میکروسپورزایی و مگاسپورزایی در گیاه شکرتیغال (Echinops ilicifolius L.)

زهرا بقایی‌فر^1*، محمود مفیدی‌نیا¹ و عبدالکریم چهرگانی‌راد²

¹ تهران، دانشگاه پیام نور، دانشکده علوم، گروه زیست­شناسی

²همدان، دانشگاه بوعلی سینا، دانشکده علوم، گروه زیست­شناسی

تاریخ دریافت: 29/1/94                تاریخ پذیرش: 21/5/94

چکیده

با وجود افزایش روزافزون مطالعات کاربردی و مولکولی در تیره آفتابگردان ( Asteraceae)، مطالعه زیست‌شناسی تولید مثلی، که مراحل و چگونگی تکوین گل‌ها را شامل می‌گردد، در این تیره ضروریست. در این پژوهش ویژگی‌های رویان‌شناختی، شامل تکوین دانه گرده و تخمک در گیاه شکرتیغالEchinops ilicifolius از تیره آفتابگردان مورد بررسی قرار گرفتند. گل‌ها و غنچه‌ها در مراحل مختلف نمو برداشت شده، در FAA تثبیت و در الکل 70 درصد نگهداری شدند. نمونه‌ها پس از قالب‌گیری در پارافین، با میکروتوم برش‌گیری گردیدند. رنگ‌آمیزی با ائوزین و هماتوکسیلین انجام شد. لام‌های تهیه شده با استفاده از میکروسکوپ نوری مطالعه شدند. نتایج نشان داد که بساک‌ها تتراسپورانژی بوده و لایه مغذی از نوع پری پلاسمودیومی کاذب است. تتراد­ها­ی میکروسپوری از نوع تتراهدرال و تتراگونال می‌باشند. در بافت رابط بساک ذرات کریستالی سوزنی شکل وجود دارد. دانه‌های گرده در زمان انتشار دویاخته­ای هستند. تخمک از نوع واژگون، تک‌پوسته­ای و کم‌خورش است. لایه آندوتلیوم از یک ردیف یاخته تشکیل شده و با کیسه جنینی در ارتباط است. نمو کیسه رویانی بر اساس تیپ پلی­گونوم انجام می‌شود. یاخته­های آنتی‌پود ممکن است به 6 تا 8 عدد افزایش پیدا کنند.

واژه‌های کلیدی: آفتابگردان، تخمک، مگاسپورزایی، میکروسپورزایی،  Echinops ilicifolius

* نویسنده مسئول، تلفن: 08132546721 ، پست الکترونیکی: z_baghaeifar@pnu.ac.ir 

مقدمه

گیاه شکرتیغال با نام علمیEchinops ilicifolius  متعلق به طایفه Echinopeae و از تیره آفتابگردان در جهان نزدیک به 350 گونه دارد. در محدوده جغرافیایی فلور ایرانیکا یعنی فلات ایران، 74 گونه از آن ذکر شده که 54 گونه آن متعلق به ایران است. اعضای این جنس گیاهانی علفی، چند ساله و بندرت یکساله هسستند. بر اساس پژوهش های انجام شده در سال های بعدی تعداد گونه های آن در فلات ایران به حدود 70 مورد افزایش یافته است(7). تیره Asteraceae بزرگترین تیره گیاهی است (5). بر اساس گزارش های باغ گیاه شناسی سلطنتی کیو این تیره بیش از 1600 سرده و 23000 گونه دارد که سرده ها و گونه های فراوان آن، پراکنش جهانی دارند. اعضای این تیره از گذشته های دور به دلایل مختلفی از جمله استفاده های دارویی، اقتصادی و بازرگانی مورد توجه بوده و موضوع مطالعات بسیاری قرار گرفته است (40). در این تیره به دلایل مختلفی، از جمله شباهت های مورفولوژیکی، تقسیم بندی سرده ها و تشخیص مرز بین آنها اغلب مشکل­زا بوده و برخی از آنها باید به زیر گروه‌های کوچک­تر تقسیم شوند (22). از این رو نیاز به بررسی و ایجاد روش های جدید در شاخه ها و گرایش هایی از علم زیست شناسی است تا بتوان این مشکل را حل کرده و رده بندی های مناسب و دقیقی از اعضای این تیره‌ بزرگ گیاهی و سایر تیره های گیاهی ارائه کرد (37). رویان شناسی شاخه ای از علوم زیستی پایه ای است که در علومی از قبیل تاکسونومی و مورفولوژی کاربرد دارد. شواهد رویان شناختی بطور فزاینده‌ای برای مطالعات تئوری و عملکردی درباره تولید مثل جنسی گیاه ضروری هستند. زیست شناسی تولید مثلی، مطالعه مراحل مختلف وابسته به هم تکوین یعنی اندام زایی گل، شکوفایی بساک، گرده افشانی ، لقاح، رویان زایی، بلوغ دانه، پراکندگی، رویش دانه و  تکثیر به وسیله دانه را شامل می‌شود. همه اینها در مفهوم وسیع در ارتباط با رویان زایی هستند. توسعه  این علم به‌ویژه برای معرفی و احیای گیاهان نادر و در حال انقراض و نیز گیاهانی که از نظر کشاورزی مهم هستند، ضروریست (4). بسیاری از گیاهان این تیره از جمله
Echinops ilicifolius  از نظر دارویی و داشتن اسانس، ارزش ویژه­ای دارند (9، 10 و 19). بررسی متون مختلف در مورد اثرات درمانی این گیاه دارویی مؤید آن است که شکرتیغال برای درمان و یا تخفیف بیماری های ریوی بعنوان خلط آور، لینت‌بخش سینه، برطرف‌کننده سرفه، رفع خشکی گلو، درمان تنگی نفس و آسم استفاده می شود. درمان های دیگری از قبیل درمان افسردگی، یبوست، چاقی، تب بری، متعادل کننده دستگاه گوارش، تسکین سوزش سردل نیز برای این گیاه ذکر شده است. شکرتیغال برای معده و دردهای احشایی مؤثر است. خاصیت نوتروپیک داشته و اثر مثبتی بر حافظه و قدرت یادگیری دارد. بدلیل اثرات آنتی اکسیدانی و وجود تری هالوز، شکر تیغال می تواند به عنوان داروی ضد سرطان، آلزایمر و هانتینگتون کاربرد داشته باشد(6، 9 و36). مطالعات متعدد سیتوشیمیایی، مورفولوژیکی و فیتوشیمیایی در این جنس انجام شده است (38 و 40)،  اما با وجوداین به نظر می­رسد که مطالعات رویان شناختی محدودی در این تیره انجام شده است. بنابراین هنوز انجام مطالعات جدید رویان شناختی برای افزایش دانش و آگاهی در مورد گیاهان این تیره ضروریست (35). بر اساس مطالعات رویان شناختی محدود انجام شده نیز، استثناهای متعددی در گیاهان این تیره گزارش شده است، از قبیل: قرار گیری یاخته‌های مادر گرده در یک ردیف در بخش میانی بساک (22)، وجود پدیده Nemec یعنی تشکیل ساختارهای شبیه کیسه رویانی در دانه گرده (14 و 16)، افزایش سینرژید­ها (8 و 15)، افزایش یاخته­های آنتی پود (29 و 34)، کیسه­ رویانی 4 یاخته­ای (21) و آپومیکسی (12 و 17) گزارش شده است. بر اساس مطالعات مرجع شناختی بعمل آمده، این پژوهش اولین بررسی در مورد رویان شناسی گونه E.ilicifolius، به عنوان نماینده ای از جنس Echinops  است.

مواد و روشها

گل ها و غنچه های گیاه E.ilicifolius در مراحل مختلف نمو، بمنظور بررسی مراحل تکوینی دانه گرده و تخمک از سطح شهرستان کمیجان در استان مرکزی برداشت و بعد در فیکساتور FAA تثبیت و در الکل 70 درصد نگهداری شدند. پس از تثبیت و شستشوی نمونه ها، آبگیری از نمونه ها توسط درجات افزایشی الکل (30، 50، 70، 80، 90 و 100) انجام شد. شفاف سازی نمونه ها با درجات مختلف مخلوط الکل و تولوئن (4/1، 4/2، 4/3 و 4/4) انجام شد. سپس نمونه ها پارافین دهی و قالب گیری شده و با روتاری میکروتوم مدل DS 4055 و ضخامت 7-5 میکرومتر برش گیری گردیدند. رنگ آمیزی با ائوزین (رنگ آمیزی سیتوپلاسم) و هماتوکسیلین (رنگ آمیزی هسته) طبق روش Yeung(1984) انجام شد (43). هر یک از مراحل تکوین تخمک و پرچم در چندین برش به وسیله میکروسکوپLX500  LABOMED  دوربین دار بررسی شد. برای هر مرحله حداقل سی گل برش گیری شده و از بهترین آنها با دوربین نصب شده بر روی میکروسکوپ عکس برداری گردید.

نتایج

تشکیل دیواره بساک: بساک در گیاه E.ilicifolius از نوع چهار کیسه گرده­ای یا تتراسپورانژی است (تصویر 1). یاخته های آرکئوسپوری در زیر اپیدرم تمایز پیدا می کنند. این یاخته ها که دارای سیتوپلاسم متراکم و هسته بزرگ و مشخصی هستند، با تقسیمات مماسی خود دو گروه یاخته را ایجاد می کنند. یاخته جداری که به سمت بیرون قرار می گیرد و یاخته هاگزا که طی تقسیم مماسی به سمت داخل قرار می گیرد. یاخته جداری با تقسیمات خود دیواره بساک چهار لایه‌ای را ایجاد می کند که از بیرون به داخل شامل لایه اپیدرم، لایه مکانیکی، لایه میانی و لایه تاپی یا تغذیه ای است (تصویر 2). لایه مغذی از یاخته هایی  با یک هسته تشکیل شده است که البته ممکن است در بعضی از مراحل به صورت دو هسته ای نیز دیده شوند. رشد این یاخته­ها به سمت حفره بساک است و از نظر شکل کم و بیش کروی بوده یا حالت کشیده دارند (تصویر5).

تصویرهای 22-1- میکروسپورزایی، تشکیل گامتوفیت نر و نمو دیواره بساک در Echinops ilicifolius.. (1) برش عرضی بساک، که چهار کیسه گرده را نشان می‌دهد (بساک تتراسپورانژی). (2) لایه‌های تشکیل‌دهنده دیواره بساک را نشان می‌دهد که شامل: لایه اپیدرم (Ep)، لایه مکانیکی (En)، لایه میانی (Me) و لایه تاپی است. (3) کیسه بساک دارای یک میکروسپور. (4 و 5) برش طولی از بساک که نشان‌دهنده دیواره بساک به‌ویژه لایه مغذی (Ta) و یاخت‌ های مادر گرده (pmc) است که در یک یا دو ردیف مستقر هستند. (5) برش طولی از بساک که از لایه مغذی عبور کرده و تقسیمات میتوزی در یاخته­های مغذی را نشان می‌دهد که منجر به دو هسته‌ای شدن و یا پلی‌پلوئیدی در یاخته­های لایه مغذی می‌گردد. این تصویر پروفاز I میوزی را نشان می‌دهد.  pmc: یاخته‌های مادر گرده، Ta : لایه تاپی، Ep : لایه اپیدرم، En : لایه مکانیکی، Me : لایه میانی ،Co : بافت رابط.

یاخته های لایه مغذی درجه بالایی از پلی پلوئیدی را از خود نشان می دهند که نتیجه تقسیمات پی‌درپی میتوزی است. در تشکیل دیواره بساک و نمو دانه گرده در مراحلی می‌توان لایه مغذی از نوع ترشحی را مشاهده کرد که در طی این مراحل یاخته های لایه مغذی تحلیل نرفته و در جای خود ثابت هستند (تصویرهای 5، 11 و 12). اما وقتی که میکروسپورها در حال نمو به دانه گرده بالغ (دو سلولی) هستند، ضمائمی از یاخته­های لایه مغذی به سمت حفره بساک تشکیل می شود. در مرحله ای که دانه­های گرده تک یاخته­ای یا دو یاخته ای هستند، یاخته­های لایه مغذی تقریباً تحلیل می روند اما هنوز باقیمانده آنها قابل مشاهده است (تصویرهای 15، ‌16و17). ضمائم حاصل از یاخته‍های لایه مغذی در مرحله دانه­های گرده تک یاخته­ای کم و بیش قابل مشاهده است (تصویرهای 13و15). لایه میانی در دیواره بساک مشخص می باشد (تصویرهای 2و 5). در مرحله دانه­های گرده دویاخته­ای، لایه مکانیکی هنوز ضخیم شدگی های فیبری را تشکیل نداده و یاخته ها هنوز زنده­اند. اما در مرحله پایانی نمو دانه­های گرده دو یاخته­ای، لایه مکانیکی ضخیم و فیبری می شود (تصویر20).

ادامه تصویرهای 22-1- میکروسپورزایی، تشکیل گامتوفیت نر و نمو دیواره بساک در Echinops ilicifolius. (6) برش طولی از بساک که نشان‌دهنده آغاز تقسیم میوز در یاخته­های مادر گرده است (متافاز I ). (7) آنافاز I. (8) تلوفاز I. (9) تلوفاز II. (10) برش طولی بساک در مرحله تشکیل تتراد میکروسپوری که هنوز بین تترادها دیواره تشکیل نشده است. (11) کریتال‌های سوزنی شکل در حفره بساک. (12) کریستالهای سوزنی در بافت رابط بین بساک‌ها. (13،14و15) تترادهای میکروسپوری آزاد شده‌اند، لایه کالوزی در اطراف میکروسپورها مشخص است (↑سفید رنگ). ضمائمی از طرف لایه تاپی به سمت حفره بساک کشیده می‌شود (↑ زرد رنگ)، با از بین رفتن سلولهای لایه تاپی سیتوپلاسم آنها با هم ادغام می‌شود، در نتیجه لایه مغذی از نوع پری پلاسمودیومی کاذب است. میکروسپورها هنوز واکوئله نشده‌اند. (16) با واکوئله شدن میکروسپورها هسته موجود در مرکز میکروسپور به کناری رانده می‌شود (↑). (17) میکروسپور­ها در زمان آزاد شدن هنوز واکوئله نبوده و دارای سیتوپلاسم متراکم، شکل منظم با یک هسته مشخص و قرار گرفته در مرکز یاخته هستند (↑آبی رنگ). میکروسپورها در حال واکوئله شدن هستند. (18) تتراد میکروسپوری از نوع تتراگونال. (19) تتراد میکروسپوری از نوع تترا هدرال. (20) نمای قطبی و استوایی از گرده. لایه مکانیکی(En) ضخیم و فیبری شده است و لایه تاپی از بین رفته است. (21) نمای قطبی و استوایی از برش میکروسپورهای بالغ که در نمای استوایی سلول‌های زایشی و رویشی مشخص است. (22) در نمای قطبی از برش بساک لایه اگزین، سه شیار و لوب در میکروسپور بالغ مشخص است. ep : اپیدرم؛  en: لایه مکانیکی؛ pmc  : یاخته مادر گرده؛  sta: پرچم؛ ta: لایه مغذی، Co: بافت رابط، Ca: لایه کالوزی، نمای قطبی (P.V) و نمای استوایی (E.V).

میکروسپورزایی و نمو گامتوفیت نر: میکروسپوروسیت ها از تمایز یاخته های هاگزا به وجود می آیند (تصویرهای2 و 3). با شروع مراحل مختلف میوز که شامل پروفاز I (تصویر5)، متافاز I (تصویر6)، آنافاز I (تصویر7)، تلوفاز I (تصویر8) و تلوفاز II (تصویر9) است در هر میکروسپور، تتراد­های میکروسپوری تشکیل می­شود. در طی میوز I سیتوکینز رخ نمی دهد، در نتیجه بین هسته­ها در مرحله تلوفاز I دیواره وجود ندارد (تصویر 8). سیتوکینز از نوع همزمان است و پس از میوز II رخ می­دهد. تتراد­های میکروسپوری بیشتر از نوع چهار وجهی (تتراهدرال) (تصویر 19) و بندرت از نوع چهار گوش (تتراگونال) (تصویر 18) ­هستند. دیواره کالوزی در اطراف تتراد­ها و لابه‌لای موناد­ها بخوبی قابل تشخیص است (تصویر های 5 و 7). زمانی که میکروسپور­ها وارد حفره بساک می شوند هنوز واکوئله نبوده و دارای سیتوپلاسم متراکم، شکل منظم با یک هسته مشخص و قرار گرفته در مرکز یاخته هستند (تصویر 17). بعد از آزاد شدن میکروسپورها بتدریج تزئینات اگزین در آنها تشکیل می­شود (تصویر14). هسته که در موقعیت مرکزی قرار دارد با توسعه واکوئل مرکزی، به موقعیت کناری رانده می شود (تصویر 16).

تصویرهای 32-23- مگاسپورزایی و تکوین مگاگامتوفیت در Echinops ilicifolius. (23) برش طولی از غنچه، که در آن تشکیل پریموردیوم پرچم (An) زودتر از پریموردیوم مادگی (Ca) انجام شده است. Pe : گلبرگ‌ها. (24) برش طولی از غنچه، که نشان می‌دهد پریموردیوم تخمکی (Po) زمانی تشکیل می‌شود که میکروسپورها در بساک تشکیل شده‌اند. (25) برش طولی تخمک با سلول آرکئوسپوری (Ar)، NE : خورش؛ (26) برش طولی تخمک با سلول مگاسپوری (Me). In : پوسته تخمک؛ (27) برش طولی تخمک در مرحله دیاد میوز I (↑). (28) برش طولی تخمک در مرحله تتراد میوز I (↑). R : رافه؛ (29) برش طولی تخمک که مگاسپور عملکردی در قطب بنی را نشان می‌دهد (↑)؛ (30) برش طولی تخمک نشان‌دهنده کیسه رویانی دو هسته‌ای (↑)؛ (31) برش طولی تخمک در مرحله کیسه رویانی چهار هسته‌ای (↑)؛ (32) برش طولی از کیسه رویانی هشت هسته‌ای.

با تقسیمات میتوزی نابرابری که هسته انجام می دهد دو هسته نابرابر بوجود می‌آید. دانه گرده دو هسته ای (هسته بزرگ، رویشی و هسته کوچک، زایشی) در نهایت دو یاخته­ای می‍شود (تصویر 21).

مگاسپورزایی و نمو گامتوفیت ماده: گیاه E.ilicifolius دارای یک تخمک است که درون تخمدانی دو برچه ای ، تک خانه­ای و زیرین قرار دارد. تخمک واژگون و تک پوسته­ای بوده و تشکیل پوسته تخمک با تقسیمات مماسی و عمود بر سطح در قاعده خورش آغاز می­شود. یاخته مادر مگاسپور از رشد و تمایز یکی از یاخته های بافت خورش در مراحل اولیه نمو تخمک به وجود می آید، بنابر‌این تخمک از نوع کم خورش است (تصویرهای 25 و 26). با انجام تقسیمات میوزی I و میوزی  II یاخته مادر مگاسپور ابتدا تولید دیاد و سرانجام تولید تتراد خطی مگاسپور را می­کند که مگاسپور بنی، مگاسپور عملکردی است (تصویرهای27 و 28). مگاسپور عملکردی دارای یک هسته است، بهمین دلیل کیسه رویانی یک هسته­ای نامیده می شود (تصویر 29). با تقسیمات میتوزی که یاخته مگاسپور عملکردی انجام می دهد، ابتدا کیسه رویانی دو هسته ای (تصویر 30)، در ادامه چهار هسته­ای (تصویر 31) و در نهایت کیسه رویانی هشت هسته­ای (تصویرهای 32 و 33) را به وجود می­آورد. در ادامه کیسه رویانی یاخته ای می شود که نتیجه آن تشکیل کیسه رویانی بالغ است (تصویر 34 و 35). زمانی که کیسه رویانی بالغ شکل می‌گیرد مهاجرت هسته­های قطبی نیز انجام می شود، مانند بیشتر نهاندانگان تیپ کیسه رویانی حاصل از نوع پلی­گونوم است (تصویرهای 33 و 34). قبل از لقاح، با مهاجرت هسته های قطبی به سمت سفت و تلفیق آنها، یک هسته ثانویه با واکوئل بزرگ به وجود می‌آید که در بخش میانی کیسه رویانی قابل مشاهده است. مهاجرت هسته ثانویه به سمت دستگاه تخم است (تصویر 34 ). از نظر شکل یاخته تخم‌زا شکل کروی داشته و با هسته درشتی که در بخش بنی خود دارد از یاخته های سینرژید قابل تشخیص است. دو یاخته قرینه هم به دلیل قطبیت و همچنین تشکیل ساختارهای رشته­ای توسعه یافته به سمت سفت قابل تشخیص هستند (تصویر 33). تعداد یاخته­های آنتی پود ممکن است افزایش (6 تا 8 عدد) پیدا کنند (تصویر 39). نحوه قرار گیری یاخته های آنتی پود در کیسه رویانی بصورت خطی است و محل قرار گیری آنها در قطب بنی کیسه رویانی است. بافت آلبومن از تقسیمات سلول دوهسته ای حاصل می شود که تقسیمات این سلول قبل از لقاح شروع می شود.

بحث و نتیجه‌گیری 

بساک و گامتوفیت نر: یاخته­های آرکئوسپوری دارای سیتوپلاسم متراکم و هسته حجیم هستند که این ویژگی ها تشخیص این یاخته ها را آسان می کند. با تقسیمات مماسی که این یاخته ها انجام می دهند دو گروه یاخته حاصل می شود. یاخته جداری بیرونی و یاخته هاگزای درونی (42). در گیاه E.ilicifolius نمو دیواره بساک بر اساس تیپ دو لپه ای است (15). لایه مکانیکی دارای ضخیم شدگی های فیبری است (43). نمو لایه میانی در گونه مورد مطالعه مشاهده می شود. یک همبستگی آشکار بین تقسیمات میوزی در یاخته­های مادر گرده و نمو لایه تاپی بساک وجود دارد که  برای سایر گونه های  این تیره  نیز گزارش شده است (19). یاخته های لایه مغذی فعالیت متابولیسمی بالایی دارند که نتیجه آن وجود درجه بالایی از پلوئیدی در آنهاست (26).

در نهان­دانگان دو تیپ اصلی نمو لایه‌ تاپی بساک قابل تشخیص است (27): ترشحی (جداری) و آمیبی periplasmodial)‍(. در‌ گیاه E.ilicifolius لایه تاپی از نوع پری پلاسمودیومی کاذب است که در آن ضمائمی از سمت لایه تاپی به داخل حفره بساک کشیده می شود. سلول های لایه تاپی ابتدا ترشحی بوده ولی با بلوغ میکروسپورها (گرده دو سلولی) لایه تاپی بتدریج از بین رفته و سیتوپلاسم آنها با هم ادغام می شود. لایه تاپی آمیبی برای گونه­های متعددی از تیره Asteraceae گزارش شده است (1) که با این نتایج همسویی دارد.

ادامه تصویرهای 39-33 - مگاسپورزایی و تکوین مگاگامتوفیت در Echinops ilicifolius. (33) برش طولی از کیسه رویانی 8 هسته‌ای که قرینه‌ها (syn)، آنتی‌پودها (ant)، تخم‌زا (os) و هسته‌های قطبی (PN) مشخص هستند. تخم‌زا: (os)؛ (34) تلفیق هسته‌های قطبی (PN) در مجاورت دستگاه تخم و تکمیل تمایز و یاخته‌ای شدن در کیسه رویانی. تخم‌زا (os) به خوبی مشهود است. (35) این تصویر نشان می‌دهد که میکروپیل انحنای مستقیم، با شکل صاف دارد. (36) برش طولی از گل که در آن کاکل فلسی شکل (P)، تشکیل نوشجای (V) و خامه دوشاخه‌ای (Sty) مشخص است. (37 و 38) نشان‌دهنده حضور کرک‌ها (Tr) و کریستال‌ها (Cry) در تخمدان است. (39) افزایش یاخته­های آنتی‌پود مشاهده می‌شود، به‌طوری‌که تعداد آنها به شش تا هشت عدد می‌رسد (↑ سبزرنگ). تخم‌زا: (os)، PN: هسته‌های قطبی،Po : پریموردیوم تخمکی،An : بساک‌ها.