مطالعه آزمایشگاهی اثرات ضد باکتریایی و سمیت سلولی فراکسیون­های جدا شده از زهر افعی زنجانی

جمیل زرگان^1*، فرشید غلامی¹، حسین ثباتی²، حمیدرضا گودرزی³، اشکان حاجی نورمحمدی¹ و محمدباقر صالحی¹

¹ ایران، تهران، دانشگاه جامع امام حسین ^{(علیه السلام)}، دانشکده علوم پایه، مرکز علم و فناوری زیست شناسی

² ایران، تهران، دانشگاه علوم پزشکی بقیه اله^(عج) ، انیستیتو سبک زندگی، مرکز تحقیقات بهداشت و تغذیه

³ ایران، کرج، موسسه تحقیقات واکسن و سرم‌­سازی رازی

تاریخ دریافت: 29/07/1398          تاریخ پذیرش: 07/07/1399

چکیده

در این بررسی اثرات ضد باکتریایی و سمیت سلولی فراکسیون­های جدا شده از زهر افعی زنجانی در شرایط آزمایشگاهی مطالعه گردید. فراکسیون های زهر خام افعی زنجانی با استفاده از RP-HPLC و پس از تزریق به ستون C-18، جداسازی، و سپس جمع‌آوری شدند. میزان پروتئین موجود در هر فراکسیون با استفاده از روش برادفورد تخمین و اثرات ضدباکتری آن‌ها در غلظت μg/mL 20 با استفاده از روش­های سنجشMIC و MTT، علیه باکتری­های اشریشیا کولی، باسیلوس سوبتیلیس و استافیلوکوکوس اورئوس مطالعه گردید. سپس سمیت سلولی مؤثرترین فراکسیون­های دارای اثرات ضدباکتریایی، با استفاده از روش‌های سنجش   MTT و Neutral red uptake  بر روی سلول HepG2 بررسی شد و اثر آنها بر  القا آپوپتوز به کمک آزمایش کامت  تعیین گردید. نتایج نشان داد که اثرات ضدباکتریایی فراکسیون­ها علیه باکتری‌های مورد بررسی متفاوت بود، بترتیبی که فراکسیون شماره 2 روی باکتری باسیلوس سوبتیلیس، فراکسیون­های شماره 2 و 9 روی باکتری اشریشیا کولی و فراکسیون­های شماره 5، 7 و 9 روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس بیش‌ترین اثر را داشته‌اند. فراکسیون شماره 2 در غلظت μg/mL 20 و شماره 5 در غلظت های 10 و 20 میکروگرم بر میلی‌لیتر بیش‌ترین سمیت سلولی را داشته درحالی‌که فراکسیون شماره 7 کمترین سمیت را ایجاد کرده است بنابر نتایج، نوع مرگ سلولی القا شده توسط فراکسیونها به صورت وابسته به غلظت از نوع آپوپتوز و نکروز بود. داده­های این مطالعه برای اولین بار نشان داد که فراکسیون­های جدا شده از زهر افعی زنجانی اثرات ضد باکتری و ضد سرطانی دارند.

واژگان کلیدی: ضد باکتریایی، سمیت سلولی، سلول HepG2، زهر، افعی زنجانی

* نویسنده مسئول، تلفن: 02177104938 ، پست الکترونیکی: jazrgan@ihu.ac.ir

مقدمه

زهر مارهای سمی مخلوطی از مواد پیچیده پروتئینی با خواص سمی و آنزیمی و مواد غیر پروتئینی از قبیل یون­های مختلف فلزی، انواع چربی‌ها (کلسترول و لسیتین و...)، کربوهیدرات­ها (گالاکتوز و گلوکز)، نمک­های مختلف فلزی و شبه فلزی، مواد رنگی، ریبوفلاوین، آب، فعال‌کننده‌ها و مهارکننده‌ها می­باشد(2). اعتقاد بر این است که تقریباً تمامی عملکرد سم مارها در نتیجه­ی ترکیب عملکرد پروتئین­های متعدد با عملکرد آنزیمی و یا غیرآنزیمی می باشد. (16). تاکنون حدود 26 نوع آنزیم مختلف از سم مار جداسازی شده که از جمله آن‌ها فسفولیپازA (Phospholipase A) و یا ترکیبی از آن می­باشد. بعضی از فسفولیپازها نسبتاً غیر سمی و برخی دیگر به شدت سمی بوده و دارای خواص نوروتوکسیک (Neurotoxic) و میوتوکسیک (Myotoxic) هستند. زهر اغلب افعی‌ها دارای اندوپپتیداز (Endopeptidase) و آرژنین استرهیدرولاز (Arginine esterhydrolase) می­باشد که در کاهش فشارخون، خونریزی و نکروز نقش دارند (9).

مطالعات سم­شناسی نشان داده است که زهرمار ها بعنوان یک منبع طبیعی مهم برای جداسازی و شناسایی مولکول­های موثر در درمان بیماری های لاعلاج مانند سرطان، مورد توجه بسیاری از محقیقین جامعه پزشکی قرار گرفته است(23). این بررسی­ها نشان می­دهد که تاکنون مولکول­های ضد­میکروبی زیادی از زهرگونه­های مختلف مار جداسازی و به دنیای فارماکولوژی معرفی شده اند (21،11و22).

بر این اساس، اطلاعات منتشر شده حکایت از آن دارد که زهر گونه­های مختلف مارها نتایج امیدوارکننده­ای علیه باکتری­های شایع عفونی مثل: استافیلوکوکوس ­اورئوس، اشریشیا کولی، سودوموناس آئروجینوسا، باسیلوس سوبتیلیس، پروتئوس ولگاریس، پروتئوس میرابیلیس و اِنتروباکتر آئروژنز می‌باشند(15).

همچنین بررسی ها نشان می دهد که برخی از مولکول­های موجود در سموم مارها دارای فعالیت ضدتوموری بوده و از رشد و تکثیر سلولهای سرطانی جلوگیری می نمایند(24). بررسی­ها نشان داده است زهر گونه­های مختلف مارها نتایج امیدوارکننده­ای علیه باکتری­های شایع عفونی مثل: استافیلوکوکوس ­اورئوس، اشریشیا کولی، سودوموناس آئروجینوسا، باسیلوس سوبتیلیس، پروتئوس ولگاریس، پروتئوس میرابیلیس و اِنتروباکتر آئروژنز می‌باشند(15).

در این مطالعه برای اولین بار خواص ضد باکتریایی فراکسیون­های پروتئینی جدا شده از زهر افعی زنجانی و تعیین سمیت سلولی مؤثرترین فراکسیون­ها بررسی گردید.

افعی زنجانی یکی از مارهای سمی ایران است. این مار متعلق به خانواده ویپریده و جنس ویپرا بوده و ازنواحی کوهستانی، علف‌زارها و مناطق ییلاقی مناطق شمالی ایران گزارش شده و در استان‌های گیلان، زنجان، آذربایجان شرقی و قزوین انتشار دارد(9).

مواد و روشها

این مطالعه به صورت تجربی انجام گرفت. به این صورت که ابتدا اثرات ضد باکتریایی فراکسیون­های پروتئینی جدا شده از زهر خام افعی زنجانی و سپس اثرات سمیت سلولی آن‌ها (مؤثرترین فراکسیون‌های دارای خواص ضد باکتریایی) بررسی شد.

تهیه زهر:  برای این منظور با رعایت نکات ایمنی دندان نیش مار درون شیشه مخصوص جمع‌آوری زهر قرار گرفت، سپس با فشاری مختصر به غده سمی، زهر به داخل شیشه تزریق شد. محلول سمی لیوفیلیز شده و تا زمان استفاده در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری گردید.

مطالعه الکتروفورتیکی پروتئین­های زهر خام با روش SDS-PAGE : در این مطالعه بمنظور تعیین الگوی الکتروفورزی پروتئین‌های زهر خام از ژل 15 درصد پلی آکریل آمید استفاده گردید (5).

پس از انجام الکتروفورز، ژل با کوماسی بریلیانت بلو R-250 رنگ‌آمیزی شد. ومتعاقب آن تخمین وزن مولکولی باندهای پروتئینی انجام گرفت. برای محاسبه وزن مولکولی هر باند، طول مهاجرت هر باند بر طول ژل (فاصله­ی خط Tracking Buffer پایین ژل که نتیجه حرکت کوماسی بلو است تا ابتدای ژل جداکننده) تقسیم گردید تا فاکتور تاخیر(Rf) تعیین شود. سپس منحنی استاندارد که لگاریتم وزن مولکولی هر باند از مارکر پروتئینی در محور Y ها و Rf محاسبه شده­ی باندهای مارکر در محور X ها قرار داشت رسم گردید. سپس با استفاده از معادله خط و با توجه به Rf  نمونه مجهول، وزن مولکولی هر باند محاسبه شد.

جداسازی فراکسیون­های زهر با HPLC : برای جداسازی و جمع‌آوری فراکسیون­های زهر افعی زنجانی از ستون تهیه­ای C-18 و کروماتوگرافی مایع فاز معکوس با کارایی بالا (RP-HPLC) (Reverse-Phase High Performance Liquid Chromatography) استفاده شد(6). بدین صورت که، مقدار 40 میلی‌گرم از زهر خام در 20 میلی‌لیتر بافر ]آب دو بار تقطیر- 1/0% تری فلورواستیک اسید (TFA) دارای 5 درصد استونیتریل[ حل نموده و به مدت 5 دقیقه با سرعت 10000 دور در دقیقه (RPM) در دمای چهار درجه­ی سانتی‌گراد سانتریفیوژ گردید. محلول رویی برای جداسازی اجزاء مختلف زهر مورد استفاده قرار گرفت. برای جداسازی از دو محلولA  و  B و برنامه شیب خطی حلال مندرج در جدول 1 استفاده شد. محلول A شامل 20 درصد استونیتریل و 1/0 درصد TFA و محلول B  از ترکیب 80 درصد استونیتریل و 1/0 درصد TFA تشکیل شده بود.  پس از شستشوی ستون ) جدول 2(، نمونه با حجم 1 میلی‌لیتر (غلظت 2 میلی­گرم در میلی­لیتر) از بافر حاوی زهر به ستون تزریق و فراکسیون متناظر با هر پیک در ظروف عاری از هر گونه آلودگی جمع آوری گردید(28).

حل کردن فراکسیون­ها و پروتئین سنجی آن‌ها:  با توجه به این که بافر مناسب انتخابی جهت تهیه سوسپانسیون ماده سمی می­بایست برای برای باکتری و سلول غیر سمی باشد، بر این اساس محلولmM  50، Tris-HCl جهت تست های ضد باکتریایی و محیط کشت DMEM استریل به عنوان گزینه  مناسب برای تهیه سوسپانسیون فراکسیون­ها برای سمیت سلولی انتخاب شد. پروتئین سنجی به روش برادفورد(3) در طول موج 595 انجام شد و برای تهیه منحنی استاندارد از غلظت های مختلف آلبومین سرم گاوی  BSA)) استفاده شد. برای جلوگیری از رشد میکروارگانیسم­ها، لوله های محتوی فراکسیون­ها به دمای 20- درجه سانتی‌گراد منتقل گردید.

جدول1- برنامه شیب خطی حلال جهت جداسازی فراکسیون‌های زهر افعی زنجانی

جدول2- برنامه شستشوی ستون کروماتوگرافی

جهت از بین بردن آلودگی­های احتمالی در محلول سمی مورد نیاز تست­های سلولی، 1 درصد آنتی بیوتیک- آنتی­میکوتیک (Invitrogen, USA. CatNo: A5955) به لوله های حاوی فراکسیون­ها اضافه شد(27).

باکتری­ها و رده سلولی مورد مطالعه: سویه­های باکتریایی مورد استفاده در این مطالعه باکتری­های گرم مثبت و گرم منفی غیر بیماری زا می باشند که از گرم منفی های مورد استفاده به باسیلوس سوبتیلیس (Bacillus subtilis, ATCC 6633) و اشریشیا کولی (Escherichia coli, ATCC 25922) و سویه گرم مثبت پاتوژن استافیلوکوکوس اورئوس (Staphylococcus aureus, ATCC 25923) بودند که از مرکز منطقه­ای قارچ‌ها و باکتری‌های صنعتی ایران (PTCC) (Persian Type Culture Collection)خریداری شدند. رده­ی سلولی سرطان کبد (HepG2) از بانک سلولی موسسه انستیتو پاستور ایران (کد C158) خریداری گردید.

مطالعه اثرات ضد باکتریایی: محیط کشت و آنتی بیوتیک: جهت کشت باکتری­ها‌ و انجام آزمایش­های ضد باکتریایی از محیط‌ کشت مولر هینتون (MH) مایع شرکت(CatNo.249892) Quelab (کانادا) استفاده شد. بمنظور مقایسه خواص ضد باکتریایی زهر از تتراسایکلین (Sigma, USA. CatNo:T3258) با غلظت 50 میکروگرم در میلی‌لیتر استفاده گردید.

بررسی خواص ضد باکتریایی فراکسیون­ها به روش MTT (-3-(4,5-Dimethylthiazoyl-2-yl)-2,5-Diphenyl-tetrazolium bromide):

روش MTT یک روش رنگ سنجی است که بر اساس اندازه‌گیری تنفس میتوکندریایی استوار است. طی واکنش، نمک زرد رنگ MTT توسط آنزیم سوکسینات دهیدروژناز که یکی از آنزیم­های چرخه تنفسی در میتوکندری­ها است شکسته شده و به کریستال­های آبی رنگ نامحلول فورمازان تبدیل می‌شود. این کریستال­ها با اضافه نمودن DMSO به صورت محلول در می­آیند(7). بمنظور انجام این تست ابتدا از باکتری‌ها کشت تازه تهیه شد. پس از تهیه سوسپانسیون باکتریایی با غلظت نیم مک فارلند (در طول موج 600 نانومتر دارای جذبی معادل 1/0) (25) . مقدار 5 میکرولیتر از سوسپانسیون تهیه شده در چاهک­ها ریخته شد. سپس فراکسیون­های پروتئینی با غلظت 20 میکروگرم در میلی­لیتر(معادلIC₅₀ زهر خام مار افعی زنجانی برعلیه باکتری های گرم مثبت) به آن‌ها اضافه و با استفاده از محیط کشت مایع (مولر هینتون براث) حجم چاهک‌ها به 100 میکرولیتر رسانده شد. در این آزمایش از سوسپانسیون باکتری و محیط کشت به عنوان کنترل منفی، تتراسایکلین (غلظت 50  میکروگرم در میلی‌لیتر) به عنوان کنترل مثبت و محیط کشت فاقد باکتری به عنوان بلانک استفاده گردید. پلیت­ها به مدت 24-18 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد (برای باسیلوس سوبتیلیس شیکر انکوباتور) انکوبه شدند. پس از انکوباسیون، 5 میکرولیتر از محلول MTT با غلظت 5 میلی‌گرم در میلی‌لیتر به چاهک‌ها افزوده شد و پلیت در شرایط تاریکی تا زمان تشکیل کریستال­های بنفش رنگ فورمازان (حدود 1 ساعت)، در دمای 37 درجه سانتی گراد قرار داده شد. بمنظور حل شدن کریستال­ها 100 میکرولیتر DMSO در چاهک­ها ریخته شد و به مدت 2 ساعت در محیط بدون نور و دمای 37 درجه انکوبه گردید. در نهایت جذب نوری چاهک‌ها در طول موج 595 نانومتر(8) توسط دستگاه خواننده الایزا (Biotek, USA) اندازه‌گیری شد. این آزمایش 3 مرتبه انجام و در هر مرتبه برای هر غلظت 3 چاهک (3 تکرار) در نظر گرفته شد. درصد زنده ماندن باکتری­ها بعد از تماس با غلظت‌های مختلف زهر با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد (20):

مطالعه اثرات ضد باکتری فراکسیون­ها با روش MIC assay (minimum inhibitory concentration): در این آزمایش اثرات ضد باکتریایی فراکسیون‌های پروتئینی جدا شده از زهر خام با غلظت 20 میکروگرم در میلی‌لیتر بر روی رشد باکتر­ی­ها با استفاده از پلیت 96 خانه بررسی شد(1). مراحل انجام این آزمایش مشابه تست سنجش MTT  بوده ولی پس از ریختن فراکسیون­ها در چاهک­ها و انکوبه کردن به مدت 24-18 ساعت، جذب نوری چاهک‌ها در طول موج 605 نانومتر با استفاده از دستگاه الایزا ریدر (Biotek, USA) اندازه‌گیری شد. آزمایش فوق 3 مرتبه انجام و در هر مرتبه برای هر فراکسیون 3 چاهک (3 تکرار) در نظر گرفته شد و درصد مهاری باکتری­ها با استفاده از فرمول زیر محاسبه گردید(14)  :

بررسی سمیت سلولی موثرترین فراکسیون­های دارای خواص ضدباکتریایی: کشت سلول: سلول های HepG2 در محیط کشت (Gibco CatNo:12400-016) DMEM-F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) دارای 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) و 1 درصد پنی سیلین - استرپتومایسین (Sigma-Aldrich, USA. CatNo:15140-122)در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی گراد و 5 درصد CO₂ کشت و پاساژ داده شدند. پس از چهار بار پاساژ دادن و تراکم در حدود 80% سلول‌ها در داخل بستر فلاسک، سلول ها با استفاده از Trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich, USA. CatNo:097K2393) از کف فلاسک جدا و پس از شمارش با استفاده از لام هموسیتومتر مورد استفاده قرار گرفتند.

آزمون  MTT جهت بررسی سمیت سلولی فراکسیون­ها: در این مطالعه سمیت سلولی فراکسیون­ها (مؤثرترین فراکسیون‌های پروتئینی دارای خواص ضد باکتریایی) در غلظت‌های 10 و 20 میکروگرم در میلی‌لیتر بر روی سلول HepG2 بررسی شد. این آزمون مطابق روش زرگان و همکاران انجام گردید(28).

ابتدا تعداد 10⁴×3 سلول در هر چاهک پلیت 96 خانه‌ای کشت داده و حجم چاهک‌ها با محیط کشت (فاقد سرم) به 100 میکرولیتر رسانده شد و پلیت به مدت یک شب در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‌گراد و 5 درصد CO₂ انکوبه گردید. پس از انکوباسیون محیط کشت قدیمی تخلیه شد و 100 میکرولیتر محیط کشت (فاقد سرم) حاوی غلظت­های 10 و 20 میکروگرم در میلی­لیتر از فراکسیون­ها به چاهک‌ها اضافه شد. چاهک کنترل با محیط کشت فاقد سرم تعویض گردید. از محیط کشت فاقد سلول به عنوان بلانک و محیط کشت حاوی سلول به عنوان کنترل استفاده شد. پلیت به مدت 24 ساعت درون انکوباتور تحت شرایط 5 درصد CO₂ و دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. سپس 5 میکرولیتر از محلول MTT با غلظت 5 میلی‌گرم در میلی‌لیتر (بافر آن PBS) به چاهک‌ها افزوده‌ شد و پلیت تا زمان تشکیل کریستال­های بنفش رنگ فورمازان (2-1 ساعت) در شرایط تاریکی و دمای 37 درجه سانتی گراد به انکوبه گردید. در این مرحله محتویات چاهک‌ها تخلیه و چاهک­ها دو مرتبه با محلول PBS شستشو داده شد. بمنظور حل نمودن کریستال‌های فورمازان، از محلول DMSO به میزان 100 میکرولیتر به هر چاهک اضافه و بعد از انکوباسیون تحت شرایط تاریکی به مدت 2 تا 4 ساعت در دمای اتاق، جذب در 570 نانومتر(7) با استفاده از دستگاه الایزا ریدر (Biotek, USA) اندازه­گیری شد.

این تست 3 مرتبه تکرار و در هر مرتبه برای هر غلظت 3 چاهک (3 تکرار) در نظر گرفته شد. سپس از داده­ها میانگین گرفته و درصد زنده ماندن سلول ها طبق فرمول زیر محاسبه شد(7):

مطالعه سیتوتوکسیسیته فراکسیون­ها با روش رنگ سنجی قرمز خنثی (Neutral red uptake assay): این روش بر مبنای جذب رنگ قرمز خنثی توسط لیزوزوم­های سلول استوار است که پس از لیز شدن غشای سیتوپلاسمی سلول، رنگ جذب شده خارج شده و میزان رنگ جذب شده اندازه‌گیری می‌شود(1).

مراحل رنگ سنجی قرمز خنثی مشابه تست  MTTبوده اما پس از ریختن غلظت های مختلف فراکسیون­ها درون چاهک­ها و انکوباسیون به مدت 24 ساعت، به جای محلول MTT، 5 میکرولیتر از محلول قرمز خنثی (با غلظت 1 میلی­گرم در میلی­لیتر) به چاهک‌ها اضافه شد و تا زمان تشکیل کریستال­ها (حدود 4-2 ساعت)، پلیت درون انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‌گراد و 5 درصد CO₂ انکوبه گردید. پس از این مدت، محتویات چاهک‌ها تخلیه شد و با دو مرتبه شستشو با PBS ماده قرمز خنثی جذب نشده توسط سلول از چاهک‌ها خارج گردید. جهت فیکس شدن سلول ها، 100 میکرولیتر از محلول فیکس کننده (Fixing solution)(کلریدکلسیم و فرمالدئید) در چاهک‌ها ریخته شد و پس از مدت 1 دقیقه خارج گردید. سپس 100 میکرولیتر از محلول لیزکننده (Sulobilize solution)(اسید استیک و اتانول) به چاهک­ها اضافه و پلیت در شرایط تاریکی بر روی شیکر به مدت 20 دقیقه و در دمای آزمایشگاه قرار داده شد. در نهایت جذب نوری چاهک‌ها در طول موج 540 نانومتر با استفاده از دستگاه خواننده الایزا (Biotek, USA) اندازه‌گیری گردید. در این تست محیط کشت بدون سلول به عنوان بلانک و محیط کشت حاوی سلول به عنوان کنترل در نظر گرفته شد. این تست 3 مرتبه تکرار و در هر مرتبه برای هر غلظت 3 چاهک (3 تکرار) در نظر گرفته شد.

 درصد مهار سلولی طبق فرمول زیر محاسبه شد:

مطالعه آسیب­های DNA سلولی فراکسیون­ها با روش کامت قلیایی (Alkaline Comet assay): در این مطالعه جهت تعیین نوع مرگ سلولی (آپوپتوز یا نکروز) ناشی از اثرات سایتوتوکسیک فراکسیون­ها از روش کامت قلیایی استفاده شد(20) . این روش در مقایسه با سایر روش‌های سنجش آسیب DNA در سلول یوکاریوت، یک روش بسیار حساس، آسان، کم هزینه و سریع جهت اندازه­گیری فرگمنته شدن DNA در سلول‌های منفرد می­باشد(18). ابتدا 300 میکرولیتر محیط کشت فاقد سرم حاوی 10⁴×12 سلول در هر چاهک پلیت 24 خانه‌ای ریخته شد. پلیت به مدت یک شب درون انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‌گراد، 5 درصد CO₂ و حدود 80 درصد رطوبت انکوبه گردید. پس از انکوباسیون محیط کشت چاهک‌ها تخلیه شد و 300 میکرولیتر محیط کشت جدید (بدون سرم) حاوی غلظت‌های 10 و 20 میکروگرم در میلی­لیتر از فراکسیون­ها به آن‌ها افزوده شد. پلیت برای 24 ساعت در انکوباتور CO₂ با دمای 37 درجه سانتی‌گراد، 5 درصد گاز کربنیک انکوبه گردید. پس از پایان انکوباسیون، با استفاده از تریپسین و PBS عمل جداسازی سلول‌ها از کف چاهک انجام شد. محتوای چاهک­ها به میکروتیوب­های 5/1 میلی­لیتری منتقل و به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد با دور rpm 1500 سانتریفیوژ شدند و محلول رویی دور ریخته شد. سپس 400 میکرولیتر PBS به میکروتیوب ها اضافه و مجدداً به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد و با دور rpm 1500 سانتریفیوژ شدند و محلول رویی تخلیه گردید. به میکروتیوب­ها 200 میکرولیتر PBS افزوده شد و با استفاده از سمپلر و سرنگ انسولین سلول‌ها از یکدیگر جدا شده و به صورت منفرد در آمدند. سپس پوشش نازکی از محلول یک درصد آگاروز با نقطه ذوب نرمال (%1NMA) (Normal Melting-Agaros) بر روی اسلایدها (لام­ها) قرار داده شد و سوسپانسیون سلولی با محلول یک درصد آگاروز با نقطه ذوب پایین (LMA1%) (Low Melting-Agaros) به نسبت یک به دو مخلوط و روی اسلایدهای تهیه شده با  NMA1% ریخته شد. جهت ایجاد یک لایه سلول روی هر اسلاید یک لامل قرار داده و به مدت 10 دقیقه در یخچال با دمای 4 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. پس از 10 دقیقه لامل آن‌ها برداشته شد و بمنظور لیز شدن غشا و همچنین تخریب هسته سلول، اسلایدها در بافر لیز کننده سرد و تازه تهیه شده به مدت 18-16 ساعت در یخچال با دمای 4 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند. پس از خارج کردن بافر لیز کننده، اسلایدها 20 دقیقه و در 2 نوبت با بافر الکتروفورز شستشو داده شدند. بمنظور باز شدن DNA، اسلایدها به مدت 40 دقیقه درون بافر الکتروفورز سرد و تازه درون یخچال گذاشته شدند و پس از آن الکتروفورز به مدت 45 دقیقه با ولتاژ 25 ولت و جریان 300 میلی‌آمپر انجام شد. الکتروفورز در شرایط دمایی زیر 20 درجه و محیط تاریک صورت گرفت. جهت خنثی سازی pH قلیایی، اسلایدها به مدت 5 دقیقه در بافر خنثی‌کننده (Neutralization buffer) قرار داده شدند. جهت رنگ آمیزی سلول‌ها به هر اسلاید 100 میکرولیتر محلول اتیدیوم بروماید با 20 میکروگرم در میلی‌لیتر اضافه و به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفتند. سپس اسلایدها به مدت 10 دقیقه با آب دوبار تقطیر شستشو داده و با استفاده از میکروسکوپ معکوس فلورسنت بررسی شدند. از هر نمونه حداقل 100 تصویر تهیه شد و مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند.

آنالیز آماری: داده­های به دست آمده با روش آنالیز واریانس یک طرفه ANOVA (of Variance One-Way Analysis) و آزمون توکی بررسی شدند و در تمام بررسی­ها سطح معنی­دار آزمون­ها 05/0 P<در نظر گرفته شد.

نتایج

نتایج مطالعه الگوی الکتروفورزی و کروماتوگرافی زهر خام و جداسازی فراکشن های مرتبط: درمطالعه الکتروفورزیس زهر خام افعی که با استفاده از ژل SDS-PAGE انجام شد، 9 باند پروتئینی با وزن مولکولی حدود 13 الی 57 کیلو دالتون مشاهده شد. (شکل1) پروتئین سنجی فراکسیون­ها نشان داد که فراکسیون‌های شماره 1، 8 و 10 فاقد پروتئین بوده و بر این اساس در بررسی­های بعدی مورد توجه قرار نگرفتند.

شکل 1- الگوی الکتروفورزی زهر افعی زنجانی در ژل 15 درصد SDS-PAGE. چاهک 1- استاندارد وزنی پروتئین  چاهک 2- زهر افعی زنجانی

شکل 2- کروماتوگرام سم افعی زنجانی

نتایج اثر ضد باکتریایی با استفاده ازMTT assay : نتایج حاصل از بررسی اثر ضد باکتریایی فراکسیون­ها با روش سنجش  MTT بر روی باکتری اشریشیا کولی نتایج نشان داد که فراکسیون‌های شماره 2 و 9 در غلظت 20 میکروگرم در میلی­لیتر بر رشد باکتری در مقایسه با کنترل منفی (محیط کشت نرمال واجد باکتری) اثر مهاری معنی­دار ایجاد نموده و درصد زنده ماندن فراکسیون شماره 9 نسبت به کنترل مثبت (تتراسایکلین با غلظت 50 میکروگرم در میلی‌لیتر) تفاوت معنی­دار نداشت.

جدول 3 - زمان شروع و پایان هر پیک در HPLC و میزان غلظت پروتئین آن

بررسی درصد زنده ماندن فراکسیون‌های جدا شده از زهر بر روی باکتری باسیلوس سوبتیلیس نشان داد که فراکسیون‌های شماره 2، 5، 6 و 9 در غلظت 20 میکروگرم در میلی‌لیتر بر رشد باکتری در مقایسه با کنترل منفی اثر مهاری معنی­دار داشتند. بیش‌ترین اثر مهاری فراکسیون‌های جدا شده از زهر خام به فراکسیون شماره 2 با اثر مهاری حدود 42 درصد تعلق داشته و از اثر مهاری تتراسایکلین به صورت معنی­داری کمتر بوده است.

در مورد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس مشخص شد که درصد زنده ماندن در فراکسیون‌های شماره 2، 4، 5، 6، 7 و 9 بترتیب 52/71، 22/58، 22/34، 62/56، 71/41 و 29/47 بود که نسبت به کنترل منفی معنی­دار بودند. فراکسیون‌های شماره 5 و 7 نسبت به آنتی بیوتیک استاندارد تفاوت معنی­دار نداشتند (شکل 3).

نتایج حداقل غلظت مهاری (سنجش MIC) فراکسیون‌های جدا شده از زهر: نتایج حاصل از بررسی اثر ضد باکتریایی فراکسیون ها با روش سنجش MIC مشخص کرد که فراکسیون‌های شماره 2، 3، 5، 6، 7 و 9 بر رشد باکتری در مقایسه با کنترل منفی اثر مهاری معنی­دار اما نسبت به کنترل مثبت اثر مهاری معنی­دار نداشتند. نتیجه این مطالعه نشان داد که فراکسیون شماره 9 در مقایسه با سایر فراکسیون­ها اثر مهاری بیشتری داشته است.

اثرات مهاری فراکسیون‌های شماره 2، 3، 5، 6، 7 و 9 با غلظت 20 میکروگرم در میلی‌لیتر بر روی باکتری باسیلوس سوبتیلیس در مقایسه با کنترل منفی به صورت معنی­دار تفاوت داشته اما در مقایسه با کنترل مثبت اثر مهاری معنی­دار نبود. فراکسیون شماره 5 نسبت به سایر فراکسیون­ها اثر مهاری بیشتری از خود نشان داد.

فراکسیون‌های شماره 3، 4، 5، 7 و 9 با غلظت 20 میکروگرم در میلی‌لیتر بر روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس نسبت به کنترل منفی رشد مهاری معنی­دار ایجاد نموده اما میزان مرگ ‌و میر ناشی از آن‌ها در سوش مورد اشاره در مقایسه با کنترل مثبت (تتراسایکلین 50 میکروگرم در میلی‌لیتر) بسیار کم و از نظر آماری تفاوت معنی­داری را نشان داد (شکل 4).

نتایج سمیت سلولی بر روی رده سلولیHepG2  با استفاده از MTT assay: مطالعه اثرات سمیت سلولی  فراکسیون‌های دارای خواص ضد باکتریایی شامل فراکسیون های شماره 2، 5، 7 و 9 جدا شده از زهر خام، بر رشد سلول‌های سرطانی HepG2 در دو غلظت 10 و 20 میکروگرم در میلی‌لیتر نشان داد که فراکسیون 2 در دو غلظت ذکر شده درصد زنده ماندن سلول‌ها را در مقایسه با کنترل به 15/79 و 35 درصد کاهش داد. این در حالی است که درصد زنده ماندن سلول‌ها پس از تماس با فراکسیون شماره 5 در غلظت‌های فوق بترتیب 65/72 و 05/66 بوده است.  

شکل 3- اثر ضد باکتری فراکسیون­های جدا شده از زهر خام با غلظت 20 میکروگرم در میلی‌لیتر بر روی باکتری­های اشریشیا کولی، باسیلوس سوبتیلیس و استافیلوکوکوس اورئوس با استفاده از سنجش MTT. غلظت­ها نسبت به گروه کنترل منفی ارزیابی شدند. شایان ذکر است تیمار با تتراسایکلین (50 میکروگرم در میلی‌لیتر) به عنوان کنترل مثبت و سوسپانسیون باکتری و محیط کشت به عنوان کنترل منفی در نظر گرفته شد. (05/0 ns: P>)، (05/0 : P<:*)، (01/0 : P<**) و (001/0 : P<***).

شکل4- اثر ضد باکتری فراکسیون­های جدا شده از زهر خام با غلظت 20 میکروگرم در میلی‌لیتر بر روی باکتری­های اشریشیا کولی، باسیلوس سوبتیلیس و استافیلوکوکوس اورئوس با استفاده از سنجش MIC. غلظت­ها نسبت به گروه کنترل منفی ارزیابی شدند شایان ذکر است تیمار با تتراسایکلین (50 میکروگرم در میلی‌لیتر) به عنوان کنترل مثبت و سوسپانسیون باکتری و محیط کشت به عنوان کنترل منفی در نظر گرفته شد. (05/0 ns: P>)، (05/0 : P<*)، (01/0 : P<**) و (001/0 : P<***).

درصد زنده ماندن فراکسیون شماره ­7 در غلظت‌های ذکر شده بترتیب 100 و 65/94 درصد بوده ولی در مورد فراکسیون 9 به 30/92 و 76/90 درصد کاهش یافت.

اثرات فراکسیون‌های شماره 2 و 5 در مهار رشد سلول با دو غلظت 10 و 20 میکروگرم در میلی‌لیتر در مقایسه با کنترل و همچنین در مقایسه با یکدیگر معنی­دار بود. اثر مهاری فراکسیون شماره 7 بر رشد سلول‌ها در غلظت 10 میکروگرم در میلی‌لیتر در مقایسه با کنترل معنی­دار نبوده، لیکن این اثر در غلظت 20 میکروگرم در مقایسه با غلظت 10 میکروگرم و همچنین کنترل معنی­دار بوده است. همچنین درصد زنده ماندن سلول‌ها پس از تماس با فراکسیون شماره 9 در غلظت 20 میکروگرم در میلی‌لیتر نسبت به کنترل معنی­دار اما در غلظت پایین تر معنی­دار نبود. (شکل 5).

شکل5- بررسی اثرات فراکسیون‌های جدا شده از زهر خام بر سلول سرطانی کبد با استفاده از سنجش MTT. فراکسیون‌ها نسبت به گروه کنترل ارزیابی شدند (05/0 ns: P>)، (05/0 : P<*)، (01/0 : P<**) و (001/0 : P<***).

نتایج اثرات مهاری بر روی رده سلولیHepG2  با استفاده از assay Neutral red uptake: اثرات مهاری فراکسیون‌های دارای خواص ضد باکتریایی (فراکسیون‌های شماره 2، 5، 7 و 9) در غلظت‌های 10 و 20 میکروگرم در میلی‌لیتر بر روی رده سلولی HepG2 به روش سنجش Neutral red uptake  بررسی شد که نتایج آن در شکل شماره 6 آمده است. درصد مهار در فراکسیون 2 در دو غلظت 10 و 20 میکروگرم در میلی‌لیتر بترتیب 94/27 و 80/94 درصد بوده است. این در حالی است که فراکسیون 5 در غلظت‌های فوق بترتیب 59/47 و 55/48 درصد، سلول‌ها را مهار کرده است. درصد مهار سلول پس از تیمار با فراکسیون 7 در غلظت‌های ذکر شده بترتیب 25/2 و 60/5 درصد بوده درحالی‌که درصد مهار فراکسیون 9 در دو غلظت بالا به 65/23 و 56/15 کاهش یافته است.

بررسی نتایج و آنالیز داده‌ها نشان داد درصد مهار فراکسیون شماره 2 در غلظت 20 میکروگرم در میلی‌لیتر در مقایسه با کنترل معنی­دار اما در غلظت 10 میکروگرم در میلی‌لیتر نسبت به کنترل معنی­دار مشاهده نشد، همچنین درصد مهار این غلظت‌ها نسبت به هم معنی­دار و قابل‌توجه بود.

شکل6- بررسی اثرات فراکسیون‌های زهر خام بر سلول سرطانی کبد با استفاده از سنجش Uptake assay. غلظت‌ها نسبت به گروه کنترل ارزیابی شدند (05/0 ns: P>) و (05/0 : P<*).

فراکسیون شماره 5 در هر دو غلظت 10 و 20 میکروگرم بر میلی‌لیتر نسبت به کنترل که حاوی سلول و محیط کشت بوده، اثر مهاری معنی­داری داشته اما این دو غلظت نسبت به هم اثر مهاری معنی­دار و قابل‌توجه ایجاد ننمودند. فراکسیون‌های شماره 7 و 9 در غلظت‌های فوق در مقایسه با کنترل و در مقایسه با یکدیگر اثر مهاری معنی­دار نشان ندادند. قابل ذکر است بررسی های آماری نشان داد که نتایج بدست آمده از آزمایش Neutral red uptake با نتایج سنجش MTT مطابقت داشته و آن را تایید نمود.

نتایج سنجش کامت قلیایی (Alkaline Comet assay) برای بررسی اثر سمیت فراکسیون­های جدا شده از آن بر سلول HepG2 : در این مطالعه از سنجش کامت بمنظور بررسی آسیب‌های DNA توسط فراکسیون‌های دارای خواص ضد باکتری (فراکسیون‌های شماره 2، 5، 7 و 9) در سلول HepG2 استفاده گردید. فراکسیون‌های شماره 5، 7 و 9 در دو غلظت 10 و 20 میکروگرم در میلی‌لیتر و فراکسیون شماره 2 به دلیل اینکه مقدار آن کم بود فقط در غلظت 20 میکروگرم در میلی‌لیتر مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که:

میزان القاء آپوپتوز و نکروز فراکسیون شماره 2 در غلظت 20 میکروگرم در میلی‌لیتر بترتیب 8/55 و 2/24 درصد بوده است. در غلظت های 10 و 20 میکروگرم در میلی‌لیتر فراکسیون شماره 5، درصد القاء آپوپتوزیس بترتیب 61/25 و 70/41 و میزان القاء نکروزیس بترتیب 78/7 و 9/13 بوده است. میزان القاء آپوپتوز فراکسیون شماره 7 در غلظت‌های 10 و 20 میکروگرم در میلی‌لیتر بترتیب 10 و 21/34 درصد بوده درحالی‌که میزان نکروزیس در غلظت‌های مورد اشاره بترتیب 82/10 و 49/19 درصد است. همچنین در مورد فراکسیون 9 در غلظت‌های 10 و 20 میکروگرم در میلی‌لیتر درصد القاء آپوپتوزیس بترتیب 89/20 و 59/33 بوده درحالی‌که میزان القاء نکروزیس بترتیب 94/11 و 17/21 می‌باشد.

بررسی نتایج و آنالیز داده­ها نشان داد که فراکسیون شماره 2 با غلظت 20 میکروگرم در میلی‌لیتر در مقایسه با کنترل اثر آپوپتوتیک معنی­داری ایجاد نمود (شکل7). اثر آپوپتوتیک در غلظت‌های 10 و 20 میکروگرم در میلی‌لیتر فراکسیون شماره 5، نسبت به کنترل و هم نسبت به یکدیگر معنی­دار بود (شکل 8).

شکل 7- مطالعه تغییرات مورفولوژیکی هسته سلولی القاء شده توسط فراکشن­های 2 ، 5 جداسازی شده از زهر خام افعی زنجانی در غلظت 20 ماکروگرم/میلی لیتر  به وسیله آزمایش کامت قلیایی. 1: DNA سلول سالم20X   2-3: DNA سلول آپوپتوزی شده 20X (شکل2:  سلول آپوپتوزی در اثر فراکشن شماره2 ) (شکل 3:  سلول آپوپتوزی در اثر فراکشن شماره5 ). 4-5: DNA سلول نکروزی 20X (شکل 4:  سلول نکروزی در اثر فراکشن شماره2 ) (شکل 5:  سلول نکروزی در اثر فراکشن شماره5 )

درصد آپوپتوز القایی فراکسیون شماره 7 با غلظت 10 میکروگرم در میلی‌لیتر تفاوت معنی­داری با کنترل نداشت اما در غلظت 20 میکروگرم در میلی‌لیتر نسبت به کنترل تفاوت معنی­دار داشته و همچنین تفاوت غلظت‌های این فراکسیون نسبت به هم معنی­دار بوده است (شکل 9). آنالیز داده­ها نشان داد درصد آپوپتوز فراکسیون شماره 9 در هر دو غلظت 10 و 20 میکروگرم در میلی­­لیتر هم در مقایسه با کنترل معنی­دار و همچنین نسبت به یکدیگر تفاوت معنی­دار و قابل‌توجه دارد (شکل 10).

بحث

بدلیل مقاوم شدن برخی از میکروارگانیسم­های بیماری­زا به آنتی بیوتیک­های رایج درمان عفونت­های ناشی از آنها به یک مشکل مهم بهداشتی تبدیل شده است(13). از طرفی سرطان یکی از بیماری­های بسیار مهم جامعه بشری است که سالیانه سبب مرگ و میر تعداد زیادی از مبتلایان می­گردد. هر چند روش­های رایج در درمان این بیماری مانند پرتودرمانی و شیمی درمانی از طریق القاء آپوپتوز و یا مهار تکثیر سلول­های سرطانی از پیشرفت بیماری جلوگیری می­نمایند، لیکن مقاومت برخی از انواع سرطان­ها به اینگونه درمان­ها و همچنین عوارض جانبی آنها (مانند آسیب­رسانی به بافت و سلول­های سالم) سبب ترغیب محققین به مطالعه روش­های جایگزین شده است(4). گزارشات نشان می­دهد که برخی از پروتئین­های موجود در سموم جانوران سمی، از جمله مار دارای اثرات ضد باکتریایی بوده و از رشد سلول­های سرطانی در شرایط آزمایشگاهی جلوگیری می­نمایند(12). در این مطالعه اثرات ضد باکتریایی و ضد سرطانی فراکشن­های زهر خام افعی زنجانی بررسی گردید.

برای انجام این بررسی ابتدا الگوی الکتروفورزی زهر خام افعی تهیه و سپس فراکسیون­های زهر خام افعی زنجانی با استفاده از RP-HPLC و پس از تزریق به ستون C-18، جداسازی، جمع‌آوری و لیوفیلیز شدند. میزان پروتئین موجود در هر فراکسیون با استفاده از روش برادفورد تخمین و اثرات ضد باکتری آن‌ها در غلظت 20 میکروگرم در میلی­لیتر با استفاده از روش­های MIC و MTT، علیه باکتری­های اشریشیا کولی، باسیلوس سوبتیلیس و استافیلوکوکوس اورئوس مطالعه گردید. سپس سمیت سلولی مؤثرترین فراکسیون­های دارای اثرات ضد باکتریایی، با استفاده از روش‌های سنجش  MTT ، Neutral red uptake   و کامت  بر روی سلول سرطانی HepG2 بررسی گردید.

در مطالعه الکتروفورزی زهر خام افعی 9باند پروتئینی با وزن مولکولی حدود 57-13 کیلو دالتون مشاهده شد. در مطالعه انجام شده توسط طاهریان و همکاران در سال 2016 (22) وجود 10 باند پروتئینی در ژل الکتروفورزی(12 درصد) گزارش شده است.

شکل 8- میزان آپوپتوز و نکروز ایجاد شده توسط فراکسیون­ شماره 2 در سلول سرطان کبد با استفاده از سنجش کامت. غلظت‌ها نسبت به گروه کنترل ارزیابی شدند (05/0 ns: P>) و (001/0 : P<***).

شکل9 - میزان آپوپتوز و نکروز ایجاد شده توسط فراکسیون­ شماره 5 در سلول سرطان کبد با استفاده از سنجش کامت. غلظت‌ها نسبت به گروه کنترل ارزیابی شدند (05/0 ns: P>)، (05/0 : P<*) و (001/0 : P<***).

شکل10- میزان آپوپتوز و نکروز ایجاد شده توسط فراکسیون­ شماره 7 در سلول سرطان کبد با استفاده از سنجش کامت. غلظت‌ها نسبت به گروه کنترل ارزیابی شدند (05/0 ns: P>) و (001/0 : P<***).

شکل11- میزان آپوپتوز و نکروز ایجاد شده توسط فراکسیون­ شماره 9 در سلول سرطان کبد با استفاده از سنجش کامت. غلظت‌ها نسبت به گروه کنترل ارزیابی شدند (05/0 ns: P>) و (001/0 : P<***).

دلیل تفاوت در تعداد باندهای گزارش شده ممکن است ناشی از درصد ژل مورد استفاده و یا نوع تغذیه، روش سم گیری، فصل سم گیری و عوامل دیگر باشد که در ترکیب زهر جانوران سمی تاثیر غیر قابل انکار دارد.(26).

جداسازی زهر خام منجر به جداسازی 10 فراکسیون شد. نتایج بررسی­های بیولوژیکی نشان داد که فراکسیون­های شماره 2 و 9 بر روی باکتری اشریشیا کولی، فراکسیون شماره 2 بر روی باکتری‌ باسیلوس سوبتیلیس و فراکسیون‌های شماره 5، 7 و 9 بر روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس بیشترین اثر مهاری را در مقایسه با کنترل منفی ایجاد کردند. همچنین مشخص شد که فراکسیون‌های دارای پروتئین جدا شده از زهر مار بر باکتری‌های گرم مثبت اثر مهاری بیشتری را در مقایسه با باکتری گرم منفی القاء نموده و در استافیلوکوکوس اورئوس این مهار از شدت بیشتری نسبت به باسیلوس سوبتیلیس برخوردار بوده است. بنظر می رسد که مقاومت بیشتر باکتری­های گرم منفی در مقابل سمیت ممکن است به دلیل تفاوت در ساختار غشای خارجی آن­ها نسبت به باکتری های گرم مثبت باشد(18). این نتایج با مطالعات گذشته صورت گرفته توسط پرومال و همکاران و  لیما و همکاران در سال 2006 و 2007 (15،10) و نیز همچنین گزارش  مریدی کیا  و همکاران درسال 2018 (13)  که نشان داده است زهر افعی Vipera latifii روی باکتری گرم منفی اثر قابل توجهی نداشته است مطابقت دارد.

 بررسی اثرات ضد باکتریایی فراکشن­های دارای پروتیین نشان داد که فراکسیون‌های 2، 5، 7 و 9 بیش‌ترین اثرات ضد مهاری را بر رشد باکتری­های مورد آزمایش از خود نشان دادند. لذا اثرات سمیت سلولی آن‌ها بر سلول سرطانی کبد (HepG2) به دلیل داشتن اثرات سایتوتوکسیک زهر مارها )12) مورد بررسی قرار گرفت. این مطالعه با استفاده از روش‌های سنجش MTT ، Neutral red uptake  و کامت  انجام گردید.

نتایج نشان داد که فراکسیون شماره 2 و 5 در غلظت 20 میکروگرم در میلی‌لیتر بترتیب  با 98/79 و  65/55 درصد مرگ و میر، بیش‌ترین سمیت را در مقایسه با سایر فراکسیون­ها از خود نشان داده و مرگ سلولی القا شده توسط آنها بیشتر از نوع آپوپتوز بوده است. این در حالی است که فراکسیون شماره 7 کمترین سمیت را داشته است.

در یک جمع­بندی، نتایج این مطالعه برای اولین بار نشان می­دهد که پروتئین/پروتئین­های موجود در برخی از فراکشن­های زهر افعی زنجانی می­توانند از رشد باکتری­ها در محیط کشت آزمایشگاهی جلوگیری نموده و بر رشد سلول­های سرطانی اثر بازدارنده داشته باشند. این ویژگی­ها فراکشن­های فوق را بعنوان یک کاندید مناسب احتمالی جهت جداسازی عوامل ضد باکتریایی و ضد سرطانی معرفی می نماید.

تقدیر و تشکر

بدین وسیله از همکاری مسئولان محترم مرکز علم و فناوری زیست شناسی و دانشکده علوم پایه دانشگاه جامع امام حسین ^{(علیه السلام)} که شرایط انجام این تحقیق را فراهم نمودند، قدردانی می گردد.