Document Type : Research Paper
Authors
1 Department of Medicine, Faculty of Medicine, Qom Branch, Islamic Azad University, Qom, Iran
2 Materials and Nuclear Fuel Research School, Nuclear Science and Technology Research Institute, Tehran, I.R. of Iran
3 Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Garmsar Branch, Islamic Azad University, Garmsar-Iran
4 Department of Biochemistry, Faculty of Sciences, Payame-e-Noor University, Tehran, Iran
5 Department of biology, Faculty of Sciences, Hakim sabzevari University, Sabzevar, Iran
Abstract
Mentha Spicata is an Iranian native plant with therapeutic effects. In this study, the effects of M. Spicata essential oils were investigated through considering oxidative injury parameters as well as expression of COX-2 inflammatory gene in lung tissue of experimental cecal ligation and puncture (CLP) rat model. Rats were divided into 5 groups: negative control (lapratomy), CLP, treatment groups with M. Spicata E.O (50 and 100 mg/kg b.w) and indomethacin. Then, 24h after CLP induction, LP, GSH, GST, FRAP, MPO, PGE2 and COX-2 expression were measured in plasma and lung tissues. The data indicated that the sepsis induction reduced GSH, FRAP and increased LP, MPO, PGE2 and COX-2 levels but didn`t affected GST activity. Treatments of rats with E.Os as well as indomethacin were been effective in increasing the GSH, FRAP and decreasing the LP, MPO, PGE2 and COX-2 levels. Histopathological examinations indicated that sepsis caused lung tissue damage which was decreased by E.O treatments. In conclusion, sepsis causes oxidative lung tissue damage and use of M. Spicata can prevent injuries through modulation the oxidative stress/antioxidant parameters.
Keywords
Main Subjects
تاثیر اسانس نعنا بر روی استرس اکسیداتیو و بیان ژن COX-2 در پیشگیری از سپسیس
ابوالفضل دادخواه1*، فائزه فاطمی2، محمدرضا محمدی ملایری3، آزاده رسولی4 و محمد حسن کاروین آشتیانی5
1 ایران، قم، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد قم، دانشکده پزشکی، گروه پزشکی
2 ایران،پژوهشگاه علوم و فنون هسته ای، پژوهشکده مواد و سوخت هسته ای
3 ایران، گرمسار، دانشگاهآزاداسلامی،واحدگرمسار، دانشکدهدامپزشکی،گروهپاتوبیولوژی
4 ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، واحد تهران شرق، گروه بیوشیمی
5 ایران، سبزوار، دانشگاه حکیم سبزواری، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی
تاریخ دریافت: 22/7/96 تاریخ پذیرش: 10/4/97
چکیده
نعناع با نام علمی Mentha Spicataیکی از گیاهان بومی ایران با اثرات درمانی بسیار است. در این تحقیق، تاثیر اسانس نعنا بر روی پارامترهای دخیل در آسیب اکسیداتیو و بیان ژن التهابی COX-2 بافت ریه در مدل تجربی التهابی CLP در رت مورد مطالعه قرار گرفته است. رت ها به پنج گروه کنترل منفی (Laparatomy)، CLP و گروه های تیمار بااسانس نعنا (mg/kg bw 100 و 50) و داروی ایندومتاسین تقسیم شدند. سپس، 24 ساعتپس از جراحی، سطح فاکتورهایینظیرLP ،GSH ، GST،FRAP ، MPO، PGE2 و بیان ژن COX-2 در پلاسما و بافت ریه اندازه گیری شد. نتایج این تحقیق نشان می دهد که سپسیس موجب کاهش FRAPو GSH و افزایش میزان LP ، MPO، PGE2 و بیان ژن COX-2 میگردد، ولی بر روی آنزیم GST اثری ندارد. تیمار حیوانات با اسانس نعنا به اندازه ایندومتاسین، در تعدیل سطح این پارامتر ها موثر بوده است، بطوریکه سبب افزایش میزان FRAP و GSH و کاهش میزانLP ، MPO، PGE2 و بیان ژن COX-2 میگردد. همچنین مطالعات پاتولوژی نشان می دهد که سپسیس منجر به ایجاد آسیب هایی در بافت ریه شده که این آسیب ها در اثر تیمار با اسانس نعنا کاهش یافته اند. نتیجه گیری: سپسیس موجب آسیب اکسیداتیو بافت ریه شده و استفاده از اسانس نعنا با تاثیر بر روی پارامترهای استرس اکسیداتیو و آنتی اکسیدانی میتواند در جلوگیری و بهبود این آسیب ها موثر باشد.
واژه های کلیدی: اسانس نعنا،CLP ، استرس اکسیداتیو، ضد التهاب، سپسیس
* نویسنده مسئول، تلفن: 09122490620 ، پست الکترونیکی: dadkhah_bio@yahoo.com
مقدمه
امروزه مصرف گیاهان دارویی با هدف دستیابی به داروهای کم خطر و با حداقل عوارض جانبی، روز به روز در حال افزایش است و این به دلیل به اثبات رسیدن اثر بخشی بسیاری از این مواد در مجامع علمی و مقبولیت آن در اکثر جوامع بشری است (47). گیاه نعنا (Mentha Spicata)، یکی از این گیاهان دارویی می باشد که در طب سنتی ایران برای درمان معده درد و اختلالات روده استفاده می شود (27، 28). همچنین، در طب سنتی غالباً از دمکرده برگ های آن به عنوان مدر (19)، تسریع کننده عمل هضم، رفع آسم، اسپاسم، درد معده، سردرد، سرماخوردگی و سرفه و همچنین به صورت استعمال خارجی برای درمان زخم ها و غدد متورم (49) و نیز برای درمان برونشیت، نفخ شکم، بی اشتهایی، کولیت و اختلالات روده ای مانند تهوع، سوء هاضمه و اسهال (29) و به عنوان آنتی اکسیدان (35)، ضدقارچ (49)، ضد باکتری (41، 42) و ضد انقباض و تشنج (19) استفاده می شود.
سپسیس یا عفونت خون، بیماری بالینی تهدید کننده ای است که هرساله 27 میلیون نفر در سراسر جهان را درگیر می کند. بروز سپسیس هنوز هم در حال افزایش است، به طوریکه در 10-30% از بخش های مراقبت های ویژه (ICU) رخ می دهد (39، 34، 33). شوک سپتیک (مرحله شدید سپسیس) با مرگ و میر بالای 40% همراه می باشد (37). پاسخ ایمنی پس از سپسیس، منجر به پاسخ شدید التهابی و در نهایت اختلال و شوک ارگان ها می شود. التهاب فرایندی است که توسط عوامل مختلف بیولوژیکی شروع گردیده و نه تنها مستقیماً با فعالسازی سیستم ایمنی بلکه با واسطه سیکلواکسیژناز ـ 2 (COX-2) نیز در ایجاد بیماری دخالت می کند (45، 32). علاوه بر نقش فاکتورهای التهابی در پاتوژنز بیماری سپسیس، COX-2 و محصول آن PGE-2 مسئول بیشتر عوارض ناشی از سپسیس می باشند. در جراحت و سپسیس، پروستاگلاندین های تولید شده توسط COX-2 از ماکروفاژها آزاد شده و نقش بسیار مهمی را در پاسخ ایمنی ایفا می کنند (32). سپسیس تقریبا به طور مستقیم یا غیر مستقیم عملکرد تمام انواع سلول های ایمنی را مختل می کند (24، 25). شدت و مدت زمان مرحله پاسخ ایمنی سبب افزایش عفونت های بیمارستانی و مرگ و میر ناشی از آن می گردد (24، 25، 6). علاوه بر این، یکی دیگر از عوارض و مشکلات ناشی از سپسیس به هم خوردن تعادل سیستم استرس اکسیداتیو بدن است (7). استرس اکسیداتیو زمانی ایجاد میشود که تعادل بین تشکیل گونه های اکسید کننده و حذف آنها توسط ترکیبات آنتی اکسیدان در اثر تولید زیاد رادیکال های آزاد اکسیژن
ROS (Reactive Oxygen Species) و یا تضعیف سیستم دفاع آنتی اکسیدانی مختل شود (22). این فرآیند ها در سپسیس منجر به آسیب اکسیداتیو بسیاری از بافت های بدن از جمله قلب، کلیه، کبد و ریه و از کارافتادن بافت ها و در نهایت مرگ می گردد (50). به همین دلیل، با توجه به نقش مهم و اصلی استرس اکسیداتیو در عوارض ناشی از سپسیس، استفاده از آنتی اکسیدانها و عناصر طبیعی در کاهش این عوارض، مورد توجه می باشد (50).
با توجه به نرخ بالای مرگ و میر مرتبط با سپسیس و به منظور دستیابی به داروهای کم خطر، برای اولین بار در این مطالعه اثر اسانس نعنا به عنوان یک گیاه بومی ایرانی در درمان بیماری ریوی ناشی از سپسیس مورد بررسی قرار گرفته است. بنابراین هدف از این مطالعه، ارزیابی اثر محافظتی اسانس نعنا بر آسیب ریه ناشی از سپسیس در روش CLP در موش های صحرایی با در نظر گرفتن پارامترهای ضروری استرس اکسیداتیو/آنتی اکسیدان و بیان ژن COX-2 می باشد.
مواد و روشها
تهیهاسانسنعنا: اسانس نعنا از شرکت باریج اسانس تهیه گردیده (Batch No. 3138-031-93/8(707051); Sample Serial No.:BE930347) و به روش
(GC-MS) Gas Chromatography – Mass Spectroscopy آنالیز گردید (17-15).
آنالیز اسانس نعنا با استفاده از GC-MS : تجزیه اسانس با دستگاه GC-MS مربوط به بخش تحقیقات گیاهان دارویی در موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع انجام شد و شناسایی ترکیبات توسط متخصصین مربوطه در موسسه انجام گردید. در این روش، اسانس نعنا بهوسیله دستگاه کروماتوگرافی گازی (GC Trace Thermo Finnigan) مجهز به آشکارساز یونی شعلهای، جداسازی شد. آنالیز نمونهها بر اساس نرمافزار Euro Chrom 2000 از شرکت KNAUER توسط روش نرمالیزه کردن سطح و با استفاده از ستون سیلیکای مذاب TR-5 m)µ025/0 ضخامت فیلم، mm 25/0×m30) و دتکتور اسپکترومترجرمی
Thermo Trace DSQ (Dual Stage Quadrupole)، برنامه دمایی ºC280ـ50 در میزان C/min 100، دمای انژکتوری
ºC270، دمای آشکارساز ºC230 و گاز حامل هلیم (%99/99) انجام گرفت.
دستگاه GC/MS شامل گروماتوگراف گازی
GC Trace Thermo Finnigan مجهز به اتوسمپلر
3000 Thermo AS بوده و ستون مورداستفاده نیز همانند ستون GC با شرایط فوقالذکر میباشد. اجزاء و ترکیبات اسانسها توسط مقایسه طیفسنجی جرمی با استانداردهای موجود شناسایی شدند. شناسایی ترکیبات مجهول با مقایسه شاخصهای بازداری آنها با ترکیبات استاندارد تأیید گردیدند.
تیمار حیوانات و نمونه گیری: در این تحقیق، از 130 سر رت نر بالغ با وزن متوسط 100 گرم استفاده گردید که از مرکز نگهداری حیوانات آزمایشگاهی از انستیتوپاستور ایران خریداری شدند. غذای حیوانات از کارخانجات فرآورده های غذایی تهران تهیه شده که به صورت Pellet با فرمول استاندارد بود. حیوانات بالغ نیز دسترسی آزاد به غذا و آب آشامیدنی از طریق بطری داشتند. حیوانات به 5 گروه تقسیم شدند: 1- گروه کنترل منفی: که حیوانات حلال اسانس نعنا (DMSO) به مدت 2 هفته به صورت خوراکی مصرف کرده و سپس در روز پانزدهم جراحی لاپاراتومی انجام گردید. 2- گروه CLP: که همانند گروه کنترل منفی تیمار شدند و سپس در روز پانزدهم جراحی CLP انجام گردید. 3 و 4- گروه های تیمار: که اسانس نعنا در دز های 50 و 100 mg/kg bw به صورت خوراکی، روزانه به مدت دو هفته دریافت کردندو سپس در روز پانزدهم جراحی CLP انجام گردید. 5- گروه کنترل مثبت: که با داروی ضد التهابی ایندومتاسین (2 mg/kg bw)، به مدت دو هفته تیمار شده و سپس در روز پانزدهم جراحی CLP انجام گردید.
جراحی CLP : در روشCLP ، پس از بیهوش کردن رتها، در دیواره شکمی آنها به اندازه 2 سانتی متر برش ایجاد گردید. سپس، سکوم خارج شده و بخش سکوم تا زیر دریچه ایلئوسکال بخیه زده شده و در سکوم آنها 2 سوراخ توسط نیدل G20 ایجاد گردید. بعد از این مرحله، روده به داخل محفظه شکمی برگردانده شده و پوست و صفاق بخیه زده شد. رت ها 24 ساعت پس از جراحی CLP بیهوش شدند و از قلب آنها خونگیری شد. در مرحله بعدی، حیوانات کشته شده و بافت ریه آنها به منظور بررسی های هیستوپاتولوژیکی و بیوشیمی جدا گردید.
اندازه گیری سطح فاکتور های دخیل در استرس اکسیداتیو در بافت ریه و پلاسما
تهیه هموژن بافت ریه: برای تهیه هموژن 20% (W/V) از بافت ریه، 4/0 گرم از بافت در یک استوانه مدرج مناسب قرار داده شد و روی آن PBS سرد (3/7=pH) تا حجم 2 میلی لیتر ریخته شد. سپس، مخلوط فوق داخل لوله مخصوص دستگاه هموژنایزر ریخته شده و محتویات لوله با حدود 5 تا 7 بار بالا و پایین کردن هموژن گردید.
اندازه گیری سطح MDA در هموژن بافت ریه: اساس اندازهگیری MDA این است که TBA با MDA ترکیب شده و محصول نارنجی رنگی ایجاد میکند که در 535 نانومتر جذب دارد. غلظت MDA با اندازه گیری میزان جذب توسط دستگاه اسپکتروفتومتر و از روی ضریب خاموشی آن (L/cm.mmol105×56/1) محاسبه گردید (52).
اندازه گیری سطح گلوتاتیون احیا در هموژن بافت ریه: GSH با استفاده از معرف Ellman’s و براساس روش Seldak و Limdsay (1968) اندازهگیری شد (43). در این روش میزان جذب کمپلکس گلوتاتیون با CDNB در طول موج 412 نانومتر اندازه گیری شده و بر اساس منحنی استاندارد میزان آن محاسبه گردید (43).
اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم میلوپراکسیداز MPO در بافت ریه: فعالیت MPO با کمی تغییر مطابق روش Hillegas و همکاران انجام شد (23). در این روش تغییر جذب ناشی از مصرف H2O2 توسط آنزیم میلوپراکسیداز در طول موج 460 نانومتر اندازه گیری شد (23).
اندازه گیری فعالیت آنزیم گلوتاتیون s– ترانسفراز GST در هموژن بافت ریه: فعالیت این آنزیم با استفاده از سوبسترای CDNB و تغییر جذب آن در طول موج 360 نانومتر اندازه گیری شد (10).
اندازه گیری ظرفیت آنتی اکسیدانی توتال پلاسما: ظرفیت آنتی اکسیدانی توتال پلاسما توسط تست FRAP و با استفاده از سوبسترای TPTZ در طول موج 593 نانومتر اندازه گیری شد (9).
اندازه گیری غلظت پروستاگلاندین E2 (PGE2) در پلاسما: غلظت PGE2 بر اساس روش ELISA و با استفاده از کیت (Assay Desighs Co ;U.S.A) ELISA اندازه گیری شد.
بررسی بیان ژن COX-2 در سطح mRNA در بافت ریه
استخراج RNA و ساخت cDNA : به منظور استخراج RNA از کیت استخراج RNA (BioBasic Inc, Canada) استفاده شد. سپس، به منظور حذف DNA از RNA استخراج شده، از آنزیم DNase شرکت
Thermo Scientific استفاده شد. به منظور یکسان بودن غلظت RNA مصرفی در ساخت cDNA، غلظت RNA موجود در نمونههای تیمار شده با DNase، توسط دستگاه نانودراپ NanoDrop 2000)) خوانده شد. در نهایت، میزان معینی از RNA برای ساخت تمامی cDNAها استفاده گردید. برای ساخت cDNA از RNA استخراج شده، از کیت شرکت تاکارا (Takara bio Inc, Japan) استفاده گردید.
انجام واکنش PCR : به منظور تأیید انجام مراحل قبل، واکنش PCR برای ژن مورد نظر انجام شد، میزان و غلظت مواد مورداستفاده برای حجم 25 میکرو لیتری و برنامه چرخه حرارتی واکنش PCR در جدول های 1 و 2، ذکر شده است. سپس محصول حاصل بر روی ژل آگارز 5/2% بارگذاری گردید. به منظور انجام واکنش PCR و
Real time PCR، از پرایمرهای اختصاصی ژن COX-2 و GAPDH استفاده شد.
جدول 1- میزان و غلظت مواد مورداستفاده جهت تهیه مخلوط واکنش برای PCR به حجم نهایی µl 25.
غلظت |
ماده مصرفی |
μl5/2 |
10X بافر |
μl75/0 |
MgCl2 (50Mm each) |
μl5/0 |
dNTP (10mM each) |
μl 1 |
Forward primer (10µM each) |
μl 1 |
Reverse perimer (10µM each) |
μl 3/0 |
Taq DNA polymerase (5u/µl) |
ng 50 |
Template DNA |
μl 25 to |
Nuclease-free water |
μl 25 |
Total volume |
جدول 2- برنامه حرارتی PCR مورداستفاده
تعداد سیکل |
مدتزمان |
درجه حرارت |
عمل انجام شده در این مرحله |
مرحله |
1 |
5 دقیقه |
95 درجه سانتیگراد |
Initial denaturation |
مرحله اول |
35 |
20 ثانیه |
95 درجه سانتیگراد |
Denaturation |
مرحله دوم |
20 ثانیه |
60 درجه سانتیگراد |
Annealing |
||
20 ثانیه |
72 درجه سانتیگراد |
Extention |
||
1 |
5 دقیقه |
72 درجه سانتیگراد |
Final Extention |
مرحله سوم |
جدول 3- توالی پرایمرهای مورد استفاده
primers |
Sequence (5' 3') |
Tm |
Product Length |
COX2 forward |
ACCTCTGCGATGCTCTTC |
50.3 ºC |
188 bp |
COX2 reverse |
AGGAATCTCGGCGTAGTAC |
51.1 ºC |
|
GAPDH forward |
TGCCAGCCTCGTCTCATAG |
53.2 ºC |
197 bp |
GAPDH reverse |
ACTGTGCCGTTGAACTTGC |
51.1 ºC |
بدین منظور، پرایمر مورد نظر با استفاده از اطلاعات موجود در بانک ژن NCBI طراحی شده و پس از اطمینان حاصل پیدا کردن، پرایمرهای مورد نظر سنتز شدند. جدول 3 مشخصات پرایمرهای مورد استفاده را نشان می دهد.
انجام واکنشReal time PCR: واکنش Real time PCR با استفاده از پرایمر اختصاصی و کیت مخصوص QuantiNova SYBR Green PCR Kit انجام پذیرفت. این کیت حاوی تمام مواد لازم برای انجام واکنش PCR (آنزیم Taq، بافر همراه باMgCl2 و dNTPs) و رنگ سایبرگرین می باشد که به عنوان مستر میکس مورد استفاده قرار میگیرد. هر واکنش Real time PCR (حجم نهایی10 میکرولیتر) حاوی μl 5 مسترمیکس،μl 4/0 پرایمرهای Forward و Reverse (جدول 1)، μl 5/0 cDNA، و
μl9/3 آب عاری از Nuclease میباشد. پس از مخلوط کردن مواد مذکور، به منظور اطمینان از صحت انجام واکنش، نمونههای حاوی ژن مورد آزمایش (COX-2) و نمونه حاوی ژن کنترل داخلی )(GAPDH در پلیتها به صورت سه تایی ریخته شد. همچنین، برای اطمینان حاصل کردن از عدم آلودگی و خطاهای حاصل از آن، برای هر ژن سه کنترل منفی در نظر گرفته شد که میزان الگوی مورد نظر (cDNA) با آب مقطر جایگزین گردید. در نهایت، از چرخه حرارتی ذکر شده در جدول 4 استفاده شده و به منظور محاسبه میزان تغییرات بیان ژن COX-2 از روش
CT DD استفاده گردید.
بررسی هیستوپاتولوژی بافت ریه: نمونه های بافتی ریه پس از جدا سازی در محلول بافر فرمالین10 درصد تثبت گردید و در ادامه، به روش متداول از آنها قالب های پارافینی تهیه گردید و با دستگاه میکروتوم به ضخامت 4 میکرون برش داده شد. نهایتاً برش های بافتی با هماتوکسیلین و ائوزین رنگ آمیزی شده و با میکروسکوپ نوری مورد ارزیابی هیستوپاتولوژی قرار گرفتند.
جدول 4 - چرخه حرارتی واکنش Real-Time PCR
تعداد سیکل |
زمان |
دما |
مرحله |
1 |
́ 2 |
oC 95 |
1 |
|
|
|
|
40 |
²15 |
oC 95 |
2 |
|
²20 |
oC 60 |
|
|
²20 |
oC 72 |
|
1 |
²15 |
oC 95-57 |
3 |
همچنین، برای ارزیابی میزان تأثیر تیمارها، آسیب های بافتی به روش زیر مورد تحلیل کمی قرار گرفتند. نمونه های هیستوپاتولوژی از لحاظ شاخص های پرخونی، ادم التهابی بافت های بینابینی و شدت ارتشاح نوتروفیل در بافت های بینابینی ریه مورد ارزیابی قرار گرفته و به روش زیر امتیاز دهی شدند. شاخص شدت آسیب بافتی و میانگین تعداد نوتروفیل های نفوذ یافته و حاشیه نشین شده، از طریق شمارش تعداد سلول های التهابی چند هستهای (پلی مورفونوکلیر) (نوتروفیل) در ده فیلد (میدان) میکروسکوپیک و محاسبه میانگین آنها برآورد گردید. شاخص هیستولوژیکی بر اساس شدت آسیب بافتی از 0 تا 4 درجه بندی شد، بدین صورت که عدد (درجه) صفر نشانگر تعداد 0 تا 9 نوتروفیل، عدد (درجه) 1 نشان دهنده تعداد10 تا 19 نوتروفیل، عدد (درجه) 2 نشانه تعداد 20 تا 29 نوتروفیل، عدد (درجه) 3 نشان دهنده تعداد 30 تا 39 نوتروفیل و نهایتاً عدد (درجه) 4 نشانگر40 تا 49 نوتروفیل نفوذ یافته یا حاشیه نشین شده در هر میدان میکروسکوپیک بود. برای امتیاز دهی به شاخص پرخونی و ادم بافت بینابینی مقیاس درجه بندی نیمه کمی مورد استفاده قرار گرفت، به طوری که عدد (درجه) صفر برای توصیف حالت طبیعی بودن تغییر بافتی)؛ 1+: برای تغییرات بافتی خفیف؛ 2 +: برای تغییرات بافتی ملایم (متوسط) و 3+ برای تغییرات شدید و 4+ برای تغییرات خیلی شدید مورد استفاده قرار گرفت.
آنالیز آماری: تفاوت های بین داده ها با استفاده از نرم افزار SPSS و تست ANOVA تعیین گردید. با استفاده از این نرم افزار P- value داده ها، محاسبه گردید و P
نتایج
بررسی آنالیز اسانس نعنا بر اساس کروماتوگرافی گازی-طیف سنجی جرمی (GC-MS): طبق جدول 5، 21 نوع ترکیب در اسانس نعنا شناسایی گردید که در بین آنها بیشترین مقدار را کاروون (%43/61)، لیمونن (%77/27) و ایزو دی هیدرو کاروون (%47/3) دارا می باشند (جدول 5).
تاثیر اسانس نعنا بر روی فاکتورهای استرس اکسیداتیو بافت ریه: همانطور که در جدول 6 نشان داده شده است، سطح MDA به عنوان محصول لیپید پراکسیداسیون در بافت ریه رتهای مبتلا به سپسیس (گروه CLP) افزایش مییابد .(P<0.05) تیمار رتهای سپتیکی با اسانس نعنا در دو دز mg/kg b.w50 و 100 باعث کاهش معنی دار سطح پراکسیداسیون لیپیدها گردید که این کاهش در گروه تیمار شده با داروی ضد التهابی ایندومتاسین نیز دیده شد (P<0.05). سطح گلوتاتیون و FRAP به ترتیب در ریه و پلاسمای رتهای مبتلا به سپسیس (گروه CLP) نسبت به گروه کنترل کاهش یافت .(P<0.05) تیمار رتهای سپتیکی با اسانس نعنا با هر دو دز باعث افزایش معنی دار میزان گلوتاتیون گردید که این افزایش در گروه تیمار شده با ایندومتاسین نیز دیده شد (P<0.05). در فعالیت آنزیم GST در بافت ریه در گروه های CLP و گروه های تیمار تغییری مشاهده نگردید (P>0.05) (جدول 6).
جدول 5- ترکیبات شیمیایی اسانس نعنا
No. |
Compound |
RI |
% |
1 |
α-Pinene |
9677/920 |
87/0 |
2 |
β-Pinene |
9892/956 |
81/0 |
3 |
Sabinene |
2258/953 |
51/0 |
4 |
Myrcene |
5914/965 |
33/0 |
5 |
Limonene |
226/1003 |
77/27 |
6 |
Limonene oxide |
171/1088 |
1/0 |
7 |
Iso-dihydro carvone |
891/1139 |
47/3 |
8 |
Carveol |
306/1168 |
4/0 |
9 |
Pulegone |
224/1173 |
81/0 |
10 |
Carvone |
525/1188 |
43/61 |
11 |
Carvone oxide |
624/1204 |
11/0 |
12 |
Iso pulegone acetate |
306/1239 |
12/0 |
13 |
Trans carvyl acetate |
243/1246 |
04/0 |
14 |
Carvyl acetate |
474/1266 |
72/0 |
15 |
Bourbunene |
861/1287 |
43/0 |
16 |
Iso Caryophyllene |
217/1304 |
06/0 |
17 |
Caryophyllene (Isomer) |
663/1315 |
42/1 |
18 |
Farnesene |
94/1334 |
12/0 |
19 |
Caryophyllene (Isomer) |
566/1341 |
14/0 |
20 |
Germacrene |
048/1362 |
03/0 |
21 |
Caryophyllene epoxide |
038/1442 |
31/0 |
Total |
100 |
جدول 6- تأثیر اسانس نعنا بر روی فاکتورهای استرس اکسیداتیو بافت کبد
گروه ها |
MDA |
GSH |
FRAP |
GST |
LAP |
52/8 ± 65/0 |
63/3 ± 36/0 |
407 ± 76/21 |
92 ± 65/4 |
CLP |
41/14 ± 93/0* |
2 ± 18/0* |
257 ± 98/10* |
33/95 ± 41/4 |
E.O 50 |
66/9 ± 89/0** |
33/3 ± 36/0** |
387 ± 3/9** |
2/98 ± 77/5 |
E.O 100 |
55/9 ± 84/0** |
52/3 ± 27/0** |
379 ± 86/12** |
127 ± 93/5 |
Indomethacin |
68/9 ± 35/0** |
5/3 ± 24/0** |
280 ± 2/18 |
92 ± 04/5 |
علامت * نشان دهنده نتیجه حاصل از آنالیز آماری گروه CLP بوده که با گروه LAP معنی دار استP<0.05) ). علامت ** نشان دهنده نتیجه حاصل از آنالیز آماری گروه های مختلف تیمار بوده که با گروه CLP معنی دار هستندP<0.05) ).
تاثیر اسانس نعنا بر روی فعالیت میلو پراکسیداز بافت ریه: آنزیم میلوپراکسیداز در بافت ریه رت های سپتیکی (گروه CLP) نسبت به گروه کنترل (لاپاراتومی) در 24 ساعت پس از القاء سپسیس افزایش معنی داری پیدا کرد (P<0.05). تیمار رت ها با اسانس نعنا در دو دز
mg/kg b.w50 و 100 و نیز داروی ایندومتاسین باعث کاهش سطح آنزیم میلوپراکسیداز در بافت ریه رت های مبتلا به سپسیس گردید (P<0.05) (نمودار 1).
نمودار 1- تأثیر اسانس نعنا بر میزان فعالیت آنزیم میلو پراکسیداز در بافت ریه
علامت * نشان دهنده نتیجه حاصل از آنالیز آماری گروه CLP بوده که با گروه LAP معنی دار استP<0.05) ). علامت ** نشان دهنده نتیجه حاصل از آنالیز آماری گروه های مختلف تیمار بوده که با گروه CLP معنی دار هستندP<0.05) ).
تاثیر اسانس نعنا بر روی غلظت پروستاگلاندین E2 (PGE2) در پلاسما: بر اساس نمودار 2، میزان پروستاگلاندین E2 در پلاسمای رت های سپتیکی (گروه CLP)- 24 ساعت بعد از القاء سپسیس- نسبت به گروه کنترل (لاپاراتومی) افزایش معنی داری داشت (P<0.05). اسانس نعنا در دو دز mg/kg b.w50 و 100 باعث کاهش سطح پلاسمایی پروستاگلاندین E224 ساعت بعد از القاء سپسیس گردید (P<0.05) که این کاهش در گروه تیمار شده با داروی ایندومتاسین (گروه کنترل مثبت) نیز دیده شد (P<0.05) (نمودار 2).
نمودار 2- تاثیر اسانس نعنا بر روی غلظت پروستاگلاندین E2 در پلاسما
علامت * نشان دهنده نتیجه حاصل از آنالیز آماری گروه CLP بوده که با گروه LAP معنی دار استP<0.05) ). علامت ** نشان دهنده نتیجه حاصل از آنالیز آماری گروه های مختلف تیمار بوده که با گروه CLP معنی دار هستندP<0.05) ).
تاثیر اسانس نعنا بر روی بیان ژن COX-2 : همانطور که در نمودار 3 نشان داده شده است، ژن COX-2 در بافت ریه رت های سپتیکی (گروه CLP)- 24 ساعت بعد از القاء سپسیس- نسبت به گروه کنترل (لاپاراتومی) افزایش معنی داری (از 05/0± 0 به 04/0± 19/0) داشت (P<0.05). اسانس نعنا در دو دز mg/kg b.w50 و 100 باعث کاهش سطح ژن COX-2 24 ساعت بعد از القاء سپسیس در بافت ریه گردید (P<0.05). کاهش سطح ژن COX-2 از 04/0± 19/0 در گروه CLP به 02/0± 05/0 در گروه تیمار شده با داروی ایندومتاسین (گروه کنترل مثبت) نیز دیده شد (P<0.05) (نمودار 3).
|
نمودار 3- تاثیر اسانس نعنا بر روی بیان ژن COX-2
نتایج هیستوپاتولوژی بافت ریه: مطالعه هیستوپاتولوژیک بافت ریه نشان داد که در گروه کنترل (لاپاراتومی) خفیف ترین ضایعات بصورت پرخونی، ارتشاح نوتروفیل ها در بافت بینابینی و ادم التهابی بافت بینابینی رخ داده است (شکل 1، A). بیشترین آسیب بافت ریه در گروه رت های مبتلا به سپسیس (گروه (CLP مشاهده می گردد. در این گروه، بافت ریه در ببررسی ظاهری (ماکروسکوپیک) دچار پرخونی است. در بررسی هیستوپاتولوژیک نیز پرخونی شدید دیده می شود. ادم شدید بافت بینابینی باعث گسترش دیواره همبندی بین لوبولی شده است. همچنین ادم بینابینی و پیرامون عروقیو خونریزی های کانونی در این گروه دیده می شود. دیواره آلوئول های ریوی ضخیم شده و به دلیل هایپرتروفی ماکروفاژهای درون عروقی و بینابینی ریوی و نیز بدلیل نفوذ و حاشیه نشینی نوتروفیل ها در دیواره سیاهرگ ها (margination)، بافت ریه هیپرسلولار به نظر می رسد. تمام این تغییرات نشان دهنده وقوع ذات الریه بینابینی حاد در بافت های ریه نمونه های این مطالعه بود (شکل 1، B1,B2). همچنین، این تغییرات بافتی با شدت های مختلف در سایرگروه های تیمار نیز دیده شد (شکل 1، C,D).
همانطور که در جدول 7 مشاهده می شود، در گروه CLP بطور معنادار نسبت به گروه کنترل، ادم التهابی و ارتشاح نوتروفیل در بافت های بینابینی ایجاد شده و گروه تیمار اسانس نعنا در دز mg/kg b.w50 (شکل 1، C) توانست بطور معنادار باعث کاهش ادم شود. از لحاظ پرخونی، بافت ریه در گروه CLP بطور معنادار پرخون تر از گروه کنترل مشاهده شد و تیمار با اسانس نعنا در دو دز
mg/kg b.w50 و 100 (شکل 1، C,D) توانست بطور معنادار باعث کاهش پرخونی شود (جدول 7).
شاخص شدت ذات الریه بینابینی که از میانگین مقادیر متغییرهای دیگر هر نمونه بدست آمده است نشان می دهد که شدت ذات الریه در گروه CLP نسبت به گروه کنترل به صورت معنا داری بیشتر است و تیمار با اسانس نعنا در دو دز mg/kg b.w50 و 100 (شکل 1، C,D) توانست بطور معنادار باعث کاهش شدت ذات الریه بینابینی شود (جدول 7). کاهش معنی دار شاخص های فوق در گروه تیمار شده با ایندومتاسین نیز دیده شد به طوری که شاخص هیستولوژیکی شدت آسیب بافت ریه و تعداد نوتروفیل های نفوذ یافته و حاشیه نشین شده، پس از تیمار رتهای دچار سپسیس با داروی ایندومتاسین کاهش شدید یافت P<0.05)) (شکل 1، E).
بحث
سپسیس پاسخ سیستمیک میزبان به عفونت، پس از تهاجم پاتوژن های میکروبی به جریان خون است که به دنبال خود، سرکوب ایمنی منجر شونده به عدم عملکرد چندین ارگان و حساسیت به عفونت های بیمارستانی را در پی دارد (1).
جدول 7- میانگین و خطای استاندارد مقادیر عددی شاخص های آسیب شناسی در گروه های مختلف مطالعه
شدت ذات الریه بینابینی |
پرخونی |
ارتشاح نوتروفیل |
ادم التهابی |
گروه های مطالعه |
2/0±1/1 |
0±1 |
3/0±8/0 |
4/0±6/1 |
LAP |
*1/0±2/3 |
*2/0±5/3 |
*2/0±5/3 |
*1/0±14/3 |
CLP |
**1/0±2 |
**2/0±4/2 |
4/0±4/2 |
**2/0±4/1 |
E.O50 |
**1/0±1/2 |
**2/0±2/2 |
2/0±2/2 |
3/0±2 |
E.O100 |
**2/0±9/1 |
**2/0±4/2 |
2/0±2 |
**2/0±8/1 |
Indomethacin |
*: دارای اختلاف معنادار با گروه LAP **: دارای اختلاف معنادار با گروه CLP
شکل 1- (A گروه لاپاراتومی LAP: پرخونی و ادم ملایم بافت بینابینی و عدم مشاهده نوتروفیل در بافت ریه 400* (B1, B2 گروه CLP : پرخونی شدید، ادم و التهاب وسیع بافت بینابینی ریه ( نواحی که با ستاره مشخص گردیده اند ) 100*، گروه CLP : مشاهده ادم التهابی در اطراف سیاهرگ در بافت بینابینی ریه. تجمع آستین وار نوتروفیل ها در اطراف سیاهرگ (سرپیکان). مرزنشینی نوتروفیل ها در مجاور آندوتلیوم سیاهرگ (پیکان ها). 400* (C گروه اسانس نعنا در دز mg/kg b.w50: پرخونی و ادم ملایم و ارتشاح نوتروفیلها در بافت بینابینی 400* (D گروه اسانس نعنا در دز mg/kg b.w100 : ارتشاح ملایم نوتروفیل ها در اطراف سیاهرگ ( پیکان بزرگ). مرزنشینی نوتروفیل ها در مجاور آندوتلیوم سیاهرگ (پیکان کوچک). حضور تعدادی ماکروفاژ در بافت بینابینی (سرپیکان) 400* (E گروه ایندومتاسین: لکوسیت های چند هسته ای (پلی مورفونوکلئر) از نوع نوتروفیل نفوذ یافته و حاشیه نشین شده در بافت ریه 400*
به طور کلی در مدل CLP، با عمل جراحی (بستن دریچه سکوم و سوراخ کردن آن) میکروارگانیسمهای رودهای به داخل جریان خون نشت پیدا کرده و سپسیس ایجاد میشود. ایجاد مدل سپسیس توسط جراحی CLP بسیار کم هزینه و سریع می باشد و استاندارد کردن آن نیز آسان است (26).
نتایج حاصل از بررسی پارامترهای دخیل در آسیب اکسیداتیو در بافت ریه رتهای مبتلا به سپسیس نشان داد که در گروه CLP، سطح پارامترهای مربوط به استرس اکسیداتیو 24 ساعت بعد از القاء سپسیس دچار اختلال می شوند. این پارامترها (آنزیم میلوپراکسیداز، مالون دی آلدهید و گلوتاتیون) از شاخص های وضعیت سیستم استرس اکسیداتیو می باشند که در سپسیس به دلیل نقص در سیستم دفاع آنتی اکسیدانی دچار اختلال می شوند (11). اولین مشاهدات در آسیب اکسیداتیو بافتی حاصل از سپسیس افزایش پراکسیداسیون لیپیدهاLP) ) در بافت ریه در گروه CLPنسبت به گروه کنترل می باشدP<0.05) ). افزایش LP در بافت مذکور همراه با افزایش فعالیت آنزیم MPO و کاهش سطح گلوتاتیون GSH)) در 24 ساعت پس از القاء سپسیس رخ داده است P<0.05)) (جدول 6، نمودار 1). آنزیم MPO نقش بسیار مهمی را در شروع پراکسیداسیون لیپیدها در سیستم in vivo ایفاء می کند. علاوه بر آن، شروع پراکسیداسیون لیپیدها و تشکیل ایکوزانوئیدهای فعال فرایندهای مهمی در التهاب هستند (54). این داده ها همراه با نتایج هیستوپاتولوژیکی (شکل 1) نشان می دهند که آسیب اکسیداتیو بافت ریه حاصل از سپسیس، تخریب بافتی شدیدی را در 24 ساعت پس از CLP موجب شده است. مطالعات دیگر نیز نشان دادند که در مدل التهابی CLP، تغییر پارامترهای دخیل در استرس اکسیداتیو منجر به آسیب بافتی می شود که با نتایج تحقیق حاضر مطابقت دارد (4، 44).
همچنین نتایج حاصل از بررسی مارکرهای آسیب اکسیداتیو بافتی نظیر MPO, GSH, LP در بافت ریه نشان می دهند که اسانس نعنا در هر دو دز 50 و100 میلی گرم به ازاء هر کیلوگرم وزن بدن باعث مهار تغییر پارامترهای فوق در رتهای مبتلا به سپسیس در 24 ساعت پس از CLP می گردد (جدول 6، نمودار 1) که نتایج پاتولوژی نیز اثر اسانس نعنا در تعدیل آسیب بافتی را تایید می کند (شکل 1، C, D). جبران کاهش گلوتاتیون که یک جزء مهم از سیستم حفاظتی داخل سلولی بر علیه استرس اکسیداتیو میباشد، منجر به بازیافت مکانیسم دفاع سلولی و توقف پراکسیداسیون لیپیدها گردیده که در نتیجه سلول را در مقابل آسیب اکسیداتیو بافتی محافظت می کند. این نتیجه با گزارش ارائه شده توسطVilla مبنی بر نقش محافظتی گلوتاتیون در سپسیس مطابقت دارد (51). از سوی دیگر نتایج به دست آمده در این مطالعه نشان داد که میزان FRAP در نمونه ی پلاسمای موش های سپتیکی، 24 ساعت پس از ایجاد CLP کاهش می یابد و تیمار رت ها با اسانس نعنا در دوزهای kg/mg b.w 50 و 100 باعث افزایش و بازگشت سطح ظرفیت آنتی اکسیدانی کل پلاسما (FRAP) به حالت نرمال می شود (جدول 6). اندازه گیری های انجام گرفته در بیماران مبتلا به شوک سپتیک نشان می دهد که میزان FRAP و فاکتورهای دخیل در آن مثل اسید اوریک و بیلی روبین متناسب با شدت سپسیس افزایش می یابد (5). علاوه بر این، نتایج حاصل از تحقیق نشان می دهد که بیماری سپسیس تاثیری بر آنزیم GST ندارد (جدول 6). این نکته حائز اهمیت است که نتایج حاصل از تیمار رت های مبتلا به سپسیس با اسانس نعنا با دوز 50 و100 میلی گرم به ازاء هر کیلوگرم وزن بدن همانند نتایج حاصل از داروی شناخته شده ضد التهابی ایندومتاسین -که در این تحقیق به عنوان گروه کنترل مثبت استفاده شده است- می باشد.
بر اساس آنالیز GC-MS بیشترین ترکیبات موجود در اسانس نعنا کاروون و لیمونن بودند (جدول 5). بسیاری از مطالعات نشان داده اند که این دو ترکیب در خانواده نعنا دارای خواص بسیاری از جمله خواص ضد باکتریایی، ضد قارچی و آنتی اکسیدانی هستند (20، 31، 46، 53). بر اساس این مطالعات، انتظار می رود که مصرف اسانس توسط حیوانات سپتیکی منجر به تعدیل پارامترهای مرتبط با واکنش های استرس اکسیداتیو/آنتی اکسیدانی شود. برخی از مطالعات in vivo و in vitro نیز نشان داده اند که آنتی اکسیدانهای طبیعی، بافت ها را در مقابل آسیب اکسیداتیو القاء شده توسط عوامل تولید کننده رادیکال های آزاد محافظت می کنند. به عنوان مثال، سیلیمارین (مخلوطی از فلاونولیگنان های جدا شده از گیاه خار مریم) با کاهش پراکسیداسیون لیپیدها و افزایش گلوتاتیون از آسیب اکسیداتیو بافتی حاصل از استامینوفن در مغز رت جلوگیری می کند (36). دیگر مطالعات نیز نشان داده اند که آنتی اکسیدان هایی از قبیل سیلیمارین و N– استیل سیستئین با تعدیل پارامتر های دخیل در استرس اکسیداتیو از جمله گلوتاتیون، پراکسیداسیون لیپیدها و آنزیم میلوپراکسیداز، از آسیب اکسیداتیو بافتی به خصوص کبد و ریه در سپسیس جلوگیری می کنند (21، 48). تیمار رت های مدل CLP با متیلن بلو نیز با تعدیل عوامل دخیل در استرس اکسیداتیو از جمله گلوتاتیون، پراکسیداسیون لیپیدها، آنزیم میلوپراکسیداز، کاتالاز و سوپراکسید دسموتاز در بافت ریه از آسیب اکسیداتیو این بافت در رت های سپتیکی جلوگیری می کند (13). علاوه بر این، در مطالعهای نشان داده شد که کورکومین موجود در زردچوبه از طریق خواص ضد التهابی و آنتی اکسیدانی خود دارای اثرات مفیدی بر روی آسیب کبدی رت های نژاد ویستار داشته است (3). مطالعهی دیگری نشان داد تیمار حیوانات با اسانس آویشن شیرازی، از طریق تعدیل پارامترهای دخیل در متابولیسم گزنوبیوتیک هاCYP 450) ، (GST و مهار افزایش سطح ASTسرم به عنوان مارکر آسیب کبدی، منجر به کاهش آسیب های بافتی کبد ناشی از مسمویت نانوذرات آهن می شود (2).
بررسی پارامتر دخیل در فرایند التهاب در گروه CLP نشان داد که افزایش تولید ROS در رت های سپتیکی منجر به افزایش بیان ژن COX-2 و منجر به افزایش تولید PGE2 و در نتیجه افزایش سطح آن در پلاسما می شود که در نهایت منجر به آسیب بافتی در ریه می گردد (نمودار 3). در سپسیس و التهاب حاد، افزایش تولید رادیکال های آزاد و میانکنش بین انواع سایتوکین های پیش التهابی و ضدالتهابی باعث از کار افتادن بسیاری از ارگان ها و در نهایت مرگ می گردد (14، 40). در این بیماری، اجزاء مهمی از فرایندهای پاتولوژیکی دست به دست هم می دهند تا نوتروفیل ها را برای آزادسازی یک سری از واسطه هایی که در تخریب سلول های نرمال نقش دارند، تحریک کنند. در این میان افزایش تولید ROS توسط ماکروفاژها، نقش مهمی را در آغاز فرآیند التهاب بازی می کند. مطالعات نشان می دهند که القاء ژن COX-2 با تشدید استرس اکسیداتیو در گسترش آسیب های بافتی ناشی از التهاب نقش مهمی دارند (14). همچنین نتایج حاصل از بررسی بیان ژن COX-2 و PGE2 در بافت ریه نشان می دهد که اسانس نعنا در هر دو دز 50 و100 میلی گرم به ازاء هر کیلوگرم وزن بدن باعث تعدیل بیان این ژن و محصول آن (PGE2) در رتهای مبتلا به سپسیس در 24 ساعت پس از CLP می گردد. قابل ذکر است که بیان ژن COX-2 در سلولهای نرمال در سطح بسیار پایینی قرار دارد. این آنزیم در ماکروفاژها و سلول های آندوتلیال در طول شرایط التهابی از جمله سپسیس القاء گردیده و افزایش شدیدی می یابد (12).
به طور خلاصه این نتایج بیان می کنند که اسانس نعنا با خواص آنتی اکسیدانی و ضد التهابی دارای نقش محافظتی در برابر عوارض و آسیب های بافتی ناشی از سپسیس می باشد که در نهایت منجر به کاهش آسیب های ناشی از سپسیس در بافت ریه می شود. این نتایج با مشاهدات هیستوپاتولوژی نیز تایید شده است.
سپاسگزاری
این تحقیق با بودجۀ معاونت پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم انجام شده است.