نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه تبریز

2 عضو هیئت علمی دانشگاه تبریز

3 دانشاه گنبدکاووس

4 دانشگاه گنبد کاووس

چکیده

برنج غذای اصلی بیش از نیمی از مردم جهان را تأمین می‌کند. با توجه به نیاز آبی بالای برنج و کمبود منابع آبی، خشکی همواره یکی از عوامل محدود‌کننده کشت این گیاه می‌باشد بنابراین این تحقیق به‌منظور بررسی تنوع ژنتیکی و شناسایی نشانگرهای ISSR، IRAP و iPBS حاوی اطلاعات ۲۳ صفت مورفولوژیکی در دو شرایط غرقاب و تنش آبی با استفاده از ۱۱۲ ژنوتیب برنج انجام شد. نتایج حاصل از رگرسیون چند متغیره نشان داد که درمجموع ۱۳۷ و ۱۲۰ نوع آلل به ترتیب در شرایط بدون تنش و تنش خشکی با حداقل یکی از صفات مورد بررسی پیوستگی معنی‌دار داشتند. ضریب تبیین در مجموع نشانگر‌های آگاهی‌بخش در شرایط بدون تنش از ۹۸/۰ الی ۲۲/۰ درصد و در شرایط تنش خشکی نیز از ۸۹/۰ تا ۲۵/۰ درصد متغیر بود. در شرایط بدون تنش آلل iPBS2224-6 برای صفت طول برگ پرچم (۹۸/۰) و در شرایط تنش خشکی آلل ISSR16-6 برای صفت وزن کل خوشه‌ها (۸۹/۰) بیشترین ضریب تبیین را به‌عنوان نشانگر سرگروه به خود اختصاص دادند. مقدار قابل‌توجهی از تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از آغازگر ISSR22 با بالاترین محتوای چندشکلی (PIC) ۴۹/۰ ، تعداد آلل‌های مؤثر ۸۸/۱، شاخص تنوع ژنی نی ۴۶/۰ و شاخص شانون ۶۶/۰ توجیه شد. شاخص نشانگری در محدوده ۴۷/۵ الی ۵۰/۰ متغیر بود. این نتایج گویای آن است که از نشانگرهایی که پیوستگی بالایی با صفات مورفولوژیک دارند، می‌توان در شناسایی نشانگرهای آگاهی‌بخش پیوسته با صفات ژنوتیپ‌های برنج به‌خصوص در شرایط تنش آبی بهره گرفت.‌

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Identification of ISSR, IRAP and iPBS markers containing information on rice characteristics under two conditions of flooding and drought stress

نویسندگان [English]

  • Halbibi Badirdast 1
  • Seyed Yahya Salehi Lisar 2
  • Ali Movafeghi 1
  • Ebrahim Gholamalalipour Alamdari 4

1 Tabriz University

2 Academic member in university of Tabriz

4 Gonbad Kavous University

چکیده [English]

Rice is the main food for more than half of the world population. Due to the high water requirement of rice and the shortage of water resources, drought is always one of the limiting factors for cultivation of this plant. So, this research was conducted to investigate the genetic diversity and the association mapping of 23 morphological traits of the ISSR, IRAP and iPBS molecular markers using 112 rice genotypes. The results of multivariate regression showed that, 137 and 120 allele types were significantly associated with at least one of the studied traits under non-stress and drought stress conditions, respectively. The explanatory factor of total awareness indicators in control condition was 0.98 to 0.22% and under drought stress condition it 0.89 to 0.25%. Under stress-free condition, iPBS2224-6 allele for flag leaf length (0.98) and under stress condition of ISSR16-6 allele for total weight of panicle (0.89) had the highest explanatory factor as header marker. A considerable amount of morphological changes were justified using ISSR22 initiator with the highest polymorphic content (PIC) of 0.49%, effective alleles number of 1.88, genetic diversity index of 46.0 and Shannon index of 0.66. Marker index varied from 5.47 to 0.50. These results indicate that markers that highly associated with morphological traits can be used to identify continuous knowledge indicators with important traits of rice genotypes, especially in drought stress conditions.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Rice
  • association mapping
  • morphological traits
  • ISSR
  • Informative markers

شناسایی نشانگرهای ISSR، IRAP و iPBS حاوی اطلاعات برای ویژگی‌های برنج در دو شرایط غرقاب و تنش خشکی

حال‌ بی‌بی بادیردست1، سید یحیی صالحی لیسار1، حسین صبوری2، علی موافقی1 و ابراهیم غلامعلی‌پور علمداری2

1 ایران، تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده علوم طبیعی، گروه علوم گیاهی

2 ایران، گنبد‌کاووس، دانشگاه گنبدکاووس، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی گنبد‌کاووس، گروه تولیدات گیاهی

تاریخ دریافت: 10/3/1397            تاریخ پذیرش: 24/9/1397

چکیده

برنج غذای اصلی بیش از نیمی از مردم جهان را تأمین می‌کند. با توجه به نیاز آبی بالای برنج و کمبود منابع آبی، خشکی همواره یکی از عوامل محدود‌کننده کشت این گیاه می‌باشد. بنابراین این تحقیق به‌منظور بررسی تنوع ژنتیکی و شناسایی نشانگرهای ISSR، IRAP و iPBS حاوی اطلاعات ۲۳ صفت مورفولوژیکی در دو شرایط غرقاب و تنش آبی با استفاده از ۱۱۲ ژنوتیب برنج انجام شد. نتایج حاصل از رگرسیون چند متغیره نشان داد که درمجموع ۱۳۷ و ۱۲۰ نوع آلل به ترتیب در شرایط بدون تنش و تنش خشکی با حداقل یکی از صفات مورد بررسی پیوستگی معنی‌دار داشتند. ضریب تبیین در مجموع نشانگر‌های آگاهی‌بخش در شرایط بدون تنش از ۹۸/۰ الی ۲۲/۰ درصد و در شرایط تنش خشکی نیز از ۸۹/۰ تا ۲۵/۰ درصد متغیر بود. در شرایط بدون تنش آلل iPBS2224-6 برای صفت طول برگ پرچم (۹۸/۰) و در شرایط تنش خشکی آلل ISSR16-6 برای صفت وزن کل خوشه‌ها (۸۹/۰) بیشترین ضریب تبیین را به‌عنوان نشانگر سرگروه به خود اختصاص دادند. مقدار قابل‌توجهی از تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از آغازگر ISSR22 با بالاترین محتوای چندشکلی (PIC) ۴۹/۰ ، تعداد آللهای مؤثر ۸۸/۱، شاخص تنوع ژنی نی ۴۶/۰ و شاخص شانون ۶۶/۰ توجیه شد. شاخص نشانگری در محدوده ۴۷/۵ الی ۵۰/۰ متغیر بود. این نتایج گویای آن است که از نشانگرهایی که پیوستگی بالایی با صفات مورفولوژیک دارند، می‌توان در شناسایی نشانگرهای مولکولی پیوسته با صفات ژنوتیپهای برنج به‌خصوص در شرایط تنش آبی بهره گرفت.‌

واژه‌های کلیدی: برنج، تجزیه ارتباط، صفات مورفولوژیک، ISSR، نشانگرهای مولکولی

* نویسنده مسئول، تلفن: 01733228883، پست الکترونیکی: [email protected]

مقدمه‌

 

برنج بعد از گندم مهمترین غله به شمار می‌رود و غذای اصلی بیش از نیمی از مردم دنیا را به خود اختصاص می‌دهد. بیش از ۸۰ درصد کالری و ۷۵ درصد پروتئین مصرفی آسیا از برنج تأمین می‌شود. برنج یکی از غذا‌های اصلی و مهم مردم ایران می‌باشد و مصرف سرانه آن به ۳۸ کیلوگرم در سال می‌رسد (۱۴). برنج گیاهی است نیمه آبزی و تا زمان رسیدن به ۸ – ۲۰ هزار مترمکعب در هکتار آب احتیاج دارد (۲۷). با توجه به نیاز آبی بالای برنج، آب یکی از منابع مهم محدودکننده در تولید محصول برنج می‌باشد (۲۵). لذا معرفی ژنوتیپهایی از برنج‌ که تحت شرایط با منابع محدود آبی قادر به رشد باشند ضروری به نظر می‌رسد. با توجه به تأثیر شرایط نامساعد محیطی و موقعیت اقلیمی حاکم بر کشور ایران بر رشد گیاهان، خشکی هنوز عمده‌ترین محدودیت در تولید محصولات زراعی محسوب می‌شود، به گونه‌ایی که از بین تنشهای زنده و غیرزنده، خشکی به‌تنهایی مسبب ۴۵ درصد از کاهش عملکرد محصولات زراعی می‌باشد. لذا شناسایی صفات مرتبط با تحمل به خشکی می‌تواند در گزینش ژنوتیپهای سازگار، کمک‌کننده و یاری‌رسان باشد (۳). ازآنجایی‌که تنوع ژنتیکی در سازگاری و بقای گیاهان در برابر تغییرات محیطی نقش مهمی ایفاء می‌کند، بنابراین آگاهی از تنوع ژنتیکی درون و بین جمعیتهای گیاهی دارای اهمیت ویژه‌ای است (۱۷ و ۲۸). روشهای مختلفی برای بررسی تنوع ژنوتیپی وجود دارد و در بین این روشها، بررسی تنوع به کمک نشانگر‌های مولکولی که چندشکلی را در سطح DNA آشکار می‌کنند (21) و در نتیجه تحت تأثیر شرایط محیطی یا مراحل تکوینی گیاه قرار نمی‌گیرند، اهمیت ویژه‌ای دارد. از نشانگر‌های مولکولی کارآمد می‌توان به (Inter Sequence Specific Repeat) ISSR و نشانگر‌های مبتنی بر رتروترانسپوزون‌ها ازجمله (Inter-Retro transposon Amplified Polymorphism) IRAP و (inter Primer Binding Site Amplification) iPBS اشاره نمود که به دلیل پوشش ژنومی بالا، تکرارپذیری زیاد و چندشکلی بالا برای بررسی تنوع ژنتیکی، تهیه نقشه‌های ژنتیکی، تجزیه ‌و تحلیل شجره‌ها و تجزیه ارتباط صفات مختلف مورد استفاده قرار می‌گیرند (۱۰ و ۱۳). تحمل به خشکی یک صفت پیچیده و کمی است و روش اندازه‌گیری مستقیمی برای اندازه‌گیری آن وجود ندارد و این امر باعث مشکل شدن شناسایی ژنوتیپهای متحمل به خشکی می‌شود (۷). در روشهای مولکولی مثل مکان‌یابی ارتباطی از عدم تعادل پیوستگی بین مکانهای ژنومی برای شناسایی و مکان‌یابی جایگاه صفات کمی استفاده می‌شود. در یک تحقیق، تجزیه ارتباط ۱۲۸ ژنوتیپ برنج و ۱۱ صفت زراعی در طول دو سال مورد مطالعه قرار گرفت. این بررسی با استفاده از ۱۲۵ نشانگر ریز ماهواره که سراسر ژنوم را پوشش می‌داد، انجام شد. در کل ۱۶ نشانگر، ارتباط معنی‌داری با صفتهای مختلف نشان دادند. این محققین بیان داشتند که استفاده از تجزیه ارتباط برای بررسی ژنوتیپهای مختلف برنج در روند برنامه‌های اصلاحی مفید و کارآمد است (۱۴). بررسی ارتباط بین ۳۸ ژنوتیب با ۱۴ نشانگر مولکولی SSR نشان داده است که مکانهای ریز ماهواره RM434، RM104، RM257، RM262 با اکثر صفات مورد بررسی در ارتباط هستند (۱۱). این محققین بیان داشتند که تجزیه ارتباط می‌تواند به‌عنوان ابزاری قدرتمند در شناسایی نشانگرهای آگاهی‌بخش در برنامه‌های اصلاحی مورداستفاده قرار گیرد. با مطالعه گیاهچه‌های ۲۲ ژنوتیپ برنج در دو شرایط بدون تنش و تنش خشکی درمجموع ۱۶ نشانگر ریز ماهواره آگاهی‌بخش در دو شرایط شناسایی شده است (۴). در بررسی که به کمک ۸ نشانگر‌ ISSR، IRAP و iPBS بر روی ۶۰ ژنوتیپ گندم صورت پذیرفته است ۵ آغازگر چند‌شکلی مناسبی داشته و از ۶۱ باند تولیدشده ۴۷ باند چند شکل، ۰۵/۷۷ درصد از باند‌ها چند شکل، میانگین چند‌شکلی ۶۰/۷۲ درصد و تعداد آللهای چند شکل به‌طور متوسط ۸۷/۵ آلل بوده است. محتوای اطلاعات چند شکل نیز بین ۳۱/۰ تا ۴۱/۰ متغیر بوده و میانگین آن ۳۶/۰ به ازای هر نشانگر بوده است بیشترین و کمترین درصد چندشکلی مربوط به آغازگر ISSR و iPBS بوده که به ترتیب ۱۰۰ و ۵۰ درصد است این محققین عنوان می‌نمایند که مجموعه نشانگر‌های ISSR،IRAP و iPBS استفاده‌شده برای شناسایی، تمایز، ارزیابی تنوع و روابط ژنتیکی جمعیتهای گندم مورد بررسی سودمند بوده و می‌تواند برای مدیریت ذخایر ژنی از طریق شناسایی نمونه‌های تکراری و همنام مفید باشد (۱۲). ازآنجاکه انتخاب به کمک نشانگر، یکی از مهمترین کاربردهای نشانگرهای مولکولی به‌ویژه در راستای ایجاد ژنوتیپهای متحمل به تنشهای محیطی می‌باشد، پژوهش حاضر با هدف بررسی تنوع ژنتیکی و شناسایی نشانگرهای مثبت و آگاهی‌بخش مرتبط با برخی صفات مورفولوژیک برنج در شرایط تنش خشکی و بدون تنش با استفاده از یک ژرم پلاسم بزرگ برنج و روش تجزیه ارتباط طرح‌ریزی شد.‌

‌مواد و روشها‌

مواد گیاهی پژوهش حاضر شامل تعداد ۱۱۲ لاین برنج تهیه ‌شده از مؤسسه بین‌المللی تحقیقات برنج (International Rice Research Institute: IRRI) در قالب طرح بین‌المللی مشترک بین آن مؤسسه و دانشگاه گنبد‌کاووس بود (جدول ۱).

 

جدول ۱- شماره و نام ژنوتیپهای ارزیابی‌شده در این مطالعه‌.

شماره

نام ژنوتیپ

منشأ

شماره

نام ژنوتیپ

منشأ

شماره

نام ژنوتیپ

منشأ

شماره.

نام ژنوتیپ

منشأ

7

BP 12600F-KN-4-1

INDONESIA

96

HHZ 1-DT3-Y1-Y1

IRRI

163

IR12L357

IRRI

281

IR 11A506

IRRI

8

BP 12816F-KN-7-1

INDONESIA

97

HHZ 1-DT4-LI1-LI1

IRRI

164

IR12L369

IRRI

282

IR 11A511

IRRI

9

BP 16732E-6

INDONESIA

98

HHZ 1-DT7-LI2-LI1

IRRI

165

IR13L114

IRRI

286

IR 11N121

IRRI

10

HHZ 10-DT7-Y1

IRRI

100

HHZ 21-SAL13-Y1-Y1

IRRI

166

IR13L118

IRRI

288

IR 11N169

IRRI

12

HHZ 14-SAL13-LI2-DT1

IRRI

101

HHZ 21-Y4-Y2-Y1

IRRI

167

IR13L137

IRRI

290

IR 11N313

IRRI

14

HHZ 1-DT3-Y1-Y1

IRRI

106

HHZ 2-SUB2-DT1-DT1

IRRI

171

IR13L397

IRRI

291

IR12L201

IRRI

15

GhNa-3

 

107

HHZ 3-SAL13-Y1-SAL1

IRRI

172

IR13L400

IRRI

292

SAKHA 105

EGYPT

52

IR 64683-87-2-2-3-3 (PSB RC 82)

PHILIPPINES

110

HHZ 3-SAL6-Y1-Y1

IRRI

173

IR13L406

IRRI

299

IR 11C123

IRRI

56

HHZ 10-DT5-LI1-LI1

IRRI

111

HHZ 4-DT3-Y1-Y1

IRRI

174

IR13L413

IRRI

300

IR 11C186

IRRI

60

HHZ 15-SAL13-Y1

IRRI

112

HHZ 4-DT6-LI2-LI1

IRRI

175

IR14L177

IRRI

307

IR 11C228

IRRI

61

HHZ 15-SAL13-Y3

IRRI

116

HHZ 6-DT1-LI1-LI1

IRRI

177

IR14L238

IRRI

309

HHZ-5-DT20-DT2-DT1

IRRI

63

HHZ 18-Y3-Y1-Y1

IRRI

121

IR14L116

IRRI

178

IR14L240

IRRI

311

Firooz (Acc 39261)

IRAN

64

HHZ 1-DT3-Y1-Y1

IRRI

122

IR14L101

IRRI

180

IR 43

IRRI

312

IR64197-3B-15-2

IRRI

66

HHZ 1-DT7-LI2-LI1

IRRI

123

IR14L103

IRRI

191

IR14T111

IRRI

     

67

HHZ 21-DT7-Y1-Y1

IRRI

124

IR13L188

IRRI

197

IR14T129

IRRI

     

68

HHZ 21-SAL13-Y1-Y1

IRRI

125

IR14L247

IRRI

215

IR12T246

IRRI

     

69

HHZ 21-Y4-Y2-Y1

IRRI

127

IR14L260

IRRI

216

IR11T257

IRRI

     

70

HHZ 22-Y3-DT1-Y1

IRRI

128

IR14L256

IRRI

222

IR 28

IRRI

     

71

HHZ 23-DT16-DT1-DT1

IRRI

129

IR14L248

IRRI

228

IR71896-3R-8-3-1

       

73

HHZ 26-SAL12-Y1-Y1

IRRI

131

IR14L121

IRRI

237

IRBL7-M[CO]

IRRI

     

74

HHZ 2-SUB2-DT1-DT1

IRRI

132

IR14L153

IRRI

256

IRBLZT-IR56[CO]

IRRI

     

76

HHZ 3-SAL13-Y2-DT1

IRRI

133

IR14L160

IRRI

260

IR06A145

IRRI

     

77

HHZ 3-SAL4-Y1-Y1

IRRI

134

IR14L137

IRRI

261

IR 09L204

IRRI

     

83

HHZ 4-SAL5-Y2-Y1

IRRI

135

IR13L268

IRRI

262

IR08L216

IRRI

     

84

HHZ 6-DT1-LI1-LI1

IRRI

138

IR12L380

IRRI

266

IR09N516

IRRI

     

85

IRRI 104

IRRI

140

IR14L262

IRRI

267

IR 09N251

IRRI

     

87

IRRI 154

IRRI

141

IR14L271

IRRI

268

IR 10A227

IRRI

     

88

HHZ 10-DT5-LI1-LI1

IRRI

143

IR14L270

IRRI

269

IR10A121

IRRI

     

89

HHZ 10-DT8-DT1-DT1

IRRI

146

IR13F228

IRRI

270

IR 10A199

IRRI

     

91

HHZ 15-DT7-SAL2

IRRI

150

IR13F321

IRRI

272

IR 10A237

IRRI

     

92

HHZ 15-SAL13-Y1

IRRI

153

IR13F589

IRRI

273

IR 10A314

IRRI

     

93

HHZ 15-SAL13-Y3

IRRI

156

IRRI 132

IRRI

278

IR 11A479

IRRI

     

95

HHZ 18-Y3-Y1-Y1

IRRI

160

B11598C-TB-2-1-B-7

INDONESIA

280

IR 11A501

IRRI

     

 

 

لاینهای مذکور در دو آزمایش جداگانه در قالب طرح لاتیس در دو شرایط نرمال و تنش خشکی در سه تکرار ارزیابی شدند. ابتدا لاینهای مذکور در گلدانهایی کشت شدند و بعد به زمین اصلی منتقل گشتند و نشاکاری انجام شد. به‌منظور ارزیابی خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاک نمونه‌گیری از خاک مزرعه انجام شد و به آزمایشگاه خاک‌شناسی شهرستان کلاله منتقل گردید (جدول ۲). هرکدام از ۱۱۲ لاین با فاصله بین و روی ردیف ۲۵ سانتیمتر در مساحت ۲ متر و ۲۵ سانتی‌متر مربع کشت شدند. آبیاری در شرایط بدون تنش به­صورت غرقاب در طول دوره رشد ژنوتیپها انجام شد، اما در محیط تنش آبیاری مزرعه از ۴۰ روز پس از نشاکاری (مرحله با حداکثر پنجه­زنی) به‌منظور اعمال تنش، آبیاری قطع شد و بعد از ۴۰ روز به فاصله ۱۵ روز آبیاری انجام گردید. پس از ۱۵ روز از خاک مزرعه نمونه‌برداری شد و وزن خشک و تر آن تعیین گردید و رطوبت وزنی آن اندازه‌گیری شد و با توجه به منحنی رطوبتی خاک مزرعه برحسب بار تخمین زده شد که در مرحله اول پتانسیل آب خاک مزرعه ۱۵ بار و در مرحله دوم پتانسیل آب خاک ۲۵ بار بود. برای جلوگیری از نفوذ آب از حاشیه مزرعه، فاصله بین آزمایشها دو متر در نظر گرفته شد و از پوشش پلاستیکی برای ممانعت از نفوذ آب استفاده گردید. از ۴۹ بوته موجود، بعد از رسیدگی کامل ۱۰ بوته از هر لاین با رعایت اثر حاشیه برداشت شد و برای اندازه‌گیری صفات به آزمایشگاه منتقل گردید و ۲۳ صفت مورفولوژیک؛ تعداد روز از کشت تا گلدهی، بیوماس، ارتفاع گیاه، تعداد پنجه بارور، تعداد پنجه‌ کل، طول و عرض برگ پرچم، طول خروج از غلاف، قطر ساقه، طول خوشه اصلی، وزن کل خوشه‌ها، وزن خوشه اصلی، وزن کل ساقه‌، وزن دانه‌های پر، وزن دانه‌های پوک، تعداد دانه پر، تعداد دانه پوک، تعداد خوشه چه اولیه، تعداد خوشه چه ثانویه؛ بر اساس دستورالعمل استاندارد ارزیابی صفات برنج (SES,2013) اندازه‌گیری و ثبت گردیدند.

 

جدول ۲- خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاک محل آزمایش.‌

مقدار (content)

 

مشخصه (Characteristic)

۲

Electric conductivity (dc Siemens / m)

هدایت الکتریکی (دسی زیمنس بر متر)

۶/۷

 

pH

۵/۱۰

Neutralizing agents (percent)

مواد خنثی شونده (درصد)

۸۴/۰

Organic carbon (percent)

کربن آلی (درصد)

۰۸/۰

Total nitrogen (percent)

نیتروژن کل (درصد)

۴/۱۶

absorbable Phosphorus (ppm)

فسفر قابل‌جذب (قسمت در میلیون)

۱۹۵

absorbable potassium (ppm)

پتاسیم قابل‌جذب (قسمت در میلیون)

۳۵

Si (percent)

سیلت (درصد)

۵۴

C (percent)

رس (درصد)

۱۱

L (percent)

لؤم

۵/۴۸

Saturated moisture percent

درصد رطوبت اشباع

۴

Fe

آهن

۸/۱۷

Mn

منگنز

۷/۰

Zn

روی

۲

Cu

مس

 

 

استخراج DNA و انجام PCR: از برگهای تازه و جوان ژنوتیپها، نمونه‌های برگی به‌منظور استخراج DNA به روش CTAB استفاده شد (۲۹). پس از استخراج DNA کیفیت و کمیت تقریبی آن به‌وسیله ژل آگارز ۸/۰ درصد تعیین شد. این آزمایش با استفاده از ۳۰ آغازگر ISSR، IRAP و iPBS ژنوم گیاه برنج انجام شد. این نشانگرها طبق مطالعات پیشین با استفاده از جمعیتها و زمینه‌های ژنتیکی متعدد، پیوسته با‌QTL های مرتبط با تنش خشکی در گیاه برنج شناسایی‌شده بودند. برای انتخاب این نشانگرها از مقالات استفاده شد (۱۸ و ۱۹). اطلاعات مرتبط با این نشانگرها در جدول ۳ ارائه‌شده است.

 

جدول ۳- اطلاعات مربوط به نشانگرهای مورد‌استفاده در این مطالعه‌.

نشانگر

توالی

دمای آنیلینیگ

(درجه سانتی‌گراد)

ISSR1

5`AACAACAACAACAACAACG-3`

۴۳-۴۸

iPBS2238

5`-ACCTAGCTCATGATGCCA-3`

۵۵-۶۰

iPBS2085

5`-ATGCCGATACCA-3`

۵۲-۵۷

ISSR7

5`ACACACACACACACACC-3`

۵۰-۵۵

iPBS2239

5`-ACCTAGGCTCGGATGCCA-3`

۵۵-۶۰

iPBS2221

5`-ACCTAGCTCACGATGCCA-3`

۵۰-۵۵

iPBS2081

5`-GCAACGGCGCCA-3`

۵۰-۵۵

iPBS2224

5`-ATCCTGGCAATGGAACCA-3`

۵۰-۵۵

ISSR13

5`-GACAGAGAGAGAGAGAA-3`

۵۰-۵۵

ISSR14

5`-CACACACACACACACAA-3`

۵۰-۵۵

ISSR16

5`-CTCTCTCTCTCTCTCTG-3`

۵۰-۵۵

ISSR21

5`-ACAGACAGACAGACAGACAGC-3`

۵۰-۵۵

ISSR22

5`-CTCTCTCTCTCTCTCTT-3`

۵۰-۵۵

iPBS2231

5`-ACTTGGATGCTGATACCA-3`

۵۰-۵۵

iPBS2074

5`-GCTCTGATACCA-3`

۵۰-۵۵

ISSR29

5`-TCTCTCTCTCTCTCTCA-3`

۵۴-۵۹

ISSR30

5`-GAGGAGAGAGAGAGAGG-3`

۵۹-۶۴

ISSR31

5`-GAAGAGAGAGAGAGAT-3`

۵۵-۵۰

iPBS2076

5`-GCTCCGATGCCA-3`

۵۹-۶۴

IRAP33

5`-CTTGCTGGAAAGTGTGTGAGAGG-3`

۶۲-۶۷

iPBS2077

5`-CTCACGATGCCA-3`

۵۵-۶۰

ISSR43

5`-AGAGAGAGAGAGAGAGC-3`

۵۵-۵۰

iPBS2083

5`-CTTCTAGCGCCA-3`

۵۵-۵۰

ISSR45

5`-GTCGTCGTCGTCGTCGTCA-3`

۵۵-۵۰

ISSR46

5`-GTTGTTGTTGTTGTTGTTA-3`

۴۲-۴۷

ISSR47

5`-CTCCTCCTCCTCCTCCTCG-3`

۵۵-۶۰

iPBS2242

5`-GCCCCATGGTGGGCGCCA-3`

۵۰-۵۵

iPBS2237+iPBS2240

5`-CCCCTACCTGGCGTGCCA-3`/5`-AACCTGGCTCAGATGCCA-3`

۵۵-۶۰

iPBS2239+iPBS2240

5`-ACCTAGGCTCGGATGCCA-3`/5`-AACCTGGCTCAGATGCCA-3`

۵۵-۶۰

iPBS2077+iPBS2239

5`-CTCACGATGCCA-3`/5`-ACCTAGGCTCGGATGCCA-3`

۵۵-۶۰

 

رقیق‌سازی DNA در حجم ۱۰ میکرولیتر، با اجزای ۲ میکرولیتر DNA، ۱ میکرولیتر از بافر (10X)PCR، ۴/۰ میکرولیتر از هر آغازگر با غلظت ۶۰ نانوگرم در میکرولیتر، ۶/۰ میکرولیتر مخلوط dNTP (۲ میلی مولار)، ۱۲/۰ میکرولیتر آنزیم DNA Taq polymerase (۵ واحد در میکرولیتر) و ۵ میکرولیتر آب دیونیزه شده انجام شد. واکنش PCR به‌صورت تاچ داون و توسط دستگاه ترموسایکلر  Bio-Rad iCycler m100(ساخت کشور آمریکا) صورت گرفت. چرخه حرارتی شامل یک چرخه واسرشت اولیه برای DNA الگو در دمای ۹۴ درجه سانتی‌گراد به مدت ۴ دقیقه و به دنبال آن ۱۰ چرخه شامل ۴۵ ثانیه در دمای ۹۴ درجه سانتی‌گراد، ۴۵ ثانیه در دمای ۶۵ درجه سانتی‌گراد (با کاهش هر یک درجه سانتی‌گراد در هر چرخه تا رسیدن به دمای اتصال) و یک دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد و به دنبال آن ۲۶ چرخه شامل ۴۵ ثانیه در دمای ۹۴ درجه سانتی‌گراد، ۴۵ ثانیه در دمای ۵۵ درجه سانتی‌گراد و یک دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد بود. پس از اتمام ۲۶ چرخه فوق، نمونه‌ها به‌منظور انجام بسط نهایی پنج دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند. سپس فرآورده‌های PCR با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز ۵/۱ درصد تفکیک شدند و  پس از رنگ‌آمیزی با safe staining توسط اشعه ماوراءبنفش ملاحظه و عکس‌برداری شدند. در نهایت امتیازدهی نوارها انجام گرفت. به‌منظور تجزیه ‌و تحلیل داده‌های مولکولی و به دست‌ آوردن اطلاعات مربوط به تنوع نشانگر‌های مورد ‌بررسی از نرم‌افزار POP gene v1.32، برای تجزیه به مؤلفه‌های اصلی از نرم‌افزارv3.21   PAST و رسم نمودار درختی و سایر اطلاعات تنوع ژنتیکی از نرم‌افزار v3.0 Power marker استفاده شد. شاخص اطلاعات چندشکلی آغازگر از طریق فرمول PIC= Σ (1- pi 2)/n محاسبه شد که pi فراوانی آلل i م و n تعداد کل ژنوتیپها می‌باشد. شاخص نشانگر از حاصل‌ضرب تعداد نوارهای چند شکل در شاخص محتوای چندشکلی محاسبه شد (۲۶). به منظور گروه­بندی ژنوتیپهای مورد بررسی از تجزیه به مؤلفه­های اصلی استفاده شد. برای این منظور از نرم افزار  PAST v3.21 استفاده شد. تجزیه رگرسیون چندگانه به روش گام‌به‌گام برای ۲۳ صفت مورفولوژیک به کمک نرم‌افزار SPSS Ver. 20 انجام شد و سپس با استفاده از رگرسیون مرحله‌ای نشانگر‌های تأثیر‌گذار برای هر صفت مشخص شد.

نتایج‌

نتایج حاصل از نشانگرهای مولکولی در ۱۱۲ ژنوتیب مورد مطالعه: ۳۰ آغازگر مورد ‌استفاده الگوی نواربندی مناسب و قابل امتیازدهی تولید نمودند (جدول ۴). این آغازگرها درمجموع ۲۸۹ باند با میانگین ۶۳/۹ باند به ازای هر آغازگر تولید نمودند؛ که از این میان ۲۱۸ باند چند شکل، و ۷۱ باند یک‌‌شکل با میانگین ۲۷/۷ باند چند شکل به ازای هر آغازگر بودند. درصد چندشکلی از ۵۰/۸۷ برای آغازگر‌ ISSR11 تا ۱۴/۵۷ درصد برای آغازگر ترکیبی iPBS2077+iPBS2239 متغیر بود و میانگین آن برای همه آغازگر‌ها ۳۳/۷۵ درصد بود. توزیع مقدار PIC برای آغازگرهای مورداستفاده در محدوده ۴۹/۰ برای ISSR22 الی ۰۶۲/۰ برای iPBS2237+iPBS2240 با میانگین ۳۶/۰ قرار داشت. شاخص نشانگر نیز از ۴۷/۵ تا ۵۰/۰ با میانگین ۵۷/۲ متغیر بود. تعداد آللهای مؤثر (۱۶) بین ۸۸/۱ (ISSR22) تا ۰۸/۱ (iPBS2237+iPBS2240) متغیر بود و میانگین آن ۴۵/۱ برای همه نشانگر‌ها به دست آمد. بررسی تنوع ژنتیکی بر اساس شاخص تنوع ژنی نی (۲۰و24) و شاخص اطلاعات شانون (۱۷) نشان داد که شاخص تنوع ژنی نی در آغازگر ISSR22  برابر ۴۶/۰ و کمترین مقدار آن در نشانگر iPBS2237+iPBS2240 برابر ۰۴۹/۰ متغیر بود و میانگین آن در همه نشانگر‌های مورد‌بررسی ۲۶/۰ بود.

 

 

جدول ۴-‌ اطلاعات مربوط به چندشکلی نشانگرها در این بررسی

نشانگر

تعداد کل باند‌ها

تعداد باند چند شکل

PIC

شاخص نشانگر

درصد چندشکلی

 تعداد آللهای مؤثر

 تنوع ژنی نی

شاخص اطلاعات شانون

ISSR1

۷

۵

۳۷/۰

۸۶/۱

۴۳/۷۱

۵۶/۱

۳۳/۰

۴۹/۰

iPBS2238

۱۰

۷

۴۵/۰

۱۵/۳

۷۰

۴۷/۱

۲۵/۰

۳۷/۰

iPBS2085

۷

۶

۴۵/۰

۷۳/۲

۷۱/۸۵

۷۶/۱

۴۱/۰

۶۰/۰

ISSR7

۱۰

۷

۳۱/۰

۱۴/۲

۷۰

۳۵/۱

۲۱/۰

۳۲/۰

iPBS2239

۱۴

۱۲

۴۶/۰

۴۷/۵

۷۱/۸۵

۵۶/۱

۳۲/۰

۴۹/۰

iPBS2221

۹

۷

۳۱/۰

۱۷/۲

۷۸/۷۷

۴۴/۱

۲۷/۰

۴۳/۰

iPBS2081

۸

۷

۴۷/۰

۳۲/۳

۵/۸۷

۶۰/۱

۳۴/۰

۵۰/۰

iPBS2224

۱۱

۹

۳۳/۰

۹۸/۲

۸۲/۸۱

۳۰/۱

۲۰/۰

۳۳/۰

ISSR13

۸

۶

۴۳/۰

۵۶/۲

۷۵

۶۸/۱

۳۶/۰

۵۱/۰

ISSR14

۸

۶

۱۵/۰

۹۱/۰

۷۵

۲۰/۱

۱۳/۰

۲۱/۰

ISSR16

۹

۶

۲۸/۰

۶۵/۱

۶۷/۶۶

۳۸/۱

۲۵/۰

۳۸/۰

ISSR21

۹

۷

۴۵/۰

۱۵/۳

۷۸/۷۷

۶۰/۱

۳۳/۰

۴۹/۰

ISSR22

۹

۶

۴۹/۰

۹۶/۲

۶۷/۶۶

۸۸/۱

۴۶/۰

۶۶/۰

iPBS2231

۱۲

۹

۴۳/۰

۸۶/۳

۷۵

۳۶/۱

۲۳/۰

۳۵/۰

iPBS2074

۱۰

۷

۴۵/۰

۱۴/۳

۷۰

۵۴/۱

۳۱/۰

۴۷/۰

ISSR29

۷

۶

۴۷/۰

۸۴/۲

۷۱/۸۵

۷۰/۱

۳۹/۰

۵۷/۰

ISSR30

۹

۷

۱۲/۰

۸۱/۰

۷۸/۷۷

۱۴/۱

۰۹/۰

۱۵/۰

ISSR31

۱۱

۹

۳۵/۰

۱۵/۳

۸۲/۸۱

۳۲/۱

۱۹/۰

۳۰/۰

iPBS2076

۱۲

۹

۴۵/۰

۰۸/۴

۷۵

۷۱/۱

۳۹/۰

۵۷/۰

IRAP33

۱۰

۷

۴۴/۰

۱/۳

۷۰

۳۵/۱

۲۶/۰

۴۳/۰

iPBS2077

۱۱

۸

۲۴/۰

۹۲/۱

۷۳/۷۲

۲۲/۱

۱۶/۰

۲۹/۰

ISSR43

۱۰

۸

۲۶/۰

۰۶/۲

۸۰

۲۲/۱

۱۲/۰

۱۹/۰

iPBS2083

۱۲

۹

۲۱/۰

۸۵/۱

۷۵

۲۹/۱

۱۷/۰

۲۶/۰

ISSR45

۱۰

۷

۴۰/۰

۸۱/۲

۷۰

۵۰/۱

۳۲/۰

۵۰/۰

ISSR46

۷

۶

۴۰/۰

۴۳/۲

۷۱/۸۵

۴۱/۱

۲۴/۰

۳۶/۰

ISSR47

۱۳

۱۱

۳۰/۰

۳۰/۳

۶۲/۸۴

۴۶/۱

۲۷/۰

۴۱/۰

iPBS2242

۹

۶

۳۰/۰

۸۲/۱

۶۷/۶۶

۴۳/۱

۲۹/۰

۴۷/۰

iPBS2237+iPBS2240

۱۲

۸

۰۶/۰

۵۰/۰

۶۷/۶۶

۰۸/۱

۰۵/۰

۰۸/۰

iPBS2239+iPBS2240

۷

۴

۴۴/۰

۷۸/۱

۱۴/۵۷

۳۰/۱

۲۰/۰

۳۴/۰

iPBS2077+iPBS2239

۸

۶

۴۵/۰

۷۲/۲

۷۵

۶۴/۱

۳۸/۰

۵۷/۰

میانگین

۶۳/۹

۲۷/۷

۳۶/۰

۵۷/۲

۳۳/۷۵

۴۵/۱

۲۶/۰

۴۰/۰

 

 

میانگین شاخص شانون در همه نشانگر‌ها ۴۰/۰ بود. بیشترین میزان این شاخص ۶۶/۰ در آغازگر ISSR22 و کمترین مقدار آن ۰۸/۰ در آغازگر iPBS2237+iPBS2240 مشاهده گردید.

تجزیه به مؤلفه‌های اصلی‌: به‌منظور تعیین میزان همبستگی بین صفات و توجیه مقادیر واریانس متغیرهای اولیه چند مؤلفه اصلی اول، تجزیه به مؤلفه‌های اصلی انجام شد. در کل ۱۱۱ مؤلفه تغییرات را توجیه نمود که از این میان بیشترین توجیه مربوط به ۱۰ مؤلفه اول و به خصوص مؤلفه اولین بود(جدول ۵).

جدول ۵- اطلاعات مربوط به ۱۰ مؤلفه اول‌ در ژنوتیپهای برنج مورد ارزیابی‌‌

مؤلفه اصلی

مقدار ویژه

درصد واریانس

میزان کل

۱

۹۶/۵

۲۵/۲۱

۲۵/۲۱

۲

۹۸/۱

۰۷/۷

۳۲/۲۸

۳

۲۸/۱

۵۵/۴

۸۷/۳۲

۴

۰۵/۱

۷۶/۳

۶۳/۳۶

۵

۹۹۶/۰

۵۵/۳

۱۸/۴۰

۶

۸۰/۰

۸۵/۲

۰۳/۴۳

۷

۷۶/۰

۶۹/۲

۷۳/۴۵

۸

۷۴/۰

۶۳/۲

۳۵/۴۸

۹

۶۵/۰

۳۱/۲

۶۷/۵۰

۱۰

۶۰/۰

۱۴/۲

۸۱/۵۲

 

اولین مؤلفه ۵۰/۲۱ درصد تغییرات را توجیه نمود دومین مؤلفه ۰۷/۷ درصد از تغییراتی را که توسط مؤلفه اول توجیه نشده بود را توجیه کرد و به همین ترتیب روند توجیه تغییرات ادامه یافت تا اینکه مؤلفه دهم ۱۴/۲ درصد از تغییراتی را که توسط ۹ مؤلفه قبل توجیه نشده بود را توجیه نمود و در کل ده مؤلفه اول ۸۱/۵۲ درصد تغییرات را توجیه نمودند.  تجزیه به مؤلفه‌های اصلی ژنوتیپهای برنج مورد بررسی را به ۴ گروه تقسیم‌بندی نمود (جدول ۶ و شکل ۱)‌. گروه اول مؤلفه اول و دوم بالا، گروه دوم مؤلفه اول بالا و مؤلفه دوم پایین، گروه سوم مؤلفه اول پایین و مؤلفه دوم بالا و نهایتاً گروه چهارم در هر دو مؤلفه دارای ارزشهای پایینی بودند. بررسیهای صفات مرفوفنولوژیک بین گروهها نشان داد که ‌در شرایط بدون تنش گروه اول قطر ساقه، تعداد خوشچه اصلی و شاخص برداشت بالاتری در مقایسه با سه گروه دیگر داشتند. این گروه در شرایط تنش خشکی تعداد پنجه بارور، تعداد پنجه کل و شاخص برداشت بالاتری دارا بودند. گروه دوم در شرایط بدون تنش طول برگ پرچم، طول خروج از غلاف و باروری بیشتری داشتند در شرایط تنش خشکی این گروه از نظر خصوصیاتی مثل طول برگ پرچم، طول خروج از غلاف بالاتر بودند.

جدول ۶- گروه بندی ژنوتیپهای برنج بر اساس تجزیه به مؤلفه های اصلی و شماره ژنوتیپهای هر گروه

گروه ۴

گروه ۳

گروه ۲

گروه ۱

۷

۲۹۹

۸۷

۲۷۳

۱۰۶

۱۶۷

۱۲۴

۱۴

۲۶۷

۲۶۸

۲۹۱

۶۳

۱۶۶

۲۸۱

۷۱

۲۱۶

۶۷

۵۶

۱۳۳

۱۸۰

۲۶۱

۲۸۶

۸۹

۲۷۲

۸

۱۰

۶۹

۹۱

۳۱۱

۱۴۳

۲۸۲

۱۱۲

۱۳۸

۱۵۶

۱۴۰

۱۴۶

۲۶۲

۲۳۷

۱۶۵

۱۲۳

۱۳۴

۱۱۶

۱۲۹

۲۷۸

۷۰

۸۳

۱۰۷

۵۲

۱۷۸

۱۵

۱۵۳

۷۳

۳۰۷

۲۹۲

۲۶۹

۷۷

۱۴۱

۶۰

۲۲۲

۹

۱۲۱

۶۶

۲۸۸

۱۳۲

۱۵۰

۲۹۰

۱۲۸

۲۶۰

۹۶

۶۱

۲۵۶

۲۶۶

۹۲

۳۰۰

۱۶۴

۲۱۵

۱۹۱

۱۱۰

۱۷۱

۱۶۰

۱۰۰

۲۲۸

۱۲۲

۱۲

۶۴

۱۷۷

۹۳

۹۷

۱۲۵

۷۴

۱۰۱

۲۷۰

۷۶

۹۸

۶۸

۳۱۲

 

۱۹۷

۹۵

۲۸۰

 

۱۲۷

۱۱۱

۸۵

 

۳۰۹

۱۷۲

۸۸

 

۱۷۳

 

۱۳۱

 

۱۷۵

 

۱۶۳

     

۸۴

     

۱۳۵

 

گروه سوم در شرایط بدون تنش از نظر خصوصیاتی مثل عرض برگ پرچم، مساحت برگ پرچم، طول خوشه اصلی، وزن کل خوشه‌ها، وزن خوشه اصلی، تعداد دانه پر، وزن دانه پر، تعداد خوشچه ثانویه، بیوماس و عملکرد برتر بودند، گروه سوم در شرایط تنش خشکی مساحت برگ پرچم، قطر ساقه، طول خوشه اصلی، وزن کل خوشه‌ها، وزن خوشه اصلی، وزن کل ساقه‌ها، تعداد دانه پر، وزن دانه پر، تعداد خوشچه اولیه، بیوماس و عملکرد بالاتری داشتند. گروه چهارم در شرایط بدون تنش تعداد پنجه بارور، تعداد پنجه کل، وزن کل ساقه‌ها، تعداد دانه پوک، وزن دانه پوک و روز تا گلدهی بالاتری دارا بودند در شرایط تنش خشکی گروه چهارم عرض برگ پرچم و تعداد خوشچه ثانویه بالاتری داشتند.

 

شکل ۱- پلات دو‌بعدی کلاستر‌ها به کمک نشانگر‌های ISSR، IRAP و iPBS.

 

رگرسیون داده‌های مولکولی و مورفولوژیکی‌: نتایج حاصل از تجزیه رگرسیون ۳۰ نشانگر ISSR، IRAP و iPBS ارتباط معنی‌دار میان ۱۳۷ نوع آلل در شرایط بدون تنش و ۱۲۰ نوع آلل در شرایط تنش خشکی را با صفات بررسی‌شده نشان داد. بیشترین تعداد آلل آگاهی‌بخش در شرایط بدون تنش مربوط به صفت طول برگ پرچم (۴۱ آلل) و کمترین تعداد آلل شناسایی‌شده در ارتباط با صفت عرض برگ پرچم بود. بیشترین و کمترین تعداد آلل آگاهی‌بخش در شرایط تنش خشکی به ترتیب مربوط به صفت وزن کل خوشه‌ها (۲۷ آلل) و صفت بیوماس (۴ آلل) بود. در نشانگر‌های مورداستفاده ضریب تبیین در مجموع نشانگر‌های آگاهی‌بخش در شرایط بدون تنش از ۹۸/۰ (صفت طول برگ پرچم) الی ۲۲/۰ (عرض برگ پرچم) متغیر بود. در ارتباط با عملکرد (۱۴ آلل)، وزن خوشه اصلی (۱۷ آلل) و وزن کل خوشه‌ها (۱۲ آلل) به ترتیب با ضرایب تبیین ۵۹۳/۰، ۷۰۵/۰ و ۶۵/۰ شناسایی شد. در شرایط تنش خشکی نیز بیشترین ضریب تبیین ۸۹/۰ درصد (وزن کل خوشه‌ها) و کمترین ضریب تبیین ۲۵/۰ (بیوماس) شناسایی شد. در شرایط تنش خشکی برای عملکرد (۷ آلل) و وزن خوشه اصلی (۱۸ آلل) با ضرایب ۴۴۷/۰ و ۷۶۳/۰ تبیین گردیدند (جدولهای ۷ و ۸).

تجزیه خوشه‌ای ژنوتیپها به کمک نشانگرهای مورد‌استفاده‌: پس از اینکه مناطق مورد نظر در ژنوم ژنوتیپهای مورد بررسی با استفاده از نشانگرهای ترانسپوزونی استفاده شده مورد تکثر قرار گرفت، ژنوتیپها با توجه به تکثیر یا عدم تکثیر منطقه مورد نظر در ژنوم به صورت صفر و یک (عدم وجود باند و وجود باند) تعیین ژنوتیپ شدند و داده­های مولکولی حاصل برای گروه بندی ژنوتیپها با استفاده از نرم افزار PAST مورد استفاده قرار گرفتند. گروه‌بندی ژنوتیپها با استفاده از نرم‌افزار PAST بر اساس داده‌های مولکولی با روش UPGMA و معیار ضریب کوفنینگ (۹۲/۰) موجب شد ژنوتیپها در ۷ گروه قرار گیرند (شکل ۲).‌‌ بررسی صفات مرفوفنواوژیک بین گروهها نشان داد که گروه ۱ در هر دو شرایط برتری خاصی در هیچ یک از صفات نداشت گروه دوم در شرایط بدون تنش تعداد خوشچه ثانویه بیشتری داشت و در شرایط تنش خشکی در تعداد خوشچه ثانویه برتر بود. گروه سوم در شرایط بدون تنش تعداد پنجه بارور بیشتر و در شرایط تنش خشکی تعداد پنجه بارور و تعداد پنجه کل بیشتری داشت. گروه چهارم در شرایط بدون تنش وزن خوشه اصلی بیشتر و در شرایط تنش خشکی تعداد دانه پر، وزن دانه پر و تعداد خوشچه ثانویه بالاتری دارا بود. گروه پنجم در شرایط نرمال در صفت باروری برتر بود و در شرایط تنش خشکی برتری خاصی در هیچ کدام از صفات نداشت. گروه ششم در شرایط نرمال طول برگ پرچم، مساحت برگ پرچم، وزن کل خوشه‌ها، تعداد دانه پر، تعداد خوشچه اولیه، بیوماس و عملکرد بیشتری در مقایسه با گروههایی دیگر داشت این گروه در شرایط تنش خشکی طول برگ پرچم، مساحت برگ پرچم، قطر ساقه، وزن کل خوشه‌ها، وزن کل ساقه‌‌‌‌‌ و عملکرد بالاتری دارا بود. گروه هفتم در شرایط بدون تنش قطر ساقه، طول خوشه اصلی و شاخص برداشت بیشتر و در شرایط تنش خشکی طول خوشه بیشتری داشت.

 

 

 

شکل ۲- دندروگرام تجزیه خوشه‌ای ژنوتیپهای برنج مورد بررسی به کمک نشانگر‌های مولکولی.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

بحث

آگاهی از میزان تنوع ژنتیکی ژرم‌پلاسم و رابطه ژنتیکی بین ژنوتیپها به محافظت و استفاده مناسب از منابع ژنتیکی کمک شایانی می‌کند (2 و 22). مطالعه و بررسی تنوع ژنتیکی به روشهای مختلفی صورت می‌پذیرد، اما در بین روشهای مورد استفاده بررسی در سطح مولکولی و ماده ژنتیکی، جدیدتر، راحت‌تر، قابل‌اعتمادتر و با سرعت بیشتری انجام می‌شود (5 و ۶).در مطالعه‌ای دیگر بر روی ۱۸ ژنوتیپ جو از ۳۴ آغازگر ISSR ارزیابی‌شده ۹ آغازگر با الگوی نواربندی مناسب تولید شده است. این آغازگر‌ها ۶۱ نوار با میانگین ۸۷/۶ نوار به ازای هر آغازگر تولید نموده‌اند که از این میان ۱۱ نوار یک‌شکل و ۵۰ نوار چند شکل بوده است. میانگین درصد چند‌شکلی برای تمامی آغازگر‌های استفاده‌شده ۲۹/۸۲ درصد و میزان اطلاعات چندشکلی برای آغازگر‌های مورد بررسی بین ۳/۰ تا ۵۷/۰ متفاوت بوده است. شاخص نشانگر نیز بین ۵/۱ تا ۵۶/۴ بوده است این گروه از محققین عنوان می‌‌نمایند که آگاهی از روابط ژنتیکی ژنوتیپها روشی مناسب برای کسب اطلاعات ارزشمند برای جهت‌دهی به برنامه‌های به نژادی و مدیریت منابع ژرم‌پلاسم می‌باشد (۵). ISSR و نشانگر‌های رتروترانسپوزونی بازتاب خوبی از تنوع درون، بین‌گونه‌ای و ارقام را به نمایش می‌گذارند (۱۶). در این مطالعه نیز نشانگر‌های مورد استفاده تنوع خوبی را در ژرم‌پلاسم برنج مورد بررسی به معرض نمایش گذاشتند به‌گونه‌ای که بالاترین میزان شاخصهایی مثل محتوای اطلاعات چند‌شکلی (PIC) شاخصی که برای نشان دادن ارزش یک نشانگر در نمایش چندشکلی موجود درون یک جمعیت به کار می‌رود و معیار دقیقی که مستقل از تعداد نمونه مورد مطالعه عمل می‌کند (۱۵) به همراه میزان شاخص اطلاعات شانون و معیار تنوع ژنی نی در نشانگر‌ ISSR22 دیده شد. در تجزیه به مؤلفه‌های اصلی همان‌گونه که انتظار می‌رفت مؤلفه اول بیشترین میزان تغییرات را توجیه نمود در اطلاعات حاصل از نشانگر‌های مولکولی کم بودن درصد تبیین تغییرات مولکولی در تجزیه‌های چندمتغیره مثل تجزیه به مؤلفه‌های اصلی اول، بر مستقل بودن مکانها و نشانگر‌های مورد ‌مطالعه و توزیع مناسب آنها در نواحی مختلف ژنوم دلالت دارد. درصورتی‌که نشانگرها از بخشهای مختلف ژنوم انتخاب ‌شده باشند پیوستگی بین آنها کم خواهد بود و درنتیجه تعداد بیشتری مؤلفه برای توجیه کل تغییرات لازم است و توزیع مناسب نشانگر‌ها در سراسر ژنوم به معنی سنجش دقیق‌تر و بهتر تنوع مولکولی به دلیل نمونه‌برداری مناسب از کل ژنوم است (۱، ۹، ۱۳ و ۲۳)؛ بنابراین نتایج تجزیه به مؤلفه های اصلی در این بررسی نشان داد که نشانگر‌های مورد بررسی در این مطالعه در نواحی مختلف ژنوم پراکنده هستند. پیوستگی ژنتیکی بین نشانگر‌ها و مکانهای ژنی صفات کمی، محتمل‌ترین توجیه برای ارتباط بین نشانگر‌های مولکولی و صفات کمی می‌باشد استفاده از پیوستگی بین نشانگر‌های مولکولی و ژنهای کنترل‌کننده صفات کمی، فرآیند شناسایی جایگاههای ژنی مؤثر در صفات و بنابراین به نژادی گیاهان را تسریع می‌نماید (۳۰). بر اساس نتایج حاصل از این بررسی می‌توان اظهار داشت که این نشانگرها پتانسیل استفاده به کمک نشانگر برای صفات مورد بررسی را دارا هستند و پویش در نواحی کروموزومی اطراف این نشانگر‌ها می‌تواند محققین را در شناسایی ژنهای کنترل‌کننده صفات مورد‌نظر یاری نماید. در بررسی که بر روی ۴۸ ژنوتیپ برنج به کمک ۱۸ نشانگر SSR صورت پذیرفته است بیشترین نشانگر‌های مثبت مرتبط با صفات برای طول دانه، طول ریشک و کمترین نشانگر مثبت برای عرض دانه، عرض لما و جرم حجمی شناسایی شده است. بیشترین تغییرات مربوط به صفت عرض دانه (۹۸ درصد) توسط نشانگر RM282 و کمترین ضریب تبیین مربوط به عرض پالئا (۶ درصد) به کمک نشانگر RM6283 تبیین شده است. این محققین این‌گونه نتیجه‌گیری نموده‌اند که با توجه به اینکه اکثر آغازگر‌های مورد ‌استفاده بر صفات مورد مطالعه مؤثر بوده‌اند بنابراین به‌احتمال‌زیاد بتوان از این آغازگر‌ها همراه با اطلاعات مربوط به صفات مورفولوژیک در اصلاح ارقام برنج و شناسایی والدین مناسب برای تولید ارقام هیبرید استفاده نمود (۸). نتایج تجزیه خوشه‌ای در این مطالعه نشان داد ژنوتیپهایی که در یک گروه قرار دارند باوجود تفاوتهای ظاهری توالیهای تکراری مشابه در ساختمان ژنوم خود دارند. چون نشانگر‌های مورد‌استفاده جزء نشانگر‌های تصادفی می‌باشند بنابراین قرار‌گیری ژنوتیپهای متفاوت در کنار‌ هم شاید به علت تکثیر مناطق غیر رمز کننده توسط نشانگر‌های مورداستفاده و تأثیر عوامل محیطی در بروز صفات ریختی ژنوتیپهای مورد بررسی در این مطالعه باشد.

‌نتیجه‌گیری کلی‌

بررسی تنوع ژنتیکی به کمک نشانگر‌های ISSR، IRAP و iPBS بازتاب خوبی از تنوع ژنوتیپهای مورد بررسی را به نمایش گذاشت. بیشترین تعداد نوار چند شکل در بین آغازگر‌های مورد ‌مطالعه مربوط به نشانگر‌ ISSR9 با ۱۲ نوار چند شکل و کمترین آن متعلق به آغازگر ترکیبی iPBS2239+iPBS2240 با ۴ نوار چند شکل بود. بالاترین میزان اطلاعات چند شکل، تعداد آللهای مؤثر، شاخصهای تنوع ژنی نی و شانون مربوط به آغازگر ISSR22 بود. میانگین شاخص نشانگر برای کلیه نشانگر‌های مورد‌بررسی ۵۷/۲ به دست آمد. در شرایط بدون تنش بیشترین ارتباط معنی‌دار با بالاترین ضریب تبیین (۹۸/۰) مربوط به آلل iPBS2224-6 در صفت طول برگ پرچم بود. در شرایط تنش خشکی بیشترین ارتباط معنی‌دار در صفت وزن کل خوشه‌ها در ارتباط با آلل ISSR16-6 به‌عنوان آلل سرگروه با ضریب ۸۹/۰ تبیین گردید. تجزیه به مؤلفه‌های اصلی نشان داد که نشانگر‌ها در ژنومهای مورد بررسی از توزیع مناسبی برخوردار هستند و بنابراین این امر سنجش دقیق تنوع مولکولی از کل ژنوم، ژنوتیپهای مورد بررسی را فراهم ساخت؛ در کل می‌توان گفت که با بررسی بیشتر آللهای شناسایی‌شده در ارتباط با صفاتی مثل طول برگ پرچم، وزن خوشه‌اصلی در شرایط بدون تنش و وزن کل خوشه‌ها می‌توان از نشانگر‌های مولد این آللها در گزینش به کمک نشانگر بهره‌برداری نمود.

۱- اعلمی، ع. کرمی، ن. ۱۳۹۵. بررسی تنوع ژنتیکی ارقام برنج ایرانی با استفاده از نشانگرهای IRAP،ISSR و REMAP. پژوهشنامه اصلاح گیاهان زراعی. ۲۰: ۵۱-۴۱.‌
۲- خدادوست، ع. یوسف‌زاده، ح. امیر‌چخماقی، ن. عبدالهی، ح. حسین‌زاده کلاگر، ا. ۱۳۹۵. تنوع ژنتیکی سیب شرقی (Malus Orientalis Uglitz.) جنگل هیرکانی ایران، با استفاده از نشانگر ISSR-PCR.‌ ۴: ۱۴-۱.
۳- رئیسی، ط. صبوری، ع. ۱۳۹۴. اعتبارسنجی و تجزیه ارتباطی نشانگرهای ریز ماهواره مرتبط با تحمل به تنش خشکی و شوری در برنج‌های هوازی و ایرانی تحت تنش اسمزی. مجله علمی پژوهشی زیست‌فناوری گیاهان زراعی. ۱۰: ۷۲-۵۷.‌
۴- سرایلو، م. صبوری، ح. دادرس، ا. ۱۳۹۴. بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای برنج با استفاده از نشانگر‌های ریز ماهواره و ارتباط آنها با صفات مورفولوژیک مرحله گیاهچه‌ای تحت شرایط نرمال و تنش خشکی. تحقیقات غلات. ۱: ۱۵-۱.
۵- سفالیان، ا. اصغری، ع. رسول زاده، ع. سیفی، ر. جماعتی، ش. فیروزی، ب. ۱۳۹۴. ارزیابی تنوع ژنتیکی و گروه‌بندی ژنوتیپهای مختلف جو بهاره تحت شرایط تنش خشکی با استفاده از صفات مرفوفیزیولوژیک و نشانگرهای ISSR. نشریه زراعت دیم ایران. ۲: ۲۲۳-۱۲۹.‌‌
۶- صفری، ه. شیروانی، ه.فریدونی، ل. ۱۳۹۶. بررسی تنوع ژنتیکی برخی از ژنوتیپهای چچم دائمی (Lolium perenne) با استفاده از نشانگر‌های مولکولی و بیوشیمیایی. مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)۴: ۱۴-۱.
۷- عبدالشاهی، ر. امیری، م. طالعی، ع. ر. یزدی صمدی، ب. ۱۳۸۹. ارزیابی ژنوتیپهای گندم نان از لحاظ تحمل به خشکی. مجله الکترونیک تولید گیاهان زراعی. ۳: ۱۷۱-۱۵۹.
۸- علیزاده، م. تجزیه ارتباط برخی از صفات گل و دانه در برنج با استفاده از نشانگر‌های رتروترانسپوزونی. پایان‌نامه کارشناسی ارشد. دانشگاه گیلان. ۲۰-۱.
‌‌‌‌۹- فاضلی، ف. چقامیرزا، ک. ۱۳۹۰. تنوع ژنتیکی نخود زراعی تیپ کابلی ایران بر اساس صفات زراعی و نشانگر RAPD. مجله به‌نژادی نهال و بذر. ۴: ۵۸۰-۵۵۵.
۱۰- قادری، ف. صادق‌زاده، ب. بابائیان جلودار، ن. عبدالهی مندولکانی، ب. ۱۳۹۵. اشباع نقشه ژنتیکی جو با استفاده از نشانگرهای رتروترنسپوزونی و جمعیت دابل هاپلوئیدی حاصل از تلاقی Clipper×Sahara. مجله بیوتکنولوژی کشاورزی. ۳: ۸۲-۶۶.
 ۱۱- قره خانی، م. نواب‌پور، س. صبوری، س. رمضانپور، س.س. ۱۳۹۵. بررسی تنوع ژنتیکی در ارقام برنج موجود در ایران با استفاده از نشانگر‌های SSR. پژوهشنامه اصلاح گیاهان زراعی ۲۰: ۱۱۵-۱۰۷.
۱۲- مسعودی، ح. صبوری، ح. طلیعی، ف. آلت جعفربای، ج. ۱۳۹۶. بررسی تنوع ژنتیکی و ارتباط برای صفات مرفوفنولوژیک و مقاومت به بیماری سفیدک پودری در ژرم‌پلاسم گندم با استفاده از نشانگر‌های مولکولی ISSR، IRAP و iPBS. مجله علمی پژوهشی زیست‌فناوری گیاهان زراعی. ۱۸: ۵۶-۴۱.
۱۳- نادری، ح. شکرپور، م. اصغری، ع. کانونی، ه. اسفندیاری، ع. ۱۳۹۳. بررسی تنوع ژنتیکی لاینهای نخود با استفاده از نشانگرهای مولکولی ISSR. مجله علوم گیاهان زراعی ایران. ۴: ۵۱۹-۵۰۹.‌‌
۱۴- نعمت زاده، ق. طالبی، ر. خدارحم‌پور، ز. کیانی، غ. ۱۳۸۲. بررسی تنوع ژنتیکی و جغرافیایی برنج با استفاده از صفات فیزیولوژیکی و زراعی. مجله علوم زراعی ایران. ۵: ۲۳۴-۲۲۵.‌
 
15- Botstein, D. White, R. L. Skolnick M. and Davis, R. W.1980. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. The American Journal of Human Genetics. 32: 314- 331.‌
16- Carvalho, A. Lima-Brito, J. Macas, B. and Guedes-Pinto, H. 2009. Genetic diversity and variation among botanical varieties of old Portuguese wheat cultivars revealed by ISSR assays. Biochemical Genetics. 47: 276-294.
17- Hamrick, J.L. and Godt, M.J.W. 1996. Conservation genetics of endemic plant species. In: Avise, J.C. Hamrick, J. L. (Eds.), Conservation Genetics: Case Histories from Nature. Chapman and Hall, New York.‌
18- Kalendar RAntonius KSmýkal PSchulman AH. 2010. iPBS: a universal method for DNA fingerprinting and retrotransposon isolation. Theor Appl Genet. 121(8):1419-30.
19- Kalendar R. 2011. The Use of Retrotransposon-Based Molecular Markers to Analyze Genetic Diversity. Field Veg. Crop Res. 48 (2011) 261-274
20- Kimuraz, M. and Crow, J. F. 1964. The number of alleles that can be maintained in a population. Genetics. 49: 725-738
21- Lewontin, R.C. 1972. The apportionment of human diversity. Evolution of Biology. 6: 381-398.
22- Matus, I.A. and Hayes, P.M. 2002. Genetic diversity in three groups of barley germplasm assessed by simple sequence repeats. Genome. 45: 1095-1106.
‌23- Mohammadi, S. A. and Prasanna, B. M. 2003. Analysis of genetic diversity in crop plant-salient statistical tools and consideration. Crop Science. 43: 1235-1248.
24- Nei, M. (1973). Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceeding National Academic Science. 70: 3321-3323.
25- Pandey, V. and Shukla, A. 2015. Acclimation and tolerance strategies of rice under drought. Rice Science. 22: 147−161.
26- Powell, W. Morgante, M. Andre, C. Hanafey, M. Vogel, J. Tingey, S. and Rafalsky, A. 1996. The comparison of RFLP, RAPD, AFLPand SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Molecular Breeding. 2: 225-238
27- Prince, S. Beena, R. Gomez, M. Senthive, A. and Babu C. 2015. Mapping consistent rice (Oryza sativa L.) yield QTLs under drought stress in target. Rice 8: 1-13.‌
28- Roldan-Ruiz, F. A. Gilliland, T. J. Dubreuil, P. Dillmann, C. Lallemand, J. 2001. A comparative study of molecular and morphological methods of describing relationships between perennial ryegrass (Lolium perenne L.) varieties. Theoretical and Applied Genetics. 103: 1138-1150.‌
29- Saghai Mroof, M.A. Biyashev, R.M. Yang, G.P. Zhang, Q. and Allard, R.W. 1994. Extraordinarily polymorphic DNA in barely species diversity, chromosomal location, and population dynamics, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91: 5466–5570.
30- Virk, P.S. Ford-Lioyd, B.V. Jackson, M.T. Pooni, H.S. Clemeno T.P. and Newbury, H.J. 1995. Marker assisted prediction of agronomic traits using diverse rice germplasm. Third International Rice Genetics Symposium, 16 to 20 October Manila, Philippines. 307-316.