بررسی هیستوپاتولوژی ترمیم زخم های عمیق پوستی با عصاره هیدروالکلی گیاه مامیثا (Glaucium corniculatum curt) 

راضیه عارف­یار¹، مهران میراولیایی²، اردشیر طالبی³ و محسن زحمتکش⁴

¹ یزد، دانشگاه پیام نور یزد، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

² اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، بخش بیوشیمی و بیولوژی مولکولی

³ اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده پزشکی، گروه علوم پزشکی، بخش پاتولوژی

⁴ یزد، شرکت علمی-تحقیقاتی فراطب

تاریخ دریافت: 24/8/94                تاریخ پذیرش: 6/9/95 

چکیده

کاهش عوارض ترمیم زخم و افزایش سرعت بهبودی از جنبه­های مورد تحقیق علم جراحی است. شناخت داروهای ارزان و موثر به خصوص فرآوردهای گیاهی، مورد توجه عموم می­باشد. هدف از این پژوهش بررسی اثر عصاره آبی- الکلی گیاه مامیثا (خشخاش بحری) بر روند ترمیم زخم پوستی و هم­چنین مقایسه با تتراسیکلین در موش نر بالغ می­باشد. در این مطالعه 30 موش نر صحرایی همسان از نژاد آلبینو در 3 گروه 10 تایی به طور کاملا تصادفی تقسیم شدند. پس از ایجاد زخم در شرایط یکسان بر روی آن­ها تأثیر عصاره گیاه مامیثا و پماد تتراسیکلین بر روند ترمیم زخم غیرعفونی بررسی گردید. برای این منظور، یک گروه کنترل نیز در نظر گرفته شد. پس از هفت و چهارده روز تیمار توسط عصاره گیاه مذکور و پماد تتراسیکلین روند ترمیم زخم در تمام گروه­ها در لایه درم و اپیدرم بررسی شد. پماد گیاهی در مقایسه با گروه کنترل تفاوت معناداری نشان داد (05/0p<). با توجه به نتایج به دست آمده به نظر می­رسد که عصاره هیدروالکلی گیاه مامیثا به واسطه­ی ترکیبات آلکالوئیدی و فلاوونوئیدی روند ترمیم زخم پوستی را در لایه درم و اپیدرم سریع­تر می­کند.

واژه های کلیدی: ترمیم زخم، درم، اپیدرم، عصاره گیاه، مامیثا

* نویسنده مسئول، تلفن: 03137932456، پست الکترونیکی: mmiroliaei@yahoo.com

مقدمه 

در سالیان اخیر عوارض ناشی از استعمال مواد شیمیایی سبب شد که محققین پژوهش­های بسیاری در زمینه استفاده از داروهای سنتی و گیاهی انجام دهند. این تحقیقات در برخی از موارد بازگو کننده این حقیقت بوده است که داروهای طبیعی تنها راه درمان به حساب آمده و در عین حال مواد اولیه موجود در آنها در صنعت داروسازی مورد استفاده قرار گرفته است (22). با توجه به عدم معرفی یک داروی موثر برای التیام زخم، مطالعه اثر گیاهان دارویی برای ترمیم زخم ضرورت دارد. ترمیم زخم یک پاسخ دینامیک، پیچیده و منظم به آسیب است و مستلزم تعامل بین انواع مختلف سلول­ها، پروتئین­های ساختمانی، فاکتورهای رشد و پروتئینازها می­باشد (20). اصول اولیه ترمیم زخم به حداقل رساندن آسیب بافت، خون رسانی کافی، اکسیژناسیون، تغذیه مناسب، محیط مرطوب برای ایجاد تمامیت آناتومیکی و عملکرد بخش مبتلا است (17). در این پروسه تعداد زیادی از انواع سلول­ها شامل نوتروفیل­ها، ماکروفاژها، لنفوسیت­ها، کراتینوسیت­ها، فیبروبلاست­ها و سلول­های اندوتلیال مشارکت دارند (12). روند ترمیم شامل تجمع پلاکتی و لخته شدن خون، تشکیل فیبرین، پاسخ التهابی به آسیب، تغییر مواد زمینه­ای، آنژیوژنز و اپی­تلیالیزاسیون مجدد است. ترمیم تا زمانی که سطوح مختل شده توسط کلاژن کاملا به هم متصل شوند، کامل نمی­شود (17). التهاب یک پدیده نرمال در فرآیند ترمیم زخم است و برای حذف میکروارگانیسم­های آلوده کننده، مهم است. در غیاب این آلودگی زدایی موثر، التهاب طولانی می‏شود. هنگامی که پاک سازی میکروبی ناکامل باشد، باکتری­ها و اندوتوکسین­ها می‏توانند منجر به بالا بردن طولانی سیتوکین­های پیش التهابی مثل اینترکولین1 (IL-1) و αTNF- و طولانی شدن فاز التهابی شوند (12). سلول های زیر درم  بعد از آسیب پوست شروع به ساخت کلاژن می کنند و سلول های اپیتلیال را ترمیم می کنند، در نتیجه کشف داروهایی برای ترمیم سریعتر لایة درم و اپیدرم در برابر  آسیب های پوستی اهمیت درمانی دارد. امروزه ﺍﺳـﺘﻔﺎﺩﻩ ﺍﺯ ﮔﻴﺎﻫﺎﻥ ﺩﺍﺭﻭﻳﻲ  به منظور کاهش عوارض جانبی ناشی از مصرف داروهای شیمیایی ﺑﺮﺍﻱ ﺍﻫﺪﺍﻑ ﺩﺭﻣﺎﻧﻲ  ﻣـﻮﺭﺩ ﺍﺳـﺘﻘﺒﺎﻝ ﻗـﺮﺍﺭ ﮔﺮﻓﺘـﻪ ﺍﺳﺖ (25،24). مرزه (Satureja bachtiarica) دارای اثر ضد التهابی و ضد باکتری  است که ناشی از ترکیبات مهم موجود در آن از جمله کارواکرول (38%) و فلاونوئیدها می باشد (14). بادرنجبویه (Melissa officinalis)برای درمان مشکلات گوارشی، زخم معده، بی اشتهایی به کار برده می‍شود و دارای خاصیت ضد باکتری، ضد قارچ، ضد ویروس هرپس، آنتی اکسیدانی و ربایندگی رادیکال های آزاد است (10،19). سدر (Ziziphus spina  christi ) برای تسریع بهبود زخم­های تازه (15) و سوختگی استفاده می شود(1)، هم چنین دارای اثر ضد میکروب است (2). پکتین موجود درگل ختمی (Althaea officinalis)دارای اثر تحریک کنندگی سیستم ایمنی و فعالیت ضد زخم است (28).  این گیاه باعث بهتر شدن فاگوسیتوز و عملکرد ماکروفاژ می­شود، در درمان بیماری­های پوستی از جمله اگزما استفاده می­گردد. حنا (Lawsonia inermis) برای درمان سوختگی و زخم های دهانی به کار برده می شود (3). درمان با عصاره هیدروالکلی گیاه حنا سطوح آنزیم های آنتی اکسیدانی سلولی را افزایش می دهد (9). از خواص درمانی ذکر شده برای این گیاه می توان کمک به بهبودی زخم های عفونی ناشی از باکتری های گرم مثبت را نام برد (18). چنین خواص متفاوت عملکردی در این گیاهان اهمیت قابل ملاحظه ای در ترمیم زخم دارند.

مامیثا یا خشخاش بحری (Glaucium corniculatum curt) یکی از گیاهان جنس گلوسیوم (Glaucium) است که دارای ظاهری بلوط مانند و به رنگ  زرد مایل به سیاه می­باشد، انعطاف پذیری کمی دارد، زود می­شکند و تلخ مزه است، در بلندی­ها می­روید و ریشه­اش بوی بسیار تندی دارد (4). ساقه گلدار گیاه مامیثا دارای موادی نظیر گلوسین، سانگینارین، کلریت رین، پروتوپین، گلوکوپیکرین، مواد رزینی و پکتینی است (26). بعضی از رزین­ها اثر التیام دهنده در برخی از تومورها و زخم­ها را دارند. رزین­های جانشین کننده کاتیون­ها طوری تهیه شده اند که دفع سدیم را از راه مدفوع افزایش می­دهند و برای مبارزه با ادم به کار می­روند (26). اگرچه در طب سنتی از گیاه مامیثا برای درمان التهاب، رماتیسم یا زخم استفاده می­شده است، اما تاکنون تحقیقی بر روی اثر آن بر روند ترمیم زخم پوستی گزارش نشده است. از آن­جا که این گیاه خواص بیولوژیک زیادی از جمله ضدمیکروبی و ضدالتهاب داشته(4، 25)، التهاب ناشی از زخم را بهبود بخشیده به نظر می­رسد که بتواند در روند ترمیم زخم پوستی نیز موثر باشد، امروزه روند استفاده از داروهای گیاهی نسبت به داروهای سنتزی افزایش یافته است (8). بنابراین، در مطالعه حاضر اثر مامیثا بر روند ترمیم زخم پوستی در موش صحرایی نر و مقایسه آن با تاثیر تتراسیکلین و گروه شاهد بررسی شده است.

مواد و روشها

در این مطالعه از 30 راس رت نر همسان با نژاد یکسان، با وزن 50 ± 250 گرم استفاده گردید. رت­ها در 3 گروه 10 تایی به صورت کاملاً تصادفی تقیسم شدند و بر روی آن­ها تاثیر عصاره گیاه مامیثا (شامل برگ­ها، ساقه و گل­ها) و پماد تتراسیکلین (پماد تجاری) در روند ترمیم زخم غیرعفونی مورد بررسی قرار گرفت.  یک گروه به عنوان گروه کنترل انتخاب گردید که پس از ایجاد زخم هیچ گونه درمانی دریافت ننموده­اند. رت­ها در قفس‏های انفرادی، دمای 2± 22 درجه سانتی گراد، سیکل روشنایی، تاریکی 12 ساعته، دسترسی آزادانه به آب و غذا در بخش حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه اصفهان نگه داری شدند. گیاه مورد نظر در مرکز هرباریوم دانشگاه اصفهان تعیین جنس و گونه شد.

ابتدا گیاه مامیثا (جمع آوری شده از دامنه های کوه دنا در نزدیکی شهرستان سمیرم) با آب مقطر به دقت شستشو داده شد تا مواد زائد آن­ جدا گردد، سپس در سایه و دمای 25-20 درجه سانتی گراد خشک شد. جهت عصاره گیری 150 گرم مخلوطی از برگ، ساقه و گل خشک گیاه آسیاب شده و در 600 میلی لیتر الکل 96 درجه به مدت 24 ساعت با دور 150 بر روی شیکر قرار داده شد. بعد از صاف کردن به باقیمانده محلول حاصل 600 میلی لیتر الکل 70 درجه اضافه گردید و به مدت 24 ساعت مجدداً بر روی شیکر با دور 150  قرار گرفت. محلول مرحله 1 و 2 مخلوط شده و توسط دستگاه تقطیر در خلأ تا 3/1 حجم اولیه تغلیظ گردید. سپس به مدت 24 ساعت در داخل آون نگه داری شد. عصاره غلیظ به دست آمده، مجدداً در داخل آون 50 درجه قرار داده شد تا عصاره غلیظ شده خشک شود. عصاره خشک در دمای C°4 نگه داری شد.

برای تهیه پماد، 3 گرم از عصاره گیاه مامیثا تهیه شده در 10 سی سی الکل 70 درجه حل گردید، سپس با 100 گرم اُسرین مخلوط گردید، تا مخلوط حاصل یکنواخت شود.

آماده سازی رت­ها برای جراحی با بیهوشی ازطریق تزریق زایلازین با دوز mg/kg 5 در عضله ران صورت گرفت. برای القای بیهوشی تزریق کتامین با دوز mg/kg 40 طبق ماده قبل، بیهوشی انجام شد. پس از بیهوشی رت­ها، موی پشت آن­ها ما بین دو استخوان کتف تراشیده و با الکل 70 درجه  سطح آن با ابعاد cm1×1 ضد عفونی شد (شکل 1). با تیغ جراحی زخمی که شامل برداشت تمام لایه­های پوستی می­شد، حاصل گردید. عمق زخم شامل درم و هیپودرم بود (16).

شکل1- منطقه زخم ایجاد شده

استعمال پماد 14 روز متوالی بر روی بستر زخم ادامه یافت. در روز هفتم و چهاردهم پس از بیهوشی کامل حیوان از طریق استنشاق کلروفرم در دسیکاتور از زخم هر گروه نمونه برداری شد. مقاطع بافتی در فرمالین 10 درصد به آزمایشگاه فرستاده شدند، پس از رنگ آمیزی به روش هماتوکسیلین – ائوزین با میکروسکوپ  نوری مورد بررسی قرار گرفتند.

آنالیز داده­ها: با استفاده از عدسی مدرج با بزرگنمایی 100، ابعاد  لایه درم و اپیدرم به دست آمده و از نظر آماری تمامی نتایج با استفاده از نرم افزار spss به صورت میانگین و انحراف معیار بیان گردید. پس از مشخص نمودن توزیع داده­ها برای مقایسه نتایج هر متغیر در هر یک از گروه­ها قبل و بعد از بررسی از Anova با اندازه گیری مکرر، برای مقایسه گروه­ها با هم ازAnova   یک طرفه وDuncan   استفاده گردید. سطح معناداری کمتر از  05/0 برای تمامی آنالیزها در نظر گرفته شد.

نتایج

ترمیم درم: پس از 7 روز تیمار با عصاره گیاه مامیثا مشاهده گردید عصاره به صورت معناداری (05/0p<). در مقایسه با گروه شاهد باعث بهبود و ترمیم لایه درم می­شود. گروه کنترل نسبت به پماد تتراسیکلین بهتر عمل نموده است (05/0p<) (شکل 2). پس از 14 روز تیمار، لایه درم در گروه مامیثا نسبت به سایر گروه­ها بهبودی مناسب­تری داشته است. لازم به ذکر است پماد تتراسیکلین نسبت به گروه کنترل بهتر عمل نموده است (05/0p<) (شکل 3).

شکل2- درصد بهبود زخم غیرعفونی در لایه درم پس از 7 روز

شکل3- درصد بهبود زخم غیرعفونی در لایه درم پس از 14 روز

ترمیم اپیدرم: پس از 7 روز تیمار مشاهده گردید که این گیاه به صورت معناداری (05/0p<). در مقایسه با کنترل باعث بهبود در لایه اپیدرم می­شود، گروه کنترل نسبت به پماد تتراسیکلین روند بهتری را نشان می دهد (05/0p<) (شکل 4). پس از 14 روز تیمار، لایه اپیدرم تمام گروه­ها تقریبا ترمیم شده است.

کنترل: در بررسی میکروسکوپی پس از 7 روز، سلول­های التهابی حاد دیده می­شوند و بافت هم­بندی تا سطح زخم کشیده شده و پس از 14 روز، اپیدرم ترمیم و داخل درم بافت ترمیمی وجود دارد  (شکل 5).

مامیثا: پس از 7 روز تیمار، سلول­های التهابی و بافت هم­بندی جدید تا عمق درم و چربی هیپودرم نفوذ کرده است. در حالی که پس از 14 روز تیمار، اپیدرم ترمیم، بافت هم­بندی تشکیل و هیپودرم بصورت کامل ترمیم شده و در دو طرف ضمائم درم تشکیل شده است (شکل 6).

تتراسیکلین: پس از گذشت 7 روز تیمار توسط تتراسیکلین، گپ و کراست در نمونه دیده می­شود و پس از گذشت 14 روز ، اپیدرم تشکیل شده است و بافت هم­بندی تا عمق درم وجود دارد، ضمائم درم به صورت ناقص در یک سوم طول زخم ایجاد شده است (شکل 7).

شکل 4- درصد بهبود زخم غیرعفونی در لایه اپیدرم پس از 7 روز

شکل 5- تصویر میکروسکوپی زخم غیرعفونی گروه کنترل پس از 14 روز  با رنگ آمیزی  H&E و بزرگنمایی 40 .

شکل 7- تصویر میکروسکوپی زخم غیرعفونی گروه تیمار شده با پماد تتراسیکلین پس از 14 روز با رنگ آمیزی H&E و بزرگنمایی 40.