تجمع رزمارینیک اسید و بیان ژن آنزیم تیروزین آمینوترانسفراز در گیاهچه­های بادرنجبویه (Melissa officinalis) تیمار شده با نانو ذره اکسید مس 

علی ریاحی مدوار^1*، معین الدین نصیری بزنجانی¹، فاطمه رضائی² و امین باقی­زاده¹

¹ کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی.

² مشهد، دانشگاه فردوسی، دانشکده علوم، گروه فیزیولوژی گیاهی

تاریخ دریافت: 8/7/95                  تاریخ پذیرش: 21/9/95

چکیده

رزمارینیک اسید یک ترکیب با ارزش دارویی است و در گیاهان از طریق مسیر بیوسنتز فنیل پروپانوئیدی تولید می­شود. در این تحقیق، محتوی رزمارینیک اسید، فلاونوئید کل و همچنین بیان ژن آنزیم تیروزین آمینوترانسفراز (TAT) در گیاهچه­های 30 روزه بادرنجبویه تیمار شده به مدت 8 ساعت با غلظتهای مختلف نانوذره اکسید مس (0، 50، 200، 500، 1000 و 2000 میلی­گرم بر لیتر) مورد آنالیز قرار گرفت. محتوی رزمارینیک اسید گیاهچه­های تیمار شده در تمامی غلظتها به صورت معنی­داری نسبت به نمونه شاهد افزایش یافت. بیشترین محتوی این ماده مؤثره در تیمار گیاهچه­ها با پایین­ترین غلظت نانوذره مشاهده شد و با افزایش غلظت نانوذره در محیط محتوی آن کاهش یافت. جالب توجه اینکه، بیان ژن آنزیم TAT نیز الگویی مشابه با محتوی رزمارینیک اسید نشان داد. محتوی فلاونوئید کل گیاهچه­های تیمار شده نیز به صورت گرادیان تا غلظت 1000 میلی­گرم بر لیتر افزایش یافت و در بالاترین غلظت به صورت معنی­داری نسبت به غلظت 1000 میلی­گرم بر لیتر کاهش یافت. بر اساس نتایج به دست آمده، چنین به نظر می­رسد که این نانوذره با تأثیر بر بیان ژنهای درگیر در بیوسنتز ترکیبات فنلی محتوی فلاونوئید و رزمارینیک اسید را تحت تأثیر قرارداده است. 

واژه های کلیدی: بادرنجبویه، رزمارینیک اسید، نانو ذرات اکسید مس، فلاونوئید.

* نویسنده مسئول، تلفن: 03433776611، پست الکترونیکی: riahi.ali@gmail.com

مقدمه

گیاه بادرنجبویه (Melissa officinalis) از رده دو لپه­ایها، راسته لب گلیها، خانواده نعنائیان (Lamiaceae) و جنس بادرنجبویه­ها است و دارای دو گونه M. officinalis و
M. romana می­باشد. این گیاه دارویی پراکنش وسیعی از غرب اروپا (4) تا نواحی غربی و مرکزی ایران را دارد (2).

امروزه از اسانس این گیاه به وفور در زمینه های مختلفی از قبیل پزشکی، غذایی، عطرسازی و آرایشی استفاده می‎شود (1). این گیاه دارای خواص ضد توموری (30)، ضد باکتریایی و ضد ویروسی (8، 10 و 28) است. بادرنجبویه به دلیل داشتن ترکیبات فنلی نظیر رزمارینیک اسید و کافئیک اسید، 10 برابر ویتامین A و E خواص آنتی­اکسیدانی دارد (17). بیشتر خواص درمانی این گیاه را به ماده مؤثره آن یعنی رزمارینیک اسید نسبت می­دهند (29).

رزمارینیک اسید، یک استر از کافئیک اسید و 3، 4-دی­هیدروفنیل لاکتیک اسید است که در گیاهان از طریق مسیر بیوسنتزی فنیل پروپانوئیدی تولید می­شود (30). اسید آمینه های تیروزین و فنیل آلانین، سوبستراهای این مسیر بیوسنتزی بوده و آنزیمهای تیروزین آمینوترانسفراز (TAT) و فنیل آلانین آمینو لیاز (PAL) آنزیمهای اصلی کاتالیز کننده این مسیر می­باشند (شکل 1) (30). نتایج منتشر شده توسط یان و همکاران (2006) نشان داد که تجمع رزمارینیک اسید در گیاه مریم گلی (Salvia miltiorrhiza) تحت تیمار با عصاره مخمر افزایش یافت. آنها گزارش کردند که تحت این تیمار فعالیت آنزیم تیروزین آمینوترانسفراز افزایش یافته، درحالی که فعالیت آنزیم PAL  تغییر نکرده بود. آنها افزایش در فعالیت آنزیم TAT را دلیل افزایش بیوسنتز رزمارینیک اسید دانستند و آن را آنزیم کلیدی در مسیر بیوسنتز رزمارینیک اسید معرفی نمودند (37).

به دلیل اهمیت دارویی و کاربردهای صنعتی رزمارینیک اسید، تا­کنون تولید آن در گونه­های گیاهی مختلفی از قبیل Melissa officinalis، Orthosiphon aristatus، Salvia miltiorrhiza و Coleus blumei تحت تأثیر الیسیتورهای زیستی و غیر زیستی مورد بررسی قرار گرفته است (14، 21، 22، 26 و 37).

شکل 1- شمای کلی مسیرهای بیوسنتزی رزمارینیک اسید از سوبستراهای تیروزین و فنیل آلانین (30).

اهمیت فلاونوئیدها در مقاومت به تنشهای گوناگونی از قبیل گرما، سرما، خشکی، اشعه ماوراء بنفش و فلزات سنگین به اثبات رسیده است (34). این متابولیتها خاصیت آنتی­اکسیدانی دارند و ثابت شده است که میزان تولید آنها و همچنین بیان ژن مرتبط با سنتز آنها در شرایط اعمال تنش افزایش می­یابد (18 و 35).

علم نانوتکنولوژی به بررسی ساختار و عملکرد مواد و ترکیباتی می­پردازد که حداقل یکی از ابعاد عملکردی آنها بین 1 تا 100 نانومتر باشد (12). با کاهش ابعاد ذرات، ویژگیهای فیزیکی، شیمیایی و الکتریکی آنها در مقایسه با حالت حجیم تغییر می­کند (27). این مواد در صنایع مختلف از قبیل صنایع غذایی، میکروالکترونیک، نساجی، ساختمان سازی، پزشکی و کشاورزی کاربردهای بسیار زیادی دارند (13، 16، 23 و 36). گزارشات متعددی تأثیر منفی و مثبت این ذرات بر گیاهان را گزارش نموده­اند (11، 15، 20، 21، 32 و 38). اخیراً مطالعات انجام شده توسط Aminizadeh و همکاران (2016) نشان داد که محتوی سولفارافان در گیاهچه­های Lepidium draba تحت تیمار با نانوذرات اکسید مس و آهن تحت تأثیر قرار گرفته است (9). علاوه بر آن تأثیر مثبت نانوذره نقره بر تولید مواد مؤثره در گیاه Artemisia annua و Calendula officinalis ثابت شده است (15 و 39). همچنین افزایش محتوی ترکیبات فنلی و رزمارینیک اسید در گیاه اسطوخودوس (Lavandua angostifloria) تحت تیمار با نانوذرات نقره گزارش شده است (6).

در این تحقیق، میزان تجمع رزمارینیک اسید، فلاونوئید کل و همچنین بیان ژن TAT در گیاهچه­های 30 روزه بادرنجبویه که به مدت 8 ساعت با غلظتهای مختلف نانو ذرات اکسید مس تیمار شده بود موردآنالیز قرار گرفت.

مواد و روشها

کشت گیاه: در این تحقیق، از بذرهای نسل اول گیاه بادرنجبویه (تهیه شده از شرکت پاکان بذر اصفهان) برای کشت استفاده شد. جهت ضد عفونی­ بذرها از هیپوکلریت سدیم 2 درصد به مدت 10 دقیقه و اتانول 70 درصد به مدت 2 دقیقه با سه مرحله آبکشی با آّب مقطر استریل بین مراحل استفاده شد. تعداد 30 عدد بذر ضدعفونی شده درون پتری دیش (با قطر 9 سانتیمتر) بر روی محیط کشت موراشینگ-اسکوگ (MS) (Murashige and Skoog 1962) (24) حاوی آگار 8/0 درصد کشت داده شدند. پتری دیشهای در انکوباتور در دمای 2± 28 درجه سانتی گراد، رطوبت نسبی 5 ± 55 درصد و تاریکی مطلق قرار گرفتند. بعد از جوانه زنی بذر­ها (روز پانزدهم)، پلیتها به مدت پانزده روز به داخل گلخانه با دمای 2±25، رطوبت نسبی 5 ± 55 درصد و سیکل نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی منتقل شدند. گیاهچه­ها برای بررسی اثر نانوذرات بر محتوی رزمارینیک اسید، فلاونوئید کل و بیان ژن TAT تیمار شدند.

تیمار کردن گیاهچه­ها: غلظتهای مختلف (صفر (به عنوان شاهد)، 50، 200، 500، 1000 و 2000 میلی­گرم بر لیتر) نانواکسید مس (میانگین اندازه60 نانومتر، درصد خلوص 98 درصد تهیه شده از شرکت NaBond Technology) به طور جداگانه توزین و به 100 میلی­لیتر محلول هوگلند در ارلن شیشه­ای (250 میلی­لیتری) اضافه شدند. گیاهان پس از جمع­آوری از روی محیط پس از چندین بار آبکشی، به مدت 8 ساعت در ارلنها در معرض نانوذره قرار گرفتند. برای ایجاد محیطی یکنواخت از لحاظ تیمار و هوادهی لازم، ارلنها در دمای آزمایشگاه بر روی شیکر با دور rpm 120 قرار گرفتند (26).

بعد از گذشت زمان مورد نظر، گیاهچه­ها از محیط جمع­آوری و بعد از چندین بار شستشو با آب مقطر استریل به دو قسمت تقسیم شدند. نیمی از گیاهچه­ها (بافت کامل گیاهچه) به منظور بررسی محتوی رزمارینیک اسید در سایه و در هوای آزاد خشک شدند و نیمی دیگر به منظور سنجش محتوی فلاونوئید کل و بررسی بیان ژن TAT بلافاصله در ازت مایع منجمد و به فریزر 80- منتقل گردیدند (26).

سنجش مقدار رزمارینیک اسید: مقدار رزمارینیک اسید با استفاده از روش نصیری بزنجانی و همکارن (2014) اندازه­گیری شد (26). به این منظور، مقدار 100 میلی­گرم از بافت خشک گیاهچه­های تیمار شده و شاهد آسیاب و 10 میلی­لیتر اتانول 30 درصد به آن اضافه گردید. این مخلوط توسط دستگاه سونیکاتور (با استفاده از امواج فرا صوت) به مدت 15 دقیقه سونیکیت شد تا گیاه به اندازه کافی متلاشی و عصاره آن خارج گردد، سپس محلول حاصل به مدت 20 دقیقه با دور rpm 4000 در دمای اتاق سانتریفیوژ گردید. محلول رویی با آب مقطر به حجم 20 میلی­لیتر رسانده و به وسیله فیلتر سرنگی 2/0 میکرومتری صاف گردید. جهت تفکیک نمونه­ها از کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا (HPLC) (Agilent 1100, USA) استفاده شد. فاز جامد شامل ستون ZORBAX SB-C18(5 µm) و فاز مایع، شامل یک سیستم حلال دو فازی؛ حلالA  (شامل آب و ارتوفسفریک 1 درصد) و حلال B (متانول و ارتوفسفریک 1 درصد) به نسبت 4/0 و 6/0 بود.

از جذب 330 نانومتر جهت شناسایی رزمارینیک اسید و همچنین از استاندارد رزمارینیک اسید (تهیه شده از شرکت  سیگما) برای تعیین زمان نگهداری نمونه در ستون و مقدار رزمارینیک اسید تولید شده استفاده گردید. مقدار رزمارینیک اسید بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن خشک گزارش گردید.

اندازه­گیری محتوی فلاونوئید: محتوی فلاونوئید کل گیاهچه­های بر اساس روش کریزک و همکاران  اندازه­گیری شد (19). به این منظور، مقدار 2/0 گرم از بافت­تر (فریز شده) در 10 میلی لیتر اتانول اسیدی ( شامل الکل اتیلیک 95 درصد و اسید استیک گلایسال به نسبت 99:1) ساییده شد و سپس به مدت 20 دقیقه با دورrpm  10000 در دمای 25 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ گردید. محلول رویی به مدت 10 دقیقه در بن ماری با دمای 80 درجه سانتی گراد قرار گرفت. جذب نمونه­ها در طول موجهای 270، 300 و 330 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Varian, cary 50Australia) اندازه­گیری شد. با استفاده از فرمول CLƐA= (A، میزان جذب؛ Ɛ، ضریب خاموشی؛ C، غلظت و L، طول مسیر نور) و ضریب خاموشی cm^-1mM^-13300، محتوی فلاونوئید کل محاسبه و محتوی آن بر حسب µM/g FW گزارش گردید.

آنالیز مولکولی: استخراج RNA کل، سنتز cDNA و تکثیر ژن:

به منظور بررسی بیان ژن آنزیمTAT، استخراج RNA کل از گیاهچه­های فریز شده با استفاده از کیت RNX-Plus (شرکت سینا ژن، شماره کاتالوگ: RN7713C) و مطابق روش انجام شده توسط یوسفی و همکاران انجام شد (7). برای این منظور، mg500 از بافت فریز شده، در حضور نیتروژن مایع ساییده و به میکروتیوب استریل منتقل شد. سپسµL500 از محلول RNX-Plus به آن افزوده و مخلوط کاملاً همگن گردید. مخلوط مذکور به مدت یک ساعت بر روی یخ انکوبه شد، سپس Lµ200 کلروفرم به آن اضافه و به شدت تکان داده­شد. پس از 5 دقیقه انکوباسیون بر روی یخ، به مدت 15 دقیقه با دور rpm 12000 در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ گردید. سپس محلول رو­شناور بی­رنگ به میکروتیوب جدید منتقل و هم حجم آن ایزوپروپانول اضافه گردید و به آرامی تکان داده شد. پس از­گذشت­ 15 دقیقه انکوباسیون روی یخ، مطابق برنامه قبل سانتریفیوژ انجام شد. در ادامه، فاز رویی حذف گردید و به رسوب سفید رنگ مقدار یک میلی­لیتراتانول 75 درصد افزوده و این­بار به مدت 8 دقیقه با دور rpm  7500 در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ انجام شد. فاز رویی دور ریخته شد و رسوب در دمای اتاق انکوبه گردید تا خشک شود. در نهایت به رسوب،L µ30 آب تیمار شده با DEPC 1/0 درصد اضافه گردید و تا زمان استفاده به فریزر 80- درجه سانتی گراد انتقال یافت. لازم به ذکر است که کلیه مراحل کار در شرایط RNase free و برروی یخ انجام گرفت. در نهایت کیفیت RNA تخلص شده بر روی ژل آگارز یک درصد بررسی شد. در ادامه، از RNA استخراج شده کتابخانه cDNA ساخته شد.

به منظور ساخت cDNA، 2 میکروگرم از  RNAکل به تیوبهای 2/0 اضافه شد (کلیه مراحل ساخت cDNA روی یخ انجام شد). در ادامه، پس از اضافه نمودن 2 میکرولیتر پرایمر الیگو dT به تیوپها به مدت 10 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد انکوبه گردید. سپس یک میکرولیتر آنزیم (200U) DNA پلی­مراز وابسته به RNA (RNA Dependent DNA Polymerase, RT) (MMuLV از شرکت فرمنتاز)، مقدار 5/2 میکرولیتر بافر رونوشت RT (10X)، 75/0 میکرولیتر dNTP، 75/0 میکرولیتر RNase inhibitor، و در نهایت آب دیونیزه استریل (RNase free) تا حجم نهایی 25 میکرولیتر به تیوپها اضافه شد. واکنش ساخت cDNA به مدت 80 دقیقه در دمای 42 درجه سانتی گراد انجام شد. در انتهای واکنش به منظور حذف آنزیمRT، تیوبها به مدت 10 دقیقه در دمای 70 درجه سانتی گراد قرار گرفت. همچنین به منظور حذف آلودگیهای اضافی RNA از آنزیم RNase A (1 میکرولیتر، 20 دقیقه در دمای 38 درجه سانتی گراد) استفاده شد. تکثیر TAT و GPDH (به عنوان کنترل داخلی) با استفاده از کتابخانه cDNAو آنزیم DNA Taq پلیمراز در حضور پرایمرهای اختصاصی که توالی آنها در جدول 1 آمده است انجام شد. واکنش تکثیر این ژنها در جدول 2 نشان داده شده است.

به منظور بررسی میزان بیان ژن TAT تحت شرایط تیمار، از روش نیمه کمی RT-PCR استفاده شد. به این منظور، مقدار مساوی (4 میکرولیتر) از محصول PCR هر کدام از ژنها (TAT و GPDH) بر روی ژل آگارز 1 درصد بارگذاری شد و پس از تفکیک و رنگ آمیزی ژلها با اتیدیوم بروماید، از ژلها وسیله دستگاه ژل داک عکسبرداری شد. میزان بیان با استفاده از نرم افزار Gene tools و از روی شدت باند تکثیر شده ژن TAT پس از نرمالیز کردن با ژن GPDH ارزیابی شد (6 و 25). نتایج به صورت درصد بیان ژن در نمونه شاهد گزارش گردید.

جدول 1- پرایمرهای مربوط به تکثیر ژن آنزیم تیروزین آمینو ترانسفراز و کنترل داخلی (GPDH). 

٭توالی مربوط به پرایمر پیشرو (F) و معکوس (R) ژن تیروزین آمینو ترانسفراز (TAT) بر اساس توالی این ژن در گیاه بادرنجبویه با شماره دستیابی JN863949  و برای ژن GPDH بر اساس توالی این ژن در گیاه Arabidopsis thaliana با شماره دستیابی NM_127989.4 ثبت شده درGene Bank طراحی شدند و توسط شرکتMWG  ساخته شدند.

جدول 2- شرایط تکثیر برای ژنهای TAT و GPDH

آنالیز آماری: کشت گیاه با سه تکرار مستقل و در قالب یک طرح کاملاً تصادفی انجام شد. میانگین داده­ها حاصل از سه تکرار مستقل با استفاده از نرم افزار SAS توسط آزمون دانکن (Duncan test) و با در نظر گرفتن سطح اطمینان 05/0  P ≤، مورد تجزیه واریانس یک عاملی (One way ANOVA) قرار گرفتند. معنی­دار بودن نتایج با حروف بر روی هر ستون مشخص گردید. حروف متفاوت بیانگر معنی­داری در سطح 5 درصد می­باشد، حروف مشابه و مشترک بیانگر عدم معنی­دار بودن نتایج در سطح 5 درصد می­باشد.

نتایج

محتوی رزمارینیک اسید: زمان نگهداری رزمارینیک اسید در ستون و همچنین تعیین غلظت آن با استفاده از تزریق غلظتهای مشخصی از نمونه استاندارد به ستون به دست آمد (نتایج نشان داده نشد).

همان طور که در شکل 2 مشاهده می­شود، تولید رزمارینیک اسید در گیاهچه­های تیمار شده با تمامی غلظتهای نانو ذره به طور معنی­داری نسبت به نمونه شاهد افزایش یافت. بیشترین مقداررزمارینیک اسید در پایین­ترین غلظت نانوذره (50 میلی­گرم بر لیتر) تولید شد ولی با افزایش غلظت نانوذره در محیط، محتوی آن به طور معنی­داری نسبت به غلظت 50 میلی­گرم بر لیتر کاهش یافت.

شکل 2- تأثیر غلظتهای مختلف نانو ذرات اکسید مس بر تجمع رزمارینیک اسید در گیاهچه­های بادرنجبویه پس از 8 ساعت تیمار. آزمایش با 3 تکرار مستقل انجام شد. حروف متفاوت بالای نمودارها نشان دهنده معنی­دار بودن نتایج در سطح 5 درصد است.

محتوی فلاونوئید کل: در گیاهچه­های بادرنجبویه تیمار شده با نانو ذرات اکسید مس، محتوی فلاونوئید کل در مقایسه با نمونه شاهد افزایش معنی­داری را نشان ­داد (شکل 3). همان طور که در شکل قابل مشاهده می­باشد، افزایش محتوی فلاونوئیدها تا غلظت 1000 میلی­گرم بر لیتر به طور گرادیان و هماهنگ با افزایش غلظت نانوذره در محیط افزایش یافت. اما محتوی آن در تیمار با غلظت 2000 میلی­گرم بر لیتر نسبت به غلظت 1000 میلی­گرم بر لیتر به طور معنی­داری کاهش  نشان داد.

شکل 3- اثر غلظتهای مختلف نانو ذرات اکسید مس بر محتوی فلاونوئید کل در گیاهچه­های بادرنجبویه پس از 8 ساعت تیمار. آزمایش با 3 تکرار مستقل انجام شد. حروف متفاوت بالای نمودارها نشان دهنده معنی­دار بودن نتایج در سطح 5 درصد است.

آنالیز نیمه کمی بیان ژن TAT: کیفیت RNA استخراج شده با تفکیک باندهای rRNA بر روی ژل آگارز یک درصد بررسی شد. دو باند مربوط به S rRNA28 و S18 مشخص کننده کیفیت مناسب  RNAتخلیص شده و دست نخورده بودن آن  می­باشد (نتایج نشان داده نشد).

مطابق شکل 4 قطعه تکثیر شده برای ژن TAT باندی معادل bp 177 وبرای ژن GPDH باندی معادل bp200 بر روی ژل مشاهده شد.

شکل4- نمونه­ای از تصویر ژل آگارز مربوط به تکثیر ژن TATو GADPH در گیاهچه­های تیمار شده با غلظتهای مختلف نانو ذرات اکسید مس. قطعه تکثیر شده از ژن TAT، باندی معادل bp 177 و برای ژن GPDH باندی تقریباً معادل bp200 روی ژل در کنار باند مربوط به مارکر وزن مولکولی ظاهر گردید. MW بیانگر مارکر وزن مولکولی و شماره­های 1 تا 6 به ترتیب مربوط به تیمارهای صفر، 50، 200، 500، 1000 و 2000 میلی­گرم بر لیتر می­باشند.