بهینه سازی واکنشهای اتصال آمینو اسید به رزین وَنگ و نشاندار کردن پپتید با کروموفور(6/5)–کربوکسی فلورسین

ریحانه خسروی¹، مرتضی دلیری²، زهرا عزیزی³، محمّد حسین صنعتی⁴، مریم محقّق^1،4 و امیر نوروزی^1*

¹ ایران، تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، پژوهشکده صنعت و محیط زیست، گروه مهندسی زیست فرآیند

² ایران، تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، گروه زیست فناوری دامی

³ ایران، تهران، دانشگاه علوم پزشکی تهران، ‌دانشکده فناوری های نوین پزشکی،‌ گروه پزشکی مولکولی

⁴ ایران، تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، پژوهشکده زیست فناوری پزشکی، گروه ژنتیک پزشکی

تاریخ دریافت: 24/04/1398          تاریخ پذیرش: 23/06/1398

چکیده

متداول ترین روش سنتز پپتیدها، سنتز روی رزین جامد است. در بین انواع رزین، رزین وَنگ (Wang) یکی از رایج ترین آنهاست. در این مطالعه روشهایی برای بهبود اتصال اوّلین آمینو­اسید از انتهای کربوکسیل(C-terminus)  به رزین وَنگ و همچنین نشاندار کردن انتهای آمین پپتید سنتز شده با رنگ فلورسنت (6/5)- کربوکسی فلورسین ارائه می­شود. پپتید تتراآرژینین(RRRR)  بر روی رزین وَنگ به روش سنتز بر پایه جامد سنتز شده و به انتهای آن رنگ فلورسنت (6/5)- کربوکسی فلورسین متّصل شد. نشاندار کردن پپتید توسط تست کایزر (نین هیدرین) مورد ارزیابی قرار گرفت. بهره واکنش اتصال اولّین آرژینین
(Fmoc-Arg(pbf)-OH) توسط آزاد­سازی گروه­­Fmoc(Fluorenylmethyloxycarbonyl chloride) متصل به آن و سنجش میزان جذب ماوراء بنفش آن در طول موج 278 نانومتر مورد اندازه گیری کمّی قرار گرفت.  جهت مقایسه بهره واکنشهای "اتصال اوّلین آمینو­اسید به رزین" و "نشاندار کردن با رنگ  فلورسنت"، از دو گروه فعّال کننده معروف کربوکسیل به نامهای  DIC (N,N′-diisopropyl carbodiimid) و ( HBTU (N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate ) استفاده شد. در اتصال اوّلین آمینو­اسید آرژینین، واکنشگر DIC بهره واکنش را بیشتر از واکنشگر HBTU افزایش می­دهد. هر چند لازم است طول زمان انکوباسیون به 17 ساعت افزایش یابد. در حالی که برای نشاندار کردن پپتیدها، HBTU عملکرد بهتری نسبت به DIC دارد. این در حالی است که در اکثر پروتکلها از DIC برای نشاندار کردن پپتیدها توسط انواع رنگ فلورسنت استفاده شده است و برای اتصال اوّلین آمینواسید نیز زمان انکوباسیون بسیار کمتر از 17 ساعت پیشنهاد شده است.

واژه های کلیدی: سنتز پپتید، ، رنگ فلورسنت، واکنش تراکمی، گروههای فعال کننده

* نویسنده مسئول، تلفن: 44787349-021 ،  پست الکترونیکی:  a_norouzy@nigeb.ac.ir

مقدمه

فیشر نشان داد که پروتئینها از آمینواسیدها تشکیل شده اند که توسط پیوند پپتیدی به هم متّصل شده اند. پپتیدها توالیهای کوتاهی از آمینواسید ها هستند که توسط پیوند پپتیدی(آمیدی) به هم متّصل می­شوند و در علوم  مختلف شیمی، سلولی و مولکولی، فیزیولوژی و... کاربرد دارند (13 و 37). از مزایای استفاده از پپتیدها می­توان به وزن مولکولی پایین، زیست سازگاری بالا و سمّیت کم اشاره کرد (37). فیشر اولین پپتید (دی گلایسین) را سنتز کرد و "پدر شیمی پپتید" نام گرفت (26). به سبب اهمیّت سنتز پپتیدها، بروس مریفیلد در سال 1960 سنتز پپتید در فاز جامد را معرفی کرد(22). از آن زمان سنتز پپتید در زمینه های علمی مختلف مانند شیمی پروتئین و شیمی آلی مورد توجه قرار گرفته که منجر به تولید انواع پپتیدهای دارویی شده است. اساساً، سنتز پپتید از طریق واکنشهای تراکمی آمیداسیون متوالی بین گروه آمین یک آمینو­اسید و گروه کربوکسیل آمینواسید بعدی صورت می­گیرد که منجر به تشکیل پیوند آمیدی یا پیوند پپتیدی می­شود. در طبیعت، این میانکنشها بین بیست عدد اِل-آمینواسید استاندارد، در ریبوزوم صورت می­گیرد و در نهایت منجر به سنتز پروتئینها می شود. (3) در حالی که در ریبوزوم پپتیدها از ناحیه آمین انتهایی  (N-terminus)به سمت ناحیه کربوکسیل انتهایی سنتز می­شوند، در سنتز پپتید به روش شیمیایی این مسیر برعکس است (شکل 1).

در حال حاضر سنتز شیمیایی پپتید به دو صورت انجام می‍­گیرد:

 1-سنتز در فاز محلول(LPPS)(Liquid Phase Peptide Synthesis): بیشتر برای سنتز پپتیدهای کوچک با تعداد رزیدوهای کم به کار می­رود. مهمترین مزیّت این روش امکان جداسازی و خالص سازی پپتید محافظت زدایی شده و کامل بعد از هر مرحله است(11).

 2-سنتز در فاز جامد (SPPS)( Solid Phase Peptide Synthesis): عبارتست از رشد زنجیره پپتیدی روی یک رزین جامد که با افزودن متوالی اسیدهای آمینه از انتهای کربوکسیل(C-terminus)  توالی پپتیدی به سمت انتهای آمین(N-terminus)  انجام می­شود (11, 23, 31).

سنتز در فاز جامد نسبت به سنتز در فاز مایع این مزیّت مهم را دارد که پس از اضافه کردن هر آمینو­اسید با یک شستشوی ساده پپتید متّصل به رزین روی فیلتر باقی می­ماند و سایر مواد از جمله ناخالصیها و محصولات جانبی شسته می­شوند. پس خالص سازی بسیار ساده تر از سنتز پپتید در فاز مایع است. فرآیند سنتز پپتید در فاز جامد با فعّال سازی گروه کربوکسیل اوّلین آمینواسید و اتصال آن به رزین آغاز می­شود (شکل 1). در مورد آمینو­اسیدهای مورد استفاده در سنتز لازم به ذکر است که انتهای آمین آنها توسط گروه Fmoc(Fluorenylmethyloxycarbonyl chloride)، محافظت شده است. در این مشتقات آمینو­اسیدی علاوه بر آمین انتهایی، در صورت وجود گروه عاملی فعّال (مانند گروه عاملی هیدروکسیل در سرین، گروه عاملی آمین در لیزین و غیره،) آن گروه جانبی نیز توسط مولکولهای خاصّی محافظت شده هستند. بنابراین تنها گروه عاملی در دسترس و آزاد گروه کربوکسیل آنها است. پس از اتصال اوّلین آمینو­اسید به رزین، گروه محافظ Fmoc توسط محلول 20 درصد پیپریدین (Piperidine) در دی­متیل فرمامید (DMF) (Dimethylformamide) جدا می­شود. سپس گروه آمین آزاد شده با کربوکسیل آمینو­اسید دوم پیوند پپتیدی تشکیل می­دهد. در مرحله بعد رزین شسته شده و محصولات جانبی و واکنشگر های اضافی حذف می­شوند. مراحل اتصال آمینو­اسید و جدا شدن گروه Fmoc برای تک تک آمینو­اسید ادامه می یابد. پس از اتمام سنتز روی رزین، پپتید سنتز شده با اسید قوی تری فلورواستیک اسید(TFA) (Trifluoroacetic acid) به مدّت یک تا چهار ساعت (یا حتّی بیشتر، بسته به توالی پپتید) انکوبه می شود. اسید به طور همزمان گروههای محافظتی زنجیره های جانبی را از آمینو­اسید ها و پپتید را از رزین جدا می­کند. سپس با فیلتراسیون پپتید از رزین جدا شده  و با دی اتیل اتر سرد رسوب داده می شود. پپتید رسوب داده شده توسّط روش کروماتوگرافی با بهره بالا یا HPLC  مورد خالص سازی قرار می گیرد.

سنتز پپتید در فاز جامد، انقلابی در تولید پپتید های بزرگتر و پیچیده تر (یا حتی پروتئینها) ایجاد کرد (17). "بروس مریفیلد" پیشگام در سنتز پپتید بر پایه جامد است که در آن پپتید بر روی یک رزین نامحلول سنتز می شود و در آخر یک مرحله جداسازی پپتید از رزین اجازه می­دهد پپتید مورد نظر به صورت محلول به دست آید(21). او در سال 1984 جایزه نوبل شیمی را به دلیل اهمیّت این ابداعش به دست آورد (26). همان طور که گفته شد، مزیّت اصلی سنتز در فاز جامد سهولت در خالص سازی تنها با یکبار شستشو است. اساساً استفاده از فاز جامد برای اتصال به پروتئینها و آنزیمها هم یک روش خالص سازی است. به این ترتیب که پس از انجام واکنش آنزیماتیک آنزیم تثبیت شده بر روی رزین با یک شستشوی ساده قابل جداسازی از محیط واکنش است. (24, 25, 28) برای بازیابی بعد از اتصال هر آمینو­­اسید ، محصولات جانبی واکنش و واکنش دهنده های اضافی به راحتی با حلال دی متیل فرمامید شسته شده و توالی پپتیدی متّصل به رزین باقی می­ماند.

گام کلیدی سنتز پپتید در فاز جامد، اتصال اوّلین آمینو­اسید به رزین است. مقیاس واکنشهای فاز جامد با توجه به مقدار اوّلین آمینو­اسید متّصل شده به رزین مشخص می‍شود و نسبت به اتصال سایر آمینواسیدها به یکدیگر، اتصال اوّلین آمینو­اسید به رزین مرحله محدود کننده بازده واکنش است. ظرفیت بار گذاری روی رزینهای تجاری معمول بین 3/0 تا 5/2 میلی مول به ازای هر گرم رزین گزارش شده است(26). بنابراین هدف از بهبود اتصال اولین آمینو­اسید به رزین، افزایش بهره واکنش بارگذاری است تا بدین وسیله بهره نهایی سنتز پپتید افزایش یابد.

پروتئینها و پپتیدها در زیر میکروسکوپ غیر قابل مشاهده هستند و با نشاندار کردن فلورسانسی می­توان آنها را در سلول، بافت و غیره ردیابی کرد (14, 15, 27, 35) بنابراین نشاندار کردن پپتیدها و پروتئینها به عنوان یک ابزار بسیار متداول و ضروری مورد استفاده قرار می­گیرد. رنگ فلورسانس یا کروموفور (6/5)-کربوکسی فلورسین ((5/6)-carboxyfluorescein) با نام تجاریFAM  یکی از متداول ترین رنگها برای نشان دار کردن پروتئینها و پپتیدها است. رنگ FAM این محبوبیت را مدیون پایداری شیمیایی در شرایط سخت دمایی و pH های بسیار اسیدی و بازی، زیست سازگاری، قیمت پایین و بهره کوانتومی بالا است. مشتقات پپتیدی نشان دار شده با فلورسین به عنوان نشانگرهای فلورسنت در تجهیزاتی مانند میکروسکوپ کونفوکال روبشی لیزری (Laser Scanning Confocal Microscope)، فلوسایتومتر، اندازه گیری قطبش فلورسانس و طیف سنجی قطبش فلورسانس درون سلولی استفاده می­شوند (10).

رنگ فلورسنت (6/5)-کربوکسی فلورسین، سبز رنگ و از مشتقات FITC (Fluorescein isothiocyanate)(فلورسین ایزوتیوسیانات) بوده و با بهره کوانتومی بالا جزء رنگهای بسیار پر کاربرد در زمینه نشاندار کردن انواع مولکولها مانند پروتئینها، الیگونوکلئوتیدها و پپتید ها می باشد (9, 19, 20, 32, 36). در این پژوهش، راهکارهایی برای بهبود اتصال آمینو­اسید اوّل به رزین وَنگ، و همچنین بهبود اتصال رنگ فلورسنت جهت نشان دار کردن پپتید پیشنهاد شده است .

مواد و روشها

مواد شیمیایی مورد استفاده و منبع آنها به شرح زیر می باشد: رنگ فلورسنت (6/5)-کربوکسی فلورسین با درصد خلوص 90 درصد، رزین وَنگ (35)، آمینواسید آرژینین با درصد خلوص 99 درصد (27)، دی متیل فرمامید (10) و دی ایزو پروپیل اتیل آمین(32)، HBTU(32)، دی­کلرو­متان (10) و دی ایزو پروپیل کربو­دی­ایمید،HOBt  و پیپریدین، دی­متیل­آمینو­پیریدین (32).

بار­گذاری آمینو­اسید بر روی رزین وَنگ در سنتز پپتید در فاز جامد: 50 میلی­گرم رزین وَنگ پس از سه بار شستشو با دی متیل فرمامید، به منظور تورم (swelling)  به مدت 90-80 دقیقه در دی متیل فرمامید قرار داده شد تا گروههای عاملی هیدروکسیل برای واکنش در معرض قرار بگیرند. برای اتصال اوّلین آمینو­اسید به رزین، ابتدا آمینو­اسید در محلول DCM/DMF حل و سپس HOBt به آن اضافه شد. پس از حل شدن کامل HOBt، محلول حاوی آمینو­اسید به رزین اضافه شد و سپس DIC و در آخر DMAP به رزین اضافه شدند، در حالی که فلاسک واکنش در دمای اتاق بر روی شیکر با 50 دور در دقیقه قرار داشت (شکل 4).

به منظور مقایسه میزان بارگذاری در یک روش دیگر به جای DIC از HBTU برای فعّال کردن گروه کربوکسیل آمینو­اسید اوّل و اتصال آن به رزین استفاده شد. مانند روش قبل پس از متورم کردن رزین، آمینواسید به آن اضافه شد. به این صورت که ابتدا گروه کربوکسیل آمینو­اسید توسط HBTU وDIPEA  فعّال و به رزین اضافه شد (آمینواسید فعّال شده دو بار اضافه و هر بار به مدّت یک ساعت انکوبه شد). گروه Fmoc نور فرابنفش را در طول موج 278 نانومتر جذب می_­کند که از این ویژگی برای سنجش میزان اتصال آمینواسید به رزین و مقایسه میزان بارگذاری در دو روش فوق استفاده شد. به این ترتیب که 10 میلی­گرم از رزین بار گذاری شده توزین و 1 میلی­لیتر از محلول پیپریدین 20 درصد در دی متیل فرمامید به آن اضافه شد و بعد از ورتکس به مدت یک ساعت در دمای اتاق بر روی شیکر قرار گرفت تا گروههای Fmoc به طور کامل جدا شود. پس از ته نشین شدن رزین،10 میکرو لیتر از محلول رویی برداشته شد و با 990 میکرو لیتر از پیپریدین 20 درصد رقیق شد (ضریب رقّت = 01/0). سپس در طول موج 278 نانومتر شدّت جذب توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر با محلول شاهد 20 درصد پیپریدین در دی متیل فرمامید مورد اندازه گیری قرار گرفت.

نشاندار کردن انتهای آمین پپتید متّصل به رزین: برای فعّال کردن رنگ (6/5)- کربوکسی فلورسین به منظور اتصال آن به انتهای آمین پپتید به دو روش زیر عمل شد:

1-فعّال سازی گروه کربوکسیل رنگ توسط HBTU (شکل2) (5) .

2-فعّال سازی گروه کربوکسیل رنگ توسط DIC-HOBt (شکل3) (33).

در روش اول ، 3/0 میلی مول (6/5 )-کربوکسی فلورسین با HBTU فعال شده و به 1/0 میلی مول پپتید تترا آرژینین متّصل به رزین اضافه شد. محلول فوق در دمای اتاق با سرعت 50 دور در دقیقه به مدّت 17 ساعت انکوبه شد. سپس تست کایزر (نین هیدرین) به منظور اطمینان از اتصال رنگ به انتهای آمین پپتید انجام شد. مکانیسم واکنش در شکل 2 نشان داده شده است.

در روش دوم، به 1/0 میلی مول رزین-پپتید با انتهای آمین آزاد، 3/0 میلی مول (6/5)-کربوکسی فلورسین در 2 میلی­لیتر محلول حجمی DMF/DCM  حل شد و بعد 14/0 میلی لیتر DIC و 13 میلی گرم HOBt به آن اضافه شد و سپس محلول حاصل به رزین-پپتید اضافه شد در حالی که فلاسک واکنش بر روی شیکر با 50 دور در دقیقه قرار داشت و مانند روش اوّل در دمای محیط به مدّت 17 ساعت انکوباسیون صورت گرفت. شکل 3 مکانیسم فعّال سازی رنگ FAM با DIC را نشان می­دهد.

شکل 2- فعّال کردن رنگ(6/5)- کربوکسی فلورسین با  HBTU و اتصال آن به انتهای آمین پپتید.

شکل3- فعّال کردن رنگ (6/5)-کربوکسی فلورسین توسط DIC-HOBt.

شکل 4- بارگذاری اولین آمینو­اسید بر روی رزین وَنگ.

در هر دو روش برای سنجش کیفی میزان اتصال رنگ به پپتید، از تست کایزر استفاده شد. در روش اوّل برای اتصال رنگ به انتهای آمین، تست کایزر منفی مشاهده شد، به این معنی که آمین آزاد وجود ندارد و واکنش به طور کامل انجام شده است. در روش دوم، بعد از دو بار اضافه کردن رنگ و هر بار به مدت 17 ساعت در دمای اتاق (33)، همچنان تست کایزر مثبت بود که نشان دهنده وجود آمین آزاد و در نتیجه ناکامل بودن واکنش است.

نتایج

همان طور که در جدول 1 مشاهده می­شود، در شرایط یکسان و با استفاده از واکنشگر های DIC، HOBt و DMAP، افزودن DIPEA به واکنش باعث افزایش جذب پروتون و بهبود بارگذاری بر روی رزین می­شود. در شرایط انکوباسیون به مدت ثابت 3 ساعت، در حضور DIPEA جذب 25/0 و در غیاب آن 2/0 گزارش شد. با افزایش مدت زمان انکوباسیون به 17 ساعت، در حضور DIPEA جذب 42/0 و در عدم حضور آن 4/0 مشاهده گردید. به این ترتیب نتیجه­گیری می­شود که استفاده از DIPEA به عنوان جمع کننده پروتون از محیط به هر صورت در افزایش میزان بارگذاری مؤثر است، به ویژه در طول زمانهای انکوباسیون کوتاهتر. در دو بار بارگذاری متوالی آمینو­اسید روی رزین با استفاده از HBTU و DIPEA هر بار به مدت یک ساعت، میزان جذب 3/0 گزارش شد که در مقایسه با واکنشگر های DIC، HOBt و DMAP و انکوباسیون 3 ساعت بیشتر است. اما با افزایش طول مدّت انکوباسیون آمینو­اسید با DMAP/HOBt/DIC به 17 ساعت بهره بارگذاری نسبت به استفاده از HBTU/DIPEA بالاتر می­رود.

نشاندار کردن پپتید با رنگ فلورسنت برای ردیابی آن و مطالعات درون سلولی ضروری است. در این مطالعه، پپتید تترا آرژینین به دو روش مختلف با رنگ FAM نشاندار شد. تفاوت روشها در استفاده از واکنشگرهای HBTU/DIPEA یا DIC/HOBt بود. کامل بودن واکنش به صورت کیفی و با تست کایزر صورت پذیرفت.

جدول 1- شرایط مختلف بار گذاری رزین با آمینواسید.

^a)طول مدّت انکوباسیون , ^b) جذب در 278 نانومتر, ^c)دو بار انکوباسیون

نین هیدرین معرّف آمین نوع اوّل است زیرا در حضور آن به رنگ آبی پررنگ در می­آید. در صورتی که آمین انتهایی پپتید به رنگ FAM متّصل شود، پیوند حاصل یک پیوند آمیدی است و معرف نین هیدرین بی­رنگ می­شود. پس از جدا کردن آخرین Fmoc از انتهای آمین پپتید تترا­آرژینین متّصل به رزین، رنگ FAM با هر یک از دو واکنشگر مذکور فعّال و به صورت مجزا به انتهای آمین پپتید متّصل شد. سپس پپتید نشاندار شده متّصل به رزین با معرف نین هیدرین مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که پس از یک بار واکنش، با هر یک از واکنشگرهای HBTU/DIPEA یا DIC/HOBt تست کایزر مثبت بود. هر چند رنگ آبی مشاهده شده با استفاده از واکنشگر HBTU/DIPEA کمرنگ تر بود. اما با تکرار واکنش روی آمینهای آزاد پپتید (قسمتهای نشاندار نشده) تست کایزر برای واکنشی که در آن ازHBTU/DIPEA  استفاده شده بود کاملاً منفی (عدم حضور آمین آزاد و در نتیجه کامل شدن واکنش) و برای واکنشی که در آن از DIC/HOBt استفاده شده بود همچنان مثبت (وجود آمین آزاد و کامل نشدن واکنش) بود. بنابراین برای نشاندار کردن پپتید، واکنشگر HBTU/DIPEA  از واکنشگر DIC/HOBt بهتر عمل می­کند.

بحث

پپتیدها کاربردهای گسترده ای دارند که از آن جمله می توان به خواص ضد سرطانی و ضد میکروبی آنها اشاره کرد.(1, 2). سنتز پپتیدهای کوتاه به روش شیمیایی بسیار متداول و ساده تر از بیوسنتز آن است. همان طور که در مقدمه گفته شد، سنتز بر پایه جامد روی رزینهای مخصوص سنتز پپتید صورت می گیرد. یکی از انواع رزینهایی که برای سنتز پپتید در فاز جامد استفاده می­شود، رزین وَنگ می­باشد. از مزایای استفاده از این رزین می توان به ظرفیت بار گذاری بالا، عدم نیاز به واکنشگرهای گران قیمت و ممانعت از راسمیزاسیون آمینو­اسیدها اشاره کرد (30). در بسیاری از مطالعات برای سنتز پپتید در فاز جامد از این رزین استفاده شده است (7, 30, 34). در مطالعه حاضر نیز پپتید بر روی رزین وَنگ سنتز شده است. در اوّلین سنتز پپتید بر پایه فاز جامد که توسط بروس مریفیلد انجام شد، از DCC (N,N′-dicyclohexylurea) برای فعّال کردن گروه کربوکسیل به منظور تشکیل پیوند پپتیدی مورد استفاده قرار گرفت (21). پس از آن به کار گیری DCC برای سنتز پپتید در فاز جامد گسترش یافت. در هنگام استفاده از DCC ترکیب دی­سیکلو­هگزیل اوره به عنوان یکی از محصولات جانبی تولید می شود که در بسیاری از حلّالهای مورد استفاده در سنتز پپتید نامحلول است و می تواند موجب انسداد منافذ فیلتر شود. برای غلبه بر این مشکل از DIC استفاده شد که محصول جانبی آن، N-آسیل اوره می باشد که حلالیّت بیشتری نسبت به دی سیکلوهگزیل اوره دارد(16).

هدف از این مطالعه بهبود بار­گذاری آمینو­اسید بر روی رزین وَنگ به منظور افزایش بازده سنتز پپتید برپایه فاز جامد و نیز بهبود واکنش تراکمی در اتصال رنگ (6/5)-کربوکسی فلورسین به انتهای آمین سنتز شده بود. در یکی از روشهای بار گذاری، اوّلین آمینو­اسید از ناحیه انتهای کربوکسیل بر روی رزین وَنگ با استفاده از HOBt-DIC  و DMAP به مدّت زمان انکوباسیون سه ساعت انجام شد(12). مکانیسم واکنش در شکل 4 ترسیم شده است. در این بارگذاری، ابتدا در مرحله (I) آمینو اسید از اکسیژن کربوکسیل به DIC حمله نوکلئوفیلی می­کند. سپس در یک واکنش اضافه-حذف HOBt جایگزین باقی مانده DIC در ترکیب Amino acid/DIC می شود. HOBt یک گروه ترک کننده خوب است که در صورت مواجه شدن کربوکسیل آلفا در آمینو­اسید متّصل به HOBt با یک نوکلئوفیل خوب می­­تواند با آن جایگزین شود.  نوکلئوفیل خوب در مرحله (II) تشکیل می­شود به این ترتیب که DMAP به میزان کاتالیتیک 1/0 اکی والان نسبت به رزین باعث ایجاد یون الکوکسی در رزین می­شود. الکوکسی (–O^–) نسبت به گروه هیدروکسیل رزین (–OH) نوکلئوفیل بسیار قوی تری است که می­تواند حمله مؤثرتری به محصول مرحله (I) داشته باشد (شکل 4 مرحله III).

در مدّت سه ساعت میزان بار­گذاری (واکنشهای سریالی فوق در شکل 4) مطلوب نبود و با افزایش زمان انکوباسیون به مدّت 17 ساعت، میزان بار گذاری به میزان 40 درصد افزایش یافت (جدول 1). بنابراین واکنش تراکمی مذکور از سینتیک پایینی برخوردار است و پیشنهاد می­شود به رغم طول زمان انکوباسیون پیشنهادی به میزان حدود سه ساعت در اکثر پروتکلها، زمان انکوباسیون افزایش یابد. در شکل 4، مرحله II یک واکنش ساده باز با اسید است لذا از سرعت بالایی برخوردار است و نمی تواند مرحله محدود کننده سرعت باشد. در عوض مراحل I و III واکنشهای جایگزینی از نوع اضافه-حذف هستند. از آنجا که HOBt یک گروه ترک کننده خوب و یون الکوکسی (محصول II) یک نوکلئوفیل قوی است، منطقاً سرعت واکنش III از I باید بیشتر باشد. زیرا در مرحله  Iفعّال شدن گروه کربوکسیل آمینو­اسید با DIC و سپس واکنش آن با HOBt مجموعاً یک واکنش دو مرحله ای است; در حالی که در مرحله III یون الکوکسی در رزین یک نوکلئوفیل قوی و گروه کربوکسیل در آمینو­اسید دارای گروه ترک کننده خوب HOBt است. بنابراین هر دو واکنشگر این مرحله بسیار فعّال هستند و از واکنش پذیری بالایی برخوردارند. لذا حمله نوکلئوفیلی و به دنبال آن انجام واکنش با سرعت بالایی صورت می گیرد . بنابراین احتمالاً مرحله محدود کننده سرعت مرحله I است. همچنین افزودن DIPEA به واکنش موجب افزایش بازده بارگذاری بر روی رزین شد. زیرا DIPEA به سبب ساختار خود -آمین نوع سوم با ممانعت فضایی بالا- به عنوان جمع کننده پروتون به کار می رود و از سویی باز DMAP به پروتون و یا آب حساس است که می تواند پروتون را از محیط جمع کند تا کاتالیزور عملکرد بهتری داشته باشد. همچنین در مرحله I، DIPEA  می­تواند یک پروتون از گروه اسیدی آمینو­اسید جذب کند که باعث حمله موثرتر آن به DIC خواهد شد.

نتایج نشان می­دهد که بار گذاری با واکنشگرهای HBTU و DIPEA حتّی با زمان انکوباسیون کوتاهتر، بازده بیشتری نسبت بهDIC وHOBt  و DMAP در زمان سه ساعت دارد که نشان دهنده دو چیز است: 1- تاثیر مثبت DIPEA در واکنش و 2- بهتر بودن HBTU به عنوان فعّال کننده گروه کربوکسیل نسبت به HOBt-DIC . مکانیسم اتصال آمینو اسید با HBTU مشابه شکل 2 می باشد یعنی فعّال شدن گروه کربوکسیل آمینو اسید و حمله اکسیژن الکلی رزین به آن. با افزایش زمان واکنش، HOBt-DIC بهره بالاتری از HBTU در بارگذاری از خود نشان می­دهد. بنابراین به رغم سینتیک پایین، HOBt-DIC همچنان بهتر از HBTU برای بارگذاری آمینو­اسید روی رزین عمل می­کند، مشروط بر این که زمان انکوباسیون به اندازه کافی طولانی باشد.

بهتر است محل نشاندار کردن پپتید انتهای آمین آن باشد زیرا اوّلاً در مقایسه با سایر نواحی پپتید که دارای آمینو­اسید هایی با گروههای عاملی قابل نشاندار کردن هستند (مانند لیزین، سرین، ترئونین) گروه حجیم پروب فلورسانس به انتهای پپتید متّصل است که معمولاً مزاحمت کمتری در عملکرد بیولوژیکی پپتید ایجاد می­کند. ثانیاً همان طور که گفته شد (شکل 1) پپتیدها تا وقتی روی رزین هستند گروههای جانبی محافظت شده دارند ولی می­توان انتهای آمین را با پیپریدین محافظت زدایی کرد. بنابراین نشاندار کردن در انتهای آمین به لحاظ سنتزی این مزایا را دارد: 1- رنگ فلورسنت نمی تواند واکنش ناخواسته ای با گروه های جانبی سایر آمینو­اسید بدهد 2- خالص سازی بسیار ساده و فقط با چند بار شستشو قابل انجام است. 3- با انجام یک تست کایزر می توان مشاهده کرد که آیا واکنش اتصال رنگ کامل شده است یا خیر، و در صورت مثبت بودن تست (وجود آمین آزاد) واکنش تراکمی دوباره تکرار شود. 4- پیوند آمیدی رنگ FAM با آمین انتهایی به اسید قوی TFA حساس نیست و در اثر کلیویج از آن جدا نمی شود. بنا به دلایل گفته شده، در این مطالعه پپتید تترا آرژینین در ناحیه آمین انتهایی نشاندار شد.

رنگ فلورسنت FAM از دیرباز برای نشاندار کردن مولکولها (8) و ردیابی آنها در سلول مورد استفاده قرار گرفته است (4, 29). از این رنگ به دلایل گوناگون و در سلولهای مختلف استفاده شده است. از جمله کاربردهای این رنگ می­توان به ردیابی پپتیدهای ضد میکروبی در ریه انسان، (4) و مطالعه پپتیدهای حامل داروی علیه سلولهای سرطانی (18, 38) نیز اشاره کرد. در این تحقیق برای تعیین بهترین روش نشاندار کردن با رنگ FAM، از دو پروتکل (قسمت مواد و روشها) استفاده شد و نتایج آنها مورد مقایسه قرار گرفت. در روش اول، گروه کربوکسیل رنگ FAM با HBTU  فعال شده و به انتهای آمین اضافه شد (شکل 2). بعد از نشاندار کردن ، تست کایزر منفی بود که نشان دهنده تکمیل واکنش است. Pengcheng Zhang  و همکاران (38) نیز از همین روش استفاده کردند و نتیجه بهتری در اتصال رنگ FAM به آمینو اسید حاصل شده است. این مطالعات کاربردی بودن پروتکل این تحقیق را تعیین می کند. در حالی که در اکثر مطالعات و پروتکلهای مرسوم (6, 10, 33) از روش دوم یعنی استفاده ازHOBt-DIC  برای فعال کردن FAM استفاده شده بود. در این تحقیق مشخص شد با روش دوم و حتی افزایش زمان انکوباسیون به مدت 17 ساعت و تکرار مجدد کوپلینگ، نتیجه مطلوب حاصل نشد و تست کایزر همچنان مثبت بود.

البته رنگ نارنجی در هر دو روش مشاهده می­شد که نشان دهنده انجام واکنش در محیط بازی و حلال آلی است ولی روش اول بهره بالاتری دارد. بنابراین در مراحل نهایی که کلیویج و خالص سازی با HPLC است، پپتید نشاندار (محصول) با بهره بیشتری سنتز شده و مانند روش دوم بخشی از پپتید نشاندار نشده وجود ندارد. علاوه بر مزایای فوق، با توجه به گران بودن قیمت رنگهای فلورسنت از جمله رنگ FAM در استفاده از روش اوّل (علی رغم ذکر روش دوم در اکثر پروتکلها) تردیدی باقی نمی­ماند.

بازده پایین در روش دوم نسبت به روش اول می­تواند به دو دلیل باشد: یکی واکنش جانبی و ناخواسته DIC با آب (شکل 5) و دیگری واکنش مؤثرتر HBTU در فعّال کردن گروه کربوکسیل رنگ FAM و طبیعتاً حمله بهتر نوکلئوفیل آمین انتهایی به آن.  

شکل 5-  واکنش DIC با آب.

تخریب DIC توسط آب می تواند در واکنش بارگذاری آمینو اسید با DIC روی رزینها هم اتّفاق بیفتد، به همین دلیل در اکثر پروتکلها به استفاده از حلّال خشک توصیه شده است.

نتایج مشاهده شده در ارتباط با ارجحیّت HBTU به DIC/HOBt برای نشاندار کردن عکس نتایج بارگذاری روی رزین بود. علّت این امر، تفاوت در خواص نوکلئوفیلی آمین انتهایی با گروه هیدروکسیل در رزین وَنگ است. گروه آمین (انتهایی پپتید) نسبت به گروه هیدروکسیل (در رزین) نوکلئوفیل بهتری است.

نتیجه­گیری

برای اتصال اوّلین آمینو­اسید به رزین وَنگ به عنوان اوّلین و تعیین کننده ترین مرحله در سنتز پپتید بر پایه فاز جامد، استفاده از گروه فعّال کننده DIC/HOBt و افزایش زمان انکوباسیون روش بهینه در بارگذاری روی رزین محسوب می­شود. برای نشاندار کردن انتهای آمین پپتید با رنگ (6/5)-کربوکسی فلورسین به رغم اکثر پروتکلها، استفاده از HBTU برای فعّال کردن گروه کربوکسیل رنگ از واکنشگرهای DIC/HOBt بهتر است زیرا واکنشگر HBTU فعّال کننده بهتری برای گروه کربوکسیل است.

تقدیر و تشکر

این مقاله مستخرج از طرح شماره 960318-I-625 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری می باشد که بدینوسیله نویسندگان لازم می دانند از پژوهشگاه مذکور تقدیر و تشکر نمایند.