Document Type : Research Paper
Author
Biology Dept., Payam e Noor University, Tehran, I.R. of Iran
Abstract
The development of nanotechnology is making the intrest of researchers towards synthsis of nanoparticles for the bio application. In the present study, copper nanoparticles (CuNPs) have been synthesized by the reduction of copper sulfate using aqueous extract of Postia puberula
Flora.The green synthesized CuNPs were characterized using UV-Vis absorption spectroscopy, Scanning Electron Microscopy (SEM) and Enerrgy Dispersive X-ray analysis(EDX) The antimicrobial activity of CuNPs was determined by disc diffusion and broth microdilution methods against some selected species of bacteria. After addition of flower extract, the change in colour of Copper Sulfate solution was noted from light blue to sea green. The UV-Vis absorption spectra confirmed the formation of the CuNPs with the characteristic peak 575 nm.
. XRD and SEM analysis of copper nanoparticles indicated that they exist in amorphous in nature and with size ranged from14 to 39 nm. Fruit extract acts as both reducing and capping agent. The synthesized Cu nanoparticles exhibited activity against of both gram positive and gram negative ba cteria.
Keywords
Main Subjects
بیوسنتز نانوذرات مس با استفاده از عصاره آبی گلPostia puberula و
بررسی فعالیت ضد باکتری آن
کاترین ابراهیمی
تهران، دانشگاه پیام نور، گروه زیست شناسی
تاریخ دریافت: 18/10/96 تاریخ پذیرش: 24/2/97
چکیده
در مطالعه حاضر از عصاره آبی گل Postia puberulaجهت احیای محلول سولفات مس و تولید نانوذرات مس استفاده شده است. وفعالیت ضد باکتری آن بررسی شد. برای شناسایی نانوذرات سنتز شده از آنالیزهای طیف سنجیUV-Vis، میکروسکوپ الکترونی روبشی(SEM)، پراش انرژی اشعه ایکس (EDX) استفاده شد. فعالیت ضد میکروبی نانوذرات مس سنتز شده با استفاده از روش انتشار در دیسک در برابر برخی گونه های انتخاب شده بررسی گردید. بعد از افزایش عصاره به محلول سولفات مس، رنگ محلول سولفات مس از آبی روشن به سبز مایل به زرد تغییر پیدا کرد. وجود پیک ماکزیمم در طول موج 575 نانومتر تشکیل نانوذرات مس را تایید کرد. میکروسکوپ الکترونی روبشی اندازه ذرات را بین 14تا 39 نانومتر نشان داد. نانوذرات سنتز شده در برابر باکتریهای استافیلوکوک اورئوس، باسیلوسسرئوس، کلبسیلا پنومونیه و اشریشیاکولی فعالیت نشان دادند. نتایج حاصله نشان داد که عصاره آبی گل گیاه مذکور به عنوان عامل احیا کننده و پایدار کننده عمل میکنند. نانوذرات مس سنتز شده در مقابل هر دو باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی فعالیت نشان دادند.
واژهای کلیدی: نانو ذرات مس، خواص ضد باکتری، سنتز سبز، عصاره Postia puberula
نویسنده مسئول، تلفن:09161604010 ، پست الکترونیکی: Katrine.ebrahimi@pnu.ac.ir
مقدمه
نانوتکنولوژی نقش مهمی را در تحقیقات مدرن ایفا میکند. این تکنولوژی قادر است در تمام زمینهها مانند داروسازی، الکترونیک، مراقبتهای بهداشتی، غذا و تغذیه، علم زیست پزشکی، دارو و انتقال ژن، صنایع شیمیایی، علم انرژی، لوازم آرایشی، بهداشت و محیط زیست، مکانیک و صنایع فضایی کاربرد داشته باشد.همچنین برای درمان عفونت، سرطان، آلرژی، دیابت و التهاب مورد استفاده قرار گیرد(28و و6و4).شیمی سبز طراحی و توسعه محصولات شیمیایی و فرآیندها برای به حداقل رساندن استفادههای خطرناک از محیط زیست میباشد( 17 و15و14). نانوذرات به روشهای فیزیکی و شیمیایی سنتز میشوند. در مقایسه با این روشها، سنتز سبز یکی از بهترین روشها برای تولید نانوذرات در سالهای اخیر میباشد. سنتز سبز دارای مزیتهای متعدد نسبت به روشهای دیگر از جمله: مقرون به صرفه، ساده، استفاده از درجه حرارت کمتر، استفاده از مواد غیر سمی به علاوه سازگار با برنامههای کاربردی پزشکی و مواد غذایی است. روش سنتز سبز در حال توسعه و سازگار با محیط زیست میباشد( 29و16 و8). در این روش عصاره به عنوان عامل کاهنده و پوشش برای نانوذرات به کار میرود. نانوذرات مس به علت خواص الکتریکی، نوری، کاتالیزوری، دارای کاربردهای گستردهای در پزشکی،ضد قارچ و ضد باکتری است(27و8و7). نانوذرات مس برای بسیاری از میکرو ارگانیسم ها مانند باکتری های اشریشیاکولی،استافیلوکوک اورئوس، سودوموناس آئروژینوزا سمی و برای سلولهای حیوانی غیر سمی است(12). گیاهان مختلفی برای سنتز نانوذرات با استفاده از روش سنتز سبز مورد استفاده قرار گرفته اند (27و18و10). نانوذرات با استفاده از تمام بخشهای گیاه مانند ساقه، گل، میوه، برگ و پوست سنتز میشوند(28و22 و 25). تیرهAsteracea) ) یکی از تیره های بزرگ گیاهان دولپه ای و آخرین تیره این گروه است. و از سری پیوسته گلبرگان چهارچرخه ای با نخمدان زیرین است (1). Postia گیاهانی چندساله علفی و نیمه چوبی با برگهای سرنیزه ای، نرم علفی یا چرمی هستند. گونه Postia puberula درختچه هایی متوسط با شاخه هایی منشعب –قاعده محکم و ضخیم و تقریبا بدون کرک ، ساقه دارای برگ و تا ارتفاع 40 سانتیمتر طول دارد. معمولا در محل گره دارای کرک های پشمی.برگها تقریبا به طول 3 سانتیمتر و عرض 7 میلیمتراند. و حالت سرنیزه ای نوک تیز دارند.جام 4 میلیمتر طول دارد. معمولا هرمافرودیت اند. فندقه ممکن است حالت ز گیل دار باشند (سه وجهی ) یا ممکن است حالت زائده دار کوچک باشند(20 ).ترکیبات عمده این گیاه هگزیل بنزوات، توریول، بتاکاریوفیلین ، آلفاپینن و لینالول میباشند.در این مطالعه از گلهای این گیاه برای سنتز نانو ذرات مس واثرضد باکتری آن استفاده شد. نوآوری در این پژوهش ، سنتزنانو ذرات مس برای اولین بار با عصاره ی گیاه مذکور به روش سنتزسبز و دوستدار محیط زیست است.
مواد و روشها
جمع آوری گیاه: گل های گیاه Postia puberulaاز ارتفاعات خرم آباد ، اردیبهشت ماه 95 جمع آوری شد و پس از شناسایی نمونههای جمع آوری شده با آب مقطر شسته و در سایه و به دور از نور مستقیم خورشید خشک و سپس به کمک آسیاب پودر شدند و پودر گیاه برای استفاده های بعدی در یخچال نگه داری شد.
تهیه عصاره آبی : مقدار 10 گرم از پودر گیاه
Postia puberula را در یک ارلن ریخته و مقدار 200 میلیلیتر آب دیونیزه به آن اضافه شد و سپس به مدت 30 دقیقه در دمای 70 درجه سانتیگراد گرم شد. بعد از رسیدن به دمای اتاق ابتدا با کاغذ صافی، صاف و بعد عصاره به مدت 20 دقیقه در 12000 دور سانتریفوژ شد و عصاره در دمای 4 درجه سانتیگراد در یخچال نگه داری شد .
سنتز نانوذرات مس: به 100 میلیلیتر از محلول سولفات مس 01/0 مولار تازه تهیه شده در حالی که روی استیرر به طور دائم هم زده میشد 75 میلیلیتر عصاره تازه تهیه شده اضافه، و به مدت 24 ساعت در دمای 60 درجه سانتی گراد نگه داری شد(21). سپس به مدت 20 دقیقه در 12000 هزار دور سانتریفیوژ شد ، این عمل دو بار تکرار شد تا تمام ناخالصیها از بین بروند.تغییر رنگ محلول از سبز به زرد کهربائی تشکیل نانو ذرات را نشان میدهد، نانوذرات سنتز شده در آون و دمای 60 درجه سانتیگراد برای آنالیزهای بعدی خشک شد(17).
شناسایی نانوذرات
آنالیز طیف سنجی UV-Vis : کاهش یونهای مس به نانوذرات مس تاییدی بر رزونانس پلاسمون سطحی (SPR ) نانوذرات مس است. 300 میکرولیتر از نمونه با 3 میلیلیتر آب مقطر رقیق گردید و آنالیز طیف UV-Vis با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر(JENWAY 6405) در محدوده 700-300 نانومتر اندازهگیری شد.
میکروسکوپ الکترونی روبشی((SEM : اندازه و مورفولوژی نانوذرات سنتز شده با استفاده از میکروسکوپ الکترونی (ساخت کشور چک Mira3) kv 15 و بزرگنمایی x 10 و وضوح nm 1 مورد بررسی قرار گرفت.
آماده سازی محیط کشت و باکتری: برای روش انتشار دیسک از محیط کشت جامد و برای حداقل غلظت مهارکنندگی( MIC ) از محیط کشت مایع استفاده میشود. در اینجا از مولر هینتون آگار به عنوان محیط کشت جامد و از مولر هینتون براث به عنوان محیط کشت مایع استفاده شد. برای تهیه محیط کشت بر اساس دستورالعمل نوشته شده بر ظرف محیط کشت مقدار مشخصی از محیط کشت در حجم مشخصی از آب مقطر در یک ارلن حل شد. سپس برای استریل شدن محیط کشت در اتوکلاو قرار داده شد. پس از اتوکلاو، محیط کشت مایع در یخچال قرار داده شد. وقتی دمای محیط کشت به حدود 50 درجه سانتیگراد رسید در زیر هود در پلیتهای متعدد ریخته و پس از اینکه محیط کشت به شکل جامد درآمد پلیتها وارونه و در یخچال نگه داری شدند. در زمان انجام تست باید از باکتری تازه پاساژ داده استفاده کرد. به همین منظور یک روز قبل از انجام تست از هر باکتری کشت تازه تهیه شد که این کار با لوپ بر روی محیط کشت مولر هینتون آگار انجام شد. پلیتها تا 24 ساعت در انکوباتور قرار داده شد.
سنجش انتشار دیسک: فعالیت ضد باکتری نمونه در برابر استافیلوکوک اورئوس(Staphylococcus aureus PTCC 1112)، باسیلوس سرئوس(Bacillus cereusPTCC 1556)، اشریشیا کولی(Escherichia coliPTCC1330) و کلبسیلا پنومونیه(Klebsiella pneumonia PTCC 1053)، وبا استفاده از روش دیسک-انتشار مورد بررسی قرار گرفت (3). در شرایط استریل یک لوپ از کشت 24 ساعته از هر باکتری در محلول نرمال سالین ریخته شد تا کدورتی مشابه استاندارد نیم مک فارلند (CFU/ml106×5/1)تهیه شود و بعد به وسیله سواپ بر سطح پلیت حاوی محیط کشت مولر هینتون آگار کشت یکنواختی تهیه گردید. بعد lµ100 از نمونه بر روی دیسک بلانک ریخته شد. سپس دیسک های بلانک روی سطح پلیت ثابت گردید. نرمال سالین به عنوان کنترل منفی و آمیکاسین به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. بعد از 24 ساعت نگهداری در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد قطر هاله عدم رشد اندازه گیری شد .
تعیین MIC : تعیین MIC در میکروپلیت 96 خانه استریل و با روش براث میکرودایلوشن انجام شد(15).بدین منظور ابتدا از محیط کشت مولر هینتون براث lµ 100 داخل 10 چاهک میکروپلیت ریخته شد و سپس به اولین چاهک هر ردیف lµ 100 نمونه اضافه گردید با چند بار بالا و پایین کردن با سمپلر خوب با هم مخلوط شد. سپس از چاهک اول 100 میکرولیتر برداشته و به چاهک بعدی اضافه شد و این کار تا چاهک شماره 10 انجام شد و از چاهک شماره 10، 100 میکرولیتر بیرون ریخته شد و به این ترتیب غلظت عصاره در هر چاهک نصف چاهک قبلی شد.از کشت 24 ساعته باکتری سوسپانسیون یکنواختی معادل محلول استاندارد نیم مک فارلند در محیط کشت مایع براث تهیه، صد برابر رقیق و μl100 از آن به هر یک از چاهکها اضافه شد. بعد از 24 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتیگراد، وجود کدورتی که نشان دهنده رشد یا عدم رشد باکتری است یادداشت شد و طبق تعریف (رقیق ترین)چاهکی که هیچ کدورتی در آن ایجاد نشد معادل MIC در نظر گرفته شد. سوسپانسیون باکتری و محیط کشت به عنوان کنترل مثبت، و از محیط کشت مولر هینتون براث نیز به عنوان کنترل منفی و از آمیکاسین به عنوان آنتی بیوتیک استاندارد استفاده گردید.
نتایج
پس از اضافه شدن عصاره به محلول سولفات مس رنگ سولفات مس از آبی کم رنگ به سبز متمایل به زرد تغییر پیدا کرد که این تغییر رنگ دلیل بر سنتز نانوذرات مس میباشد (شکل 1).
شکل1-تغییر رنگ محلول سولفات مس بعد از افزایش عصاره آبی گیاه
آنالیز طیف UV-Vis: برای بررسی تشکیل نانو ذرات مس می توان از طیف UV بهره جست. به این ترتیب غلظت های مختلف از سولفات مس و عصاره تهیه شده، با هم مخلوط و طیف جذبی UV-Vis آنها در محدوده 700-400 نانومتر اندازه گیری شد.
نانوذرات سنتز شده در دو ناحیه ی400 و بین 600-500 نانومتر ماکزیمم جذب نوری دارد. شکل2 نشان میدهد که پیک جذبی آن در طول موج 575 نانومتر برای نانوذرات مس رخ داده است.
شکل2-طیف جذبی نانوذرات مس
میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM): پس از تایید سنتز نانو ذرات با استفاده از تغییر رنگ و همچنین طیف های جذبی Vis-UV مورفولوژی نانوذرات سنتز شده توسط دستگاه میکروسکوپ الکترونی روبشی دانشگاه لرستان بررسی گردید.با توجه به تصاویر حاصله، نانوذرات مس سنتز شده مورفولوژی کروی داشته و اندازه ذرات بین 14تا 39 نانومتر تعیین گردید (شکل5).
شکل 5-تصاویر میکروسکوپ الکترونی نانوذرات مس سنتز شده
بررسی طیف EDX : حضور مس فلزی از طریق آنالیز EDX تایید گردید(شکل6). نانوذرات مس یک پیک جذبی در Kev 1 دارند که شاخص برای نانوذرات فلزی مس است. آلودگی اصلی در این طیف اکسیژن میباشند . اکسیژن ناشی از جذب فیزیکی در طول تهیه نمونه باشد.
شکل 6- طیف EDX نانوذرات مس سنتز شده
فعالیت ضد باکتری نانوذرات سنتزی: نانوذرات مس در مقابل باکتریهای گرم مثبت (استافیلوکوک اورئوس، باسیلوس سرئوس ) و باکتریهای گرم منفی ( کلبسیلا پنومونیه و اشریشیاکولی) دارای فعالیت ضد باکتری است. نتایج در جدول 1 آمده است.
بحث
بررسی نتایج نشان دادکه استفاده از عصاره آبی میوه گیاه
Postia puberula یک روش ساده، سریع، ارزان، سازگار با محیط زیست و قابل انجام در هر نوع آزمایشگاه برای سنتز نانوذرات مس است. در این روش از معرف های شیمیایی و سمی استفاده نمی شود، هیچگونه آلودگی ای برای محیط ایجاد نمی کند و بنابراین برسایر روش های شیمیایی و فیزیکی سنتز نانوذرات برتری دارد. گروههای عاملی موجود در عصاره گل های گیاه فوق الذکر ، مسئول احیای یون های فلزی مس به نانوذرات مس بودند. در این روش نانوذرات مس با پایداری خوب سنتز گردید. بنابراین بیوملکول های موجود در عصاره نه تنها یون های مس را احیا کردند، بلکه بعد از تهیه شدن، از آنها در مقابل عوامل اکسیدان محافظت به عمل آوردند. نانوذرات حاصل شده از این روش بسیار پایدار و تجدیدپذیر میباشند. نانوذرات مس دارای کاربردهای گسترده ای در پزشکی از جمله: فعالیت ضدسرطان، ضدانگل، ضدقارچ، ضدباکتری، در بسته بندی مواد غذایی و پانسمان زخم میباشند. همچنین این نانوذرات در صنعت دارای کاربردهایی از جمله: خازن های الکتریکی، انتقال حرارت، مواد فوق العاده قوی، حسگرها، کاتالیزورها و... میباشند.
جدول1- فعالیت ضد میکروبی نانوذرات مس
باکتری |
|||
MBC(mg/ml) |
MIC (mg/ml) |
هاله عدم رشد 4mg/disc |
|
5 |
5 |
15 |
باسیلوس سرئوس |
5 |
5 |
14 |
استافیلوکوکوس اورئوس |
10 |
10 |
10 |
اشریشیا کلی |
10 |
10 |
12 |
کلبسیلا نومونیه |
الف |
ب |
شکل7- فعالیت ضد باکتری عصاره در مقابل (الف) استافیلوکوک اورئوس، (ب) باسیلوس سرئوس (ج) اشیرشیاکلی (د) کلبسیلا پنومونیه |
ج |
د |
نتایج نشان داد، شکل نانوذرات سنتز شده به این روش نزدیک به کروی و اندازه ی آنها بین 39 -14 نانومتر بود. همچنین نانوذرات مس سنتز شده توانایی مقابله با میکروارگانیسم های بیماری زا دارند. هاله عدم رشد مشاهده شده در مقابل باکتری های گرم مثبت بیشتر از هاله ایجاد شده در برابر باکتری های گرم منفی بود. تاکنون برای سنتز نانوذرات از گیاهان مختلف از جمله: سنتز نانو ذره نقره به روش سبز با استفاده از گیاه مرزنجوش اروپایی و اثرات ضدمیکروبی آن توسط کاووسی و همکاران(2014) انجام شد( 2 ). ولی برای سنتز نانوذرات مس میتوان به موارد زیر اشاره کرد:
گیاه ریحان(Ocimus sanctum) توسط(2014،Kulkarni) (13) ، گیاه کور (Capparise zeylanica) توسط (2014، Saranya adevi et al) (23) ، گیاه شعله زنبق (Gloriosa superbal) توسط(2015 Naika et al,) (19) ، عصاره انگور(Vitis vinifera) توسط (2014،Subbaiya Angrasan and)(5) ، گیاه خرزهره (Nerium oleander) توسط (2014،Gopinath et al)( 9) ، گیاه (Artabotrys odoratissimus) توسط (2014،Kathad and Gajera)(11) استفاده شده است. .Saranya adevia و همکاران اندازه ذرات سنتز شده را بین 100-50 نانومتر اعلام کردن(23).
subhankari و همکاران اندازه ذرات را بین 40-25 نانومتر گزارش دادند(26).Kulkarni اندازه ذرات را 77 نانومتر (13)و همچنین Shend و همکاران اندازه ذرات را بین 60-10 نانومتر گزارش کردند(24). در این تحقیق بررسی فعالیت ضد باکتری نانوذرات در مقابل باکتری های گرم مثبت و گرم منفی نشان داد که این ذرات تاثیر بیشتری روی باکتری های گرم مثبت دارند. نتایج این تحقیق با نتایجی که ، Angrasan and Subbaiya اعلام کردند همخوانی دارد.بررسی منابع نشان داد تا کنون گزارشی در سنتز نانو ذرات مس با عصاره آبی گیاه Postia puberula انجام نشده و این بررسی برای اولین بار انجام شده است .
نتیجه گیری
نتایج این تحقیق نشان میدهد که باکتریهای گرم منفی به دلیل داشتن دیواره ضخیم تر در مقایسه با باکتریهای گرم مثبت مقاوم ترند. همچنین اثر ضد باکتری نانوذرات فلزی به اندازه کوچک و نسبت بالای سطح به حجم آنها ارتباط داده می شود. این ویژگی به نانوذرات اجازه می دهد که بتوانند تماس بیشتری با غشای باکتری ها داشته باشند درنتیجه اثر مهارکنندگی آنها روی عوامل پاتوژن بیشتر شود. به توجه به دلایل فوق از گیاه Postia puberula میتوان برای سنتز نانوذرات مس به روش کم خطر وارزان و سازگار با محیط زیست در مقیاس بالا استفاده کرد و از آنها در بسیاری از مصارف پزشکی بهره جست.
تقدیر و تشکر:از دانشگاه پیام نور مرکز خرم آباد جهت همکاری در انجام این پژوهش تشکر میکنم.