Document Type : Research Paper
Authors
1 Imam Khomeini International University (IKIU)
2 Imam Khomeimi International University
3 Imam Khmeini International University (IKIU)
Abstract
Glucose oxidase (β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase) catalyzes the oxidation of β-D-glucose to gluconic acid, by utilizing molecular oxygen as an electron acceptor with simultaneous production of hydrogen peroxide. Glucose oxidase has been purified from a range of different fungal sources, mainly from the genus Aspergillus and Penicillium and has wide applications in chemical, pharmaceutical, food, biotechnology and other industries. In this study, a glucose oxidase (GOX)-encoding gene was isolated from Penicillium funiculosum by polymerase chain reaction (PCR) technique and then was cloned into a pUC19 plasmid. Consequently, molecular structure, biochemical and phylogenetic characteristics were analyzed. Nucleotide sequence of the gene, called PfGOX, revealed 1818 bp long, encoding a protein of 605 amino acid residues. The calculated molecular mass and the predicted isoelectric point of the deduced polypeptide were 65.79 kDa and 4.50, respectively. Analysis of secondary and three dimensional structures of the deduced polypeptide sequence for PfGOX was shown that PfGOX is similar to those of previously reported glucose oxidase proteins from other fungi. The deduced protein sequence was indicated a high similarity to glucose oxidases isolated from fungi such as Penicillium amagasakiense, Talaromyces flavus, Talaromyces stipitatus, and Talaromyces variabilis. Phylogenetic study was also demonstrated that PfGOX gene belongs to the subgroup IA of fungous glucose oxidases
Keywords
همسانه سازی، شناسایی و جداسازی یک ژن گلوکز اکسیداز (GOX) از قارچ Penicillium funiculosum
زهرا اسماعیل پور، قاسمعلی گروسی*، رحیم حداد و رضا حیدری جاپلقی
قزوین، دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره)، دانشکده فنی – مهندسی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی
تاریخ دریافت: 9/6/91 تاریخ پذیرش: 23/1/93
چکیده
گلوکز اکسیداز (β-D-گلوکز:اکسیژن 1-اکسیدوردوکتاز) با استفاده از اکسیژن مولکولی به عنوان پذیرنده الکترون، اکسیداسیون β-D-گلوکز را به گلوکونیک اسید کاتالیز نموده و منجر به تولید پراکسید هیدروژن میشود. این آنزیم در دامنه وسیعی از قارچهای مختلف، عمدتاً جنسهای Aspergillus و Penicillium تولید شده و کاربردهای وسیعی در صنایع مختلف از قبیل شیمی، داروسازی، صنایع غذایی، بیوتکنولوژی و غیره دارد. در این مطالعه، ژن کدکننده گلوکز اکسیداز از قارچ Penicillium funiculosum با استفاده از تکنیک واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) جداسازی و در ناقل pUC19 همسانهسازی شده و ساختار مولکولی، ویژگیهای بیوشیمیایی و فیلوژنتیکی آن مورد بررسی قرار گرفت. توالی نوکلئوتیدی این ژن، تحت عنوان PfGOX، به طول bp1818 بوده و یک پروتئین با 605 آمینواسید را رمز می کند. وزن مولکولی محاسبه شده و نقطه ایزوالکتریک پیشبینی شده این پروتئین به ترتیب برابر 78/65 کیلو دالتون و 05/5 میباشد. بررسی ساختارهای دوم و سوم توالی پروتئینی PfGOX نشان داد که این پروتئین از نظر ساختاری مشابه با توالیهای گلوکز اکسیداز گزارش شده از قارچهای دیگر میباشد. توالی پروتئینی به دست آمده شباهت زیادی را با توالیهای گلوکز اکسیداز سایر قارچها از قبیل Penicillium amagasakiense، Talaromyces flavus، Talaromyces stipitatus و Talaromyces variabilis نشان داد. بررسی فیلوژنتیکی نیز مشخص کرد که این ژن به زیرگروه IA گلوکز اکسیدازهای قارچی تعلق دارد.
واژه های کلیدی: همسانهسازی، گلوکز اکسیداز، قارچ، Penicillium funiculosum، ساختار سهبعدی.
* نویسنده مسئول، تلفن: :8371159-0281، پست الکترونیکی: ga.garoosi@ikiu.ac.ir
مقدمه
گلوکز اکسیداز (β-D-گلوکز:اکسیژن 1-اکسیدوردوکتاز، EC 1.1.2.3.4) فلاووپروتئینی با وزن مولکولی 175-130 کیلودالتون است که با استفاده از اکسیژن مولکولی به عنوان پذیرنده الکترون، اکسیداسیون β-D-گلوکز را به گلوکونیک اسید کاتالیز نموده و منجر به تولید پراکسید هیدروژن (H2O2) میشود (4). این آنزیم در دامنه وسیعی از قارچهای مختلف، عمدتاً جنسهای Aspergillus و Penicillium تولید شده (7 و 12) و به دلیل کاربردهای وسیع در صنایع مختلف از قبیل شیمی، داروسازی، صنایع غذایی، بیوتکنولوژی و غیره، به تازگی توجه زیادی را به خود جلب نموده است (4 و 31). یکی از کاربردهای مهم آنزیم گلوکز اکسیداز در بخش بیوتکنولوژی کشاورزی، تولید گیاهان مقاوم در برابر عوامل بیماریزای قارچی و باکتریایی است (9، 20 و 32). گیاهان در برابر حمله عوامل بیماریزا، با فعالسازی تعدادی از پاسخهای دفاعی از قبیل تقویت دیواره سلولی، سنتز فیتوالکسینها (Phytoalexin) و فعالسازی برخی آنزیمهای هیدرولیتیک مانند کیتیناز و گلوکاناز، از خود محافظت میکنند (1،2، 3 و 21). با این وجود، تولید گونههای اکسیژن فعال (Reactive Oxygen Species, ROS) به ویژه پراکسید هیدروژن، جزء اولین پاسخهای دفاعی سلولهای گیاهی در برابر حمله عوامل بیماریزای قارچی و باکتریایی است، به طوری که آنها به عنوان یک مولکول هشدار دهنده ثانویه عمل کرده و آنزیمهای درگیر در استحکام دیواره سلولی و ساخت فیتوالکسینها را فعال میسازند (32). بنابراین تولید پراکسید هیدروژن دستورزی شده با استفاده از یک ژن قارچی در گیاهان میتواند روش مفیدی در جهت افزایش مقاومت گیاهان در برابر عوامل بیماریزای قارچی و باکتریایی باشد (15).
آنزیم گلوکز اکسیداز ابتدا توسط Muler (1928) از قارچ niger Aspergillus جداسازی (22) و اندک زمانی پس از آن مشخص شد که توسط باکتریها و قارچهای متعددی تولید میشود. همسانهسازی و تعیین توالی DNA ژن گلوکز اکسیداز قارچ A. niger NRRL-3، اولین بار توسط Kriechbaum و همکاران (1989) انجام شده (17) و ساختار آن توسط Wholfahrt و همکاران (1999) تعیین گردید (29). مقایسه mRNA و DNA ژن گلوکز اکسیداز نشان داد که هیچ اینترونی در توالی نوکلئوتیدی ژن کدکننده گلوکز اکسیداز قارچ A. niger وجود ندارد (17). این موضوع در مورد توالی نوکلئوتیدی ژن گلوکز اکسیداز قارچ Penicillium variable (25)، Talaromyces flavus (23) و P. amagasakiense (18) نیز ثابت شد. اولین بار Fravel و همکاران (1991) و سپس Wu و همکاران (1995) اظهار داشتند که بیان ژن گلوکز اکسیداز در گیاهان میتواند مقاومت به آلودگی باکتریایی را فراهم کرده و در مهندسی ژنتیک گیاهی کاربرد داشته باشد (9 و 32)، به طوری که با افزایش ناگهانی H2O2 تحت یک پروموتور القایی، مرگ سلول و واکنش فوق حساسیت را ایجاد نموده و در نتیجه گیاه در برابر بیماری بادزدگی سیب زمینی مقاوم میگردد (20).
با توجه به نقش این آنزیم در ایجاد مقاومت به عوامل بیماریزای قارچی و باکتریایی در گیاهان، جداسازی و همسانهسازی ژن عامل آنزیم گلوکز اکسیداز (GOX) برای اولین بار از قارچ پنی سیلیوم بومی ایران (Penicillium funiculosum PTCC 5301) انجام گردید تا زمینه و مقدمات لازم برای تولید گیاهان تراریخت متحمل فراهم گردد. همچنین، خصوصیات بیوشیمیایی و ساختارهای دوبعدی و سهبعدی توالی پروتئینی به دست آمده با استفاده از نرمافزارهای بیوانفورماتیکی پیشبینی شده و با استفاده از بررسیهای همولوژی و فیلوژنتیکی با ژنهای گلوکز اکسیداز سایر قارچها نشان داده که ژن همسانه شده به زیرگروه IA تعلق دارد.
مواد و روشها
کشت قارچ و استخراج DNA ژنومی: قارچ
P. funiculosum با شماره دسترسی PTCC 5301 از سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران خریداری و روی محیط کشت PDA (Potato Dextrose Agar) کشت داده شد. محیط کشت PDA به صورت آماده از شرکت پروتون شیمی، ایران تهیه و نمونههای قارچی به مدت 7 روز در دمای 22 درجه سانتی گراد کشت داده شدند و هر ماه واکشت گردیدند. سپس DNA ژنومی قارچ با استفاده از روش Cubero و همکاران (1999) استخراج گردید (6).
طراحی آغازگرها و واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR): تکثیر ژن PfGOX با استفاده از آنزیم Pfu (Fermentas) و آغازگرهای اولیگونوکلئوتیدی طراحی شده بر اساس توالی نوکلئوتیدی ژن گلوکز اکسیداز از قارچهای P. adametzii و P. amagasakiense (موجود در پایگاه NCBI GenBank با شمارههای دستیابی EF137913 و AF012277) با استفاده از نرمافزار Oligo نسخه 7 انجام شد (26). آغازگرهای اختصاصی شامل سه نوکلئوتید اضافی و جایگاه شناسایی آنزیم برشی SacI در انتهای ′5 بودند که توسط شرکت Metabion آلمان سنتز شدند. مخلوط واکنش در حجم نهایی µl 50 حاوی (8.8 pH) mM Tris-HCl 20، mM (NH4)2SO4 10، mM KCl 10، mM MgSO4 2، Triton X-100 0.1%، mg/ml BSA 0.1، µM 500 از هر dNTP، pM 50 از هر آغازگر (رفت و برگشت)، ng 100 DNA الگو و 1.25 واحد از آنزیم Pfu DNA polymerase مورد استفاده قرار گرفت. واکنش PCR با استفاده از یک دستگاه ترموسایکلر (Techne-TC512، انگلستان) قابل برنامهریزی در 35 چرخه دمایی انجام شد که شرایط دمایی و زمانی هر چرخه شامل: مرحله واسرشتگی در دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، مرحله اتصال در دمای 50 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه و مرحله تکثیر در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت دو دقیقه بود. همچنین مرحله واسرشتگی اولیه در دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه و مرحله تکثیر نهایی در دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه انجام گرفت. آغازگرهای اختصاصی مورد استفاده شامل آغازگر رفت با توالی 5'-ATAGAGCTCATGGTGTCTGTATTTCTC-3' و آغازگر برگشت با توالی 5'-ATAGAGCTCCTAGGCACTTTTGGCATAG-3' بود.
همسانه سازی و توالییابی DNA ژنومی PfGOX : پس از خالصسازی محصول PCR با اندازه مورد نظر از روی ژل با استفاده از کیت استخراج اسید نوکلئیک (GF-1 PCR Clean Up Kit-Vivantis)، ژن مورد نظر و ناقل پلاسمیدی pUC19 (Fermentas) توسط آنزیم برشی SacI (Fermentas) تیمار گردیده و مجدداً خالصسازی شدند. سپس واکنش اتصال با استفاده از آنزیم DNA لیگاز T4 (Fermentas) انجام گرفته و محلول اتصال به روش شوک حرارتی به سلولهای مستعد اشریشیاکلی (Escherichia coli) سویه DH5α، انتقال داده شد (27). با انجام آزمون سفید- آبی، تعدادی کلونی به عنوان کلونیهای نوترکیب انتخاب شده و پلاسمیدهای نوترکیب با روش تحلیل قلیایی با SDS استخراج گردیده و با استفاده از دو تکنیک PCR و برش آنزیمی مورد بررسی دقیقتر قرار گرفتند (27). توالییابی DNA پلاسمید نوترکیب با استفاده از آغازگرهای راهانداز باکتریوفاژ T7 در دو جهت رفت و برگشت توسط شرکت Seqlab آلمان، انجام شد.
بررسی توالی و پیشبینی ساختارهای دوم و سوم پروتئین به دست آمده از PfGOX : توالی نوکلئوتیدی حاصل از توالییابی با استفاده از برنامه Translate (http://www.expasy.ch/tools/dna.html) مورد ترجمه قرار گرفته و خصوصیات بیوشیمیایی توالی آمینواسیدی به دست آمده، شامل شاخصهای آلیفاتیک، آبگریزی و ناپایداری با استفاده از برنامههای ProtParam (11)، ProtScale (http://arbl.cvmbs.colostate.edu/molkit/hydropathy/index.html) و TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk /services/) مورد بررسی قرار گرفت. همچنین پیشبینی موقعیت زیرسلولی ژن PfGOX با استفاده از برنامه YLOC (5) انجام گرفت. ساختار دوم توالی پروتئینی PfGOX با استفاده از برنامه SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/) تعیین گردیده و ساختار سوم توسط برنامه I-TASSER (33) مورد پیشبینی قرار گرفت.
بررسی فیلوژنتیکی: توالی آمینواسیدی به دست آمده به منظور یافتن پروتئینهای مشابه در بانکهای اطلاعاتی با استفاده از الگوریتم BLASTp در مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی (NCBI) مورد جستجو قرار گرفته و تعدادی توالی پروتئینی از منابع مختلف که بیشترین شباهت را با توالی مورد نظر داشتند، انتخاب شدند. همردیفسازی چندگانه توالی پروتئینی PfGOX و توالیهای به دست آمده به منظور شناسایی نواحی حفظ شده در طی تکامل با استفاده از نرمافزار ClustalX انجام شد. یک درخت فیلوژنتیکی به روش Neighbor Joining و با استفاده از نرمافزار MEGA4.1 Beta 2 (28) ساخته شده و بررسی Bootstrap با 1000 تکرار به منظور بدست آمدن حدود اطمینان برای شاخهها نیز انجام گردید (8). شماره دستیابی توالیهای پروتئینی موجود در پایگاه اطلاعات توالی NCBI مورد استفاده جهت بررسیهای همردیفسازی چندگانه و روابط فیلوژنتیکی، در جدول 1 آمده است.
جدول 1- مشخصات توالیهای پروتئینی مورد استفاده برای تهیه همردیفسازی چندگانه و ترسیم درخت فیلوژنتیکی به همراه شماره دستیابی موجود در پایگاه اطلاعات توالی NCBI GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov).
شماره دستیابی |
نام ژن |
نام علمی |
جنس |
ردیف |
XP_002375824 GAA89731 ACR56326 XP_001727544 XP_001217613 |
AfGOX AkGOX AnGOX AoGOX AtGOX |
Aspergillus flavus Aspergillus kawachii Aspergillus niger Aspergillus oryzae Aspergillus terreus |
Aspergillus |
1 |
EJD48758 |
AdGOX |
Auricularia delicata |
Auricularia |
2 |
CAD88590 |
BfGOX |
Botryotinia fuckeliana |
Botryotinia |
3 |
CCF42512 |
ChGOX |
Colletotrichum higginsianum |
Colletotrichum |
4 |
AER13599 |
GcGOX |
Glomerella cingulata |
Glomerella |
5 |
EFZ02033 |
MaGOX |
Metarhizium anisopliae |
Metarhizium |
6 |
AAD01493 XP_002563451 ABN79922 AJ583233 |
PaGOX PcGOX PeGOX PvGOX |
Penicillium amagasakiense Penicillium chrysogenum Penicillium expansum Penicillium variabile
|
Penicillium |
7 |
CCA75795 |
PiGOX |
Piriformospora indica |
Piriformospora |
8 |
AAB09442 XP_002482295 CAE47418 |
TfGOX TsGOX TvGOX |
Talaromyces flavus Talaromyces stipitatus Talaromyces variabilis |
Talaromyces |
9 |
EIW65340 |
TveGOX |
Trametes versicolor |
Trametes |
10 |
الف)
ب)
شکل 1- ساختار و الکتروفورز نتیجه برش آنزیمی ناقل نوترکیب pUC19-PfGOX. الف) ساختار ناقل نوترکیب pUC19-PfGOX حاوی ژن PfGOX در جهت معمولی روی جایگاه چندگانه برای همسانهسازی (MCS). توالی مسئول رونوشتبرداری ناقل نوترکیب (pMB1)، ژنهای lacZ و مقاومت به آمپیسیلین (AmpR) روی ناقل نوترکیب نشان داده شدهاند. ب) برش آنزیمی ناقل نوترکیب pUC19-PfGOX با آنزیم برشی SacI و الکتروفورز ژل آگاروز 1 درصد. M) نشانگر وزن مولکولی Kb1، 1) پلاسمید حلقوی pUC19 فاقد ژن PfGOX و هضم نشده، 2) پلاسمید pUC19 فاقد ژن PfGOX و هضم شده با آنزیم برشی SacI، 3) پلاسمید نوترکیب pUC19-PfGOX هضم نشده، 4) پلاسمید نوترکیب pUC19-PfGOX هضم شده با آنزیم برشی SacI.
نتایج و بحث
همسانهسازی و بررسی توالی نوکلئوتیدی ژن PfGOX و خصوصیات بیوشیمیایی پروتئین به دست آمده: ژن کدکننده PfGOX با استفاده از تکنیک PCR از قارچ پنی سیلیوم بومی ایران (P. funiculosum )، جداسازی و در ناقل پلاسمیدی pUC19 همسانهسازی شده و نتایج توالییابی و بررسی با برنامه BLAST نشان داد که قطعه همسانهسازی شده در جهت معمولی، یک ژن گلوکز اکسیداز می باشد (شکل 1). توالی DNA ژنومی PfGOX، ثبت شده در پایگاه توالی نوکلئوتیدی GenBank NCBI با شماره دستیابی HQ529689، به طول bp 1818 بوده که با کدون ATG آغاز شده و با کدون TAG خاتمه یافته و یک پروتئین با 605 آمینواسید را کد مینماید (شکل 2). بررسی خصوصیات بیوشیمیایی پروتئین به دست آمده با استفاده از برنامه ProtParam نشان داد که وزن مولکولی محاسبه شده و نقطه آیزوالکتریک پیشبینی شده توالی پروتئینی ژن PfGOX با فرمول مولکولی C2942H4556N782O893S19، به ترتیب برابر 78/65 کیلودالتون و 05/5 میباشد. همچنین برنامه ProtParam نشان داد که شاخص آلیفاتیک پروتئین PfGOX، به عنوان یک عامل مهم به منظور برآورد مقاومت پروتئینها در برابر حرارت، 28/86 بوده که نشان دهنده مقاوم بودن پروتئینهای گلوکز اکسیداز در برابر حرارت میباشد (31). شاخص ناپایداری پروتئینها بیان گر میزان پایداری آنها در لوله آزمایش می باشد، و پروتئینهایی با شاخص کمتر از 40 جزء پروتئینهای پایدار تقسیم بندی می شوند. شاخص ناپایداری پروتئین مورد نظر در حدود 38/26 محاسبه گردید به علاوه شاخص ناپایداری آن در لوله آزمایش در حدود 38/26 بوده و لذا در رسته پروتئینهای پایدار تقسیمبندی میشود (4).
شکل 2- توالی نوکلئوتیدی و پروتئینی ژن PfGOX. توالی پپتید راهنما به صورت زیرخط، آمینواسیدهای Cys و آمینواسیدهای Asn درگیر در فرآیند N-گلیکوزیلاسیون به ترتیب با علامت مربع و دایره و آمینواسیدهای موجود در جایگاه فعال به صورت ضخیم نشان داده شدهاند. همچنین شمارههای بازها و آمینواسیدها به ترتیب در سمت چپ و راست آورده شده است.
شاخص آبگریزی (Hydropathy) محاسبه شده با استفاده از برنامه ProtScale به روش Kyte & Doolittle (1982) نشان داد که توالی پروتئینی ژن PfGOX به میزان زیادی آب گریز بوده (19) و از مجموع کل آمینواسیدها، 59 آمینواسید با بار منفی (Asp+Glu) داشته، در حالی که تعداد کل آمینواسیدهای با بار مثبت آن (Arg+Lys) برابر 44 می باشد.
بررسی توالی آمینواسیدی و موتیفهای ساختاری توالی پروتئینی ژن PfGOX : بررسی توالی آمینواسیدی نشان داد که ژن PfGOX با bp 1818 طول، یک پروتئین اولیه با 605 آمینواسید را کد میکند که مانند آنزیمهای کیتیناز و گلوکاناز، میتواند در جهت تولید گیاهان مقاوم در برابر عوامل بیماریزای قارچی و باکتریایی مورد استفاده قرار بگیرد (1، 2 و 3). ژن PfGOX همانند سایر ژنهای گلوکز اکسیداز از A. niger (10)، P. amagasakiense (16) و
P. variabile (25) دارای یک توالی پپتید راهنما به طول 18 آمینواسید با ترادف MVSVFLSTLLLSAATVQA در انتهای آمینی خود میباشد که پس از جداسازی، یک پروتئین بالغ و فعال به طول 587 آمینواسید را تولید می کند. توالی گلوکز اکسیداز از A. niger با داشتن یک پپتید راهنما به طول 22 آمینواسید، دارای یک آمینواسید بازی (Arg) در موقعیت 1- میباشد که موجب برش پیوند پپتیدی بین آمینواسیدهای Arg و Ser و نهایتاً جداسازی توالی پپتید راهنما میشود (17). در حالی که آمینواسید موقعیت 1- در توالی پپتیدی ژن PfGOX یک آمینواسید آب گریز (Ala) بوده و نشان دهنده سازوکار متفاوت در جداسازی توالی پپتید راهنما می باشد.
پروتئین بالغ PfGOX مشابه با توالی پروتئینی ژنهای گلوکز اکسیداز از A. niger (10)، P. amagasakiense (16) و
P. variabile (25) دارای سه آمینواسید Cys در موقعیتهای حفظ شده Cys168، Cys210 و Cys525 و یک جایگاه فعال با 7 آمینواسید Tyr73، Phe418، Trp430، Arg516، Asn518، His520 و His563 میباشد. Arg516 مهمترین آمینواسید جهت اتصال مؤثر آنزیم گلوکز اکسیداز به β-D-گلوکز میباشد، در حالی که Asn518 به میزان کمتری در این واکنش شرکت میکند (30). آمینواسیدهای آروماتیک Tyr73، Phe418 و Trp430 به منظور جهتگیری صحیح سوبسترای و نیز جهت اکسیداسیون سریع گلوکز حائز اهمیت میباشند (4). همچنین آمینواسیدهای His520 و His563 در طی واکنش با OH1 گلوکز پیوندهای هیدروژنی تشکیل میدهند (4). همچنین، مقایسه توالی آمینواسیدی ژن PfGOX با ژنهای گلوکز اکسیداز از A. niger (10)،
P. amagasakiense (16) و P. variabile (25)، 4 جایگاه N-گلیکوزیلاسیون را در موقعیتهای حفظ شده Asn93، Asn165، Asn172 و Asn392 نشان داد. در حالی که در توالی آمینواسیدی ژنهای گلوکز اکسیداز از A. niger (13)،
P. amagasakiense (16) به ترتیب 6 و 5 جایگاه N-گلیکوزیلاسیون شناسایی شده است.
پیشبینی موقعیت زیرسلولی این پروتئین با استفاده از برنامه YLOC نشان داد که این آنزیم همانند سایر آنزیمهای گلوکز اکسیداز در مسیرهای متابولیکی فعال بوده و محل فعالیت آن خارج از اندامکهای سلولی از قبیل میتوکندری و پراکسیزوم میباشد. همچنین بررسیها با برنامه TMHMM نشان داد که PfGOX با داشتن یک دومین غشایی در انتهای آمینوی خود، به عنوان یک پروتئین خارج سلولی شناخته شده و قادر به خروج از سلول میباشد. این پیشبینیها با نتایج Petruccioli و همکاران (1997) مشابه میباشد (24). به طوری که آنها نشان دادند که آنزیم گلوکز اکسیداز به طور طبیعی از درون سلولهای قارچی P. variabile به درون محیط کشت ترشح میکند. به هر حال این فعالیت منحصر به فرد نیاز به بررسیهای دقیقتری دارد.
بررسی ساختار دوم و سوم توالی پروتئینی ژن PfGOX : بررسی ساختار دوم توالی پروتئینی ژن PfGOX با استفاده از برنامه SOPMA نشان داد که این پروتئین حاوی 208 آمینواسید درگیر در مارپیچ α (38/34 درصد)، 114 آمینواسید تشکیل دهنده صفحه β (84/18 درصد)، 48 آمینواسید موجود در پیچ β (93/7 درصد) و 235 آمینواسید درگیر در مارپیچ تصادفی (86/39 درصد) میباشد (شکل 3). این نتایج با ساختار دوم توالی پلیپپتیدی ژنهای گلوکز اکسیداز از قبیل PaGOX (P. amagasakiense) که حاوی 206 مارپیچ α (05/34 درصد)، 99 صفحه β (36/16 درصد) متصل شده توسط 37 پیچ β (12/6 درصد) و 263 مارپیچ تصادفی (47/43 درصد)، AnGOX (A. niger) با 185 مارپیچ α (58/30 درصد)، 110 صفحه β (18/18 درصد) متصل شده توسط 59 پیچ β (75/9 درصد) و 251 مارپیچ تصادفی (49/41 درصد) و PvGOX (P. variabile) شامل 182 مارپیچ α (08/30 درصد)، 102 صفحه β (86/16 درصد) متصل شده توسط 39 پیچ β (45/6 درصد) و 282 مارپیچ تصادفی (61/46 درصد) تشابه زیادی را نشان داد (10، 16 و 25) (شکل 3).
شکل 3- ساختار دوم توالی پروتئینی PfGOX با استفاده از برنامه SOPMA و مقایسه آن با توالی پلیپپتیدی ژنهای گلوکز اکسیداز از قبیل PaGOX (P. amagasakiense)، AnGOX (A. niger) و PvGOX (P. variabile). مارپیچهای α، صفحات β، پیچهای β و مارپیچهای تصادفی به ترتیب با خطوط آبی، قرمز، سبز و بنفش نشان داده شدهاند.
پیشبینی ساختار سهبعدی توالی پروتئینی ژن PfGOX بوسیله برنامه I-TASSER نشان داد که این آنزیم مشابه با ساختار سه بعدی ژنهای PaGOX (P. amagasakiense) (29) و AnGOX (A. niger) (14) حاوی 15 صفحه β و 22 مارپیچ α میباشد (شکل 4). نحوه آرایش مارپیچهای α و صفحات β در ساختار سهبعدی پروتئین PfGOX و به طور کلی آنزیمهای گلوکز اکسیداز به گونهای است که مارپیچهای α در سطح خارجی پروتئین و صفحات β در داخل پروتئین قرار گرفتهاند. آمینواسیدهای Asn درگیر در فرآیند N-گلیکوزیلاسیون در سطح خارجی پروتئین به گونهای واقع شدهاند تا بتوانند با کربوهیدراتهای غنی از قند مانوز پیوند برقرار نمایند (4). همچنین، آمینواسیدهای موجود در جایگاه فعال طوری در کنار یکدیگر آرایش یافتهاند تا بتوانند با کوفاکتور فلاوین آدنین دینوکلئوتید (FAD) پیوند غیرکووالان برقرار نمایند (29). شکل 4الف طرح روبانی آنزیم PfGOX و توزیع آمینواسیدهای Cys، آمینواسیدهای Asn درگیر در فرآیند N-گلیکوزیلاسیون و آمینواسیدهای موجود در جایگاه فعال را نشان میدهد. نمایش سطح جامد و طرح گوی و میله به همراه سطح واندروالس در پروتئین PfGOX به ترتیب در شکلهای 4ب و 4ج نشان داده شدهاند. همچنین شکل 4د موقعیت قرارگیری آمینواسیدهای موجود در جایگاه فعال را نشان میدهد.
شکل 4- مدلهای سهبعدی توالی پروتئینی ژن PfGOX. الف) مدل سهبعدی روبان (Ribbon) توالی پروتئینی ژن PfGOX. مارپیچهای α، صفحات β و نواحی مارپیچ پیچیده به طور مشخص در ساختار سهبعدی قابل مشاهده میباشند. آمینواسیدهای Cys و آمینواسیدهای Asn درگیر در فرآیند N-گلیکوزیلاسیون به شکل کروی (Sphere) به ترتیب با رنگهای زرد و ارغوانی قابل مشاهده میباشند. همچنین آمینواسیدهای موجود در جایگاه فعال به شکل گوی- میله (Ball-stick) قرمز رنگ نشان داده شدهاند. ب) مدل سهبعدی توالی پروتئینی ژن PfGOX با سطح جامد. ج) مدل سهبعدی گوی- میله (Ball-stick) توالی پروتئینی ژن PfGOX به همراه سطح واندروالسی 10 درصد. آمینواسیدهای موجود در جایگاه فعال به شکل گوی- میله (Ball-stick) قرمز رنگ نشان داده شدهاند. د) نحوه آرایش آمینواسیدهای موجود در جایگاه فعال در فضای سهبعدی به منظور برقراری پیوند غیرکووالان با کوفاکتور FAD.
بررسیهای همولوژی و فیلوژنتیکی: توالی پروتئینی ژن PfGOX با سایر ژنهای گلوکز اکسیداز از قارچهای دیگر مورد مقایسه قرار گرفته و مشاهده شد که بالاترین تشابه را با ژنهای PaGOXاز P. amagasakiense، TfGOX از
T. flavus، TsGOX از T. stipitatus و TvGOX از
T. variabilis به ترتیب به میزان 99 درصد (با 99 درصد یکسانی)، 99 درصد (با 99 درصد یکسانی)، 98 درصد (با 96 درصد یکسانی) و 94 درصد (با 89 درصد یکسانی) دارد (شکل 5). توالی پپتید راهنما، آمینواسیدهای Cys، آمینواسیدهای Asn درگیر در فرآیند N-گلیکوزیلاسیون و آمینواسیدهای موجود در جایگاه فعال به طور مشخص در شکل 5 نشان داده شدهاند.
شکل 5- همردیفسازی چندگانه ژن PfGOX با توالیهای پروتئینی گلوکز اکسیداز از قارچهای دیگر با استفاده از نرمافزار ClustalX. توالی پپتید راهنما، آمینواسیدهای Cys، آمینواسیدهای Asn درگیر در فرآیند N-گلیکوزیلاسیون و آمینواسیدهای موجود در جایگاه فعال به ترتیب با کادرهای آبی، زرد، ارغوانی رنگ و علامت مثلث نشان داده شدهاند. شماره دستیابی توالیهای پروتئینی مورد استفاده در تهیه همردیفسازی چندگانه در جدول 1 آمده است.
شکل 6- بررسی فیلوژنتیکی ژن PfGOX با توالیهای پروتئینی گلوکز اکسیداز از قارچهای دیگر. درخت فیلوژنتیکی با استفاده از نرمافزار MEGA4.1 Beta 2 به روش Neighbor Joining رسم گردید. شماره دستیابی توالیهای پروتئینی مورد استفاده در ساخت درخت فیلوژنتیکی در جدول 1 آمده است.
بررسی فیلوژنتیکی توالی پروتئینی PfGOX با توالیهای پلیپپتیدی گلوکز اکسیداز از قارچهای دیگر با استفاده از نرمافزار Mega4 به روشNeighbor Joining نشان داد که درخت فیلوژنتیکی به دست آمده به دو گروه اصلی I و II تقسیم میشود (شکل 6). گروه I عمدتاً شامل قارچهای Penicillium، Aspergillus و Talaromyces بوده که نشان دهنده خویشاوندی نزدیک از نظر ژنتیکی و تکامل از یک جد مشترک میباشد. گروه I به دو زیرگروه IA و IB تقسیمبندی میشود، به طوری که ژن PfGOX به همراه ژنهای PaGOX (P. amagasakiense) (16) و PvGOX (P. variabile) (25) در زیرگروه IA قرار داشته در حالی که ژن AnGOX (A. niger) (10) متعلق به زیرگروه IB میباشد. گروه II نیز خود شامل دو زیرگروه IIA و IIB است که شامل قارچهای Auricalaria، Botryotinia، Colletotrichum، Glomerella، Metarhizium و Piriformospora میباشد.
در این تحقیق یک ژن گلوکز اکسیداز، تحت عنوان PfGOX، از قارچ پنی سیلیوم بومی ایران
(P. funiculosum PTCC 5301) با استفاده از واکنش PCR جداسازی و همسانهسازی گردیده و ویژگیهای بیوشیمیایی آن مورد بررسی قرار گرفت. با استفاده از بررسیهای مدلینگ ساختاری نشان داده شد که PfGOX از نظر ساختارهای دوم و سوم مشابه با سایر توالیهای گلوکز اکسیداز از قارچهای دیگر بوده و بررسیهای همولوژی و فیلوژنتیکی نشان داد که این ژن شباهت بالایی با توالیهای پروتئینی گلوکز اکسیداز سایر قارچها داشته و به زیرگروه IA گلوکز اکسیدازهای قارچی تعلق دارد.
10. Frederick, K.R., Tung, J., Emerick, R.S., Masiarz, F.R., Chamberlain, S.H., Vasavada, A. and Rosenberg, S. 1990. Glucose oxidize from Aspergillus niger, cloning, gene sequence, secretion from Saccharomyces cerevisiae and kinetic analysis of a yeast–derived enzyme. J. Biol. Chem. 265: 3793–3802.
11. Gasteiger, E., Hoogland, C., Gattiker, A., Duvaud, S., Wilkins, M. R., Appel, R. D. and Bairoch, A. 2005. Protein identification and analysis tools on the ExPASy server. In: J. M. Walker (Ed), The proteomics protocols handbook. (pp. 571-607.) Humana Press.
12. Hatzinikolaou, D.G., Hansen, O.C., Macris, B.J., Tingey, A., Kekos, D., Goodenough, P. and et al. 1996. A new glucose oxidase from Aspergillus niger characterization and regulation studies of enzyme and gene. Appl. Microbiol. Biotechnol. 46:371–81.
13. Hecht, H.J., Kalisz, H.M., Hendle, J., Schmid, R.D. and Schomburg, D. 1993. Crystal structure of glucose oxidase from Aspergillus niger refined at 2.3 Å resolution. J. Mol. Biol. 229:153–72.
14. Kalisz, H.M., Hecht, H.J., Schomburg, D. and Schmid, R.D. 1991. Effects of carbohydrate depletion on the structure, stability and activity of glucose oxidase from Aspergillus niger. Biochim. Biophys. Acta. 1080:138–142.
15. Kazan,, K., Murray F.R., Goulter, K.C., Llewellyn, D.J. and Manners, J.M. 1998. Induction of cell death in transgenic plants expressing a fungal glucose oxidase. Phytopathol. Society. 6:555–562.
16. Kiess, M., Hecht, H.J. and Kalisz, H.M. 1998. Glucose oxidase from Penicillium amagasakiense. Primary structure and comparison with other glucose-methanol-choline (GMC) oxidoreductase. Europ. J. Biochem. 252:90–99.
17. Kriechbaum, M., Heilman, H.J., Wientjes, F.J., Hahn, M., Jany, K.D., Gassen, H.G., Sharif, F. and Alaedinoglu, G. 1989. Cloning and DNA sequence analysis of the glucose oxidase gene from Aspergillus niger NRRL-3. Dep. Biological Sci. 1:63–66.
18. Kusai, K., Sekuzu, I., Hagihara, B., Okunuki, K., Yamauchi, S. and Nakai, M. 1960. Crystallization of glucose oxidase from Penicillium amagasakiense. Biochim. Biophys. Acta. 40:555–557.
19. Kyte, J. and Doolittle, R.F. 1982. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. 157:105–32.
20. Lee, Y.H., Yoon, I.S., Suh, S.C. and Kim, H.I. 2002. Enhanced disease resistance in transgenic cabbage and tobacco expressing a glucose oxidase gene from Aspergillus niger. Plant Cell Rep. 20:857–863.
21. Levine, A., Tenhaken, R., Dixon, R. and Lamb, C. 1994. H2O2 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response. Cell. 79:583–593.
22. Muller, D. 1928. Oxidation von glukose mit extrakten aus Aspegillus niger. Biochem. Z. 199:136–170.
23. Murray, F.R., Llewellyn, D.J., Peacock, W.J. and Dennis, E.S. 1997. Isolation of the glucose oxidase gene from Talaromyces flavus and characterisation of its role in the biocontrol of Verticillium dahliae. Curr. Genet. 32:367–375.
24. Petruccioli, M., Piccioni, P. and Federici, F. 1997. Glucose oxidase overproduction by the mutant strain M-80.10 of Penicillium variabile in a benchtop fermenter. Enz. Microb. Technol. 21:458– 462.
25. Pulci, V., D' ovidio, R., Petruccioli, M. and Federici, F. 2004. The glucose oxidase of Penicillium variable P16: gene cloning, sequencing and expression. Appl. Microbiol. 38:233–238.
26. Rychlik, W. 2007. OLIGO 7 primer analysis software. Meth. Mol. Biol. 402:35-59.
27. Sambrook, J. and Russell, D. W. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual (3nd ed. Vol:1-3.). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA.
28. Tamura, K., Dudley, J., Nei, M. and Kumar, S. 2007. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Biol. Evol. 24:1596–1599.
29. Wholfahrt, G., Witt, S., Handle, J., Schomburg, D., Kalisz, H.M. and Hecht, H.J. 1999. 1.8 and 1.9 a resulation structures of the Penicillium amagasakiense and Aspergillus niger glucose oxidase as a basis for modelling substrate complexes. Acta Crystal. Sect. Dep. 55:969–977.
30. Witt, S., Wohlfahrt, G., Schomburg, D., Hecht, H. and Kalisz, H. 2000. Conserved arginine-516 of Penicillium amagasakiense glucose oxidase is essential for the efficient binding of β-D-glucose. J. Biochem. 347:553–9.
31. Wong, C.M., Wong, K.H. and Chen, X.D. 2008. Glucose oxidase: natural occurrence, function, properties and industrial applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 78:927–938.
32. Wu, G., Shortt, B.J., Lawrence, E.B., Levine, E.B., Fitzsimmons, K.C. and Shah, D.M. 1995. Disease resistance conferred by expression of a gene encoding H2O2-generating glucose oxidase in transgenic potato plants. Plant Cell. 7:1357–1368.
33. Zhang, Y. 2008. I-TASSER server for protein 3D structure prediction. BMC Bioinformatics. 9:40–26.