بهینه‌سازی عوامل تغذیه‌ای و رشدی برای تشکیل گلوله‌های قارچ پلوروتوس استراتوس

آیدا معدنی ملاک¹، امیر لکزیان^1*، الهام خداوردی² و غلامحسین حق‌نیا¹

¹ ایران، مشهد، دانشگاه فردوسی مشهد، دانشکده کشاورزی، گروه علوم خاک

² ایران، مشهد، گروه علوم پزشکی مشهد، دانشکده داروسازی، گروه فارماسیوتیکس

تاریخ دریافت: 4/7/1399                              تاریخ پذیرش: 7/7/1399

چکیده

تاکنون الگوهای رشدی و موفولوژیکی متفاوتی از قبیل (میسیلیوم، خوشه و پلت (گلوله)) در فرآیندهای صنعتی برای قارچ­های رشته‌ای مشاهده شده است. هدف این مطالعه بهینه‌سازی شرایط رشد قارچ پلوروتوس استراتوس Pleurotus ostreatus در تشکیل پلت قارچی با تغییر شرایط مختلف رشدی بود. تاثیر عواملی نظیر محیط کشت قارچ (محیط کشت کرک و محیط کشت عصاره مالت)، دما (25، 28، 32 درجه سانتی­گراد)، pH (5/4، 5/5 و 5/6)، سرعت گردش چرخاننده (100-130-150 دور در دقیقه)، نوع منابع کربنی، سطح ماده تلقیحی، حضور عوامل افزودنی و عناصر کم مصرف در شکل‌گیری دو نوع پلت قارچی (ساده و مرکب) بررسی شد. از میان عوامل ذکر شده، pH، سرعت گردش چرخاننده، نحوه آماده‌سازی ماده تلقیحی و زمان مناسب جهت افزودن منابع کربنی به عنوان اثرگذارترین فاکتورها شناخته شدند. فعالیت دو آنزیم لاکاز و منگنز پراکسیداز تولیدی هر دو نوع پلت ساده و مرکب در محیط کشت اصلاح شده کرک اندازه‌گیری شد. طبق نتایج به دست آمده پلت‌های یکنواخت قارچی تنها در pH معادل 5/5 تشکیل شدند. اندازه پلت‌ها همبستگی معکوسی با تعداد دور در دقیقه چرخاننده داشت. همچنین شکل‌گیری پلت‌ها با افزودن عوامل افزاینده غیر از پپتون تحت تاثیر قرار نگرفتند. در نهایت با اندازه‌گیری میزان فعالیت آنزیمی (لاکاز و پراکسیداز) پلت‌های قارچی مشخص شد که پلت‌های مرکب در مقایسه با پلت‌های ساده قادر به ترشح مقادیر قابل توجهی از آنزیم‌های تجزیه کننده لیگنین هستند. طبق شواهد پلت‌های قارچی گونه P. ostreatus عمدتا در نتیجه تراکم میسیلیومی شکل می‌گیرند و تجمع اسپورها لزوما تنها مرحله مهم در ایجاد پلت‌های قارچی نیست.

واژه های کلیدی: پلت‌های قارچی، پلوروتوس استراتوس، pH، سرعت گردش، ماده تلقیح

* نویسنده مسئول، تلفن: 38805844-051 ، پست الکترونیکی: alakzian@yahoo.com

مقدمه

انجام فرآیندهای زیستی با کمک زیست‌توده قارچی، موضوعی مورد توجه در مباحث زیست فناوری می‌باشد. در طول دهه‌های اخیر کاربرد گونه‌های قارچی در حذف و تجزیه آلاینده‌های آلی و غیر آلی از فاضلاب‌ها به عنوان روشی پیشنهادی در مقایسه با روش‌های سنتی و استفاده از باکتری‌ها در تصفیه فاضلاب‌ها مطرح بوده است (1، 11). برخی از مزایای قارچ‌ها نسبت به باکتری‌ها اعم از تولید تعداد بیشتری از آنزیم‌ها، حذف آلاینده‌ها با منشا آلی و غیرآلی، تحمل نوسان ورود آلاینده به محیط و تحمل بیشتر در برابر pH پایین و انرژی مصرفی کمتر می‌باشد (4، 5، 11، 27). قارچ‌ها عمدتا با دو مکانیسم عمده جذب سطحی و تجزیه آنزیمی، باعث حذف آلاینده‌ها می‌شوند (13، 26، 46). کاربرد قارچ­ها هم­چنین به عنوان حامل جهت تثبیت ریزجانداران دیگر مانند جلبک‌های ریز و مخمرها در کشت‌های تلفیقی به عنوان رهیافتی تازه پیرامون انرژی‌های زیستی مطرح می‌باشد (8، 47).

یکی از مورد مهمترین گروه‌های قارچی به لحاظ استفاده در فرآیندهای زیست فناوری، قارچ‌های رشته‌ای می‌باشند (25، 40). اصطلاح رشته‌ای بودن به دلیل ایجاد فرم هیفی در چنین قارچ‌هایی تخصیص یافته است. قارچ‌های رشته‌ای جز جانداران یوکاریوت هتروفیک وابسته به منبع خارجی کربن بوده و به صورت جنسی و غیرجنسی تولید مثل می‌کنند (31، 43). مورفولوژی و نحوه رشد قارچ­های رشته­ای در محیط کشت مایع پارامتر مهمی در انجام فرآیندهای زیستی می‌باشد. تاکنون سه نوع متفاوت از اشکال رشدی، رشد میسیلیومی، پلت و خوشه فرم در مورد قارچ‌های رشته‌ای شناسایی شده است (7، 15، 23، 48).

در میان اشکال مختلف رشدی قارچ شکل‌گیری پلت‌های قارچی از مزایای زیادی در فرآیندهای زیستی برخوردار می‌باشند و به عنوان امتیازی مهم برای هریک از گونه‌های قارچی از نقطه نظر صنعتی محسوب می‌شوند (3، 24). گزینش رشد قارچ در قالب پلت در صنایع مختلف باعث شده است که موانع موجود در نتیجه به‌کارگیری میسیلیوم پراکنده و آزاد قارچی (Freely suspended mycelium) تا حد زیادی از میان برداشته شود. مزیت­های اصلی استفاده از فرم پلت قارچی در مقایسه با سایر فرم­ها تولید زیست‌توده متراکم و بالا بوده که همین امر بقای قارچ را در برابر تنش­های محیطی بهبود بخشیده و باعث ایجاد مقاومت و پایداری در رقابت با میکروارگانیسم­های بومی محیط می­شود (19). از دیگر مزایای استفاده از این پلت‌های قارچی می‌توان به جداسازی آسان زیست‌توده از محیط کشت و استفاده مکرر و مجدد از آن‌ها، مصرف کمتر انرژی جهت نگهداری ثابت دما در طی انجام فرآیند، انتقال بهتر اکسیژن و عناصر غذایی به واسطه سطح تماس و کاهش چسبندگی به بدنه راکتورهای زیستی اشاره نمود (11، 12، 18، 23، 29). در هر پلت قارچی 3 ناحیه اصلی، منطقه فشرده نیمه ‌هوازی، لایه احاطه کننده هسته و ناحیه موئین خارجی قابل مشاهده است که ناحیه خارجی بوده که در آن هیف‌ها زیست پذیر بوده و فعال‌ترین بخش پلت به لحاظ متابولیکی را تشکیل می‌دهند (11، 40).

همان‌طور که در عمل مشاهده‌ شده است، دستیابی به پلت‌های یکنواخت با اندازه مطلوب در انجام فرآیندهای زیستی کار ساده‌ای نبوده به این خاطر که عوامل متعددی در شکل‌گیری و مورفولوژی پلت‌های قارچی دخیل هستند. از آن جمله می‌توان به رژیم چرخش، ترکیب محیط کشت، pH، دما، غلظت اکسیژن محلول، وجود مواد افزودنی و گرانروی محیط کشت، میزان ماده تلقیحی، شرایط تلقیح و دیگر عوامل اشاره نمود (32، 39). چنین عواملی در هریک از گونه‌ها به طور متفاوتی اثرگذار هستند. در نتیجه مطالعه شکل‌گیری پلت‌های قارچی با فهم مکانیسم‌های دخیل در ایجاد این پلت‌ها به توسعه و بهبود کاربرد چنین زیست‌توده‌های قارچی کمک می‌کند (40).

بنابراین بررسی تفکیکی گونه‌های قارچی و بهینه‌سازی فاکتورهای رشدی جهت تشکیل پلت­های قارچی حتی در مقیاس آزمایشگاهی می­تواند از دو جنبه مهم: 1) سهولت برداشت و استفاده مجدد زیست توده قارچی به شکل پلت قارچی در واکنش­های زیستی و تجزیه‌ای 2) بهبود روند تجزیه زیستی به دلیل انتقال بهتر اکسیژن به زیست توده قارچی و صرف انرژی کمتر در انجام هوادهی، حائز اهمیت ‌باشد (20). با توجه به این امر که قارچ‌های شاخه بازیدیومیست میکروارگانیسم‌هایی با توانایی بالا در تولید گستره وسیعی از آنزیم‌های تجزیه کننده غیراختصاصی لیگنولیتیک بوده و از طرفی فرآیند تثبیت زیست‌توده‌های میکروبی به عنوان روشی جهت دستیابی به حفظ طولانی مدت فعالیت قارچی مطرح می‌باشد (2، 37). هدف اصلی این مطالعه بر بهینه‌سازی شرایط و فاکتورهای رشدی قارچ بمنظور ایجاد و شکل‌گیری دو نوع پلت قارچی ساده و مرکب از گونه قارچی Pleurotus ostreatus بود. به این ترتیب که در پلت ساده، میسیلیوم­های قارچ به خودی خود به دور هم جمع می­شوند و تولید توده قارچی می­کنند و حال آن­که در پلت نوع مرکب زیست توده قارچی بر روی بستره ای از ذرات کربنی جمع و تثبیت شده و پلت قارچی شکل می­گیرد (10). همچنین با توجه به مطالعات صورت گرفته قبلی در این زمینه از بین تمامی آنزیم­های تجزیه کننده فعالیت دو آنزیم منگنز پراکسیداز و لاکاز جهت بررسی و مقایسه فعالیت آنزیمی دو نوع پلت قارچی انتخاب شدند (34).

مواد و روشها

آماده‌سازی پلت‌های ساده و مرکب: گونه قارچی P. ostreatus از شرکت (Fungi Perfecti, USA) در قالب اسپان‌های قارچی خریداری شد. سپس جهت تهیه ماده تلقیحی قارچ، کشت گونه قارچی در محیط کشت PDA (Potato Dextrose Agar) (یک لیتر حاوی عصاره 4 گرم سیب‌زمینی، 20 گرم گلوکز و 15 گرم آگار) انجام و به مدت پنج تا شش روز در گرمخانه در دمای 30 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. همچنین جهت حفظ فعالیت قارچی هر 30 روز کشت دوباره قارچ در محیط PDA مجددا تکرار شد. پلت ساده از میسیلیوم تثبیت شده (Self-immobilized) تهیه شد اما در پلت مرکب میسیلیوم تثبیت شده روی مخلوطی از ذرات خاک‌اره و پودر کربن فعال با نسبت 15/15 میلی‌گرم در 100 میلی‌لیتر از محیط کشت قارچ تهیه گردید.

روش تهیه ماده تلقیحی و تشکیل پلت‌های قارچی: بمنظور تهیه ماده تلقیحی از خارجی‌ترین قطر کلنی قارچ رشد یافته در محیط کشت PDA، 6 قطعه با سایز 1 سانتی‌متر مربع به ارلن 250 میلی‌لیتر حاوی 50 میلی‌لیتر محیط کشت پایه کرک با ترکیب (هر لیتر حاوی 10 گرم گلوکز، 2 گرم K₂H₂PO₄، 5/0 گرم MgSO₄، 1/0 گرم CaCl₂ و 1/0 گرم NH₄Cl) منتقل شد. بعد از گذشت 8 روز رشد در دمای 30 درجه سانتی‌گراد زیست‌توده حاصل شده جهت مراحل بعدی با کاغذ صافی از محلول رویی جداسازی شد. بلافاصله بعد از جداسازی قارچ‌ها بمنظور تهیه ماده تلقیحی همگن از میسیلیوم‌های قارچی با افزودن کمی آب مقطر استریل و با استفاده از یک همزن استریل عمل هم زدن به مدت یک دقیقه انجام شد. بمنظور انجام مراحل بعدی ماده تلقیحی همگن و سترون در درجه 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.

بمنظور بهینه‌سازی شرایط تشکیل پلت‌های قارچی عواملی نظیر نوع محیط رشد قارچ، دما، pH و سرعت گردش محیط، نوع و سایز منابع کربنی و زمان افزودن منبع کربنی (صرفا جهت تشکیل پلت‌های مرکب)، روش تهیه ماده تلقیحی، میزان تلقیح قارچ به محیط رشد، حضور مواد افزاینده به محیط و برخی عناصر کمیاب و تاثیر آن‌ها بر شکل‌گیری پلت‌های قارچی P. ostreatus بررسی شدند.

جهت کشت قارچ دو نوع محیط کشت عصاره مالت و محیط کشت پایه کرک بمنظور غربال کردن عوامل موثر در نظر گرفته شدند. آزمایشات در هر مورد بصورت جدا و در قالب طرح کاملا تصادفی اجرا شد. فاکتورهای آزمایشی جهت بهینه سازی محیط کشت برای تشکیل پلت­های قارچی و سطوح انتخاب شده برای هر فاکتور بر اساس تلفیقی از مطالعات قبلی انجام شده در این زمینه صورت گرفت (10، 28). این فاکتورها عبارت بودند از: دما در سه سطح 25، 28 و 32 درجه سانتی‌گراد، pH محیط کشت در سه سطح pH 5/4، 5/5 و 5/6، سرعت چرخش در سه سطح (100، 130 و 150 دور در دقیقه)، منابع کربنی جهت تشکیل پلت‌های قارچی مرکب شامل خاک‌اره در دو سایز (125/0 و 212/0 میلی‌متر) و زغال فعال کربن در اندازه ذرات 200 میکرون، روش تهیه ماده تلقیحی به دو صورت (صاف شده و صاف نشده)، میزان افزودن ماده تلقیحی در سه سطح 1، 2 و 3 میلی‌لیتر (معادل 150، 300 و 450 میلی‌گرم وزن تر میسیلیوم قارچی) در نظر گرفته شد. همچنین نحوه شکل‌گیری پلت‌های قارچ در حضور و عدم حضور یکسری عوامل افزاینده از قبیل پپتون و کلرید کلسیم هریک در سطح غلظتی 2 گرم در لیتر، سولفات آهن و تیامین بترتیب 1/0 و 1 میلی‌گرم در لیتر به محیط کشت پایه کرک بررسی شدند. اضافه کردن محلولی شامل عناصر کم مصرف (هر لیتر حاوی 3 گرم MgSO₄.H₂O، 1 گرم NaCl، 1/0 گرم CoSO₄، 01/0 گرم Al₂(SO₄)، 01/0 گرم H₃BO₃، 01/0 گرم NaMoO₄ و 5/1 گرم نیترو استیک اسید) نیز به عنوان یکی دیگر از عوامل مورد بررسی قرار گرفت.

اندازه‌گیری زیست‌توده قارچی و سایز پلت‌های تشکیل شده: طی آزمایشات مختلف در نتیجه اعمال پارامترهای مختلف موثر بر رشد و بعد از اطمینان از تشکیل پلت‌های قارچی و یا عدم تشکیل پلت (میسیلیوم‌های پراکنده قارچی)، زیست‌توده قارچی بعد از جداسازی در قالب وزن تر گزارش شد. وزن پلت‌های تشکیل شده قارچی در هر ارلن بعد از صاف کردن در صافی فلزی و وزن تر میسیلیوم‌های پراکنده قارچی با ریختن در لوله فالکون و انجام سانتریفوژ در دور 5000 به مدت 5 دقیقه صورت گرفت. جهت اندازه‌گیری سایز پلت‌های قارچی، با جداسازی پلت‌های قارچی تشکیل شده در هر ارلن، میانگین قطری پلت‌های قارچی جدا شده با استفاده از ورنیه تخمین زده شد.

اندازه‌گیری فعالیت آنزیمی (لاکاز و پراکسیداز) پلت‌های قارچی: نمونه‌برداری از محیط کشت جهت اندازه‌گیری فعالیت آنزیمی (لاکاز و پراکسیداز) پلت‌های قارچی ایجاد شده هر سه روز یکبار (روزهای سوم، ششم و نهم) و هر بار به میزان یک میلی‌لیتر از محیط کشت قارچ انجام گرفت. سپس نمونه‌ها در دور 5000 دور به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شدند و محلول‌های رویی در میکروتیوب‌های مربوطه جمع‌آوری و تا زمان اندازه‌گیری فعالیت آنزیمی در فریزر در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

سنجش فعالیت لاکاز از طریق اکسیداسیون پیش ماده ABTS (2,2΄-azino-biss3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) در بافر استات سدیم 1/0 مولار با pH معادل با 5/4 انجام شد. جذب نمونه‌ها با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتری در طول موج 420 نانومتر به مدت 1 دقیقه خوانش و ضریب خاموشی استفاده شده برای محاسبه واحد آنزیمی معادل 36 mM^-1cm^-1 در نظر گرفته شد (6).

فعالیت آنزیم منگنز پراکسیداز نیز با استفاده از پیش ماده دی متوکسی فنول (DMP) (2,6-dimethoxyphenol) و تشکیل کمپلکس مالونات منگنز در بافر 50 میلی مولار مالونات بهمراه سولفات منگنز یک میلی‌مولار صورت گرفت. واکنش آنزیمی به محض افزودن آب اکسیژنه با غلظت نهایی 1 میلی‌مولار به عنوان پذیرنده الکترون آغاز گردید. افزایش جذب در طول مدت یک دقیقه در زمان 30 ثانیه از شروع واکنش و 5/1 دقیقه با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتری در طول موج 468 نانومتر اندازه‌گیری شد. تغییرات جذبی در دقیقه با استفاده از ضریب خاموشی 49.6 mM^-1cm^-1 به واحد فعالیت آنزیمی در لیتر (U.L^-1) تبدیل شد. هر واحد آنزیمی به تعداد میکرومول‌های سوبستراهای اکسید شده در دقیقه در نظر گرفته شد (43).

تمامی آزمایشات انجام شده در سه تکرار و مقایسه میانگین‌ها با استفاده از آزمون توکی در سطح اطمینان 99 درصد با استفاده از نرم‌افزار JMP13 صورت گرفت.

نتایج

نتایج کلی بررسی پارامترهای رشدی متفاوت در شکل‌گیری پلت‌های قارچی به تفکیک ایجاد پلت ساده و مرکب گونه قارچی P. ostreatus در جدول 1 نشان داده شده است. بر اساس شواهد به دست آمده به طور معمول شکل‌گیری موفقیت آمیز پلت‌های قارچی در نتیجه اعمال تیمارهای مختلف بعد از گذشت 48 تا نهایت 72 ساعت از زمان شروع انکوباسیون صورت گرفت و با ادامه فرآیند انکوباسیون تا مدت زمان 10 روز هیچ‌گونه تغییر شکل مورفولوژیکی خاصی در ساختار پلت‌های ایجاد شده قابل مشاهده نبود.

جدول 1- شکل‌گیری پلت‌های قارچی P. ostreatus در شرایط رشدی متفاوت

×: فرم رشته، †: فرم خوشه و *: فرم پلت

نتایج حاصل از تاثیر نوع محیط رشدی قارچ طبق جدول 1 نشان داد که قارچ P. ostreatus قادر به ایجاد پلت ساده در هر دو محیط رشدی عصاره مالت و محیط کشت پایه کرک بوده است. هرچند در مورد ایجاد پلت‌های مرکب استفاده از محیط کشت پایه کرک احتمالا به لحاظ سیالیت و مواد غذایی موجود در ایجاد پلت‌های قارچی بهتر عمل نمود (جدول 1).

دما به طور مستقیم شکل‌گیری و مورفولوژی پلت‌ها را تحت تاثیر قرار می‌دهد. به طوری که در بین سه دمای 25، 28 و 32 درجه سانتی‌گراد شکل­گیری هر دو نوع فرم پلت به صورت ساده و مرکب در دمای 28 درجه سانتی­گراد راحت‌تر اتفاق افتاد. در این آزمایش همچنین مشخص شد که با تغییر دما نوع مورفولوژی پلت قارچی ایجاد شده نیز تحت تاثیر قرار می‌گیرد. به گونه‌ای که با بالا بردن دمای محیط از 28 به 32 درجه سانتی­گراد هیف‌های زیست پذیر و ناحیه موئین بیشتری در اطراف پلت قارچی قابل مشاهده بود (شکل 1).

شکل 1- ناحیه مویین میسیلیومی در اطراف پلت­های قارچی مرکب گونه Pleurotus ostreatus در محیط کشت کرک در دمای 32 درجه سانتی­گراد

یکی دیگر از عوامل در شکل‌گیری پلت‌های قارچی pH می‌باشد. نتایج به دست آمده از این آزمایش نشان داد که نوسانات تغییر pH در سه سطح (5/4، 5/5 و 5/6) منجر به ایجاد حالت‌های متفاوتی از مورفولوژی قارچ (رشته، خوشه و پلت) شد (جدول 1). در این آزمایش تنها در pH 5/5 تشکیل پلت‌های ساده و مرکب مشاهده شد و در دو سطح دیگر تشکیل پلت‌ها به صورتی بسیار اندک و بیشتر در قالب رشد رشته‌ای و یا خوشه قابل ملاحظه بود. علت رخداد تشکیل پلت قارچی در pH 5/5 می­تواند به دو علت باشد. اولا گونه قارچی P. ostreatus به لحاظ رشدی در pH مورد نظر بیشترین سرعت رشدی را داشته و همین امر سبب انسجام سریع تر هیف­های قارچی به یکدیگر و تشکیل شکل پلت را به دنبال داشته است. دوما از آنجایی که محیط کشت پایه کرک بعد از آماده سازی دارای pH معادل 5/5 می­باشد، لذا تنظیم pH در سطوح 5/4 و 5/6 تعادل اسیدی محیط را تا حدودی برهم زده و مانع رشد بهینه قارچ شده است.

با بررسی زیست‌توده تر قارچی ایجاد شده در فرم پلت قارچی همچنین مشخص شد که بیشترین زیست‌توده حاصل شده قارچی در فرم پلت در pH معادل 5/5 اتفاق افتاد (نمودار 1). در دو pH 5/4 و 5/6 به دلیل عدم تشکیل هیچ یک از انواع پلت ساده و مرکب؛ بعد از عمل سانتریفوژ و تخلیه محلول رویی زیست‌توده قارچ بر اساس وزن تر در هر ارلن گزارش شدند.

نمودار 1- نتایج مقایسه میانگین تاثیر سطوح مختلف pH بر زیست‌توده قارچی تولید شده (وزن تر بر حسب گرم در 100 میلی‌لیتر محیط کشت) پلت ساده و مرکب. مقایسه میانگین­های هر سه تکرار تیمارها توسط آزمون توکی و به صورت جداگانه انجام شده و در دو نوع حروف مورد استفاده، تیمارهایی که دارای حداقل یک حرف مشترک باشند در سطح یک درصد اختلاف معنی‌دار ندارند.

نتایج به دست آمده از تاثیر سرعت چرخش محیط بر تشکیل پلت‌های مرکب قارچ در شکل 2 نشان داده شده است. بر اساس شکل 2 با افزایش سرعت گردش میانگین اندازه پلت‌های ایجاد شده کوچک‌تر شده است. به طوریکه با افزودن 2 میلی‌لیتر ماده تلقیحی قارچ به محیط کرک تنها یک عدد پلت قارچی مرکب رویت شد (شکل 2 الف). با افزایش سرعت گردش توزیع و پراکندگی ذرات کربن و خاک‌اره در محیط بیشتر شده و رشد هیف‌های قارچ در قالب پلت با سایزهای کوچک‌تر اتفاق افتاده است (شکل 2 ب و پ).

شکل 2- تنوع در اندازه پلت‌های قارچی مرکب گونه Pleurotus ostreatus در دورهای متفاوت چرخاننده 100 (شکل 2 الف)، 130 (شکل 2 ب) و 130 (شکل 2 پ) دور در دقیقه در pH معادل 5/5 در محیط کشت کرک

نتایج حاصل از نمودار 2 نیز حاکی از عدم تشکیل پلت ساده قارچی در دو سرعت 130 و 150 دور در دقیقه بوده، در حالی که در سرعتی معادل 100 دور در دقیقه تشکیل پلت‌های ساده قارچی با میانگین قطری 5/0 میلی‌متر در هر ارلن قابل مشاهده بود.

نمودار 2- نتایج مقایسه میانگین تاثیر دورهای مختلف چرخاننده بر قطر پلت‌های قارچی (ساده و مرکب) گونه Pleurotus ostreatus  بر حسب سانتی‌متر. مقایسه میانگین­های هر سه تکرار تیمارها توسط آزمون توکی و به صورت جداگانه انجام شده و در دو نوع حروف مورد استفاده، تیمارهایی که دارای حداقل یک حرف مشترک باشند در سطح یک درصد اختلاف معنی‌دار ندارند.

افزودن منابع کربنی به محیط صرفا جهت ایجاد پلت‌های مرکب قارچ صورت گرفت (جدول 1). طبق مشاهدات افزودن سایز درشت‌تر خاک‌اره (212/0 میلی‌متر) اثر مثبت معنی‌داری در شکل‌گیری پلت‌های قارچی مرکب داشت. از طرفی افزودن همزمان منابع کربن و خاک‌اره بهمراه ماده تلقیحی قارچ سبب ایجاد ته‌نشینی سریع ماده تلقیحی بهمراه منابع کربنی حتی در سرعت‌های گردش بالا در محیط می‌شد. این مشکل با افزودن منابع کربنی استریل شده بعد از گذشت یک روز از رشد قارچ به محیط کشت مرتفع گردید. در شکل 3 (ب) شمایی از هسته کرینی ایجاد شده در پلت نوع مرکب در گونه قارچی P. ostreatus قابل مشاهده است.

با توجه به این امر که شکل رشدی گونه قارچی انتخاب شده در این آزمایش از طریق رشد انشعابات هیفی متراکم در محیط صورت می‌گرفت؛ بنابراین جهت تهیه ماده تلقیحی از چنین میسیلیوم‌های قارچی متراکم نیاز به همگن سازی ماده تلقیحی بود؛ در غیر این صورت امکان انحلال اسپوری قارچ و به دست آوردن ماده تلقیحی ممکن نبود. هرچند که با وجود همگن شدن ماده تلقیحی با کمک همزن برای تهیه پلت‌های قارچی مرکب نیاز به حضور قطعات ریزتر میسیلیومی بود که این کار با عبور ماده تلقیحی همگن شده از منافذ پارچه کتانی (ماده تلقیحی صاف شده) میسر شد (در جدول 1 بخش روش تهیه ماده تلقیحی به آن اشاره شده است).

شکل 3- پلت قارچی مرکب تشکیل شده از گونه Pleurotus ostreatus در محیط کشت کرک (شکل 3 الف) و برش مقطعی همان پلت (شکل 3 ب) که نمایانگر هسته کربنی و حضور میسلیوم­های قارچی در اطراف آن است.

در این آزمایش مقدار بهینه ماده تلقیحی اضافه شده به محیط که منجر به ایجاد پلت‌های ساده و مرکب شد، معادل 2 میلی‌لیتر در 100 میلی‌لیتر محیط کشت کرک در نظر گرفته شد (جدول 1).

نتایج این مطالعه در مورد افزودن پپتون به محیط کشت به عنوان منبع پروتئینی نشان داد که اضافه نمودن پپتون به محیط کشت پایه کرک اثر مثبتی بر شکل‌گیری پلت‌های ساده و مرکب بهمراه داشت (جدول 1). در این آزمایش همچنین افزودن کلرید کلسیم (2 گرم در لیتر) به محیط کشت پایه کرک سبب تغییر شکل مورفولوژی پلت‌های ساده از حالتی با ناحیه موئین محیطی به حالتی متراکم و منسجم گردید (شکل 4). در آزمایش حاضر همچنین مشخص شد که افزودن سولفات آهن و تیامین در غلظت‌های بسیار کم به محیط کشت پایه کرک نه تنها اثر مثبت نداشته بلکه تا حدودی سبب بازدارندگی تولید پلت‌های قارچی شده است. در رابطه با افزودن عناصر میکرو نیز به همین ترتیب هیچ‌گونه اثر محرکی در نتیجه حضور این مواد در محیط کشت دیده نشد (جدول 1).

شکل 4- مقایسه شکل‌گیری و مورفولوژی پلت­های قارچی ساده تشکیل شده از گونه Pleurotus ostreatus در محیط کشت کرک بدون کلرید کلسیم (شکل 4 الف) و در نتیجه افزودن کلرید کلسیم در محیط کشت (شکل 4 ب)

نتایج این پژوهش در رابطه با فعالیت برخی آنزیم‌های خارج سلولی موثر در تجزیه آلاینده‌ها نظیر لاکاز و پراکسیداز در طی سه زمان 3، 6 و 9 روز بعد از شکل‌گیری پلت‌های قارچی در نمودارهای 3 و 4 آمده است. از آنجایی که محیط کشت کرک در تولید هر دو نوع پلت قارچی ساده و مرکب نتایج مثبتی نشان داد، اندازه گیری فعالیت آنزیم­های لاکاز و پراکسیداز ترشح شده از پلت در محیط کشت کرک صورت گرفت. نتایج حاکی از آن است که پلت‌های مرکب در هر سه زمان مورد مطالعه نسبت به پلت‌های ساده سطوح فعالیت آنزیمی بیشتری را به خود اختصاص داده‌اند. به طوریکه در مورد فعالیت آنزیم لاکاز میزان فعالیت آنزیمی پلت‌های مرکب در سه زمان 3، 6 و 9 روز بترتیب 7/1، 2 و 4/2 برابر بیشتر از فعالیت آنزیمی در محیط کشت حاوی پلت‌های ساده بوده است (نمودار 3). در بررسی فعالیت آنزیمی پراکسیداز نیز روند مشابهی در هر سه روز نمونه‌برداری مشاهده شد. هرچند که میزان فعالیت آنزیمی پراکسیداز نسبت به فعالیت لاکاز به طور معنی‌داری کمتر بوده است. با بررسی روند افزایش معنی‌دار فعالیت آنزیم پراکسیداز افزایش 1.6 برابری در دو زمان 3 و 6 روز و افزایش 8/2 برابری فعالیت آنزیمی پلت‌های مرکب در مقایسه با پلت‌های ساده قابل مشاهده است (نمودار 4). از این آزمایش می‌توان نتیجه گرفت که تثبیت قارچ بر روی ذرات کربنی با فراهم آوری مواد غذایی مورد نیاز قارچ در محیط کشت علاوه بر ایجاد دوام و پایداری بیشتر پلت‌ها سبب راندمان بیشتر پلت‌های قارچی در تولید آنزیم‌های تجزیه کننده لاکاز و پراکسیداز در محیط خواهد شد.

نمودار 3- نتایج مقایسه میانگین تغییرات فعالیت آنزیم لاکاز ترشح شده از دو نوع پلت قارچی (ساده و مرکب) قارچ P. ostreatus در سه زمان (3، 6 و 9 روز). مقایسه میانگین­های هر سه تکرار تیمارها توسط آزمون توکی و به صورت جداگانه انجام شده و در دو نوع حروف مورد استفاده، تیمارهایی که دارای حداقل یک حرف مشترک باشند در سطح یک درصد اختلاف معنی‌دار ندارند.

نمودار 4- نتایج مقایسه میانگین تغییرات فعالیت آنزیم پراکسیداز ترشح شده از دو نوع پلت قارچی (ساده و مرکب) قارچ P. ostreatus در سه زمان (3، 6 و 9 روز). مقایسه میانگین­های هر سه تکرار تیمارها توسط آزمون توکی و به صورت جداگانه انجام شده و در دو نوع حروف مورد استفاده، تیمارهایی که دارای حداقل یک حرف مشترک باشند در سطح یک درصد اختلاف معنی‌دار ندارند.

بحث

مطالعات مختلف انجام شده در مورد شکل­گیری پلت­های قارچی حاکی از بهینه سازی شرایط رشدی مختلف در ایجاد چنین ساختارهایی دارد. همان‌طور که در آزمایش حاضر نیز مشخص شد با تغییر پارامترهای رشدی تغییرات معنی­داری در ایجاد پلت‌های قارچی مشاهده شد. در میان تمامی عوامل دما، pH، سرعت چرخش محیط، نحوه تهیه ماده تلقیحی قارچ و میزان ماده تلقیحی اضافه شده به محیط، همچنین زمان افزودن منبع کربن در ایجاد پلت­های قارچی موثرترین فاکتورها شناخته شدند. جهت تشکیل پلت­های قارچی بایستی توجه نمود که تشکیل چنین ساختارهایی برای هریک از گونه‌های قارچی متفاوت است و در نتیجه قابلیت تعمیم کلی وجود نخواهد داشت. در این راستا مطالعه شکل‌گیری پلت‌های قارچی برای هریک از گونه‌ها بایستی به صورت جداگانه صورت گیرد.

در رابطه با تاثیر دما در مطالعه­ای مشابه Liu و همکاران (2008) گزارش کردند که دمای 38 درجه سانتی‌گراد سبب شکل‌گیری سریع پلت­های قارچی Rhizopus oryzae می‌شود (22). این محققان همچنین بیان کردند که دمای 38 درجه نسبت به دمای 22 تا 33 درجه سانتی‌گراد تولید زیست‌توده قارچی را بیشتر تحت تاثیر قرار می‌دهد. در مطالعه‌ای دیگر اثر دو دمای 23 و 19 درجه سانتی‌گراد بر مورفولوژی پلت‌های Rhizopus oryzae بررسی شد (48). طبق نتایج دمای 19 درجه منجر به ایجاد پلت‌های متراکم با قطر کوچک‌تر (1/1 میلی‌متر) و ناحیه مویینه کم شده در حالی که در دمای 23 درجه، قطر پلت‌ها افزایش یافته (3/1 میلی‌متر) و ناحیه مویینه بزرگ‌تر و هیف‌های زیست پذیر بیشتری تولید شده است. در مطالعه حاضر نیز مشخص شد با افزایش دما منطقه مویینه بیشتری در اطراف پلت­های قارچی قابل مشاهده بود.

میزان pH محیط دیگر پارامتر رشدی بوده که به طرز معنی­داری تجمع هیف‌ها و اسپورهای قارچی را متاثر می­نماید. همانند دیگر متغیرها اثر pH تابعی از نوع گونه قارچ است به طوریکه در بعضی موارد تنها تغییر ناچیزی در pH منجر به شکل‌گیری پلت‌های قارچی می‌شود. همچنان که در این آزمایش بهترین pH جهت شکل­گیری پلت­های قارچی pH معادل 5/5 بود. محققان دیگر نیز به تاثیر pH در شکل‌گیری پلت‌های قارچی اتفاق نظر داشته، به عنوان مثال شکل‌گیری پلت‌های قارچی Penicillium chrysogenum نیاز به pH قلیایی محیط داشته و پلت‌های قارچی Rhizopus oryzae در محیط‌های اسیدی شکل می‌گیرند (20). در مطالعه‌ای که توسط Tao و همکاران در سال 2015 انجام شد پلت‌های قارچ A. niger در pH 5/5 تشکیل شدند (39).

با بررسی سرعت گردش محیط کشت، رابطه معکوسی بین اندازه قطر پلت‌ها با میزان چرخش در دقیقه چرخاننده حاصل شد. طبق مطالعات صورت گرفته نیز فاکتور سرعت گردش مهم‌ترین فاکتور در تعیین اندازه و یکنواختی قطر و سطح پلت‌های قارچی می‌باشد (17). به طوریکه برخی قارچ‌ها نیاز به تنظیم یک رژیم گردش خاصی با تغییر تعداد دور در دقیقه شیکر در طول دوره رشدی قارچ بمنظور ایجاد پلت قارچی هستند. به طور کلی هر چه تعداد دور در دقیقه پایین‌تر (100 دور در دقیقه) باشد انتظار تشکیل پلت‌ها با اندازه بزرگ‌تر و فعالیت آنزیمی بیشتر، محتمل‌تر می‌باشد (17). برای مثال گونه Rhizopus نیاز به رژیم چرخشی نسبتا شدیدی جهت شکل‌گیری پلت‌های قارچی دارد (22).

نوع ماده تلقیحی یکی دیگر از عوامل کلیدی در شکل‌گیری پلت‌های قارچی می‌باشد. عوامل وابسته به ماده تلقیحی عبارت‌اند از نوع گونه قارچ به کار رفته، کیفیت و فرآیند تولید ماده تلقیحی و میزان ماده تلقیحی (11). قبلا بیان شد که هیچ یک از گونه‌های قارچی قادر به ایجاد پلت در شرایط یکنواخت نیستند. به طور کلی سه مکانیسم شکل‌گیری به لحاظ مورفولوژیکی برای پلت‌های قارچی گزارش شده است (47). در نوع اول پلت از یک تک اسپور تولید می‌شود (پلت غیر انعقادی)، در مکانیسم دوم پلت‌ها از نوع انعقادی بوده به این ترتیب که اسپورهای قارچ‌ در یک جا متراکم شده و شروع به جوانه زدن می‌کنند. همانند فرآیندی که در قارچ A. niger انجام می‌شود (16، 47). در برخی موارد نیز پلت‌های قارچی حاصل ماده تلقیحی هیفی قارچ بوده و بدون حضور اسپورهای قارچی شکل می‌گیرند. همان‌طور که Priegnitz و همکاران (2012) در مورد یکی از جهش‌های قارچ A. niger مشاهده کردند که شکل‌گیری پلت‌های قارچی از طریق تراکم اسپورها مقدور نبوده و مکانیسم شکل‌گیری پلت فقط به واسطه حضور و تراکم هیف‌های قارچی می‌باشد (35). در اغلب موارد تولید پلت‌های قارچی به صورت مرسوم توسط محلول اسپوری قارچ تهیه می‌شود. هرچند تولید این پلت‌ها در شرایطی اختصاصی از طریق قطعات میسیلیومی نیز گزارش شده است (45). همان‌طور که در مورد گونه قارچی P. ostreatus تشکیل پلت­های قارچی از طریق رشد میسیلیومی در محیط اتفاق افتاد. طبق شواهد پلت‌های قارچی گونه P. ostreatus عمدتا در نتیجه تراکم میسیلیومی شکل می‌گیرند و تجمع اسپورها لزوما تنها مرحله مهم در ایجاد پلت‌های قارچی نیست.

نکته مهم دیگر، مقدار ماده تلقیحی به کار رفته در محیط کشت بوده که در واقع رشد و مورفولوژی پلت‌های قارچی را دیکته می‌کند (7). به طوریکه در مطالعات نشان داده شده استفاده از غلظت‌های بالای اسپورهای قارچی ممکن است منجر به شکل‌گیری میسیلیوم‌های پراکنده شود در حالی که سطوح کم ماده تلقیحی (معمولا کمتر از 10⁸ اسپور در میلی‌لیتر) تشکیل پلت‌های قارچی را افزایش می‌دهد (30). در مطالعه حاضر میزان بهینه تلقیح ماده تلقیحی معادل 2 میلی­لیتر (300 میلی­گرم وزن تر میسیلیوم قارچی) در 100 میلی­لیتر محیط کشت پایه کرک در نظر گرفته شد.

تاکنون مطالعات صورت گرفته بیشتر در رابطه با نحوه شکل­گیری پلت­های ساده بوده است در نتیجه در مورد زمان افزودن منبع کربنی و نوع منبع کربنی اطلاعات اندکی وجود دارد؛ اما با انجام این آزمایش مشخص شد که زمان افزودن منبع کربنی جهت تشکیل پلت­های قارچی مرکب عاملی بسیار تعیین کننده در تشکیل چنین ساختارهایی می‌باشد. احتمالا با توجه به این­که تجمع هیف­های قارچی بمنظور شکل­گیری پلت قارچی بسیار زیر تاثیر گرانروی محیط کشت می­باشد، لذا با افزودن همزمان ماده تلقیحی و کربن فعال گرانروی محیط کشت در لحظه بالا رفته و قبل از مجتمع شدن هیف­ها به دور هم و شکل­گیری خوشه­های قارچی، میسیلیوم­ها و اسپورهای آزاد قارچ بهمراه ذرات کربنی در محیط کشت ته نشست می­کنند (14، 22، 36).

در مطالعات بهینه‌سازی شکل‌گیری پلت‌های قارچی به نقش کلیدی برخی مواد افزاینده نظیر پروتئین‌ها و ویتامین‌ها، منابع مختلف کربنی و نمک‌های معدنی نیز اشاره شده است. در این مطالعه مشخص شد که افزودن پپتون سبب تحریک شکل­گیری پلت­های قارچی و کلرید کلسیم سبب انسجام و ایجاد شکل متراکم در ساختار پلت قارچی گردید. در مطالعه‌ای مشابه تاثیر افزایش گلیسرول و کلرید کلسیم بر مورفولوژی پلت‌های قارچی Neurospora نشان داده شد. افزودن این ترکیبات به محیط کشت منجر به ایجاد توده‌های کوچک و هسته‌های متراکم و ناحیه مویین کمی شد (9، 28). هرچند که زیست‌توده قارچی و تولید اتانول افزایش یافت (28). در تحقیقی دیگر غلظت بالای کلرید سدیم (4.2 osmol kg^-1) مانعی جهت شکل‌گیری خوشه و پلت قارچی تشخیص داده شد (44). در آزمایشات دیگر تاثیر منابع کربن مختلف نظیر ساکارز، گلوکز و فروکتوز و زایلوز جهت شکل‌گیری پلت‌ها مورد ارزیابی قرار گرفته‌اند. Espinosa-Ortiz و همکاران (2016) بمنظور شکل‌گیری پلت‌های قارچی A. niger از منبع کربنی لاکتوز استفاده کردند (11). در مقابل در تحقیقی دیگر با ارزیابی منابع کربنی مختلف (گلوکز، آرابینوز، ساکاروز و گالاکتوز با غلظت 20 گرم در لیتر) تاثیر معنی‌دار خاصی در مورفولوژی پلت‌های قارچی Neurospora مشاهده نشد (27). طبق نتایج به دست آمده افزودن عناصر کم مصرف به محیط رشد قارچ تاثیری در شکل­گیری پلت­های قارچی نداشت. هرچند نتایجی مبنی بر شکل‌گیری پلت‌های قارچی در حضور مواد معدنی کمیاب وجود دارد (47). با توجه به برخی تفاوت‌های موجود و مطالعات اندک در این زمینه لزوم بررسی‌های جامع پیرامون تاثیر ترکیب محیط کشت بر شکل‌گیری پلت‌های قارچی بایستی مورد توجه قرار گیرد.

همچنین در بررسی فعالیت آنزیمی در محیط رشد پلت­های قارچی نتایج به دست آمده حاکی از فعالیت نسبتا بالای آنزیم­های لاکاز و منگنز پراکسیداز در محیط کشت داشت. دلیل انتخاب آنزیم­های لاکاز و منگنز پراکسیداز از بین تمامی آنزیم­های تجزیه کننده غیراختصاصی توانایی بالای این آنزیم­ها در اکسیداسیون انواع متعدد سوبستراها (آلی، غیرفنلی و غیرآلی)، تحمل گرمایی بالا، داشتن pH ایزوالکتریک اسیدی است (2، 26، 37). پیش از این محققان دیگر نیز نقش و تاثیر این دو آنزیم چه به صورت خالص شده از محیط و یا همراه زیست توده قارچی در تجزیه آلاینده‌ها اشاره کرده‌اند (1، 24، 26). همانطور که نتایج این آزمایش نشان داد فعالیت آنزیمی در پلت­های قارچی مرکب به طور معنی داری بالاتر از پلت­های ساده قارچی بوده است. بررسی­های متعدد نشان داده است که استفاده از مواد آلی و غیرآلی به عنوان بستره در شکل­گیری پلت­های قارچی سبب بهبود عملکرد ساختاری و تغذیه ای قارچ شده و متعاقبا پایداری رشدی قارچ و فعالیت آنزیمی بالاتر را به دنبال خواهد داشت (10). Elgueta و همکاران (2012) با اندازه گیری فعالیت آنزیم­های لیگنولیتیک ترشح شده از پلت­های قارچی ساده و مرکب به فعالیت بسیار معنی دار آنزیم منگنز پراکسیداز در مقایسه با سایر آنزیم­ها اشاره کردند (10). همچنین مشخص شد که فعالیت آنزیم­های منگنز پراکسیداز و لاکاز در پلت قارچی مرکب به طور معنی داری بیشتر از پلت قارچی از نوع ساده می­باشد. محققان دیگر نیز نتایج مشابهی گرفتند و نشان دادند میانگین فعالیت دو آنزیم منگنز پراکسیداز و لاکاز 30 درصد بیشتر از فعالیت این آنزیم­ها در پلت­های ساده قارچی می­باشد (34). با توجه به این نتایج ترشح آنزیم­های تجزیه کننده لاکاز و پراکسیداز توسط چنین پلت­های قارچی می­تواند نوید بخش کاربرد چنین ساختارهای قارچی در مباحث زیست‌محیطی و بیوتکنولوژی باشد.

جمع‌بندی

نتایج مطالعه حاضر نشان داد که شکل­گیری پلت­های قارچی P. ostreatus در شرایط کنترل شده رشدی در مقیاس آزمایشگاهی قابل انجام بود. در میان تمامی فاکتورهای موثر در تشکیل پلت­های قارچی P. ostreatus، سه عامل pH محیط کشت، سرعت گردش چرخاننده و نحوه تهیه ماده تلقیحی مهم­ترین عوامل در ایجاد پلت­های ساده و مرکب بودند. بر اساس نتایج همچنین مشخص شد که تشکیل ساختارهای قارچی در قالب پلت به طرز معنی­داری سبب افزایش ترشح آنزیم­های خارج سلولی لاکاز و پراکسیداز در طول زمان انکوباسیون خواهد شد.