غربالگری مجازی مبتنی بر ساختار با توان بالا جهت انتخاب ترکیب(ترکیبات) شیمیایی مهارکننده‌ی جدید علیه کمپلکس فاکتور رونویسی FOXM1 با ترادف ژنومی هدف

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه رازی، کرمانشاه، ایران

چکیده

پروتئین FOXM1 به عنوان یک فاکتور رونویسی مهم، در عملکردهای متنوعی ازجمله کنترل بیان ژن‌های مختلف، انتقال سلول‌ها به فاز تقسیم، آنژیوژنز، مهاجرت و غیره درگیر می‌باشد و بیش‌بیان آن در انواع مختلف سرطان گزارش شده است. بنابراین، این پروتئین یک هدف دارویی بالقوه در درمان سرطان می‌باشد. تاکنون، داروها و ترکیبات زیادی FOXM1 را هدف قرار داده‌اند، از جمله FDI-6 و RCM-1 که عملکرد آن‌ها مهار میان-کنش‌های FOXM1-DNA می‌باشد. در این مطالعه، به منظور پیش‌گیری از تشکیل کمپلکس FOXM1-DNA، زیرمجموعه In-vitro از پایگاه داده ZINC بصورت محاسباتی مورد بررسی قرار گرفت. برای دستیابی به این هدف، ابتدا جایگاه‌های اتصال لیگاند در پروتئین، با اجرای الگوریتم MDpocket مورد جست و جو قرار گرفتند. قبل از محاسبه‌ی انرژی اتصال‌پذیری ترکیبات به پاکت‌های پیش‌بینی شده، کتابخانه‌ها (حدود 260.000 ترکیب) با استفاده از وب‌سرور FAF-Drugs4 بر اساس خواص فیزیکوشیمیایی غربال شدند. پس از آن، ترکیبات منتخب با استفاده از AutoDock VINA علیه پاکت‌های پیش‌بینی شده FOXM1 داک شدند. فرایند غربالگری بر اساس انرژی اتصال‌پذیری، هشدارهای ساختاری و گروه‌های غیر توکسیک طراحی شد. بر این اساس، سه ترکیب با انرژی داکینگ تقریبا مشابه، نمره‌ی عبور را بدست آوردند. جهت تمایز و رتبه‌بندی ترکیبات انتخاب شده، روش MM/PBSA روی سه کمپلکس FOXM1-لیگاند اعمال شد و نهایتا، لیگاند1 بر اساس انرژی آزاد اتصال انتخاب شد. لیگاند معرفی شده در این مطالعه، مولکول‌ hit جدید نویدبخشی است که امید می‌رود میان‌کنش FOXM1 با DNA مرتبطش را قطع کند. با این حال، کوشش‌های تجربی بیشتری به‌منظور شناسایی لیگاند کشف شده به عنوان یک ترکیب lead باید انجام شود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Hightroughput structure-based virtual screening to select new inhibitory chemical compound(s) against FOXM1 transcription factor with its DNA target

نویسندگان [English]

  • hamid mahdiuni
  • tahereh merati

Department of Biology, School of Sciences, Razi University, Kermanshah, Iran

چکیده [English]

As an important transcription factor, FOXM1 involves in various functions including the control of expression of several genes, the transition of cells into dividing phase, angiogenesis, migration and so on, and its overexpression has been reported in the different types of cancers. Therefore, this protein is a putative drug target in cancer therapy. Hitherto, many compounds and medicines have been targeted FOXM1 including FDI-6 and RCM-1 whose functions are the inhibition of FOXM1-DNA interactions. In this study, in order to inhibit FOXM1-DNA complex formation, in-vitro subset of the ZINC database was evaluated computationally. To achieve this purpose, ligand-binding pockets on the protein were explored firstly by running of MDpocket algorithm. Before computation of affinity binding energy of the compounds to the predicted pockets, the libraries (circa 260000 compounds) were screened using FAF-drugs4 web server based on the physicochemical properties. Afterwards, the passed compounds were docked on the predicted pockets of FOXM1 using AutoDock-VINA. The screening process was planned according to the affinity binding energy, structural alerts and toxic-free groups. Accordingly, the three compounds acquired the passing score with approximately the same docking energy. To differentiate and ranking of the selected compounds, the MM/PBSA approach was applied on the three ligand-FOXM1 complexes and finally, 1-Hydroxypyrene β-D-Glucuronide was picked out based on its binding free energy. The introduced ligand in this study is the promising novel hit molecule, interrupting FOXM1 interactions with its cognate DNA. However, more experimental efforts need to be performed for recognition of the discovered ligand as lead compound.

کلیدواژه‌ها [English]

  • FOXM1
  • virtual screening
  • molecular docking
  • molecular dynamics simulation
  • MM-PBSA

غربالگری مجازی مبتنی بر ساختار با توان بالا جهت انتخاب ترکیب(ترکیبات) شیمیایی مهارکننده­ی جدید علیه کمپلکس فاکتور رونویسی

 FOXM1 با ترادف ژنومی هدف

طاهره مرآتی و حمید مهدیونی*

ایران، کرمانشاه، دانشگاه رازی، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 10/03/1399                  تاریخ پذیرش: 07/07/1399

چکیده

پروتئین FOXM1 به عنوان یک فاکتور رونویسی مهم، در عملکردهای متنوعی ازجمله کنترل بیان ژن­های مختلف، انتقال سلول­ها به فاز تقسیم، آنژیوژنز، مهاجرت و غیره درگیر می­باشد و بیش­بیان آن در انواع مختلف سرطان گزارش شده است. بنابراین، این پروتئین یک هدف دارویی بالقوه در درمان سرطان می­باشد. تاکنون، داروها و ترکیبات زیادی FOXM1 را هدف قرار داده­اند، از جمله FDI-6 و RCM-1 که عملکرد آن­ها مهار میان­کنش­های FOXM1-DNA می­باشد. در این مطالعه، به منظور جلوگیری از تشکیل کمپلکس FOXM1-DNA، زیرمجموعه In-vitro از پایگاه داده ZINC بصورت محاسباتی مورد بررسی قرار گرفت. برای دستیابی به این هدف، ابتدا جایگاه­های اتصال لیگاند در پروتئین، با اجرای الگوریتم MDpocket مورد جست و جو قرار گرفتند. قبل از محاسبه­ی انرژی اتصال­پذیری ترکیبات به پاکت­های پیش­بینی شده، کتابخانه مورد نظر­ (حدود 260.000 ترکیب) با استفاده از وب­سرور FAF-Drugs4 بر اساس خواص فیزیکوشیمیایی غربال شد. پس از آن، ترکیبات منتخب با استفاده از AutoDock VINA علیه پاکت­های پیش­بینی شده FOXM1 داک شدند. فرایند غربالگری بر اساس انرژی اتصال­پذیری، هشدارهای ساختاری و گروه­های غیر توکسیک طراحی شد. بر این اساس، سه ترکیب با انرژی داکینگ تقریبا مشابه، نمره­ی عبور را بدست آوردند. جهت تمایز و رتبه­بندی ترکیبات انتخاب شده، روش MM/PBSA روی سه کمپلکس FOXM1-لیگاند اعمال شد و نهایتا، 1-هیدروکسی پیرن β-D-گلوکوروناید بر اساس انرژی آزاد اتصال انتخاب شد. لیگاند معرفی شده در این مطالعه، مولکول­ hit جدید نویدبخشی است که  امید می­رود  میان­کنش FOXM1 با  DNA مرتبطش را قطع کند. با این حال، کوشش­های آزمایشگاهی بیشتری به­منظور شناسایی لیگاند کشف شده به عنوان یک ترکیب lead  باید انجام شود.

واژه های کلیدی: FOXM1، غربالگری مجازی، داکینگ مولکولی، شبیه­سازی دینامیک مولکولی، MM-PBSA

* نویسنده مسئول، تلفن: 09123171905 ، پست الکترونیکی: hmahdiuni@razi.ac.ir

مقدمه

 

فاکتور رونویسی FOXM1 که قبلا با نام­های Win، MPP2، HFH-11 و Trident شناخته می­شد، یک فاکتور رونویسی آنکوژنیک است که مهار عملکرد آن برای درمان سرطان یک هدف بالقوه به شمار می‌آید (15). این پروتئین شامل سه دُمین اصلی به نام­های دمین سرچنگالی ForkHead Domain (FKH) یا دُمین اتصال به DNA ،DNA Binding Domain (DBD) ، دمین Transactivation Domain (TAD) و دمین N-terminal Repressor Domain (NRD) است که از این میان، دُمین اتصال به DNA در بین تمامی پروتئین­های ابرخانواده Forkhead در یک توالی 100 آمینواسیدی حفاظت شده است. این دُمین با شناسایی جایگاه ویژه­ی 5­’-A(C/T)AAA(C/T)AA-3’ بر روی پروموتر ژن­های هدف، به DNA متصل می­شود. پیرایش متناوب 2 اگزون از 10 اگزون کد کننده­ی فاکتور رونویسی FOXM1 موجب ایجاد 3 ایزوفرم در انسان می­شود: FOXM1a، FOXM1b و FOXM1c که ایزوفرم اول از نظر فعالیت رونویسی غیرفعال محسوب شده و قابلیت اتصال به DNA در ایزوفرم سوم کمتر از نوع دوم آن است (18, 14).   فاکتور FoxM1 بطور گسترده در سلول­های با نرخ تکثیر بالا مانند جنین درحال رشد، تیموس، بیضه، روده­ی کوچک و کلون بیان می­شود و از طریق تنظیم انتقال G1/S و G2/M و اثر بر پیشرفت میتوز در چرخه­ی سلولی قویا بر رشد سلول اثر می­گذارد. پروتئینFoxM1 جهت تکامل جنین و هم­چنین هومئوستاز و بازسازی بافت در بزرگسالان موردنیاز است. این فاکتور حین جنین­زایی (Embryogenesis) به منظور تکامل صحیح بافت­های اپیتلیال و مزانشیمی بیان می­گردد که شامل قلب، کبد، بافت­های نورواکتودرمال و عضلات صاف موجود در رگ­های خونی و دستگاه گوارش می­باشند. سلول­های تمایز­یافته‌ای که در فاز ایستایی یا سکون به­سر می­برند بندرت مقادیر کمی از FoxM1 را بیان می­کنند، مگر تحت شرایط خاصی نظیر پاسخ به آسیب،که بیان FoxM1 جهت تغییر کینتیک چرخه­ی سلولی افزایش پیدا می­کند و در نتیجه سلول­ها ظرفیت تکثیر موردنیاز جهت ترمیم آسیب را باز می­یابند. همچنین، آنالیز مکانیزم­های دخیل در بازتولید بافت، نقش قابل توجه FoxM1 در ترمیم بافت­های مختلفی مانند ریه، کبد و قلب را نشان می­دهد (14 و15).   FoxM1 به عنوان یک آنکوژن بالقوه می­تواند بصورت مستقیم و غیرمستقیم سبب آغاز فرایند تومورزایی و پیشرفت سرطان گردد، بدین صورت که بیش­بیان (Over expression) آن مرتبط با افزایش رشد و تکثیر سلول بوسیله­ی القاء رشد مستقل از لنگر (Anchorage independent growth) و پیش­بردن چرخه­ی تقسیم سلول، می­باشد (4). بیش بیان FOXM1 در گستره ی متنوعی از سرطان­ها همچون پانکراس، کبد، معده، کولورکتال، کلون، کلیه، مثانه، پروستات، سینه، ریه، تخمدان، دهانه رحم، مغز، پوست و لوسمی گزارش شده است (2, 32, 5, 6, 9, 33).

داروهای ضد سرطان بسیاری گزارش شده­اند که می­توانند FOXM1 را مهار کنند (9). با این حال، مکانیسم مولکولی دقیقی که نشان دهد این داروها چگونه FOXM1 را تحت تاثیر قرار می­دهند در دسترس نمی­باشد. اغلب نتایج حاصل از تیمار دادن سلولهای سرطانی با این ترکیبات شامل کاهش بیان mRNA و پروتئین FOXM1 و درنتیجه کاهش نرخ رشد و تهاجم سلولهای سرطانی  می­باشد (9). دیگر مهارکننده­های غیر مستقیم FOXM1 که پروتئین­های بالادستی FOXM1 را تحت تاثیر قرارداده و منجر به تنظیم بیان و فعالیت رونویسی این فاکتور می­گردند، شامل مهارکننده­های پروتئازومی همچون MG115، MG132 و bortezomib (Velcade) و آنتی بیوتیک­های تیازولی مانند Siomycin A و Thiostrepton هستند (24, 10, 11).

برخلاف آنزیم­ها، انتقال دهنده­های غشای سلولی و کانال­های یونی، اغلب فاکتورهای رونویسی فاقد پاکت­های اتصال دارو هستند و این امر آن­ها را به هدف­های دارویی چالش برانگیز اما بالقوه­ای تبدیل کرده است. بنابراین، طراحی منطقی دارو برای این دسته از پروتئین­ها امری دشوار محسوب می­شود و درنتیجه تکنیکهای غربالگری با توان بالا High-Throughput Screening (HTS) در کشف و معرفی لیگاندهای جدید متصل شونده به فاکتورهای رونویسی از اهمیت بالایی برخوردارند. استفاده از این تکنیک­ها منجر به معرفی تعدادی لیگاندهای شیمیایی کوچک به عنوان داروهای مهارکننده­ی FOXM1 شد که از این میان می­توان به FDI-6 و RCM-1 اشاره کرد (8, 30). ترکیب FDI-6 با استوکیومتری 1-1 به FOXM1 متصل شده و مانع از ایجاد کمپلکس FOXM1-DNA می­شود در حالی که RCM-1 تجمع FOXM1 در هسته را مختل کرده و با افزایش یوبی­کوئیتیناسیون و انتقال پروتئین از هسته به پروتئاروم، تخریب آن را تقویت می­کند.

داکینگ و شبیه سازی دینامیک مولکولی  یکی از مهم ترین ابزارهای پیش بینی محل اتصال میانکنش­های اتصالی مولکول­های مختللف هستند و استفاده از این تکنیک­ها در اکتشافات دارویی به سرعت در حال افزایش است (31).  هدف از انجام این تحقیق  کوشش در جهت یافتن و معرفی ترکیب یا ترکیبات شیمیایی کوچک برهم­زننده­ی اتصال فاکتور رونویسی FOXM1 به توالی DNA مورد تشخیص آن از طریق روش غربالگری مجازی می­باشد. شکل 1 به طور شماتیک روند این مطالعه را نشان می‌دهد. یک کتابخانه حاوی تقریبا 260000 ترکیب شیمیایی ابتدا با درنظر گرفتن فیلترهای فیزیکوشیمیایی مورد نظر پایش و سپس مرحله­ی داکینگ مولکولی انجام شد. پس از اعمال فیلترهای سمیت و دو مرحله نمره دهی بر اساس میزان تمایل انرژی اتصال، وجود شرکت تجاری تامین کننده­ی ترکیبات و جایگاه اتصال آن­ها به پروتئین FOXM1، شبیه سازی دینامیک مولکولی بر روی سه ترکیب انتخاب شده در کمپلکس با پروتئین FOXM1 انجام گشت. آنالیزهای انجام گرفته بر روی ترژکتوری حاصل از شبیه سازی این ترکیبات، منجر به معرفی یک مولکول Hit جدید در اتصال به فاکتور FOXM1 شد.

 

شکل 1- نمای کلی روند انجام پژوهش.

 

مواد و روشها

آماده سازی ساختار پروتئین: مختصات اتمی دُمین متصل شونده به DNA پروتئین FOXM1 با شناسه 3G73  که شامل دو پروتئین FOXM1 در اتصال به توالی DNA مورد تشخیص خود می­باشد، از بانک داده پروتئین (Protein Data Bank) به آدرس https://www.rcsb.org دانلود شد. مولکول­های آب، زنجیره­ی DNA و زنجیره­ی A مولکول از فایل مربوطه حذف شدند. ساختار از لحاظ وجود هرگونه اتم­های از دست رفته بررسی شد.

یافتن پاکت اتصال لیگاند در پروتئین FOXM1: از آن­جا که FOXM1 جزء فاکتورهای رونویسی است که اغلب فاقد جایگاه اتصال لیگاند مشخصی می­باشند، یافتن یک پاکت اتصال لیگاند در گام نخست امری ضروری است. ماهیت ساختارهای کریستالی به دلیل شرایط کریستالیزاسیون به گونه‌ای است که ممکن است بسیاری از پاکت‌های بالقوه در این ساختار آشکار نباشند. همچنین، تعدادی از پاکت‌های مهم تنها به طور گذرا در پروتئین ایجاد می‌شوند. به همین دلیل، به منظور درنظر گرفتن شرایط دینامیکی پروتئین ابتدا شبیه سازی دینامیک مولکولی بر روی پروتئین FOXM1 انجام شد و سپس جهت یافتن پاکت­های اتصال لیگاند در سطح پروتئین، از برنامه­ی نرم‌افزاری MDpocket (25) استفاده شد. برنامه MDpocket با استفاده از کنفورماسیون­های بدست آمده از شبیه سازی دینامیک مولکولی، به ما اجازه می­دهد تا انعطاف پذیری پاکت­ها و گذرا بودن آن‌ها، کانال­ها و تغییرات کانفورماسیونی القاء شده توسط لیگاند را بر اساس حالات کانفورماسیونی پروتئین شناسایی کنیم(26).

جهت بدست آوردن کنفورماسیون­های مورد نیاز برای اجرای MDpocket، یک شبیه سازی دینامیک مولکولی 100 نانو ثانیه‌ای روی دُمین متصل شونده به DNA پروتئین FOXM1  با استفاده از بسته­ی نرم افزاری GROMACS  نسخه 5.1.4 انجام شد (1). برای این منظور، میدان نیروی GROMOS96 53a6 که برای شبیه سازی پروتئین مناسب می­باشد انتخاب، و توپولوژی پروتئین تولید گردید. یک جعبه مکعب شکل تعریف شد به طوریکه برای جلوگیری از برهم‌کنش‌های ناخواسته ناشی از شرایط مرزی، فاصله سطح پروتئین تا دیواره‌های جعبه 1 نانومتر در نظر گرفته شد. این جعبه توسط مولکول­های مدل آبی SPC/E پر شد. پس از آن، برای خنثی سازی بار سیستم و بافری کردن آن، نمک  NaCl با غلظت 15/0 مولار اضافه شد (شکل 2). کمینه سازی انرژی بر روی سیستم انجام ‌شد. سپس، به سیستم اجازه داده شد که به مدت 500 پیکوثانیه، با شرایط NVT  و 500 نانوثانیه با شرایط  NpT  به تعادل برسد. دمای سیستم‌، تا 300 درجه کلوین افزایش یافت و در طول شبیه‌سازی ثابت بود.  برای ثابت نگه ‌داشتن دما، از ترموستات Berendsen با ثابت زمانی 1/0 پیکوثانیه استفاده شد. فشار سیستم در طول شبیه‌سازی ثابت و برابر با 1 بار (Bar) در نظر گرفته شد. برای ثابت نگه داشتن فشار سیستم، از باروستات Parrinello-Rahman به صورت همگرا (Isotropic) و با ثابت زمانی 2 پیکوثانیه استفاده شد. پس از به تعادل رسیدن سیستم، با استفاده از میدان نیروی GROMOS96 53a6 جهت حل معادلات حرکت اتم­ها، شبیه سازی به مدت 100­نانوثانیه انجام شد.

پس از محاسبه­ی انحراف جذر میانگین مربعات Root Mean Square Deviation (RMSD)، که به منظور اطمینان از پایداری ترمودینامیکی سیستم تحت مطالعه انجام می­شود، 80 نانوثانیه انتهایی ترژکتوری حاصل از MD برای آنالیزهای بعدی استفاده شد. با استخراج کنفورماسیون‌ها طی هر 10 پیکوثانیه، 8000 ساختار کانفورماسیونی از 80 نانوثانیه نهایی شبیه سازی تولید شد و با تنظیم پارامتر­های MD pocket جهت محاسبه­ی پاکت اتصالی برای مولکول­های دارویی کوچک، برنامه در یک دستور پایتون(Python Directory)  اجرا شد.

شکل 2- سیستم آب­پوشی شده­ی پروتئینFOXM1 . یون­های Cl با رنگ آبی و یون­های Na با رنگ سبز نشان­داده شده­اند.

غربالگری کتابخانه ترکیبات شیمیایی و داکینگ مولکولی: زیرمجموعه in-vitro از بانک داده ZINC، که یک پایگاه داده­ی رایگان شامل بیش از 230 میلیون ترکیب قابل خریداری می­باشد، به صورت فرمت SDF دانلود شد. این کتابخانه در زمان انجام پروژه حاوی بیش از 260000 ترکیب شیمیایی بود. زیرمجموعه in-vitro شامل ترکیباتی است که در ارزیابی­های اتصال مستقیم در غلظت­های 10­ میکرومولار یا کمتر بصورت فعال عمل می­کنند (29). به­ منظور کاهش اندازه­ی کتابخانه و آماده­سازی ترکیبات، فیلتر­های ازپیش تعریف­شده­ی RO5 (Lipinski role of 5) و فیلترهای شبه-دارو (Drug-like filters) با استفاده از ابزار Filter Editor موجود در وب سرور FAF-Drugs4 باهم ترکیب شده و بر ترکیبات شیمیایی کتابخانه اعمال شدند (3, 21, 17).

با استفاده از برنامه­ی Open Babel (22)، مختصات اتمی ترکیبات حاصل از مرحله قبل از فرمت SDF به PDB تغییر یافت، درحالی­که هیدروژن­های قطبی با در­نظر گرفتن ژئومتری به آن­ها اضافه گردید. سپس، با استفاده از ماژول Pythonsh از برنامه نرم‌افزاری AutoDock Tools (ADT) (28)، این ساختارها به فرمت pdbqt تبدیل شدند. این فرمت ساختاری که شامل اطلاعاتی همچون بارهای جزئی، اتم­های هیدروژن قطبی، نوع اتم­ها و همچنین اطلاعاتی در مورد درجات آزادی نسبی می­باشد جهت اجرای داکینگ مولکولی این ترکیبات در مرحله بعد ضرورری است.

داکینگ مولکولی یک فرایند محاسباتی است که تلاش می­کند اتصال غیرکووالان بین ماکرومولکول­ها (رسپتور) و مولکول‌های کوچک (لیگاند) را پیش­بینی کند. برای اجرای داکینگ مولکولی از اتوداک     Vina (7) نسخه 1.1.2 استفاده شد (13). این برنامه نرم‌افزاری یکی از رایج­ترین و محبوب­ترین ابزار داکینگ مولکولی می‌باشد. علت محبوبیت آن را می­توان به رایگان بودن برنامه و مهم­تر از آن کیفیت نتایج خصوصا در مورد لیگاندهایی با بیش از 8  باند قابل چرخش مربوط دانست. جهت انجام داکینگ، ابتدا توسط برنامه ADT، اتم­های هیدروژن به فایل PDB ساختار آماده شده‌ی FOXM1 اضافه شدند و سپس ساختار حاصل با فرمت pdbqt تولید شد. جعبه توری(Grid Box) با ابعاد   Å 34×24×38 در محل پاکت پیش­بینی شده تعریف شد. برای انجام داکینگ پروتئین-لیگاند، پروتئین درون جعبه توری از پیش تعریف­شده ثابت و لیگاندها بصورت منعطف درنظر گرفته شدند. پارامتر جامعیت(Exhaustiveness)  به عنوان کنترل کننده­ی تعداد تکرار محاسبات برابر با 24 اعمال شد.

پس از انجام داکینگ، لیگاندها بر اساس میزان تمایل اتصال، محل اتصال به پروتئین (پاکت پیش­بینی شده در مجاورت N-terminal loop) و عبور از فیلترهای سمیت که توسط وب­سرور FAF-Drugs4 انجام گردید، نمره دهی شد و سه لیگاند جهت انجام مراحل بعدی انتخاب گردیدند.

شبیه­سازی دینامیک مولکولی کمپلکس‌های پروتئین-لیگاند: شبیه‌سازی کمپلکس پروتئین FOXM1 با لیگاندهای انتخاب شده هریک به مدت 100­نانوثانیه انجام شد. پارامترهای توپولوژی لیگاندها با استفاده از سرور PRODRG تولید شد (27). شرایط شبیه‌سازی MD همانند بخش 2-2 اعمال شد. پس از انجام شبیه­سازی MD تمامی کمپلکس‌های پروتئین-لیگاند، پایداری ترمودینامیکی کمپلکس‌های پروتئین-لیگاند توسط محاسبه­ی RMSD ارزیابی شد. با توجه به نمودارهای RMSD، فواصل زمانی که ساختارها در تعادل ترمودینامیکی بودند(40 نانوثانیه پایانی) جهت انجام آنالیزهای بعدی انتخاب شدند.

تخمین انرژی آزاد اتصال بین FOXM1 و لیگاندها با استفاده از روش MM-PBSA: راهکار MM-PBSA (Molecular Mechanics-Poisson-Boltzmann Surface Area) یک روش محاسبه­ی انرژی مستقل از مسیر است که از مجموعه­ای از ساختار­ها در حالت آغازین و پایانی جهت تخمین انرژی آزاد اتصال بیومولکول­ها در کمپلکس استفاده می­کند. این روش می­تواند انرژی پتانسیل مکانیک مولکولی شامل نیروهای وان­در­والس، میانکنش­های الکترواستاتیک و انرژی­های قطبی و غیرقطبی حلال را در طول ترژکتوری حاصل از شبیه­سازی MD محاسبه کند (16). به طور کلی، معادله­ی محاسبه­ی انرژی آزاد اتصال کل برای کمپلکس­های پروتئین-لیگاند در حلال مجازی(Implicit Solvent)  به صورت زیر می­باشد:

 

  •  

 

در این معادله G complex انرژی آزاد کل برای کمپلکس پروتئین-لیگاند است، G protein انرژی آزاد کل برای پروتئین فاقد لیگاند در حلال می‌باشد و G ligand انرژی آزاد کل برای لیگاند در حلال می‌باشد. انرژی آزاد اتصال از مجموع تغییرات انرژی مکانیک مولکولی (MM)، تغییرات هیدراته شدن (solvation) و تغییرات انتروپی (∆S) در دمای مطلق(T)، محاسبه می‌شود:

 

  •  
  •  
  •  

 

برای تعیین سهم هر آمینواسید (x) پروتئین FoxM1 در اتصال به ترکیبات منتخب، انرژی اتصال به ازای هر رزیدو با استفاده از روابط زیر محاسبه شد:

 

  •  

 

به طوری که   و   انرژی اتم i از آمینواسید x بوده که در حالت اتصال­یافته و آزاد محاسبه می­شود، و n تعداد نهایی اتم­ها در آمینواسید مذکور است. در نهایت انرژی آزاد اتصال طبق فرمول زیر بدست می­آید:

 

  •  

 

در این معادله، m نشان­دهنده­ی تعداد کلی اسیدهای آمینه در کمپلکس پروتئین-لیگاند است.

با استفاده از ماژول g-mmpbsa (16) انرژی آزاد اتصال کل در طول ترژکتوری­های حاصل از شبیه­سازی کمپلکس­های پروتئین-لیگاند، محاسبه گردید و بهترین لیگاندها از لحاظ انرژی آزاد اتصال کل، به عنوان ترکیبات Hit انتخاب شدند.

آنالیزهای انجام شده در این مطالعه با استفاده از ماژول‌های موجود در بسته نرم‌افزاری GROMACS و نرم‌افزار LigPlot (23) صورت گرفت. گراف‌ها توسط نرم‌افزار OriginLab نسخه 8، Microsoft Excel 2013 و تصاویر به کمک نرم‌افزار VMD (12) تولید شدند.

نتایج و بحث

پیش­بینی پاکت­های بالقوه اتصال لیگاند در پروتئین FOXM1: یکی از چالش‌هایی که در یافتن پاکت‌های سطحی پروتئین‌ها وجود دارد آنست که بیشتر روش‌های کنونی از یک ساختار ایستا برای پیش‌بینی پاکت‌ها استفاده می‌کنند. بنابراین، به منظور لحاظ کردن دینامیک پروتئین و در نظر گرفتن پاکت‌های گذرا که می‌توانند کاندیداهای مناسبی برای لیگاندهای شیمیایی کوچک باشند، شبیه‌سازی دینامیک مولکولی به مدت 100 نانوثانیه روی دُمین متصل شونده به DNA پروتئین FOXM1 انجام شد. برای نمونه‌برداری کافی،  ساختارهای کنفورماسیونی از ترژکتوری MD استخراج شد. برای استخراج این کنفورماسیون‌ها لازم است که سیستم مورد نظر ما از نظر ترمودینامیکی به تعادل رسیده باشد و یکی از معیارهای رایج برای این منظور، پایایی نمودار RMSD است. همان‌گونه که در شکل 3 نمایش داده شده است، سیستم پس از 20 نانوثانیه به تعادل رسید و از اینرو، 8000 ساختار کنفورماسیونی از 80 نانوثانیه پایانی شبیه‌سازی استخراج شد.

شکل 3- نمودارRMSD پروتئین FOXM1-DBD در طول 100­ نانوثانیه شبیه سازی MD. سیستم پس از 20 نانوثانیه به تعادل ترمودینامیکی رسیده است.

شکل 4 نشان­دهنده­ی نقشه­ی چگالی پاکت(Pocket density map)  حاصل از اجرای MD pocket بر روی ترژکتوری حاصل از شبیه‌سازی MD پروتئین FOXM1-DBD است. این نقشه دربرگیرنده­ی اطلاعاتی همچون کانال­ها و پاکت­های حفظ ­شده در پروتئین در طی شبیه‌سازی می­باشد. در مطالعات قبلی بر نقش لوپ N-terminal در پایدارسازی ساختار کمپلکس پروتئین-DNA تاکید شده است (31).

شکل 4- نتایج حاصل از اجرایMD pocket . پاکت­های پیش­بینی شده در محل هلیکس سه (h3) و لوپ N-terminal به عنوان پاکت­های بالقوه اتصال دارو درنظر گرفته شدند. پاکت موجود در ناحیه c-ترمینال با علامت پیکان مشخص شده است.

بر اساس این داده‌ها و نتایج حاصل از اجرای MD pocket، نواحی از پروتئین که باید برای محاسبات داکینگ مورد جستجو قرار گیرند شامل ناحیه دربرگیرنده هلیکس سه (h3) و لوپ N-ترمینال (ناحیه محصور در شکل 4) می‌باشند. باید توجه داشت که یک پاکت بالقوه در ناحیه لوپ C-terminal شناسایی شد (پیکان نشان داده شده در شکل 4). از آن­جا که هدف این مطالعه برهم زدن اتصال پروتئین به توالی ژنومی هدفش می­باشد و تا کنون هیچ اطلاعاتی در مورد نقش لوپ C-terminal در اتصال پروتئین FOXM1 به DNA گزارش نشده است، این پاکت برای محاسبات داکینگ مولکولی نادیده گرفته شد.

غربال‌گری زیرمجموعه in-vitro بانک داده ZINC و پیشگویی ساختار کمپلکس‌های FOXM1 با لیگاندهای غربال شده: با استفاده از وب سرور FAF-Drugs4 و براساس ویژگی­های فیزیکوشیمیایی (جدول1) کتابخانه­ی 260000تایی ترکیبات شیمیایی زیرمجموعه in-vitro غربال‌گری شد و اندازه­ی کتابخانه به 126598 ترکیب کاهش یافت. فرایند داکینگ مولکولی با استفاده از الگوریتم VINA انجام شد. با اعمال معیار انرژی اتصال و غربالگری مجدد ترکیبات توسط وب­سرور FAF-Drugs4 بر اساس سنجش Pan(PAINS) که شامل مواردی همچون وجود گروه­های توکسیک می­باشد، 53827 ترکیب شیمیایی موفق به عبور از سنجش Pan شدند که در بین آنها 625 ترکیب دارای بالاترین میزان تمایل اتصال (انرژی بیش از  kJ/mol7-) بودند. از این میان، سه ترکیب قابل خریداری، موفق به کسب بالاترین نمره شدند (جدول 2) و به صورت کمپلکس با پروتئین FOXM1 و در فرمت PDB جهت بررسی­های دقیق­تر و انجام مطالعات شبیه­سازی استخراج شدند. به منظور مقایسه جایگاه اتصال و انرژی تمایل اتصال ترکیبات شیمیایی FDI-6 و RCM-1 (که در بخش مقدمه به عنوان مهارکننده­‌های مستقیم FOXM1 به آن­ها اشاره شد)، نتایج حاصل از داکینگ این ترکیبات با پروتئین FOXM1 در شکل 5 نمایش داده شده است. همانگونه که آشکار است، موقعیت اتصالی این دو مهارکننده‌ در پروتئین کاملا متفاوت است اما در حفره‌های اصلی پیش‌بینی شده توسط برنامه MDPocket قرار می‌گیرند. انرژی اتصال این مهارکننده‌ها کمتر از ترکیبات منتخب می‌باشد (Kcal/mol 4/6- و Kcal/mol 6- به ترتیب برای FDI6 و RCM-1) اما با توجه به تقریب‌های مورد استفاده در محاسبه انرژی‌های داکینگ (20) نمی‌توان با قطعیت گفت که قدرت اتصال این ترکیبات به FOXM1 کمتر از ترکیبات منتخب می‌باشد.

 

جدول 1- پارامترهای فیزیکوشیمیایی تعریف­شده جهت غربال‌گری زیرمجموعه in-vitro بانک داده ZINC

محدوده انتخابی

ویژگی­های فیزیکو شیمیایی

500-100

وزن مولکولی (MW)

5-3-

لگاریتم ضریب تقسیم (LogP)

10≥

گیرنده­ی پیوند هیدروژنی (HBA)

5≥

دهنده­ی پیوند هیدروژنی (HBD)

180≥

سطح توپولوژیکی قطبی (tPSA)

11≥

پیوند­های قابل چرخش

1

تخلف مجاز

 

جدول 2- ترکیبات انتخاب­شده پس از انجام داکینگ با شعاع برش انرژی  kcal/mol7-

انرژی اتصال

ساختار

شماره لیگاند

5/7-

 

1

5/7-

 

2

5/7-

 

3

 

شکل 5- داکینگ مولکولی ترکیبات شیمیایی FDI-6 و RCM-1 بر روی پروتئین FOXM1. ترکیبات در دو جایگاه متفاوت اما در پاکت‌های پیش‌بینی شده توسط MD Pocket قرار می‌گیرند.

 

شبیه­سازی دینامیک مولکولی کمپلکس های FOXM1 و لیگاندهای منتخب: به منظور مدل‌سازی دقیق‌تری از کمپلکس‌های FOXM1 با لیگاندهای منتخب، شبیه­سازی دینامیک مولکولی (MD) این کمپلکس‌ها به مدت 100 نانوثانیه انجام شد. محاسبه­ی انرژی اتصال و سهم هر مولفه در این انرژی با روش MM/PBSA برای سه کمپلکس FOXM1 با لیگاندهای 1، 2 و 3 انجام شد (جدول 3). مقایسه مقادیر انرژی اتصال در جداول 2 و 3 به خوبی نشان می‌دهد که روش‌های مبتنی بر توابع نمره‌دهی (مانند داکینگ مولکولی) قادر به رتبه‌بندی لیگاندها نمی‌باشند؛ درحالی‌که سه لیگاند منتخب در محاسبات داکینگ تقریبا انرژی داکینگ یکسانی داشتند، انرژی‌های اتصال حاصل از روش MM/PBSA این ترکیبات اختلاف قابل ملاحظه‌ای با یکدیگر نشان می‌دادند. از میان این ترکیبات، لیگاند 1 با فرمول شیمیایی C22H18O7 و نام 1-Hydroxypyrene β-D-Glucuronide منفی­ترین میزان انرژی اتصال را دارا بود. همانگونه که از جدول 3 پیداست، نتایج حاصل از محاسبه­ی انرژی مقادیر بالایی از انرژی الکتروستاتیک و انرژی حلال‌پوشی قطبی رانشان می‌دهند. این مقادیر اغلب به دلیل اثرات حلال، یکدیگر را خنثی می­کنند. از طرفی سهم غیر الکتروستاتیک حلال‌پوشی که توسط SASA (Solvent-Accessible Surface Area) نمایندگی می‌شود، برای تمامی لیگاندها مقداری کوچک و مشابه است. در نتیجه، انرژی وان­در والس سهم اصلی را در انرژی اتصال کل دارا می­باشد. در کمپلکس FOXM1-لیگاند1، محل اتصال لیگاند بر روی پروتئین، لوپ N-terminal می­باشد. (شکل 6). این لیگاند به ناحیه ای از پروتئین متصل شده­ که در آنالیز MDpocket به عنوان یکی از نواحی بالقوه اتصال مولکول­های کوچک شیمیایی معرفی شد.

 

 

جدول 3- انرژی آزاد اتصال و مقدار عبارات استفاده شده در محاسبه آن برای ترکیبات شیمیایی منتخب. واحد تمامی داده­ها  kJ/molمی­باشد.

شماره لیگاند

انرژی وان در والس

انرژی الکترواستاتیک

انرژی حلال پوشی قطبی

SASA

انرژی اتصال

1

632/176-

078/196-

058/198

471/15-

070/190-

2

546/114-

582/68-

351/79

724/11-

519/115-

3

940/149-

174/25-

301/62

846/14-

621/127-

 

شکل 6- کمپلکس  لیگاند 1 با پروتئین FOXM1. در کمپلکس FOXM1-ligand1 ، لیگاند شیمیایی به لوپ N-ترمینال متصل شده است. ریشه­های درگیر در تشکیل پیوند نشان داده شده اند.

 

تعیین آمینواسیدهای مهم در برهم­کنش FOXM1-لیگاند1: به منظور تعیین سهم هر آمینواسید در جایگاه‌اتصالی FOXM1 برای لیگاند 1، انرژی اتصال کل برای هر رزیدوی آمینو اسیدی در این پاکت‌ اتصالی محاسبه شد (شکل 7). در جایگاه اتصال لیگاند 1، رزیدوهای آمینو اسیدی Ser232، Arg236، Phe247، Arg254، Lys247، Lys282 و Arg316 منفی‌ترین انرژی آزاد اتصال کل را نشان دادند و با احتمال قوی، موثرترین ریشه­ها در برقراری اتصال لیگاند1 به پروتئین FOXM1 می­باشند. با توجه به ماهیت این آمینو اسیدها که بیشتر رزیدوهای بازی آرژنین و لیزین می‌باشند و همچنین با در نظر گرفتن مقادیر بالای انرژی الکتروستاتیک در اتصال لیگاند 1 به FOXM1 (تقریبا kJ/mol 196-)، به نظر می‌رسد که سهم اصلی در اتصال لیگاند به پروتئین را پیوندهای هیدروژنی و برهمکنش‌های یونی بازی می‌کنند (جدول 4). اما، تقریبا بخش اعظم این انرژی الکتروستاتیک توسط انرژی حلال‌پوشی قطبی خنثی می‌شود (جدول 3 را ببینید)؛ بنابراین، مولفه وان در والسی نیروی مکانیک مولکولی سهم اصلی را از طریق بخش آب‌گریز این آمینو اسیدها به خصوص لیزین دارا می‌باشد. از طرف دیگر، رزیدوهای آمینو اسیدی مانند Glu235، Glu253، Asp268 و Asp321 بیشترین سهم نامطلوب را در فرآیند اتصال لیگاند 1 به پروتئین FOXM1 بازی می‌کنند (شکل 8).

 

جدول 4- سهم انرژی مکانیک مولکولی، حلال پوشی قطبی و غیرقطبی آمینواسیدهای درگیر در کمپلکس FOXM1-لیگاند1. واحد تمامی داده­ها  kJ/mol می­باشد.

ریشه­های آمینواسیدی

انرژی مکانیک مولکولی

حلال پوشی قطبی

حلال پوشی غیرقطبی

SER-232

6949/30-

1388/6

0891/0-

GLU-235

7557/24

3748/3-

0172/0-

ARG-236

5742/21-

9653/3

0066/0-

PHE-247

7625/15-

9564/2

1753/1-

GLU-253

6092/21

6051/0-

4- E 1-

ARG-254

4472/23-

1377/3

0

LYS-255

8989/15-

7466/0

0

ARG-256

8483/12-

5789/0

0

LYS-260

3384/14-

4007/0

0

ASP-261

7264/18

0909/2-

0

GLU-267

0203/22

4589/3-

0

ASP-268

6177/34

975/4-

002/0-

LYS-274

6436/32-

4148/4

0029/0-

LYS-278

9511/14-

9275/0

0

LYS-282

8623/16-

8847/1

0

ARG-286

6233/13-

2814/1

0

ASP-293

8942/11

787/0

0

ARG-297

5679/11-

6463/0

0

GLU-298

6746/11

52/0-

0

ARG-316

358/16-

6914/1

0272/0-

ASP-321

0966/71

1778/2-

1001/0-

شکل 7- نمودار سهم هر رزیدوی آمینو اسیدی در انرژی اتصال کل لیگاند1 به پروئین FOXM1 در کمپلکس FOXM1-لیگاند1

شکل 8- موقعیت ریشه­های آمینواسیدی نامطلوب از نظر انرژی در اتصال به لیگاند در کمپلکس FOXM1-لیگاند1

 

اثر متقابل لیگاند1 و پروتئین FOXM1: یکی از ارزیابی‌های مهم در مطالعه برهم‌کنش لیگاند با پروتئین، بررسی اثر لیگاند بر ساختار پروتئین است و یکی از معیارهای مهم در این ارتباط، تغییرات انعطاف‌پذیری رزیدوهای پروتئین مربوطه در اثر اتصال لیگاند می‌باشد. برای بررسی تغییرات انعطاف‌پذیری رزیدوهای آمینواسیدی FOXM1 در اثر اتصال به لیگاند1، نوسانات مربع ریشه میانگین Root Mean Square Fluctuation (RMSF) برای هر آمینو اسید در پروتئین FOXM1 در غیاب و حضور لیگاند1 در 80 نانوثانیه انتهایی شبیه‌سازی MD محاسبه شد (شکل9). نمودار RMSF  معیاری ازمیزان انعطاف­پذیری کربن آلفای (Cα) رزیدو­های آمینو اسیدی پروتئین نسبت به مقدار میانگین نوسانات Cα در حین شبیه سازی است. در نمودار RMSF مربوط به کمپلکس پروتئین-لیگاند، چنانچه کربن‌های آلفای ریشه­های آمینو اسیدی نسبت به همین کربن ها در پروتئین تنها، نوسان کمتری داشته باشند، می­توان اینگونه استنتاج کرد که این ریشه­ها در ایجاد پیوندهایی جدید مشارکت می­کنند و بالعکس. البته باید خاطر نشان کرد که لیگاند می تواند موجب افزایش نوسانات موضعی Cα در فاصله ای دور از محل برهمکنش شود (19). در کمپلکس FOXM1-لیگاند1، آمینو اسیدهای 251، 252، 298 الی 303  انعطاف‌پذیری بیشتری نسبت به همین آمینو اسیدها در پروتئین تنها دارند اما رزیدوهای 254 الی 256 و 313 الی 321 نوسانات کمتری تجربه می‌کنند. این نتایج در هماهنگی با نتایج ذکر شده در شکل 7 و جدول 4، به نقش نامطلوب آمینواسیدهایی همچون Glu298 با انرژی اتصال کل برابر با kJ/mol 1536/11+ و نقش مطلوب رزیدوهای Arg254، Lys255 و Arg256 اشاره می­کند. سایر ریشه‌های آمینو اسیدی تغییرات نوسانی محسوسی نسبت به پروتئین تنها نشان نمی‌دهند. این پدیده می تواند احتمالا به دلیل اتصال ضعیف بین لیگاند مورد نظر و پروتئین FOXM1 باشد. لازم به ذکر است که در یک مطالعه محاسباتی توسط طباطبایی و همکاران، تغییرات نوسانی محسوسی برای آمینو اسیدهای FOXM1 با و بدون اتصال به DNA به عنوان لیگاند طبیعی این فاکتور مشاهده نشده است (31) که این خود احتمالا نشان­دهنده اتصال ضعیف این فاکتور با لیگاندهای دیگر به عنوان یک ضرورت است.

 

شکل 9 - نمودارRMSF پروتئین FOXM1 (آبی) و کمپلکس FOXM1-لیگاند1 (قرمز)

 

 

از آنجا که پیوندهای هیدروژنی در اتصال دارو به گیرنده مربوطه نقش مهمی ایفا می­کنند، تعیین پیوندهای هیدروژنی پایدار و گروه‌های درگیر در آنها حائز اهمیت است. جهت محاسبه­ی پیوندهای هیدروژنی بین لیگاند منتخب و پروتئین FOXM1، علاوه بر در نظر گرفتن رزیدوهای دارای منفی‌ترین میزان انرژی مکانیک مولکولی و انرژی آزاد اتصال کل ، پیوندهای هیدروژنی و وان در والس در آخرین کنفورماسیون‌ تولید شده در شبیه‌سازی‌های کمپلکس­ مربوطه توسط نرم­افزار Ligplot+ موردبررسی قرار­گرفتند و ریشه­های آمینواسیدی پروتئین در مجاورت لیگاند1 استخراج شدند (شکل‌ 10-الف).  هم­چنین، جهت مقایسه­ی ریشه­های مهم میان­کنش کننده در جایگاه­ اتصال، دیاگرام دو بعدی آمینواسیدهای مجاور ترکیبات FDI-6 و RCM-1  با استفاده از کنفورماسیون­های حاصل از داکینگ مولکولی رسم شد (شکل 10-ب). همانطور که مشاهده می­شود و در بخش­های قبلی نیز بدان اشاره شد، میانکنش­های وان در ­والس نقشی حیاتی در اتصال لیگاندها به پروتئین ایفا می­کنند.

 

شکل 10-الف: دیاگرام دوبعدی آمینواسیدهای مجاور میان­کنش کننده با لیگاند1

بر اساس شکل 10-الف، آمینواسیدهای Phe247، His269، Phe270، Arg316، Tyr317، Leu318 ، Leu320 و Ala243 در میان­کنش­های وان در والسی با لیگاند1 شرکت می­کنند. اما، لیگاند1 ظاهرا هیچگونه پیوند هیدروژنی با هیچکدام از ریشه­های مجاور برقرار نمی­کند. جهت بررسی صحت این داده­ها، آنالیز پیوند هیدروژنی برای کمپلکس FOXM1-لیگاند1 در طول ترژکتوری حاصل از شبیه­سازی دینامیک مولکولی انجام شد (شکل 11). به منظور محاسبه پیوندهای هیدروژنی در کمپلکس‌ FOXM1 با لیگاند1 زاویه قطع بین گروه پذیرنده و دهنده­ی پیوند 30 درجه و فاصله­ی قطع بین هیدورژن و گروه پذیرنده کوچکتر یا برابر با 5/3 Å در نظر گرفته شد. اکسیژن و نیتروژن غیر­متصل به هیدروژن همواره به عنوان پذیرنده­های پیوند هیدروژنی عمل می­کنند.

 

 

شکل 10- ب: دیاگرام دو بعدی آمینواسیدهای مجاور میان کنش کننده با ترکیبات FDI-6 و RCM-1

 

 

برای ترکیب RCM-1، ریشه­های Ser240، Tyr241،lys278، Gly280، Trp281، Ser284 و His287  در ایجاد میان­کنش های وان در والسی FOXM1 با این لیگاند درگیر هستند در حالی که آمینواسید Arg236 دو پیوند هیدروژنی با گروه کربنیل این ترکیب ایجاد می­کند (شکل 10-ب). ریشه­های مجاور ترکیب شیمیایی FDI-6 که جایگاه اتصال آن به پروتئین FOXM1 مشابه محل اتصال لیگاند1است، متشکل از Val233، Glu235، Pro238، Tyr239، Asp268 و Pro271 هستند و His269 در ایجاد دو پیوند هیدروژنی با این ترکیب مشارکت می­کند.

در لیگاند1، بواسطه وجود یک گروه کربوکسیل آزاد، برهمکنش‌های یونی متعددی بین لیگاند و رزیدوهای باردار FOXM1 قابل پیش‌بینی است (شکل 7). اما، آنالیز پیوند هیدروژنی برای کمپلکس FOXM1-لیگاند1 نشان داد که تنها رزیدوهای آمینو اسیدی His269، Ser232 و Arg236 قادر به ایجاد پیوند هیدروژنی با لیگاند مربوطه هستند (شکل 11) و از بین آنها فقط رزیدوی His269 می‌توانست پیوند هیدروژنی پایداری تشکیل دهد. باید توجه داشت که آمینواسید His269 در کمپلکس پروتئین-لیگاند1 در در شکل 10-الف به عنوان آمینواسید شرکت­کننده در میانکنش وان در والس در نظر گرفته شده بود، که این خود نشان می‌دهد برای ارزیابی برهمکنش‌های مهم نمی‌توان تنها به یک کنفورماسیون منفرد اعتماد کرد.  پیوند هیدروژنی تشکیل شده توسط ریشه­های Ser232 و Arg236 ناپایدارتر از His269 بود و آنالیز سایر ریشه­ها ایجاد هیچگونه پیوند هیدروژنی مناسبی با لیگاند را نشان نداد.

 

شکل 11- سیر زمانی تشکیل پیوند هیدروژنی بین لیگاند1 و رزیدوهای کلیدی پروتئین FOXM1 در طول ترژکتوری حاصل از شبیه­سازی کمپلکس FOXM1-لیگاند1. رزیدوی His269 پیوند هیدروژنی پایداری تشکیل می‌دهد.

 

نتیجه ­گیری

هدف از انجام این مطالعه، معرفی ترکیب(های) شیمیایی کوچک جدید به عنوان مهار­کننده­های فاکتور رونویسی FOXM1،که نقش کلیدی و مهمی در آغاز و پیشرفت انواع سرطان­ها ایفا می­کند، به روش غربالگری مجازی بود که روشی مقرون به­صرفه در زمان و هزینه­های مالی محسوب می‌شود. در پایان، یک ترکیب شیمیایی از میان کتابخانه­ی 260000 تایی به عنوان ترکیب Hit معرفی شد. نیروهای اصلی در اتصال لیگاند منتخب به پروتئین FOXM1 نیروهای بین مولکولی خصوصا میان­کنش­های وان در والسی بودند که با توجه به ماهیت و محل برهم­کنش این فاکتور با DNA هدف مربوطه قابل پیش‌بینی است. با توجه به آن­که لیگاند طبیعی این پروتئین، پروموتر DNA هدف می‌باشد و همچنین با در نظر گرفتن اینکه دست کم در یکی از پاکت‌های محاسبه شده برای FOXM1 آمینو اسیدهای دارای بار مثبت فراوان بودند، انتخاب یا طراحی لیگاندهای دارای گروه‌های باردار منفی (همانند لیگاند 1) منطقی به نظر می‌رسد. اما، باید توجه داشت که وجود این گروه‌ها در یک لیگاند تمایل به آب‌پوشی را برای لیگاند افزایش می‌دهد که این خود می‌تواند موجب ضعیف شدن برهم‌کنش‌های الکتروستاتیک بین این گروه‌ها و آمینو اسیدهای مربوطه در پروتئین هدف شود. علاوه‌براین، آب‌پوشی گروه‌های قطبی و باردار در یک لیگاند هزینه آنتروپی تشکیل کمپلکس (اتصال لیگاند به گیرنده) را به شدت افزایش می‌دهد. با وجود این، با توجه به مقدار و ماهیت انرژی الکترواستاتیک در مورد لیگاند انتخاب شده، و همچنین وجود آمینواسیدهای مجاور با بار مثبت ، میتوان لیگاندهایی با بار کلی منفی طراحی کرد که بتوانند به پروتئین FOXM1 متصل شوند.

  • Abraham, M. J., Murtola, T., Schulz, R., Páll, S., Smith, J. C., Hess, B., Lindahl, E. ,2015, GROMACS: High performance molecular simulations through multi-level parallelism from laptops to supercomputers, SoftwareX., 1–2:19–25.
  • Adami, G. R., Ye, H. ,2007, Future roles for FoxM1 inhibitors in cancer treatments, Future Oncology., 3:1–3.
  • Alland, C., Moreews, F., Boens, D., Carpentier, M., Chiusa, S., Lonquety, M., Renault, N., Wong, Y., Cantalloube, H., Chomilier, J., Hochez, J., Pothier, J., Villoutreix, B. O., Zagury, J.-F., Tuffery, P. ,2005, RPBS: a web resource for structural bioinformatics, Nucleic Acids Research., 33: 44–49.
  • Bella, L., Zona, S., Nestal de Moraes, G., Lam, E. W.-F. ,2014, FOXM1: A key oncofoetal transcription factor in health and disease, Seminars in Cancer Biology., 29:32–39.
  • Benayoun, B. A., Caburet, S., Veitia, R. A. ,2011, Forkhead transcription factors: key players in health and disease, Trends in Genetics., 27:224–232.
  • Faust, D., Al-Butmeh, F., Linz, B., Dietrich, C. ,2012, Involvement of the transcription factor FoxM1 in contact inhibition, Biochemical and Biophysical Research Communications., 426:659–663.
  • Feinstein, W. P., Brylinski, M. ,2015, Calculating an optimal box size for ligand docking and virtual screening against experimental and predicted binding pockets, Journal of Cheminformatics., 7:18.
  • Gormally, M. V., Dexheimer, T. S., Marsico, G., Sanders, D. A., Lowe, C., Matak-Vinković, D., Michael, S., Jadhav, A., Rai, G., Maloney, D. J., Simeonov, A., Balasubramanian, S. ,2014, Suppression of the FOXM1 transcriptional programme via novel small molecule inhibition, Nature Communications., 5:51-65.
  • Halasi, M., Gartel, A. L. ,2013, Targeting FOXM1 in cancer, Biochemical Pharmacology., 85:644–652.
  • Hegde, N. S., Sanders, D. A., Rodriguez, R., Balasubramanian, S. ,2011, The transcription factor FOXM1 is a cellular target of the natural product thiostrepton, Nature Chemistry., 3:725–731.
  • Huang, C., Du, J., Xie, K. ,2014, FOXM1 and its oncogenic signaling in pancreatic cancer pathogenesis, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer., 1845:104–116.
  • Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. ,1996, VMD: Visual molecular dynamics, Journal of Molecular Graphics., 14:33–38.
  • Jaghoori, M. M., Bleijlevens, B., Olabarriaga, S. D. ,2016, 1001 Ways to run AutoDock Vina for virtual screening, Journal of Computer-Aided Molecular Design., 30:237–249.
  • Jaiswal, N., Chakraborty, S., Nag, A. ,2014, Biology of foxm1 and its emerging role in cancer therapy, Journal of Proteins and Proteomics., 5:1–24.
  • Koo, C.-Y., Muir, K. W., Lam, E. W.-F. ,2012, FOXM1: From cancer initiation to progression and treatment, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms., 1819:28–37.
  • Kumari, R., Kumar, R., Lynn, A. ,2014, g_mmpbsa —A GROMACS Tool for High-Throughput MM-PBSA Calculations, Journal of Chemical Information and Modeling., 54:1951–1962.
  • Lagorce, D., Sperandio, O., Baell, J. B., Miteva, M. A., Villoutreix, B. O. ,2015, FAF-Drugs3: a web server for compound property calculation and chemical library design, Nucleic Acids Research., 43: 200–207.
  • Littler, D. R., Alvarez-Fernandez, M., Stein, A., Hibbert, R. G., Heidebrecht, T., Aloy, P., Medema, R. H., Perrakis, A. ,2010, Structure of the FoxM1 DNA-recognition domain bound to a promoter sequence, Nucleic Acids Research., 38:4527–4538.
  • Martínez, L. ,2015, Automatic identification of mobile and rigid substructures in molecular dynamics simulations and fractional structural fluctuation analysis, PLoS ONE., 10:1-10.
  • Morris, G. M., Huey, R., Lindstrom, W., Sanner, M. F., Belew, R. K., Goodsell, D. S., Olson, A. J. ,2009, AutoDock4 and AutoDockTools4: Automated docking with selective receptor flexibility, Journal of Computational Chemistry., 30:2785–2791.
  • Neron, B., Menager, H., Maufrais, C., Joly, N., Maupetit, J., Letort, S., Carrere, S., Tuffery, P., Letondal, C., 2009, Mobyle: a new full web bioinformatics framework, Bioinformatics., 25:3005–3011.
  • O’Boyle, N. M., Banck, M., James, C. A., Morley, C., Vandermeersch, T., Hutchison, G. R. ,2011, Open Babel: An open chemical toolbox, Journal of Cheminformatics., 3:33.
  • RA, L., MB, S. ,2011, LigPlot+: multiple ligand-protein interaction diagrams for drug discovery, Journal of Chemical Information and Modeling., 51:2778–2786.
  • Radhakrishnan, S. K., Bhat, U. G., Hughes, D. E., Wang, I., Costa, R. H., Gartel, A. L. ,2006, Identification of a Chemical Inhibitor of the Oncogenic Transcription Factor Forkhead Box M1, Cancer Research., 66:9731–9735.
  • Schmidtke, P., Bidon-Chanal, A., Luque, F. J., Barril, X. ,2011, MDpocket: open-source cavity detection and characterization on molecular dynamics trajectories, Bioinformatics., 27:3276–3285.
  • Schmidtke, P., Le Guilloux, V., Maupetit, J., Tuffery, P. ,2010, fpocket: online tools for protein ensemble pocket detection and tracking,Nucleic Acids Research., 38: 582–589.
  • Schüttelkopf, A. W., van Aalten, D. M. F. ,2004, PRODRG : a tool for high-throughput crystallography of protein–ligand complexes, Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography., 60:1355–1363.
  • Morris, G. M., Huey, R., Lindstrom, W., Sanner, M. F., Belew, R. K., Goodsell, D. S., Olson, A. J. ,2009, AutoDock4 and AutoDockTools4: Automated docking with selective receptor flexibility, Journal of Computational Chemistry., 30:2785–2791.
  • Sterling, T., Irwin, J. J. ,2015, ZINC 15 – Ligand Discovery for Everyone, Journal of Chemical Information and Modeling., 55:2324–2337.
  • Sun, L., Ren, X., Wang, I.-C., Pradhan, A., Zhang, Y., Flood, H. M., Han, B., Whitsett, J. A., Kalin, T. V, Kalinichenko, V. V ,2017, The FOXM1 inhibitor RCM-1 suppresses goblet cell metaplasia and prevents IL-13 and STAT6 signaling in allergen-exposed mice, Science Signaling., 10:1-10.
  • Tabatabaei-Dakhili, S. A., Aguayo-Ortiz, R., Domínguez, L., Velázquez-Martínez, C. A. ,2018, Untying the knot of transcription factor druggability: Molecular modeling study of FOXM1 inhibitors, Journal of Molecular Graphics and Modelling., 80:197–210.
  • Wang, Z., Ahmad, A., Li, Y., Banerjee, S., Kong, D., Sarkar, F. H. ,2010, Forkhead box M1 transcription factor: A novel target for cancer therapy, Cancer Treatment Reviews., 36:151–156.
  • Xu, X., Miao, R., Wan, Y., Zhang, L., Qu, K., Liu, C. ,2015, FoxM1 as a Novel Therapeutic Target for Cancer Drug Therapy, Asian Pacific Journal of Cancer Prevention., 16:23–29.
دوره 35، شماره 2
تیر 1401
صفحه 198-211
  • تاریخ دریافت: 06 اسفند 1398
  • تاریخ بازنگری: 10 خرداد 1399
  • تاریخ پذیرش: 07 مهر 1399