تجزیه ارتباطی صفات مورفو-فنولوژیک در توتونهای شرقی (Nicotiana tabacum L.) با نشانگرهای SSR تحت شرایط حضور و عدم حضور گل­جالیز

مریم طهماسب عالی¹، رضا درویش­زاده^1،2* و امیر فیاض مقدم¹

¹ ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه تولید و ژنتیک گیاهی.

² ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، پژوهشکده زیست فناوری.

تاریخ دریافت: 31/05/1399          تاریخ پذیرش: 24/10/1399

چکیده

شناسایی مکانهای ژنی کنترل کنندة صفات کمّی به ویژه در وضعیّت تنش از موضوعهای مهم حوزة ژنتیک و به­نژادی است. گل­جالیز علف­هرز هلوپارازیت (انگل اجباری) تضعیف کننده توتون (Nicotiana tabacum L.) با اثرات مخرب روی تولید آن است. در این مطالعه واکنش فنوتیپی 89 ژنوتیپ توتون شرقی در برابر انگل گل­جالیز در قالب طرح پایه بلوکهای کامل تصادفی با سه تکرار در طول دو سال متوالی در آزمایشات گلدانی ارزیابی شدند. در هر سال، ژنوتیپها در دو آزمایش جداگانه؛ یکی در شرایط نرمال (عدم حضور انگل گل­جالیز) و دیگری در شرایط حضور انگل گل­جالیز که در آن خاک گلدانها با 06/0 گرم بذر گل­جالیز مخلوط شد کشت شدند. در آزمایش مولکولی از 26 جفت آغازگر SSR برای تهیه پروفیل مولکولی افراد استفاده شد. مطالعه ساختار جمعیت به عنوان پیش­نیازی برای انجام تجزیه ارتباط به روش بیزین، نشان داد که دو زیر گروه احتمالی (2=K) در جمعیت مورد مطالعه وجود دارد. بر اساس آماره D′ 31/4 درصد از جفت مکانهای SSR به طور معنی­داری (0.01>P) در عدم تعادل پیوستگی بودند. در تجزیه ارتباط به روش مدل خطی مخلوط بر اساس میانگین تکرارها در دو سال برای هر ژنوتیپ در هر یک از شرایط در رابطه با هر صفت، در مجموع 16 مکان ژنی مرتبط با صفات مورد ارزیابی در سطح احتمال پنج درصد (P<0.05) شناسایی شد. تعدادی از نشانگرها مشترکاً برای یک صفت در محیطهایی با سطوح مختلف تنش (نرمال و تنش گل­جالیز) شناسایی شدند. این نشانگرها دارای اثر متقابل کمتری با شرایط محیطی می­باشند (نشانگرهای پایدار)؛ بنابراین گزینش با آنها برای صفتی در شرایط نرمال، باعث بهبود صفت در شرایط تنش نیز خواهد شد. نتایج به دست آمده از این مطالعه، اطلاعات ارزشمندی در زمینه گزینش به کمک نشانگر و مبنای ژنتیکی صفات مورد مطالعه ارائه می­دهد که می‌توان از این اطلاعات در گزینش افراد طی برنامه‌های به‌نژادی و تولید ارقام جدید با میزان عملکرد بالا بهره برد.

واژه های کلیدی: توتون، گل­جالیز، عدم تعادل پیوستگی، نشانگرهای مولکولی، مکان­یابی ارتباطی، مقاومت به تنشهای غیرزیستی.

* نویسنده مسئول، تلفن: +98 (44) 31942785 ، پست الکترونیکی: r.darvishzadeh@urmia.ac.ir

مقدمه

توتون یکی از محصولات با ارزش کشاورزی و صنعتی است. در میان تنشهای زنده و غیرزنده، علف­هرز گل­جالیز مهم ترین عامل در کاهش عملکرد توتون می­باشد (21). این گیاه انگلی در بسیاری از کشورهایی که توتون در آن کشت می­شود گزارش شده است. بذرهای گل­جالیز برای دوره زمانی طولانی مدت (15-20 سال) در خاک زنده مانده و در حضور گیاه میزبان جوانه می­زنند (46). روشهای مختلف از جمله زراعی، شیمیایی جهت مبارزه با انگل گل­جالیز بکار برده می­شود اما هیچ کدام از این روشها به طور کامل مؤثر نیست (41). در چند دهه اخیر سناریوی تولید و توسعه ارقام مقاوم به عنوان یکی از مؤثرترین روشهای کنترل مطرح شده است (41). تولید ارقام مقاوم به گل­جالیز اقتصادی، عملی و یک روش محیط زیستْ دوستدار می­باشد (20 و 29).

بهبود ژنتیکی اکثر صفات مهم در گیاهان از جمله توتون به دلیل ماهیت کمّی و تأثیرپذیری زیاد از عوامل محیطی دشوار است. یافتن نشانگرهای مولکولی مناسب در شرایطی که گیاه با شرایط تنش (تنش زیستی مثلاً انگل گل­جالیز یا تنش غیرزیستی مثلاً خشکی یا شوری) مواجه است می­تواند جهت اعمال گزینش برای بهبود عملکرد (عملکرد دانه در گیاهانی مثل آفتابگردان یا برگ خشک در گیاهانی مثل توتون) نقش به سزایی داشته باشد. استفاده از نشانگرهای مولکولی، سبب کاهش مدت زمان اصلاح و هزینه پروژه­های اصلاحی می­شود (44). اولین نشانگر مولکولی معرفی شده برای گیاهان، پلی­مورفیسم طولی قطعات برش­یافته (RFLP) بود. با ظهور واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR)، چندین سیستم نشانگری DNA دیگر مانند پلی­مورفیسم DNA تکثیر شده تصادفی (RAPD)، پلی­مورفیسم طولی قطعات تکثیر شده (AFLP)، توالی تکراری ساده (SSR) معرفی شد (19) که در بررسی تنوع ژنتیکی و تجزیه ساختار ژنتیک صفات در گیاهان استفاده می­شوند (50،34،27). نشانگرهایSSR  یا ریزماهواره­ها­، به دلیل چند آللی بودن، پلی­مورفیسم بالا، توزیع تصادفی در ژنوم، توارث هم­بارز و مکان اختصاصی بودن یکی از قابل اعتمادترین نشانگرها برای مطالعات ژنتیکی می­باشند (33) و در مقایسه با سایر نشانگرها به طور گسترده در مطالعات تنوع ژنتیکی و مطالعات نقشه­یابی گیاهان از جمله توتون استفاده می­شوند (12 و 16). از جمله روشهای مورد استفاده جهت شناسایی نشانگرهای مولکولی مرتبط با صفات، نقشه­یابی QTL مبتنی بر تجزیه پیوستگی و تجزیه ارتباطی است. در روش تجزیه پیوستگی، هدف شناسایی نشانگرهای پیوسته با یک صفت کمّی در یک جمعیت خواهر- برادری است. در تجزیة ارتباط، رابطة بین ژنوتیپ و فنوتیپ گیاه مستقیماً برای شناسایی نواحی کروموزومی دخیل در کنترل صفت با استفاده از نامتعادلی پیوستگی موجود در جمعیتهای طبیعی و مجموعه­های ژرم­پلاسم بررسی می­شود (7). مکان­یابی جایگاههای ژنی کنترل کننده صفات کمّی در دهه­های اخیر در گیاهان مختلف خانواده بادنجانیان شامل سیب­زمینی، گوجه فرنگی مورد استفاده قرار گرفته است (47). با این حال در مورد توتون مطالعات نقشه­یابیQTL  محدود بوده که دلیل اصلی آن دشوار بودن تهیه نقشه ژنتیکی برای توتون است، زیرا میزان چند شکلی در ارقام توتون بسیار پایین است (8 و 30). در پژوهشی با استفاده از نشانگرهای AFLP در 92 ژنوتیپ توتون نشانگرهای مرتبط با سه بیماری معمول (بیماریهای­ پوسیدگی سیاه ریشه و کپک آبی و بیماری ناشی از ویروسY  سیب­زمینی) شناسایی شدند. در این بررسی محققان موفق به شناسایی هفت نشانگر به ترتیب دو، سه و دو نشانگر مرتبط با مقاومت به بیماری پوسیدگی سیاه ریشه، کپک آبی و بیماری ناشی از ویروسY  سیب­زمینی شدند (31). در مطالعه­ایCai  و همکاران (14) با استفاده از نشانگرهای SRAP وAFLP  یک QTL  برای هر یک از صفات ارتفاع گیاه، قطر ساقه، طول میانگره و طول برگهای میانی در توتونهای هواخشک (تیپ بارلی) گزارش نمودند. در مطالعه دیگری که توسطTong  و همکاران (48) به منظور مکان­یابی ژنهای کنترل کننده مقاومت به بیماری لکه قهوه­ای در توتون گرمخانه­ای انجام گرفت، سهQTL  مرتبط با مقاومت به بیماری شناسایی گردید که بر روی گروههای پیوستگی LG2a،  LG3a وLG5  قرار داشتند و 14/31 درصد از تنوعات فنوتیپی را توجیه می­کردند. زمانبر بودن تولید جمعیتهای مصنوعی و محدود شدن اطلاعات ژنتیکی به جمعیتهای در حال تفکیک در مقایسه با اطلاعات جامع­تر و متنوع­تر موجود در جمعیتهای طبیعی سبب شده است در سالهای اخیر تجزیة ارتباط جایگاه ویژه­ای در تحقیقات به­نژادی به خود اختصاص دهد (5). تجزیة ارتباط در چند سال اخیر در دنیا به عنوان یکی از روشهای نوین در شناسایی مکانهای ژنومی کنترل کنندة صفات کمّی مطرح است. با عنایت به اهمیت بسیار زیاد تحقیقات مرتبط با تنش گل­جالیز و اینکه برای گیاهی مانند توتون که هنوز اطلاعات ژنتیکی چندانی دربارة بسیاری از صفات آن وجود ندارد، شناسایی نشانگرهای پیوسته با مکانهای کنترل کنندة صفات مهم تحت تنش می­تواند اطلاعات بسیار مفیدی در اختیار محققان ژنتیک و به­نژادی قرار دهد. در این پژوهش ضمن بررسی ساختار جمعیت بخشی از ژرم­پلاسم توتون شرقی ایران با استفاده از نشانگرهای SSR، نشانگرهای مرتبط با نواحی ژنومی کنترل کننده صفات مورفو-فنولوژیک تحت شرایط حضور و عدم حضور انگل گل­جالیز شناسایی شده است. نشانگرهای شناسایی شده در این تحقیق در صورت تأیید می­توانند در برنامه به­نژادی توتون از طریق انتخاب به کمک نشانگر به کار گرفته شوند.

مواد و روشها

مواد گیاهی و ارزیابی صفات مورفو- فنولوژیک: واکنش فنوتیپی 89 ژنوتیپ توتون شرقی (جدول 1) در دو محیط حضور و عدم حضور انگل گل­جالیز در قالب طرح پایه بلوکهای کامل تصادفی با سه تکرار طی دو سال متوالی (1386 و 1387) در مرکز تحقیقات توتون ارومیه در شرایط گلدانی ارزیابی شد. فنوتیپ ماحصل ژنوتیپ، محیط و اثر متقابل ژنوتیپ در محیط است. با کاربرد طرح آزمایشی و تعداد تکرار مناسب می­توان اثر محیط را کنترل نمود. تکرار آزمایش در چند سال نیز به محقق در کنترل اثر متقابل ژنوتیپ در محیط کمک می­نماید. بنابراین در آزمایشات چندساله در مقایسه آزمایشات یک­ساله میانگین ژنوتیپها دقیق­تر (بدون اریب) برآورد می­شوند.

برای ارزیابی واکنش ژنوتیپها، گلدانهای سفالی به حجم 10 لیتر انتخاب و با خاکی که از مزرعه یونجه تهیه شده بود پُر شدند. دلیل استفاده از خاک مزرعه یونجه، میزبانِ گل­جالیز نبودنِ این گیاه و استقرارِ طولانی مدتِ گیاه در زمین (معمولاً در شرایط ایده­آل 6 سال) می­باشد. در آزمایش تنش گل­جالیز، خاک گلدانها قبل از پر شدن، با 06/0 گرم بذر گل‏جالیز (Orobanche cernua) قاطی شد. گیاهچه­های هر یک از ژنوتیپهای توتون در خزانه تهیه شد و وقتی گیاهچه­ها از لحاظ ارتفاع به حدود 12 سانتیمتر رسیدند، به گلدانها انتقال یافتند. تمامی عملیات زراعی در طول دوره رشد توتون با توجه به استانداردهای موجود برای توتونهای شرقی انجام گرفت. برگهای ژنوتیپهای توتون در زمان رسیدگی صنعتی برداشت و در مقابل آفتاب خشک شدند. در هر یک از شرایط حضور و عدم حضور انگل گل­جالیز صفات ارتفاع بوته (سانتیمتر)، تاریخ گلدهی (روز)، تعداد برگ، سطح برگ (سانتیمتر مربع)، وزن تر برگ (گرم)، وزن خشک برگ (عملکرد) (گرم)، وزن تر ریشه (گرم)، وزن خشک ریشه (گرم) و وزن تر و خشک اندام هوایی (گرم) اندازه­گیری شدند. 

جدول 1- اسامی ژنوتیپهای توتون شرقی مورد استفاده در آزمایش به همراه احتمال تعلق آنها به زیرجمعیتهای حاصل از تجزیه ساختار جمعیت در نرم افزار Structure

RIL: Recombinant inbred line

ارزیابیهای مولکولی: ارزیابی پروفیل مولکولیِ ژنوتیپهای توتون با 26 جفت آغازگر ریزماهواره (SSR) انجام گرفت. توالی و اطلاعات آغازگرها در فایل تکمیلی 1 ارایه شده است. آغازگرها از بین 278 جفت آغازگر SSR موجود در نقشه پیوستگی توتون (12)، بر مبنای ایجاد پوشش ژنومی مناسب (داشتن نماینده از کروموزومهای مختلف) و کیفیت باندهای تکثیر شده در پروسه PCR (باندهای چندشکل با وضوحِ بالا در روی ژل­ الکتروفورز)، برای انگشت­نگاری ژنوم توتونهای شرقیِ مورد مطالعه انتخاب شدند. نحوه توارث هم­بارز، سطح پلی­مورفیسم بالا و سادگی کار از دلایل انتخاب این نشانگر برای تهیه پروفیل مولکولی افراد بود (33). جزئیات پروسه استخراج DNA و انجام واکنش زنجیره­ای پلی­مراز در مقاله Vaghari Azar و همکاران (49) ارایه شده است. یکی از مشکلات نشانگرهای ریزماهواره وجود آلل خنثی در برخی جایگاهها هست. بدین ترتیب که گاهاً در برخی از جایگاهها در یک یا چند فرد تکثیر انجام نمی­گیرد. مشکل اصلی وجود آلل خنثی در افراد هتروزیگوت هست که به علت عدم تکثیر یکی از آللها، فرد به اشتباه به صورت هوموزیگوت امتیازدهی می­شود. از آنجا که توتون یک گیاه خودگشن هست و ژنوتیپهای مورد مطالعه لاین خالص هستند چنین مشکلی در مطالعه حاضر دور از انتظار است. همچنین در صورتی که شرایط تکثیر در PCR بهینه نباشد احتمال تکثیر نوارهای غیراختصاصی وجود دارد. با بهینه کردن شرایط تکثیر خصوصاً دما و زمانِ مرحله اتصال و بسط می­توان نوارهای غیراختصاصی را حذف کرد که در این کار قبل از شروع کار اصلیِ تهیه پروفیل مولکولی افراد، اپتیمایز کردن پروتکل PCR انجام گرفت (49). 

تجزیه­های آماری: آماره­های توصیفی شامل مقدار کمینه، بیشینه، میانگین، انحراف معیار و ضریب تغییرات فنوتیپی برای داده­های حاصل از ارزیابی واکنش ژنوتیپها تحت شرایط حضور و عدم حضور گل­جالیز در نرم­افزار SAS نسخه­ 4/9 محاسبه شد. بمنظور انجام تجزیه ارتباطی صفات، ابتدا تجزیه ساختار جمعیت و دسته­بندی دقیق ژنوتیپها به زیرجمعیتهای مناسب با روش بیزین (Bayesian) در نرم­افزار Structure 3.3.2 انجام گرفت (37). در این روش هر یک از ژنوتیپها با یک احتمال و طوری به زیر جمعیتهای فرضی منتسب می­شود که در هر زیرجمعیت میزان همگنی (یکنواختی) بیشتر شود (40). مقادیر اولیه K (زیرجمعیتهای فرضی اولیه) بین یک  تا 10 در نظر گرفته شد و جهت افزایش دقت برای هر کدام از زیرجمعیتها پنج تکرار منظور گردید. طول دوره گرم­کردن (Burn-in) و تعداد تکرارMCMC ، 10000 در نظر گرفته شد تا نمودار حداکثر درست­نمایی حاصل شود. نرم­افزارStructure  برای هر مقدار K (تعداد واقعی زیرجمعیتها) یک ماتریس بنام Qst محاسبه می­کند که شامل ضرایب احتمال عضویت هر ژنوتیپ به هر یک از زیرجمعیتهاست. برای تعیین تعداد بهینه K یا تعداد زیرجمعیتها، از روشEvanno  و همکاران (18) استفاده شد. این روش بر پایه آماره ∆K است که شیب تابع احتمال را در نقطه­ای می­شکند که تعداد K فرضی در آن نقطه دارای حداکثر احتمال باشد. ماتریس روابط خویشاوندی بر اساس داده­های ریزماهواره و میزان عدم تعادل پیوستگی بین جفت نشانگرهای ریزماهواره با استفاده از نرم­افزار TASSEL 2.1 محاسبه شد (13). شناسایی ارتباط نشانگر-صفت با مدل خطی مخلوط (MLM) و با در نظر گرفتن ماتریسQ+K  (ماتریس ضرایب ساختارجمعیت + ماتریس روابط خویشاوندی؛ جهت جلوگیری از ارتباط کاذب بین نشانگر- صفت) به عنوان کواریت در مدل با نرم­افزار TASSEL 2.1 انجام گرفت.

نتایج و بحث

بررسی تنوع و ساختار ژنتیکی جمعیت: مقادیر حداقل، حداکثر، میانگین، انحراف معیار و ضریب تغییرات فنوتیپی صفات مورد مطالعه در ژنوتیپهای توتون تحت شرایط حضور و عدم حضور گل­جالیز در جدول 2 ارایه شده است. پارامتر ضریب تغییرات یکی از مهم­ترین و با ارزش­ترین شاخصهای برآورد تنوع بوده و مقدار عددی آن معمولاً بین 0 تا 100 درصد تغییر می­کند. هرچقدر مقدار عددی آن در رابطه با صفتی به 100 نزدیکتر باشد نشان می­دهد جمعیت از لحاظ آن صفت متنوع­تر هست. حُسن استفاده از این معیار شاخص پراکندگی نسبت به دیگر معیارها این است که با توجه به فرمول آن   این معیار تحت تأثیر واحد اندازه­گیری صفت و یا دامنه تغییرات آن قرار نمی­گیرد، بنابراین براحتی می­توان از آن برای مقایسه میزان تنوع صفات با واحدهای مختلف در یک جمعیت استفاده کرد. در فرمول ضریب تغییرات  واریانس فنوتیپی و  میانگین صفت می­باشد. با توجه به جدول 2 مشاهده می­شود که ژرم­پلاسم توتون شرقی مورد مطالعه از لحاظ اکثر صفات مورد بررسی از تنوع خوبی برخوردار هستند. بالاترین ضریب تغییرات فنوتیپی در دو شرایط حضور و عدم حضور گل­جالیز در وزن خشک برگ و در مرحله بعد در صفات وزن تر برگ و وزن خشک بوته مشاهده شد. اصولاً تنوع زیاد برای یک صفت در مواد اصلاحی موفقیت پروژه­های اصلاحی را تضمین می­کند. صفات با ضریب تغییرات پایین از شانس کمتری جهت انتخاب برخوردار هستند (28). با توجه به اینکه برگ خشک در گیاه توتون عملکرد گیاه محسوب می­شود وجود تنوع گسترده در این صفت حائز اهمیت بوده و می­تواند در برنامه­های اصلاحی مورد استفاده قرار گیرد (24 و 26).

جدول 2- آماره­های توصیفی صفات مورد ارزیابی در ژنوتیپهای توتون شرقی تحت شرایط نرمال و تنش گل­جالیز

با آغازگرهای SSR مورد مطالعه در مجموع 66 آلل تکثیر شدند. میانگین تعداد آلل تکثیر شده به ازای هر جفت آغازگر 54/2 بود. در تجزیه ساختار جمعیت مورد مطالعه بر اساس داده­های حاصل از 26 جفت آغازگر SSR (فایل تکمیلی 2) با روش بیزین دو زیر جمعیت احتمالی (K=2) در ژرم­پلاسم توتون شرقی مورد مطالعه شناسایی شد و 2=K به عنوان K بهینه در برآورد ماتریس سهم عضویت افراد در هر کلاستر (ماتریس Q) تعیین شد. براساس نتایج ارئه شده در بارپلات (شکل 1) با احتمال بیش از "70 درصد عضویت" 43 فرد متعلق به زیر ساختار اول (قرمز) و با احتمال بیش از "70 درصد عضویت" 24 فرد متعلق به زیر ساختار دوم (سبز) می­باشد. در مجموع 28/75 درصد از افراد مورد مطالعه دارای درصد عضویت بیشتر و یا مساوی 70 و حدود 72/24 درصد افراد باقیمانده دارای سهم عضویت کمتر از 70 می­باشند (شکل 2). اکثرِ افرادِ متعلق به زیر ساختار اول (قرمز) از جمعیتهای رگه­های خویش آمیخته­ی نوترکیب (RILs)، تنباکو و چپق هستند. جمعیت رگه­های خویش آمیخته از تلاقی دو لاین باسما سرس 31 و Dubec 566 در مرکز تحقیقات توتون ارومیه تولید شده­اند (مکاتبات شخصی، مرکز تحقیقات توتون ارومیه). جمعیت چُپُق از توده­های بومی توتون استان آذربایجان غربی توسط روش گزینش لاین خالص در مرکز تحقیقات توتون ارومیه معرفی شده­اند (مکاتبات شخصی، مرکز تحقیقات توتون ارومیه). اکثر افراد متعلق به زیر ساختار دوم (سبز) از تیپ تیکلاک هستند. مشخصه بارز تیپ تیکلاک نسبت به بقیه توتونهای شرقی داشتنِ برگِ دمبرگ­دار هست (مشاهدات مزرعه­ای، مرکز تحقیقات توتون ارومیه). در پژوهشی که توسطDadras  و همکاران (15) بر روی 50 ژنوتیپ توتون هوا خشک انجام شد جمعیت مورد مطالعه ایشان همچون جمعیتِ توتونهای شرقی مورد استفاده در مطالعه حاضر، همگن نبوده و ژنوتیپهای هوا خشک در طی تجزیه کلاستر و تجزیه ساختار جمعیت در هشت گروه و سه زیر جمعیت طبقه­بندی شدند.

شکل 1- تجزیه کلاستر مبتنی بر مدل Bayesian ژنوتیپهای توتون شرقی مورد مطالعه براساس نشانگرهای SSR (K=2). هر رنگ یک زیرجمعیت یا کلاستر را نشان می­دهد. اعداد روی محور افقی و عمودی به ترتیب شماره افراد و ضریب تعلق هر فرد به یک کلاستر را نشان می­دهد.

عدم تعادل پیوستگی (LD): در ژنوتیپهای مورد بررسی مقدار D´ (شاخصی برای سنجش نبود تعادل پیوستگی) بین 0014/0 الی یک و مقدار میانگین برابر با 1889/0 بود. 64/92 درصد از  مقادیر D´ بزرگتر از 1/0 بود (D´≥0.1, P ≤ 0.01) (شکل 2). بنابراین تعدادی از جفت مکانها در عدم تعادل پیوستگی هستند. عدم تعادل پیوستگی نشان­دهنده همبستگی غیرتصادفی آلل­ها در مکانهای ژنی مختلف روی یک کروموزوم (گروه پیوستگی) یا کروموزومهای مختلف است. عدم تعادل پیوستگی یک پیش نیاز اساسی در تجزیه ارتباطی صفات می­باشد (6). درجه و قدرت وضوح نقشه­یابی به دامنه LD بستگی دارد (39). گستره عدم تعادل پیوستگی در گیاهان، بسته به گونه و نوع جمعیت مورد بررسی، از صدها جفت باز تا صدها جفت کیلو باز مشاهده شده است. در جمعیتهای مصنوعی اصلاحی، تنها عامل ایجادکننده عدم تعادل، پیوستگی ژنی به علت نزدیکی فیزیکی ژنها بر روی کروموزومها است، ولی در جمعیتهای طبیعی، عدم تعادل پیوستگی می­تواند توسط عوامل دیگری غیر از پیوستگی ژنی مانند ساختار و خویشاوندی افراد در جمعیت، جهش، مهاجرت، گزینش و رانده شدگی ژنتیکی طی دوره تکامل یک جمعیت به وجود آید (36). پیوستگی زیاد بین دو ژن (آلل) باعث ایجاد سطح بالایی از عدم تعادل پیوستگی می­شود. عواملی مانند جهش جدید، خودگشنی، ساختار جمعیت، روابط خویشاوندی افراد، رانش ژنتیکی و انتخاب (طبیعی، مصنوعی و متعادل کننده) باعث افزایش و عواملی مانند نوترکیبی بالا، نرخ جهش، جهشهای تکراری و دگرگشنی باعث کاهش میزان عدم تعادل پیوستگی می­شوند (36). انتخاب همزمان بین جایگاههای ژنی در طول برنامه­های به­نژادی برای چندین صفت بطور معمول باعث ایجاد عدم تعادل پیوستگی بین جفت نشانگرهای مستقل می­شود. از نقطه نظر تئوریک، روابط خویشاوندی در جمعیت­ها باعث ایجاد عدم تعادل پیوستگی بین مکانهای ژنی پیوسته می­شود. با این حال وجود یک والد غالب در جمعیت (به طوری که بسیاری از افراد جمعیت به نحوی از این والد مشتق شده­اند)، ممکن است باعث ایجاد عدم تعادل پیوستگی بین نشانگرهای غیرپیوسته شود. علاوه بر این عوامل، ساختار جمعیت و رانش ژنتیکی، نیروهایی هستند که باعث ایجاد عدم تعادل پیوستگی در بین نشانگرهای غیر پیوسته در جمعیت می‍شوند (3).

شکل 2- پلات عدم تعادل پیوستگی (LD Plot) بین جفت مکانهای SSR در ژنوتیپهای توتون شرقی با استفاده از نرم­افزار TASSEL. قسمت بالای قطر نشان­دهنده عدم تعادل پیوستگی با استفاده از آماره  D^´و قسمت پایین قطر P- value برای عدم تعادل پیوستگی بین جفت مکانها را نشان می­دهد.

تجزیه ارتباط نشانگر-صفات: به طور کلی برای مکان­یابی ارتباطی دو روش GLM (مدل خطی عمومی) و MLM (مدل خطی مخلوط) پیشنهاد شده است. امروزه روش آماریMLM  به دلیل امکان گنجاندن ماتریس ساختار جمعیت و ماتریس خویشاوندی به عنوان کوواریت در مدل جهت جلوگیری از ارتباطات مثبت و دروغین بین نشانگرها و صفات به طور گسترده­ای برای تجزیه ارتباط در گیاهان استفاده می­شود (7). در مطالعه­ای (43) در تجزیه ارتباطی تحمل به شوری در ژرم­پلاسم پنبه گزارش کردند که استفاده از مدل MLM باعث کاهش ارتباطات کاذب نشانگر- صفت می­شود. همچنینYu  و Buckler (51) در شناسایی نشانگرهای پیوسته با تغییرات فنوتیپی در صفات آگروموفولوژیک ذرت از مدل MLM به منظور بهبود نتایج و کاهش نتایج مثبت دروغین استفاده نمودند و بر اساس اظهار محققین نتایج دقیق­تری در مقایسه با مدلGLM  به دست آمد. به نظر می­رسد مدلMLM  برای مکان­یابی ارتباطی مدل قابل اطمینانی باشد.

در تجزیه ارتباط بر اساس مدل MLM در سال اول در سطح احتمال پنج درصد (P<0.05) در مجموع 12 نشانگر (مکان­ SSR) مرتبط با صفات مورد ارزیابی شناسایی شد (جدول 3). از کل مکانهای SSR مرتبط با صفات مورد بررسی، بر اساس مدل MLM  (12 مکان)، 6 و 6 مکان به ترتیب تحت شرایط نرمال (عدم حضور گل­جالیز) و حضور گل­جالیز ارتباط معنی­داری با صفات مورد بررسی نشان دادند. از 6 مکان مرتبط با صفات تحت شرایط نرمال (عدم حضور گل­جالیز) 3 مکان با صفت تاریخ گلدهی، 1 مکان با ارتفاع بوته، 2 مکان با تعداد برگ مرتبط بود. از 6 مکان مرتبط با صفات تحت شرایط حضور گل­جالیز، 1 مکان با تعداد برگ، 2 مکان با سطح برگ، 1 مکان با وزن تر برگ، 1 مکان با وزن تر ریشه و 1 مکان با وزن خشک بوته پیوسته بود (جدول 2). در تجزیه ارتباط براساس مدل MLM در سال دوم در سطح احتمال پنج درصد (P<0.05) در مجموع 14 نشانگر مرتبط با صفات مورد ارزیابی شناسایی شد (جدول 3). از 14 مکان، 7 و 7 مکان ارتباط معنی­داری با صفات مورد بررسی به ترتیب تحت شرایط نرمال (عدم حضور گل­جالیز) و حضور گل­جالیز نشان دادند. از 7 مکان مرتبط با صفات تحت شرایط نرمال (عدم حضور گل­جالیز)، 2 مکان با ارتفاع بوته، 2 مکان با سطح برگ، 1 مکان با وزن تر برگ، 1 مکان با وزن تر بوته و 1 مکان با وزن خشک بوته پیوسته بود (جدول 2). از 7 مکان مرتبط با صفات تحت شرایط حضور گل­جالیز، 1 مکان با صفت تعداد برگ، 1 مکان با سطح برگ، 2 مکان با وزن تر برگ، 1 مکان با وزن خشک برگ و 2 مکان با وزن خشک بوته پیوسته بود (جدول 3).

در تجزیه ارتباط  بر اساس  مدل  MLM  بر  اساس  میانگین

تکرارها در دو سال برای هر ژنوتیپ در هر یک از شرایط در رابطه با هر صفت در سطح احتمال پنج درصد (P<0.05) در مجموع 16 مکان ژنی مرتبط با صفات مورد ارزیابی شناسایی شد (جدول 3). از کل مکانهای مرتبط با صفات مورد بررسی (16 مکان)، 6 و 10 مکان ارتباط معنی­داری با صفات مورد بررسی به ترتیب تحت شرایط نرمال (عدم حضور گل­جالیز) و حضور گل­جالیز نشان دادند. از 6 مکان مرتبط با صفات تحت شرایط نرمال (عدم حضور گل­جالیز)، 1 مکان با صفت تاریخ گلدهی، 1 مکان با ارتفاع بوته، 1 مکان با تعداد برگ، 2 مکان با سطح برگ و 1 مکان با وزن خشک بوته پیوسته بود (جدول 3). از 10 مکان مرتبط با صفات تحت شرایط حضور گل­جالیز، 1 مکان با ارتفاع بوته، 1 مکان با تعداد برگ، 1 مکان با سطح برگ، 2 مکان با وزن تر ریشه، 2 مکان با وزن خشک ریشه، 2 مکان با وزن تر بوته و 1 مکان با وزن خشک بوته پیوسته بود (جدول 3).

وجود ارتباط معنی­دار چند نشانگر با یک صفت مانند ارتباط نشانگرهای Pt30250، Pt30126،  Pt30067 با تاریخ گلدهی در شرایط عدم حضور گل­جالیز در سال اول، ماهیت کمّی و چندژنی این صفت را نشان می­دهد (9). تعدادی نشانگر مشترک برای صفات مورد مطالعه در این تحقیق شناسایی شدند. به عنوان نمونه ارتباط و پیوستگی نشانگر PT30126 در سال اول و تحت شرایط عدم حضور گل­جالیز با صفات تاریخ گلدهی و تعداد برگ، نشانگر PT30134 در سال اول و تحت شرایط تنش با صفات وزن تر برگ و تعداد برگ، نشانگر PT30126 در سال دوم و تحت شرایط عدم حضور گل­جالیز با صفات ارتفاع بوته و وزن تر برگ، نشانگر PT30205 در سال دوم و تحت شرایط عدم حضور گل­جالیز با صفات وزن تر و خشک بوته، نشانگر PT30134 در سال دوم و تحت شرایط تنش با صفات وزن خشک بوته و تعداد برگ، نشانگر PT30285 در سال دوم و تحت شرایط تنش با صفات وزن تر و خشک برگ، نشانگر PT30061 در مرکب دو سال و تحت شرایط عدم حضور گل­جالیز با صفات وزن خشک بوته و تعداد برگ، نشانگر PT30046 در مرکب دو سال و تحت شرایط تنش با صفات سطح برگ وزن خشک ریشه و وزن تر بوته، نشانگر PT30134 در مرکب دو سال و تحت شرایط تنش با صفات ارتفاع بوته وزن تر ریشه و تعداد برگ، نشانگر PT30061 در مرکب دو سال و تحت شرایط تنش با صفات وزن تر و خشک بوته مشاهده شد.

وجود نشانگرهای مشترک می­تواند ناشی از اثرات پلیوتروپی و یا پیوستگی نواحی ژنومی دخیل در کنترل مقاومت باشد (32). شناسایی نشانگرهای مشترک اهمیت زیادی در به­نژادی گیاهان دارد، زیرا گزینش همزمان چند صفت را امکان­پذیر می­سازد (23 و 36). وجود چنین حالتی کارآیی گزینش براساس نشانگر را بالا برده و موجب می­شود به دنبال اصلاح یک صفت در یک گیاه، تغییر ارزش در صفات همبسته نیز مشاهده شود (24 و 26).

تعدادی از نشانگرها مشترکاً برای یک صفت در محیطهایی با سطوح مختلف تنش (نرمال و تنش گل­جالیز) شناسایی شدند. به عنوان نمونه نشانگرِ PT30126 با صفت وزن تر برگ در سال دوم، نشانگرِ PT30134 با صفت ارتفاع بوته در مرکب دو سال و نشانگر PT30061 با صفت وزن خشک بوته در مرکب دو سال تحت هر دو شرایط حضور و عدم حضور گل­جالیز شناسایی شدند. شناسایی چنین نشانگرهایی می­تواند حاکی از عدم وجود اثر متقابل بین این نشانگرها با محیط باشد (28)؛ بنابراین می­توان از آنها به عنوان نشانگرهای پیوسته با این صفات و مستقل از محیط در برنامه­های اصلاح توتون استفاده کرد.

اگرچه شناسایی ژنهای کنترل کننده صفاتی نظیر مقاومت به بیماریهای مختلف در توتون به وفور انجام شده است (10 و 35) ولی در مورد صفات با توارث پیچیده نظیر عملکرد به خصوص تحت تنشهای مختلف گزارشات محدودی وجود دارد. یکی از دلایل مطالعات کم در این زمینه، وجود تنوع کم در داخل گونه N. tabacum می­باشد (31،30)؛ این در حالی است که شناسایی QTLهای کنترل کننده صفات کمّی می­تواند به فهم کنترل ژنتیکی آنها و توسعه استراتژیهای گزینش به کمک نشانگر کمک نماید (31،30). Dadras و همکاران (15) با استفاده از تجزیه ارتباطی مبتنی بر نبود تعادل پیوستگی در 50 ژنوتیپ توتون هوا خشک، 9 نشانگر AFLP مرتبط با صفات سطح برگ، ارتفاع گیاه، تعداد برگ، طول و عرض برگ شناسایی کردند. Basirnia و همکاران (11) با 26 نشانگر SSR تجزیه ارتباط به روش MLM برای تجمع کلر در برگ 70 ژنوتیپ توتون شرقی انجام دادند و یک مکان SSR از گروه لینکاژی 13 شناسایی کردند که با ژنهای کنترل کننده تجمع پایین کلر در برگ ژنوتیپهای توتون شرقی مرتبط بود. در پژوهشی Hoshyardel و همکاران (26) نقشه پیوستگی برای توتون شرقی با استفاده از جمعیت رگه­های خویش آمیخته نوترکیب (103 لاین) حاصل از تلاقیBasma 31 seres  (♀) و (♂) SPT406  و نشانگرهای SSR، ISSR، IRAP  و REMAP تهیه کردند و با استفاده از مکان­یابی فاصله­ای مکانهای ژنی کنترل کننده تعدادی از صفات زراعی را شناسایی نمودند. در پژوهش دیگری Hoshyardel و همکاران (25) به منظور شناسایی مکانهای ژنی مرتبط با گلدهی در توتون تیپ شرقی، جمعیت ژنتیکی شامل 100 فرد F2 حاصل از تلاقی دو ژنوتیپ توتون شرقی SPT 406 (والد پدری) و Basma seres 31 (والد مادری) را برای صفت روز تا شروع گلدهی مورد ارزیابی قرار دادند. در آزمایشات مولکولی نقشه پیوستگی جمعیت F2 با 23 نشانگر SSR و 29 نشانگرISSR  تهیه گردید که 8/570 سانتی­مورگان از ژنوم توتون را پوشش می­داد. با استفاده از روشهای مکان­یابی فاصله­ای ساده و مرکب به ترتیب 9 و 2QTL  برای صفت مورد مطالعه شناسایی گردید. تعیین نشانگرهای مرتبط با صفات مهم از طریق تجزیه ارتباط در گونه­های گیاهی مختلفی از جمله برنج (45)، پنبه (4)، کتان (1)، سورگوم (17)، آفتابگردان (5)، گیاه دارویی گرچک (22)، نخود (42)، یونجه (2) و انگور (38) نیز انجام شده است. با کاهش هزینه­های ارزیابی ژنوتیپی با تراکم بالا و گسترش داده­های ژنوم مرجع برای بیشتر گیاهان، پیش­بینی می­شود که استفاده از تجزیه ارتباطی برای شناسایی مکانهای ژنی کنترل کننده صفات کمی بیش از این گسترش یابد (7).  

جدول 3- نشانگرهای SSR پیوسته با صفات مورفو-فنولوژیک ارزیابی شده در ژنوتیپهای توتون شرقی تحت شرایط نرمال و تنش گل­جالیز براساس مدل خطی مخلوط (MLM)

نتیجه­ گیری

نتایج نشان داد که بین ژنوتیپهای توتون شرقی مورد بررسی از نظر صفات مورفو-فنولوژیکی تحت شرایط نرمال و تنش گل­جالیز و همچنین مکانهای ریزماهواره مورد بررسی تنوع بالایی وجود دارد. با مطالعه ساختار جمعیت در ژرم­پلاسم توتون شرقی مورد مطالعه دو زیر جمعیت شناسایی شد. در تجزیه ارتباط بر اساس مدل MLM، در سال اول در مجموع 12 مکان ژنی، در سال دوم  14 نشانگر و در تجزیه مرکب 2 سال در مجموع 16 مکان ژنی مرتبط با صفات مورد ارزیابی در سطح احتمال پنج درصد (P<0.05) شناسایی شد. تعدادی از نشانگرها مشترکاً برای یک صفت در محیطهایی با سطوح مختلف تنش (نرمال و تنش گل­جالیز) شناسایی شدند. به عنوان نمونه نشانگرِ PT30134 با صفت ارتفاع بوته در تجزیه مرکب دوسال تحت هر دو شرایط حضور و عدم حضور گل­جالیز شناسایی شدند. شناسایی چنین نشانگرهایی می­تواند حاکی از عدم وجود اثر متقابل بین این نشانگرها با محیط باشد؛ بنابراین می­توان از آنها به عنوان نشانگرهای پیوسته با این صفات و مستقل از محیط در برنامه­های اصلاح توتون استفاده کرد. همچنین نتایج نشان داد که برخی از نشانگرها با چندین صفت مرتبط هستند که وجود چنین حالتی در به­نژادی گیاهی از نظر اصلاح همزمان چندین صفت بسیار حایز اهمیت می‍باشد.