم است. الگوی لیزین B از کیفیت بالاتری بر اساس امتیاز بندی نرم افزار برخوردار است. پس ازآن به ترتیب لیزین C و A بر اساس معیار امتیازدهی کیفیت نرم افزار قرار دارند. داشتن بیشترین تراکم درمحدوده منفی در هرسه نمودار دارای کمترین درصد خطا در کیفیت ساختار تعیین شده است (شکل۴).

تعیین کیفیت توسط نرم افزار PROCHECK: پایداری مدل­های پیشگویی شده با نقشه راماچاندمان در پایگاه PROCHECK  بررسی شد و درصد اسیدآمینه­ها در نواحی مطلوبترین (Most favoured regions)، مجاز فرعی (Additional allowed region)، مجاز سخاوتمدانه (Generously allowed regions) و غیرمجاز (Disallowed regions) برای‌ الگوی پیشنهادی 1am7A از لیزین A با استفاده از سرور PROCHECK به ترتیب ۲/۹۱، ۸/۸، ۰، ۰ درصد، الگوی 1lbaA از لیزین B به ترتیب  ۷/۸۶،  ۵/۱۲، ۸/۰ ، ۰/۰ درصد وبرای الگوی پیشنهادی 1d9uA از لیزین C به ترتیب ۱/۸۷ ،۹/۱۲، ۰، ۰ درصد پیشگویی گردید (شکل۵).

شکل 5-نقشه راماچاندران نرم افزار PROCHECK  هر نقطه آبی رنگ نشان دهنده‌ی یک اسید آمینه در نواحی قرمز(مطلوب)، نارنجی (مجازفرعی)، زرد (مجاز سخاوتمندانه)، کرم( غیرمجاز) است.  الف) شیمی فضایی اسیدآمینه‌های ساختار سه بعدی لیزین A،  ب) شیمی فضایی اسیدآمینه‌های ساختار سه بعدی لیزین C،  ج) شیمی فضایی اسیدآمینه‌های ساختار سه بعدی لیزین B

بررسی اپی توپ های ایمنی زا برای لنفوسیت B: اپی­توپ خطی و اپی­توپ های فضایی به شرح زیر است: در پایگاه Bcepred نواحی از توالی آمینواسیدی که دارای امتیاز بالاتر از حدآستانه نرم افزاربودند، به عنوان نواحی اپی‌توپ معرفی گردید. در این نرم افزار حدآستانه نرم افزار امتیاز  ۸/۱ مشخص شد. در لیزین A تنها ۷ درصد از آمینواسیدها، در لیزین B، ۶ درصد از آمینواسیدها و در لیزینC، ۸ در صد از آمینواسیدها به عنوان نواحی اپی‌توپ معرفی گردید (جدول 1).

جدول 1- بررسی اپی‌توپ‌های خطی لیزین‌های A، BوC با استفاده از پایگاه Bcepred

در پایگاه IEDB  شناسایی اپی­توپ بر اساس روش Kolaskar وTongaonkar بررسی گردید. حد آستانه این روش برابر شاخص عددی ۰۱۷/۱ است. ۵ پپتید دارای شاخص بالاتر از حدآستانه نرم افزار، به عنوان نواحی اپی­توپ لیزین A، هستند که پپتید دارای توالی ۸  آمینواسیدی( ۶۷-۵۹ ) دارای بالاترین قدرت ایمنی زایی و امتیاز ۱۷۰/۱ است.

درلیزینB، ۷ پپتید دارای شاخص بالاتر از حد آستانه نرم­افزار است، پپتید ۱۳ آمینواسید (آمینواسیدی ۲۳-۱۱) با بالاترین امتیاز۱۷۲/۱ بین پپتیدهای این مجموعه بالاترین قدرت ایمنی زایی را دارد.  در لیزین C از بین ۷ اپی‌توپ شناسایی شده، پپتید ۷  آمینواسیدی از توالی شماره ۳۷ تا ۴۳ با امتیاز ۱۱۹/۱ و توالی ۸ امینواسیدی(۱۰۴-۹۷ ) دارای امتیاز ۲/۱ به عنوان بهترین اپی­توپ در این لیزین معرفی می شود (شکل۶).

بر اساس نتایج بدست آمده از پایگاه CBTOPE  در لیزین A تنها ۱ درصد،  لیزین B، ۶ درصد و لیزینC، ۱۱در صد از آمینواسیدها به عنوان اپی‌توپ فضایی معرفی گردید (جدول 2).

شکل 6- پیش بینی مناطق دارای اپی‌توپ در لیزین‌های فاژی A، B، C

جدول 2- بررسی اپی‌توپ‌های فضایی لیزین‌های A، BوC با استفاده از پایگاه CBTOPE

پیش گویی اپی توپ های لنفوسیتT: در بررسی پپتیدهای متصل شونده به مولکول  MHCI در لیزین A، آلل HLA-A*02 از ۱۵۹ پپتید دارای  توالی۱۰ آمینواسید، ۱ پپتید از شماره توالی آمینواسید ۱۶۰-۱۵۱دارای میل اتصال قوی و بقیه پپتید ها دارای اتصال ضعیف به مولکول MHCI برای عرضه به سلول‌های T بودند. در لیزینB از ۱۳۷ پپتید دارای توالی ۱۰ آمینواسید، ۱ پپتید از شماره توالی آمینواسید ۵۱-۴۲ دارای میل اتصال قوی و ۱ پپتید دارای اتصال متوسط و بقیه پپتیدها دارای اتصال ضعیف به مولکول MHCI برای عرضه به سلول‌های T بودند. در لیزین c از ۱۵۱ پپتید دارای  توالی ۱۰ آمینواسید، ۱ پپتید از شماره توالی آمینواسید ۱۵۳-۱۴۴ دارای میل اتصال قوی و ۴ پپتید دارای اتصال متوسط و بقیه پپتیدها دارای اتصال ضعیف به مولکول MHCI برای عرضه به سلول‌های T بودند.

در بررسی پپتیدهای متصل شونده به مولکول MHCII در لیزین A از ۱۵۴پپتید دارای  توالی ۱۵ آمینواسید، ۱۷ پپتید دارای میل اتصال متوسط و بقیه پپتید ها دارای اتصال ضعیف به مولکول MHCII برای عرضه به سلول‌های T بودند.  در لیزینB از ۱۳۲ پپتید دارای  توالی ۱۵ آمینواسید، ۳۰ پپتید دارای میل اتصال متوسط و بقیه پپتیدها دارای اتصال ضعیف به مولکول MHCII  برای عرضه به سلول‌های T بودند. در لیزین C از ۱۴۶ پپتید دارای  توالی ۱۵ آمینواسید، ۲۴ پپتید دارای میل اتصال متوسط و بقیه پپتیدها دارای اتصال ضعیف به مولکول MHCII برای عرضه به سلول‌های T بودند.

پیشگویی توانایی آنتی ژنیسیته لیزین موثر بر جنس سودوموناس: بر اساس نتایج به دست آمده از نرم افزار، توانایی آنتی ژنیسیته برای لیزین‌ A عدد ۶/۰، برای لیزین‌ B عدد ۶/۰و برای لیزین C  عدد ۵۱/۰ میباشد. با توجه به اینکه حد آستانه نرم افزار ۵/۰ تا ۱ میباشد. و در این مطالعه حد آستانه  ۵/۰ به عنوان حد­ آستانه بهینه با دقت کافی انتخاب گردید. هریک از لیزین ها دارای توانایی آنتی ژنیسیته کمی می‌باشند و تنها ۱/۰ و۰۱/۰ با حد آستانه نرم افزار اختلاف دارند. همچنین مقدار آنتی ژنسیته لیزین  Cکمتر از لیزین A و B میباشند.

بحث

با گسترش ژن‌های مقاوم به آنتی بیوتیک، روش‌های جایگزین از جمله فاژدرمانی علیه عفونت جنس سودوموناس مورد توجه است(21)،  نتایج مطالعات بیوانفورماتیک از ساختار لیزین فاژهای موثر بر جنس سودوموناس،  نشان داد که بیشتر از ۹۰٪ گونه­های فاژ در سه گروه میوویریده، سیفوویریده، پودوویریده قرار گرفتند. در سال ۲۰۱۵ P.Pires  و همکاران گزارش کردند که ۱۳۷ فاژ برعلیه  جنس سودوموناس در پایگاه‌های داده NCBI وجود دارد که حدود ۲/۹۴ درصد متعلق به راسته کادوویروس‌ها، شامل سه خانواده میوویریده، سیفوویریده، پودوویریده هستند، ۱٪ متعلق به خانواده اینوویریده، ۱ ٪  متعلق به خانواده لویویریده و۲٪ متعلق به خانواده سیستوویریده است که ۸ مورد در آن زمان تعیین توالی نشد(۲3). شاخص آلفاتیک با درصد بالای اسید آمینه­های آلفاتیک (آلانین، گلایسین، لوسین) ارتباط دارد که احتمالا سبب پایداری پروتئین در بازه دمایی وسیع می شود(14). بنابراین لیزین  C نسبت به لیزین A و B  پایداری بیشتری دارد. دومین فاکتور در بررسی ویژگی بیوشیمیایی، شاخص متوسط هیدروپاتی برای شناسایی میزان قطبیت مولکول است، بطوریکه دارا بودن امتیاز منفی، یک پروتئین غیرقطبی را معرفی میکند. بنابراین لیزین A خاصیت غیرقطبی بیشتری دارد(۱5). در ساختاردوم پروتئین­های لیزین‌ A، B، C نسبت هلیکس از صفحات بتا بیشتر است که سبب تاخوردگی و پایداری بهتر پروتئین میگردد(۳6). همچنین در تحقیقی که در سال ۲۰۱۹ توسط  Santosو همکاران گزارش شد، لیزین PlyPl23 موثر بر باکتری جنس پانی باسیلوس دارای ساختار هلیکس بیشتری نسبت به صفحات بتا است. این مطالعه هم می­تواند خاصیت تجمعی بودن پروتئین‌های لیزین را نقص کند (۳3).

مدل‌های پیشگویی ساختار سوم برای لیزین‌های A و  C مدل 1am7A و 1d9uA به ترتیب متعلق به پروتئین‌ گلیکوزید هیدرولازها و مدل پیشگویی شده 1lbaA از لیزین B متعلق به آمیدازها،  دارای ۷۰٪‌ حفاظت شدگی به همراه دومین‌های پروتئین‌های این خانواده (گلیکوزیدهیدرولازها، آمیدازها) است(۱8، ۹، ۶). در ارزیابی کیفیت مدل مورد نظر از نقشه راماچاندران استفاده شد. زوایای چرخش phi و  psi برای تمامی امینواسیدهای ساختاری درمحور XوY قابل مشاهده است. زاویه phi چرخش را حول باند N-C alpha اسیدآمینه نشان میدهد. درحالیکه زاویه psi چرخش را حول C-C alpha مشخص می‌کند. با توجه به تاخوردگی (folding) پلی­پپتیدها، زوایای phiوpsi  وابسته به نوع زنجیره جانبی اسید آمینه در محدوده چرخش ۱۸۰- تا ۱۸۰+ درجه‌ قرار می گیرند. ترکیباتی که اتم­ها فاصله نزدیکتری از مجموع شعاع واندروالسی را دارند، نواحی غیرمجاز را میسازند، قرارگیری در این نواحی برای همه‌ی اسید آمینه‌ها به غیر از گلایسین از نظر برخورد فضایی ممکن نیست. گلایسین به علت نداشتن زنجیره جانبی محدودیت سایر اسیدآمینه ها را ندارد و در تمامی نقاط نقشه به ویژه نواحی مخصوص دور، در ساختار دوم که برای سایرین ممنوع است، میتواند قرار بگیرد. مکان اسید آمینه‌ها در نقشه حاصل از پایگاه PROCHECK  با علامت مثلث و مربع قابل تشخیص است. درصد باقیمانده در ناحیه مطلوب راهنمای خوبی جهت ارزیابی کیفیت استریوشیمیایی ساختار است و با توجه به قرارگیری درصد بالای ۸۵٪ اسید آمینه‌ها، در ناحیه مطلوب مدل‌های انتخابی برای لیزین‌های A، B،C  از کیفیت بالایی برخوردار میباشند. بنابراین داروهای پروتئینی، سبب القای پاسخ ایمنی میزبان نسبت به این داروها می شود. مطالعه بالینی Rashel   و همکاران در سال ۲۰۰۷  مشخص نمود که  بعد از تزریق، پروتئین لیزین سبب تولید آنتی بادی و پاسخ ایمنی در بدن میزبان می شود. ولی هیچ گونه مهاری در عملکرد لیزین ایجاد نمیکند و سبب هیچ گونه علایم حساسیت زا در بدن حیوان نمی شود(۲6).  در طراحی هر دارو با توجه به ماهیت عملکرد آن شناخت نواحی اپی‌توپ و میزان تحریک سیستم ایمنی توسط این نواحی و همچنین مهندسی‌ نواحی اپی‌توپی به منظور رسیدن به سطح ایمنی‌زایی کمتر حائز اهمیت است(۷). توانایی شناسایی اپی­توپ‌های آنتی­ژن توسط سلول‌های ایمنی و القای پاسخ ایمنی برای طراحی دارو میتواند مورد توجه قرار گیرد. روش‌‌های ایمنوانفورماتیکی علاوه بر روش‌های in vitro و in vivo در شناسایی نواحی اپی‌توپ آنتی ژن سلول‌های  Bو سلول‌های T موثر است(13، 16).

روش koslar و Tangaonkar در سال 1990، مقیاسی از ترکیب هیدروفوبیسیته، انعطاف پذیری و دسترسی سطحی ارائه می­نماید. این مقیاس به نام تمایل ذاتی ایمنی­زایی، نامگذاری و بعنوان استاندارد طلایی در پیشگویی اپی‌توپ معرفی شد که دقت آن ۷۵ درصد میباشد(۱7). اپی‌توپ‌های شناسایی شده برای سلول‌های B، شامل ۵/۱۲درصد از کل توالی آمینواسید‌های لیزین در این خانواده‌ است. در تمام پایگاه‌های بررسی شده (BCepreds، IEDB) اپی‌توپ‌های پیشنهاد شده برای سلول‌های B دارای امتیاز کمتر از نصف میانگین بودند. بعبارت دیگر خاصیت ایمنی­زایی این پروتئین ضعیف است. از مجموع اپی‌توپ‌های پیشنهاد شده برای اتصال به مولکول MHCII از ۱۵۰ اپی‌توپ ارایه شده برای نرم افزار تنها ۱تا ۳ اپی‌توپ برای لیزین‌های A، B،C  دارای میل اتصال متوسط و بالا به مولکول‌های MHCII و سایر اپی‌توپ های ارایه شده دارای میل اتصال کم بودند. باتوجه به اتصال ضعیف بیش از۹۸ درصد از اپی‌توپ‌های ارائه شده به گیرنده MHCII، امکان انتخاب لیزین، برای استفاده به عنوان دارو افزایش می‌یابد.