نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه مهندسی زیست فرآیند، پژوهشکده صنعت و محیط زیست، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران

2 گروه زیست فناوری دامی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران

3 گروه پزشکی مولکولی،‌دانشکده فناوری های نوین پزشکی،‌دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران

4 هیات علمی/ پژوهشگاه ملی ژنتیک و زیست فناوری

5 - گروه ژنتیک پزشکی، پژوهشکده زیست فناوری پزشکی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران

6 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فن آوری

چکیده

متداول ترین روش سنتز پپتیدها، سنتز روی رزین جامد است. در بین انواع رزین، رزین وَنگ (Wang) یکی از رایج ترین آنها است. در این مطالعه روش هایی برای بهبود اتّصال اولین آمینو اسید از انتهای کربوکسیل(C-terminus) به رزین وَنگ و همچنین نشاندار کردن انتهای آمین پپتید سنتز شده با رنگ فلورسنت (6/5)- کربوکسی فلورسین ارائه می شود. پپتید تتراآرژینین(RRRR) بر روی رزین وَنگ به روش سنتز بر پایه جامد سنتز شده و به انتهای آن رنگ فلورسنت (6/5)- کربوکسی فلورسین متّصل شد. نشاندار کردن پپتید توسط تست کایزر(نین هیدرین) مورد ارزیابی قرار گرفت. بهره واکنش اتّصال اولین آرژینین (Fmoc-Arg(pbf)-OH) توسط آزاد سازی گروه Fmoc(Fluorenylmethyloxycarbonyl chloride) متصل به آن و سنجش میزان جذب ماوراء بنفش آن در طول موج 278 نانومتر مورد اندازه گیری کمّی قرار گرفت.
جهت مقایسه بهره واکنش های "اتّصال اوّلین آمینو اسید به رزین" و "نشاندار کردن با رنگ فلورسنت"، از دو گروه فعال کننده معروف کربوکسیل به نام های DIC (N,N’-diisopropyl carbodiimid) و
HBTU (N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate) استفاده شد. در اتّصال اوّلین آمینو اسید آرژینین، واکنش گر DIC بهره واکنش را بیشتر از واکنش گر HBTU افزایش می دهد. هر چند لازم است طول زمان انکوباسیون به 17 ساعت افزایش یابد. در حالی که برای نشاندار کردن پپتیدها، HBTU عملکرد بهتری نسبت به DIC دارد.
این در حالی است که در اکثر پروتکل ها از DIC برای نشاندار کردن پپتیدها توسط انواع رنگ فلورسنت استفاده شده است و برای اتّصال اوّلین آمینو اسید نیز زمان انکوباسیون بسیار کمتر از 17 ساعت پیشنهاد شده است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Improving Reaction Yields of Binding Amino Acids to Wang Resin and Peptide Labeling with (5/6)-Carboxyfluorescein

نویسندگان [English]

  • Reihaneh Khosravi 1
  • Morteza Daliri 2
  • Zahra Azizi 3
  • Mohammad Hosein Sanati 4
  • Maryam Mohaghegh 5

1 Bioprocess engineering department, institute of industrial and environmental biotechnology, national institute of genetic engineering and biotechnology (NIGEB)

2 Animal biotechnology department, institute of agricultural biotechnology, national institute of genetic engineering and biotechnology (NIGEB)

3 Department of Molecular Medicine, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran

4 Medical genetics department, institute of medical biotechnology, national institute of genetic engineering and biotechnology (NIGEB)

5 Medical genetics department, institute of medical biotechnology, national institute of genetic engineering and biotechnology (NIGEB)

چکیده [English]

The most common method for peptide synthesis is to synthetize it on a solid resin. Among the variety of resins, Wang resin is one of the highly use ones. In this study, we introduced improved protocols for anchoring an amino acid on the Wang resin, a famous resin for peptide synthesis, and N-terminally labeling peptide with (5/6)-carboxyfluorescein, a fluorescent dye. The peptide tetra arginine, RRRR, was synthetized on Wang resin with solid phase peptide synthesis (SPPS) method and the dye was attached to its N-terminus. The attachment yield of the first arginine residue (Fmoc-Arg(pbf)-OH) were quantified by liberating the Fmoc groups from the amino acid/resin complex following measure its UV absorption at 278 nm. The labeling was monitored by Ninhydrin test that reveals presence of primary, unbound N-terminally amines. In anchoring the first arginine residue on the resin, DIC (N,N’-Diisopropyl carbodiimide) works more efficiently than HBTU (N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate), only if the incubation time increases to 17 hours; while, HBTU undeniably enhances the efficiency of the fluorescence labeling compared to DIC. However, in most available protocols, DIC was recommended for labeling the peptides with (5/6)-carboxyfluorescein and the recommended incubation time for attaching the first amino acid on the Wang resin is usually far shorter than 17 hours.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Peptide synthesis
  • Fluorescent dye
  • Coupling reaction
  • Activating agents