Cellular and Molecular Research
(Iranian Journal of Biology)
Structural study on pepsin stability in the presence of ZnO and Fe3O4 nanoparticles
Document Type : Research Paper
Authors
1 university of shahrekord
2 university of jiroft
3 sayer
Abstract
Porcine pepsin A (EC 3.4.23.1), belongs to the aspartic protease family, and is secreted as a zymogen called pepsinogen. Pepsinogen activation occurs at pH values between 1 and 4. Pepsin consists of a bilobal conformation with two catalytic aspartic residues (Asp32 and Asp215) on either side of the active site, The structure of porcine pepsin is predominantly β-strand and random coil with limited α-helix. Porcine Pepsin is most efficient cleaving peptide bonds between hydrophobic and preferably aromatic amino acids such as phenylalanine, tryptophan, and tyrosine. Because the importance of pepsin enzyme as an industrial enzyme in the food industry and nano particles functions in industry, we investigated Structural stability of pepsin in presence and absence of ZnO and Fe3O4 nanoparticles. This study were performed using glycin-Hcl(0.1M) buffer at pH=2 and temperature range (303 to 363) K. porcine Pepsin stability Was not changed in the presence of Zno and Fe3O4 nanoparticles. Strength of the electrostatic and hydrogen interactions between pepsin enzyme and ZnO , Fe3O4 nanoparticles Were a low level in denaturation of pepsin.
Keywords
Main Subjects
مطالعه پایداری ساختاری آنزیم پپسین در حضور نانوذرات اکسیدروی و اکسیدآهن
بهزاد شارقی*، کلثوم شهدادنژاد و هما محمدی
شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، دانشکده علوم پایه، گروه بیوشیمی
تاریخ دریافت: 21/8/93 تاریخ پذیرش: 24/12/93
چکیده
آنزیم پپسین خوک A (EC 3.4.23.1) متعلق به خانواده آسپارتیک پروتئازها است، و به صورت زیموژن که پپسینوژن نام دارد ترشح می شود، فعالشدن پپسینوژن در مقادیر pH بین 1 و 4 اتفاق می افتد. پپسین شامل یک صورتبندی دو لوبی با دو رزیدو آسپارتیک کاتالیتیکی(32Asp و215Asp) که در دو طرف جایگاه فعال می باشد و ساختار آن غالباً صفحه بتا و رندوم کویل با مارپیچ آلفا محدود میباشد. پپسین پیوندهای پپتیدی بین آمینواسیدهای هیدروفوبیک و ترجیحاً آروماتیک از قبیل تریپتوفان، فنیلآلانین و تیروزین را هیدرولیز میکند. با توجه به اهمیت آنزیم پپسین به عنوان یک آنزیم صنعتی در صنایع غذایی و کاربردهای نانوذرات در صنعت اثر نانوذرات اکسید مس و اکسید روی را بر روی پایداری ساختاری پپسین بررسی گردید. این مطالعه با استفاده از بافر گلایسین-اسیدکلریدریک (1/0 مولار) با 2=pH و در دامنه دمایی 303 تا 363 درجه کلوین انجام شد. پایداری پپسین در حضور نانوذرات اکسید روی و اکسید آهن تغییر نکرد. قدرت برهمکنش الکتروستاتیک و هیدروژنی بین آنزیم پپسین و نانوذرات اکسیدروی و اکسیدآهن در دگرگون شدن پپسین کم بوده است.
واژه های کلیدی:پپسین، پایداری ساختاری، نانوذرات اکسیدروی و اکسیدآهن، دگرگون شدن
* نویسنده مسئول، تلفن: 09131093764، پست الکترونیکی: b_shareghi@yahoo.com
مقدمه
فناوری نانو یکی از مدرنترین فناوریهای روز دنیاست که دارای خصوصیات منحصربهفرد و در تمام زمینههای علم و فناوری کاربرد دارد(10). فناوری نانو در پزشکی از جمله دارورسانی، مواد کاشتنی در بدن، جراحی، وسایل تشخیصی، درمان سرطانها کاربردهای زیادی دارد (15و16). اخیراً از نانوذرات مغناطیسی مانند نانوذره اکسیدروی استفادههای زیادی می شود برای مثال در تصویربرداری رزونانس مغناطیسی MRI (MagneticResonanceImaging)، افزایش دما (hyperthermia) برای درمان تومور، رساندن دارو و .... کاربرد زیادی دارند. همچنین مشخص شده است که بعضی از نانوذرات مغناطیسی مانند نانوذره اکسیدآهن، از تشکیل تجمعات آمیلوئیدی(مثلاً آمیلوئید بتای لیزوزیم) جلوگیری می کنند و یا تجمعات تشکیلشده آمیلوئیدی را از بین می برند و از این طریق در درمان بیماری آلزایمر مؤثر می باشند (4). آنزیم پپسین خوک A(3.4.23.1E )، متعلق به خانواده آسپارتیک پروتئازها است. پپسین به صورت زیموژن که پپسینوژن نام دارد ترشح می شود (13). همانند دیگر زیموژنهای آسپارتیک معده، فعالشدن پپسینوژن در مقادیر pH بین 1 و 4 اتفاق می افتد (8). پپسین شامل یک صورتبندی دو لوبی با دو رزیدو آسپارتیک کاتالیتیکی(32Asp و215Asp) که در دو طرف جایگاهفعال میباشد و ساختار آن غالباً صفحه بتا و رندوم کویل با مارپیچ آلفا محدود میباشد (14). پپسین پیوندهای پپتیدی بین آمینواسیدهای هیدروفوبیک و ترجیحاً آروماتیک از قبیل تریپتوفان، فنیلآلانین وتیروزین را هیدرولیز می کند (5 و 6).
مواد دگرگونکننده پروتئین، سبب از هم گسیختن ساختمان دوم، سوم و چهارم میشوند بنابراین مواد دگرگونکننده سبب تخریب تمامی ترتیبهای ساختمان پروتئین به جز ساختمان اولیه شده و فعالیت بیولوژیک آن را از بین میبرند(11). هدف اصلی از مطالعات دگرگونسازی پروتئینها به دست آوردن اطلاعات اضافی در مورد ساختمان، خواص و عملکرد پروتئینها است. مطالعات غیر طبیعی کردن پروتئینها در محلولهای آبی انجام میشود و بنابراین در درک رفتار پروتئینها تحت شرایط فیزییولوژیک مفید خواهد بود. فرایند دگرگونسازی پروتئینها برای مطالعه نیروهای تعیینکننده ساختمان سوم حائز اهمیت است. استفاده دیگر از مطالعات دگرگونسازی مطالعه نیروهای مؤثر و نقش انواع میانکنشها در جایگاهفعال آنزیم است(7).
با توجه به اهمیت آنزیم پپسین به عنوان یک آنزیم صنعتی در صنایع غذایی از جمله تهیه پنیر، نوشابه و در چاشنیهای غذایی، و همچنین کاربردهای نانوذرات در صنعت، در این تحقیق پایداری دمایی پپسین در حضور نانوذرات اکسید روی و اکسیدآهن مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
در این مطالعه از آنزیم پپسین خوک (محصول شرکت سیگما) ، بافر گلایسین-اسیدکلریدریک با 2=pH در غلظت 1/0 مولار و نانوذرات اکسیدروی(اندازه14-10نانومتر) و اکسیدآهن(اندازه10نانومتر ) (محصولات شرکت سیگما) و از دستگاه اسپکتروفتومتر UV-Vis مدل فارماسیا-4000، جهت اندازه گیری استفاده شده است.
بررسی پایداری حرارتی آنزیم پپسین در حضور غلظتهای مختلف نانوذره اکسیدروی در دامنه حرارتی 303 تا 363 درجه کلوین: از بافر گلایسین-اسیدکلریدریک با 2pH= درغلظت 1/0 مولار و غلظتهای مختلف نانوذره اکسید روی( 0 تا 3/6 میکروگرم بر میلیلیتر) استفاده شد. منحنیهای دگرگون سازی در حضور نانوذره اکسید روی در طول موج 280 نانومتر با استفاده از محلولهای پپسین با غلظت 138/0 میلی گرم بر میلی لیتر به دست آمده است.
بررسی پایداری حرارتی آنزیم پپسین در حضور غلظتهای مختلف نانوذره اکسیدآهن در دامنه حرارتی 303 تا 363 درجه کلوین: از بافر گلایسین-اسیدکلریدریک با 2pH= درغلظت 1/0 مولار و غلظتهای مختلف نانوذره اکسید آهن( 0 تا 7/0میکروگرم بر میلیلیتر) استفاده شد. منحنیهای دگرگون سازی در حضور نانوذره اکسید آهن در طول موج 280 نانومتر با استفاده از محلولهای پپسین با غلظت 138/0 میلی گرم بر میلی لیتر به دست آمده است.
نتایج و بحث
پایداری حرارتی آنزیم پپسین با اندازهگیری تغییرات انرژی آزاد گیبس و Tmمحاسبه می گردد. برای این هدف با تغییر آنزیم از حالت طبیعی به حالت دگرگونشده، کسر دگرگونسازی بصورت زیر محاسبه میشود:
(1) FU=(AN-A)/(AN-AU)
در این رابطه، AN، جذب در حالت طبیعی، A، جذب مشاهده شده و AU، جذب در حالت دگرگونشده می باشند Keqیا ثابت تعادل از رابطه زیر بدست می آید:
(2) Keq=FU/(1-FU)=(AN-A)/(A-AU)
تغییرات انرژی آزاد گیبس نیز از این رابطه محاسبه میشود:
(3) ΔG°=-RTlnKeq=-RTln[FU/(1-FU)]=-RTln[(AN-A)/(A-AU)]
در این رابطه، R، ثابت گازها می باشد و برابر با 314/8 است و T، دما بر حسب کلوین می باشد.
Tmیا دمای ذوب یک آنزیم، دمایی است که در آن ΔG°برابر با صفر است.
نمودارهای 1 و 2 تغییرات کسر دگرگونسازی علیه دما در غلظتهای مختلف نانوذرات اکسیدروی و اکسیدآهن در 2pH= را نشان میدهند. همانطور که در این نمودارها دیده میشود، با افزایش غلظت نانوذرات اکسیدروی و اکسیدآهن، منحنیهای دگرگونسازی برای آنزیم پپسین تقریباً تغییر پیدا نکرده است یعنی هرچه غلظت نانوذرات اکسیدروی و اکسیدآهن افزایش می یابد، آنزیم پپسین تقریباً در همان دما دگرگون می شود.
در نمودارهای 3 و 4 تغییرات ΔG° علیه دما در غلظتهای مختلف نانوذرات اکسیدروی و اکسیدآهن در 2pH= مشاهده میشود. در این نمودارها دیده میشود که با افزایش غلظت نانوذرات اکسیدروی و اکسیدآهن، Tm آنزیم تقریباً تغییر نکرده است و درنتیجه پایداری حرارتی آن تقریباً ثابت مانده است.
نمودار 1- تغییرات)FUکسر دگرگونسازی)آنزیم پپسین علیه دما در غلظتهای مختلف نانوذره اکسیدروی در 2pH= و دامنه حرارتی303 تا 363 درجه کلوین
نمودار 2- تغییرات) FUکسر دگرگونسازی)آنزیم پپسین علیه دما در غلظتهای مختلف نانوذره اکسیدآهن در 2pH= و دامنه حرارتی303 تا 363 درجه کلوین
نمودار 3- تغییرات ΔG°آنزیم پپسین علیه دما در غلظتهای مختلف نانوذره اکسیدروی در 2pH= و دامنه حرارتی303 تا 363 درجه کلوین
نمودار4- تغییرات ΔG° آنزیم پپسین علیه دما در غلظتهای مختلف نانوذره اکسیدآهن در 2pH= و دامنه حرارتی303 تا 363 درجه کلوین
در طی چند سال اخیر، مشخص شدهاست که نانومواد کاربردهای زیادی در صنایع دارند. برای مثال، این نانومواد در کرمهای ضد آفتاب به منظور جذب نور UV استفاده می شوند و یا در خمیر دندان و رنگها برای تثبیت رنگ سفید به مدت طولانی، بهکار می روند، تعدادی از آنها نیز در صنعت الکترونیک مورد استفاده قرار می گیرند. علاوه بر این نانومواد کاربردهای زیادی در پزشکی، لوازم آرایشی، وسایل ورزشی، سلولهای سوختی و دیگر صنایع دارند. با این وجود نانوذرات به خاطر اندازه کوچکشان از طریق استنشاق، هضم، نفوذ پوستی یا تزریق وارد بدن می شوند و باعث ایجاد آسیب فیزیکی یا القای پاسخ التهابی زیان باری در بدن خواهند شد. در چندین مطالعه نشان داده شدهاست که نانوذرات می توانند از سد خونی-مغزی عبور کنند و وارد سیستم عصبی مرکزی(CNS) شوند. همچنین استرس اکسیداتیو ایجاد شده از طریق نانوذرات باعث از بین رفتن لیپیدها، کربوهیدراتها، پروتئینها و DNA خواهد شد که در این بین، پروکسیداسیون لیپید، بیشترین آسیب را به بدن وارد می کند چون سبب می شود که در غشای سلول تغییراتی ایجاد شود(19و20). از نانوذرات اکسیدروی در زمینه های متعددی از جمله در پوشش رسانای اکسیدی با قابلیت هدایت بالا برای سلولهای خورشیدی، حسگر های گازی، آشکار ساز های نوری ماوراء بنفش،جاذب شیمیایی، کاتالیستهایی برای هیدروژن دار کردن درفاز مایع، کاتالیستهایی برای تخریب نوری به جای نانو ذره های تیتانیوم، ساخت نیمه هادیها، فیلترکننده های اشعه ماوراء بنفش و در زمینه های علوم پزشکی و دارویی به عنوان یکی از پرکاربردترین نانوذرات برای مقابله با عفونتهای بیمارستانی ناشی از باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی استفاده می شود (1).
نانوذرات از جمله اکسید کادمیوم در طراحی حسگرهای زیستی نیز کاربرد دارند، نقش مؤثر نانوذرات در حسگرهای زیستی افزایش سرعت انتقال الکترون بین گونه احیاء واکسایش می باشد (2).
در مطالعه ای که اثر نانوذره 2SiO را بر روی آنزیم لیزوزیم بررسی کردند نشان دادند با افزایش غلظت نانوذره 2SiO میزان آلفا هلیکس لیزوزیم نسبت به آنزیم طبیعی کمتر می گردد. علاوه بر این با افزایش سایز نانوذره 2SiO نیز میزان آلفاهلیکس لیزوزیم کاهش می یابد (18). نانوذره 2SiO دارای بار منفی است و از طریق بر همکنش الکترواستاتیک با لیزوزیم واکنش میدهد و سبب باز شدن تاخوردگی آنزیم میشود و ساختار دوم لیزوزیم از بین میرود میزان آلفا هلیکس کم شده ولی پیچه های تصادفی زیادمیشوند، همچنین محتوای صفحه بتا کمی افزایش می یابد (21). در مطالعهای که اثر نانوذرات اکسیدروی بر روی پروتئین میوگلوبین بررسی شده، نشان داده شده است که جزء آلفاهلیکس میوگلوبین کاهش می یابد اگرچه حتی در حضور بیشترین غلظت نانوذرات اکسیدروی ساختار مارپیچی میوگلوبین حفظ می شود(9). آزمایشات مختلف نشان دادهاند که وقتی لیزوزیم برروی سطح نانوذره مغناطیسی اکسیدآهن جذب می شود، محتوای صفحه بتای آن از 42/25 درصد به 49/27 درصد افزایش می یابد و محتوای آلفا-هلیکس آن نیز از 9/15 درصد به 29/24 درصد افزایش پیدا میکند. برعکس، محتوای رندومکویل و T-ترن کاهش مییابد (17).
در مطالعه ای که اثر نانوذره TiO2را بر روی لیزوزیم بررسی کردند نشان داده شده است که اثر TiO2 روی ساختار دوم لیزوزیم اثر می گذارد به این صورت است که میزان آلفا هلیکس آنزیم را به شدت کاهش می دهد ولی بتا شیت را افزایش می دهد و پیچ- بتا را همراه با رندوم کویلها کاهش می دهد. با نزدیک شدن لیزوزیم به سطح TiO2 هیدروژن باند هایی از نوعN-H…..O , O-H…..O تشکیل می شوند. دلیل این تغییرات گسترده بر روی ساختمان دوم لیزوزیم این است که تعداد زیادی از گروههای زنجیره های قطبی به TiO2 باند هستند لیزوزیم دچار پیچ خوردگی و تغییر ساختار زنجیره ها می شود که از این رو هیدورژن باند های آلفا هلیکسهای داخلی از بین می روند (22).
در مطالعه ای که اثر نانوذره 2TiO را بر روی پپسین بررسی کردند نشان دادند که نانو 2TiO، sheet-β وturn-β را کاهش میدهد و همچنین لوپ hairpin-β را که از جایگاه فعال محافظت میکند، تخریب می نماید. نانو 2TiO یک اثر اتصالی قوی دارد و میتواند OH- در سطح ذرات در شرایط آبی تولید کند. اثر اتصالی و تجمع OH- ممکن است سبب تغییر در قطبیت پپسین و ساختار جایگاهفعال شود، به این صورت منجر به کاهش فعالیت پپسین شود. برهمکنش بین نانو 2TiO و پپسین بیشتر الکتروستاتیک، همراه با اتصالات هیدروفوبیک میباشد. برهمکنش نانو2TiO با پپسین از نوع غیرکووالان است. اتصال غیرکووالان، شامل نیروهای الکتروستاتیک، اتصالات هیدروفوبیک و پیوند هیدروژنی، اغلب ضعیف و غیراختصاصی است اما ترکیبی از پیوندهای غیرکووالان ممکن است سبب تغییر صورتبندی و عملکرد پروتئین شود(23).
Tm، یک شاخص پایداری گرمایی پروتئین است، Tm بالاتر نشان دهنده پایداری بیش تر پروتئین است. دگرگون سازی پروتئین یک متد کلیدی در ترمودینامیک و آنالیز جایگاه اتصال است که می تواند درک و فهم را از ارتباط ساختار و عملکرد پروتئین افزایش دهد (3). Tm یا دمای ذوب یک آنزیم، دمایی است که در آن ΔG° برابر با صفر است. که نحوه محاسبه آن در ابتدای مبحث نتایج بیان شده است. در نمودارهای تغییرات کسر دگرگون سازی علیه دما چنانچه نمودار به سمت دمای بیشتر شیفت کند یعنی میزان پایداری آنزیم بیشتر شده است در واقع آنزیم در دمای بیشتری دگرگون می شود، چنانچه چنانچه نمودار به سمت دمای کمتر شیفت کند یعنی میزان پایداری آنزیم کمتر شده است در واقع آنزیم در دمای کمتری دگرگون می شود.
همان طور که در نمودارهای کسردگرگون سازی و تغییرات انرژی آزاد گیبس نشان داده شد با افزایش غلظت نانوذره اکسیدروی و اکسیدآهن منحنیهای دگرگونسازی برای آنزیم پپسین تقریباً تغییر پیدا نکرده است یعنی هرچه غلظت نانوذره اکسیدروی و اکسیدآهن افزایش مییابد، آنزیم پپسین تقریباً در همان دما دگرگون میشود. با توجه به اینکه pH ایزوالکتریک آنزیم پپسین تقریباً 1 می باشد (5). آنزیم پپسین در pHهای بالاتر ازنقطه ایزوالکتریک دارای بار منفی ودرpH های پایین تر از آن دارای بار مثبت است. پس در نتیجه آنزیم پپسین در 2pH= دارای بار منفی می باشد. از طرفی نانوذرات اکسیدروی و اکسیدآهن به ترتیب دارای نقطه ایزوالکتریک 9 و1/5 هستند(12). پس این نانوذرات در 2pH= دارای بار مثبت هستند و پپسین هم که دارای بار منفی است، بنابراین نانوذرات اکسیدروی و اکسیدآهن از طریق برهمکنش الکتروستاتیک و همچنین از طریق پیوند هیدروژنی در صورتی که زاویه و فاصله بین آنها به اندازهای باشد که برای تشکیل پیوند هیدروژنی مجاز باشد، به پپسین متصل می شوند، با توجه به نتایج به دست آمده از آزمایش می توان گفت که میزان برهمکنشهای هیدروژنی و الکتروستاتیک بین نانوذرات اکسیدروی با پپسین به اندازهای نبوده که سبب تغییر ساختار سهبعدی آنزیم و دناتوراسیون آن شود.
', './data/cell/coversheet/161463480843.jpg'))
Volume 28, Issue 3 - Serial Number 3
November 2015Pages 344-351
- Receive Date: 12 November 2014
- Revise Date: 09 February 2015
- Accept Date: 16 March 2015