Document Type : Research Paper
Authors
University of Zabol
Abstract
in this study tries to kinship and genetic distance between populations is assessed cumin. A total of five population of cumin were collected and then were analyzed using 10 RAPD primers and 10 ISSR primers. To analysis of data will be used NTsys pc2.1, GenAlex6.501 and Popgene32 software. The RAPD primers gave 182 Amplified bands that TIBMBC03 primer had the highest bands (24), marker index (12.15) and diversity index (0.5) and The ISSR primers gave 135 Amplified bands that UBC809 primer had the highest bands (18), marker index (7.56) and diversity index (0.47). In RAPD marker, the highest Nei diversity (0.32) and Shanoon diversity (0.333) was belong to cumin of Sabzvar and also in ISSR marker the highest Nei diversity (0.18) and Shanoon diversity (0.27) was belong to cumin of Sabzvar. According to RAPD marker, the lowest value of similarity (0.114) between Sabzvar and Kashan Cumin and also in ISSR primer, the lowest value of similarity was observed (0.085) between Sabzvar and Kashan Cumin. Moreover, according to both ISSR and RAPD analysis, the lowest genetic similarity was 0.117 between Sabzvar and Kashan Cumin. The results of this study showed that Sabzevar cumin is recommended as a center of plant diversity on the basis of studied populations and the farthest population to earliest possible crosses and create a variety of genetic diversity were cumin of Sabzevar and Kashan.
Keywords
Main Subjects
ارزیابی ژنتیکی جمعیتهای مختلف گیاه دارویی زیره سبز با استفاده از نشانگرهای مولکولی DNA
لیلا جانی پور1. لیلا فهمیده1 و بهمن فاضلی نسب2*
1 زابل، دانشگاه زابل، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی
2زابل، دانشگاه زابل، پژوهشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات
تاریخ دریافت: 24/8/96 تاریخ پذیرش: 16/11/96
چکیده
ایران یکی از غنیترین منابع گیاهان دارویی جهان به شمار میرود که دارای تنوع بالای در شرایط زیستگاهی برای انواع این گیاهان است. بدین منظور در این تحقیق سعی خواهد شد تا روابط خویشاوندی و فاصله ژنتیکی بین جمعیتهای زیره سبز مورد ارزیابی قرار گیرد. تعداد پنج جمعیت زیره سبز جمعآوری و با استفاده از 10 آغازگر RAPD و 10 آغازگر ISSR بررسی خواهد شد. دادهها با استفاده از نرمافزارهای NTsys pc2.1، GenAlex6.501 و Popgene32 تجزیهوتحلیل خواهند شد. در نشانگر RAPD در مجموع 182 باند تکثیر که آغازگر TIBMBC03 دارای بیشترین تعداد باند (27)، شاخص نشانگری (15/12) و شاخص چندشکلی (5/0) و در نشانگر ISSR در مجموع 135 باند تکثیر که آغازگر UBC809 دارای بیشترین تعداد باند (18)، شاخص نشانگری (56/7) و شاخص چندشکلی (42/0) بودند. در نشانگر RAPD، بیشترین میزان شاخص تنوع ژنی نی (32/0) و شاخص شانن (233/0) متعلق به جمعیت زیره سبز سبزوار و در نشانگر ISSR نیز بیشترین میزان شاخص تنوع ژنی نی (18/0) و شاخص شانن (27/0) متعلق به جمعیت زیره سبز سبزوار بود. کمترین میزان تشابه (144/0) بر اساس نشانگر RAPD مربوط به زیره سبز سبزوار و زیره سبز کاشان و در نشانگر ISSR نیز کمترین میزان تشابه (085/0) مربوط به زیره سبز سبزوار و زیره سبز کاشان و همچنین بر اساس اطلاعات حاصل از نشانگر RAPD و ISSR توأم، کمترین میزان تشابه (117/0) مربوط به زیره سبز سبزوار و زیره سبز کاشان بود. در کل نتایج این تحقیق نشان داد که زیره سبز سبزوار بهعنوان مرکز تنوع این گیاه بر اساس جمعیتهای مورد بررسی پیشنهاد و دورترین جمعیتها جهت تلاقیهای احتمالی و ایجاد تنوع جدید و مفیدتر زیره سبز سبزوار و زیره سبز کاشان معرفی میشوند.
واژه های کلیدی:تنـوع ژنتیکی، زیره سبز، RAPD، ISSR
* نویسنده مسئول، تلفن: 31232180-054 ، پست الکترونیکی: bfazeli@uoz.ac.ir
مقدمه
ایران یکی از غنیترین منابع گیاهان دارویی جهان به شمار میرود که دارای تنوع بالای شرایط زیستگاهی برای انواع این گیاهان است متأسفانه، با وجود بنیانگذاران طب سنتی و گیاهی در ایران باستان، هیچگونه کوششی برای پیشرفت در این زمینه صورت نگرفته و فقط فعالیتهایی در حد طب سنتی و درمان با مفردات گیاهی آنهم بهصورت خیلی محدود و گاهی نادرست وجود داشته است (36).
با توجه به افزایش سریع جمعیت ایران و نیاز روزافزون صنایع دارویی به گیاهان دارویی بهعنوان ماده اولیه تولید دارو، ضرورت مطالعه و تحقیق بر روی این دسته از گیاهان بیش از پیش اهمیت یافته است. استفاده مطلوب، منطقی و بهینه از این منابع که به لحاظ فناوری بسیار کمهزینهتر و سادهتر از صنایع دارویی شیمیایی است، میتواند ضمن تأمین بخشی از نیازهای عمده بهداشتی و درمانی جامعه از خروج مقادیر متنبهی ارز جلوگیری نموده و مانع گسترش وابستگی به بیگانگان شود. بنابراین با اتخاذ سیاستها و راهکارهای مناسب و مبتنی بر یک شناخت واقعگرایانه از وضعیت موجود این منابع و کاربرد روشهای علمی و صحیح در تمام ابعاد اعم از کاشت، داشت، برداشت و بهرهبرداری صنعتی و اقتصادی آن، چه از طبیعت و چه بهصورت کشت مکانیزه، میتوان به درکی واقعی و اصولی در خصوص نقش و بازدهی گیاهان دارویی در جوامع رو به رشدی همچون ایران رسید و علاوه بر حفظ و حراست از این سرمایههای ملی به شکوفایی و توسعه پایدار جامعه نیز دست یافت(36).
زیره سبز با نام علمی (cuminum cyminum) از خانواده چتریان (apiaceae) و سرشار از متابولیتهای ثانویه است. زیره سبز گیاهی است یکساله از خانوادهی جعفری و ارتفاع آن برحسب شرایط محیطی از 15 تا 50 سانتیمتر متغیر است (44). زﻳﺮه ﺳﺒﺰ ﺑﻮﻣﻲ ﻣﻨﺎﻃﻖ ﻣﺮﻛﺰی و ﺟﻨﻮﺑﻲ آﺳﻴﺎ بوده و در ﭼﻨﺪ ﻛﺸﻮر از ﺟﻤﻠﻪ ﻫﻨﺪ، ﭘﺎﻛﺴﺘﺎن، ﺗﺮﻛﻴﻪ، اﻳﺮان، ﻣﺼﺮ و اﺳﭙﺎﻧﻴﺎ ﻛﺸﺖ میشود این گیاه از لحاظ ارزش اقتصادی مهمترین گیاه دارویی کشور محسوب میشود (22). اهمیت اقتصادی زیره سبز به دلیل دارا بودن ویژگیهای از قبیل فصل رشد کوتاه، نیاز آبی کم، عدم تداخل فصل رشد آن با سایر محصولات کشاورزی، توجیه اقتصادی آن نسبت به دیگر محصولات کشاورزی و دیگر محصولات زراعی و صادراتی بودن آن است (28). اسانس این گیاه شامل ترکیباتی نظیر تانن، رزین، آلورون، سیمن، فلاندون و کارون است. ماده اصلی تشکیلدهندهی اسانس آلدهیدکومنیک یا کومینول است (40).
از دلایل اهمیت بررسی تنوع ژنتیکی، استفاده در مدیریت مجموعههای ژنتیکی باهدف کاهش هزینهها، افزایش دقت و قابلیت استفاده در برنامههای اصلاحی است. بنابراین یکی از پایههای اساسی علم اصلاح نباتات بهویژه برای گیاهان دارویی، دسترسی و آگاهی از میزان تنوع در مراحل مختلف پروژههای اصلاحی است (6).
نشانگرهای مولکولی یک ابزار ارزشمندی را برای توصیف و ارزیابی تنوع ژنتیکی درون گونهها فراهم کردهاند بهطوریکه نشانگرهای مختلف سطوح مختلفی از تنوع را نشان میدهند (17).
فن RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) از نوع نشانگر مبتنی بر PCR، ارزان، سریع و نیازمند به اطلاعات اولیه در مورد ژنوم مورد نظر نیست. در این روش برخلاف سایر روشهای مبتنی بر PCR از آغازگر منفرد به طول 1 تا 13 نوکلئونید که توالی آن بهطور اختیاری تعیین میشود استفاده میگردد. هر آغازگر بخش قابل توجهی از یک مکان ژنی را تکثیر مینماید که به آن DNA چندشکلی تکثیر یافته (RAPD) میگویند (48).
فن ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)، یک روش مبتنی بر PCR است که شامل تکثیر یک قطعه DNA موجود در فاصله تکثیر پذیر میان دو ناحیه تکراری ریز ماهواره منحصربهفرد با جهات مختلف است. این فن، از ریز ماهوارهها (ریز ماهواره) با طول bp 25-16، بهعنوان آغازگر یک واکنش تک آغازگری که لوکوسهای چندگانه ژنومی را برای تکثیر توالیهای بین ریز ماهوارهای با اندازههای مختلف، هدف میگیرد بهره میبرد. تکرارهای ریز ماهواره مورد استفاده بهعنوان آغازگر، میتوانند دو، سه، چهار یا پنج نوکلئوتیدی باشند. آغازگرهای مورد استفاده میتوانند به هر نقطهای از DNA متصل شوند. اگرچه معمولاً در انتهای ׳3 یا ׳5 خود به یک تا چهار باز متصل بوده و بر اساس آنها، گسترش مییابند (20).
تاکنون تحقیقات مختلفی در مورد استفاده از نشانگرهای RAPD و ISSR بهصورت جداگانه جهت بررسی تنوع ژنتیکی گیاهان مختلف مثل رازیانه (8)، آویشن باغی (4)، آویشن کوهی (51)، نعنا (31)، مریمگلی (16)، زیره پارسی(19)، گزنه (9) و زیره سیاه (13) گزارش شده است.
با توجه به اینکه زیره سبز از مهمترین گیاهان دارویی کشور محسوب و سرشار از متابولیتهای ثانویه است (44) به دلیل دارا بودن ویژگیهای از قبیل فصل رشد کوتاه، نیاز آبی کم، عدم تداخل فصل رشد آن با سایر محصولات کشاورزی، توجیه اقتصادی آن نسبت به دیگر محصولات کشاورزی و دیگر محصولات زراعی و صادراتی بودن آن است (28).و از لحاظ ارزش اقتصادی مهمترین گیاه دارویی کشور محسوب میشود (22) در نتیجه در این تحقیق سعی خواهد شد جمعیتهای مختلف گیاه دارویی زیره سبز از لحاظ میزان تنوع، شباهت و فاصله ژنتیکی با استفاده از نشانگرهای مولکولی RAPD و ISSR مورد ارزیابی قرار گیرند.
مواد و روشها
مواد گیاهی: تعداد 5 جمعیت گیاه زیره سبز از بانک ژن سازمان جنگلها و مراتع کشور تهیه (جدول 1) و با استفاده از نشانگر RAPD و ISSR در آزمایشگاه بیوتکنولوژی و مهندسی ژنتیک پژوهشکده زیستفناوری کشاورزی دانشگاه زابل در سال 1396 مورد ارزیابی قرار گرفتند.
استخراج و تکثیر DNA : استخراج DNA ژنومی بر مبنای روش دلاپورتاوهمکاران (14) به روش تک بوته و از هر جمعیت سه بوته در مجموع پانزده جمیعت انجام شد.
فنRAPD: تعداد 10 آغازگر RAPD که در سایر گیاهان خانواده چتریان جواب داده بودند برای این تحقیق انتخاب (جدول 2) و واکنش زنجیرهای پلیمراز بر اساس دستورالعمل ویلیامز و همکاران (48) با کمی تغییر بهقرار زیر انجام شد: یک میکرو لیتر آغازگرها (10 پیکو مولار) با غلظت نهایی 25/0 میکرو مولار؛ 5/5 میکرو لیتر مستر میکس (x2)(شرکت امپلیکون دانمارک)، 1 میکرو لیتر DNA (10 نانوگرم در میکرو لیتر) و با آب دی یونایزر حجم نهایی تا 15 میکرو لیتر و سپس چرخه حرارتی بدینصورت که یک چرخه واسرشته سازی اولیه در 94 درجه سانتیگراد به مدت پنج دقیقه، 40 چرخه (تکرشتهای شدن DNA در 94 درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه؛ اتصال آغازگر به DNA تکرشتهای در دمای 5/35 درجه به مدت یک دقیقه و بسط آغازگر در 72 درجه سانتیگراد به مدت دو دقیقه) و یک چرخه بسط نهایی در 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه انجام شد. جهت الکتروفورز از ژل آگاروز 5/1 درصد و رنگآمیزی با استفاده از ژل رد انجام شد.
فنISSR : با توجه به اینکه تاکنون هیچ نوع اطلاعاتی مبنی بر شناسایی نشانگرهای ISSR زیره و حتی خانواده چتریان وجود نداشت لذا در این تحقیق از 10 آغازگر ISSR گوجهفرنگی استفاده شد (جدول 3). حجم واکنش زنجیرهای پلیمراز و چرخههای حرارتی بر اساس روش یا ترزوپولوس و ببلی (47) با کمی تغییر به شرح زیر انجام شد:
حجم واکنش زنجیرهای پلیمراز 15 میکرو لیتر شامل؛ 1 میکرو لیتر آغازگر (10 پیکو مولار) با غلظت نهایی 25/0 میکرو مولار، 5/7 میکرو لیتر مسترمیکس (امپلیکن دانمارک (x2))، 1 میکرو لیتر DNA (10 نانوگرم در میکرو لیتر) و 5/5 میکرو لیتر آب دی یونایزر و سیکل حرارتی شامل؛ یک چرخه واسرشته سازی اولیه در 94 درجه سانتیگراد واحد به مدت 5 دقیقه؛ 40 چرخه (تکرشتهای شدن DNA در 94 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه، اتصال آغازگر به DNA تکرشتهای در دمای مخصوص (جدول 3) به مدت 1 دقیقه، بسط آغازگر در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 5/1 دقیقه) و یک چرخه بسط نهایی در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه بود. جهت الکتروفورز از ژل آگاروز 5/1 درصد و رنگآمیزی با استفاده از ژل رد انجام شد.
جدول 1- مشخصات جمعیتهای مورد استفاده در تحقیق
کد نمونه |
اسم فارسی |
اسم علمی |
محل جمعآوری |
موقعیت جغرافیایی |
1 |
زیره سبز |
Cuminum cyminum |
سبزوار |
N, 57° 25′ 48″; E, 36° 7′ 12″ |
2 |
زیره سبز |
Cuminum cyminum |
نیشابور |
N, 36° 12′ 0″; E, 58° 48′ 0″ |
3 |
زیره سبز |
Cuminum cyminum |
گز بر خوار |
N, 51° 23′ 24″; E, 32° 22′ 48″ |
4 |
زیره سبز |
Cuminum cyminum |
اصفهان |
N, 51° 39′ 0″; E, 32° 37′ 48″ |
5 |
زیره سبز |
Cuminum cyminum |
کاشان |
N, 51° 34′ 48″; E, 33° 58′ 48″ |
جدول 2- نام، توالی و دمای اتصال آغازگرهای RAPD مورد استفاده (48)
دمای اتصال (درجه سانتیگراد) |
توالی ׳3→׳5 |
نام آغازگر |
ردیف |
5/35 |
TGC TCG GCT C |
TIBMBA02 |
1 |
5/35 |
GTG CGA GAA C |
TIBMBA03 |
2 |
5/35 |
GGA CGA CCG T |
TIBMBA06 |
3 |
5/35 |
TCG GCA CCG T |
TIBMBB16 |
4 |
5/35 |
ACA CCG TGC C |
TIBMBB17 |
5 |
5/35 |
GGC TTG ACC T |
TIBMBC03 |
6 |
5/35 |
GAG GCG ATT G |
TIBMBC05 |
7 |
5/35 |
GGT CTT CCC T |
TIBMBC08 |
8 |
5/35 |
CCT CCA CCA G |
TIBMBC12 |
9 |
5/35 |
CTG GTG CTC A |
TIBMBC16 |
10 |
جدول 3- نام، توالی و دمای اتصال آغازگرهای ISSR مورد استفاده (47)
دمای اتصال (درجه سانتیگراد) |
توالی ׳3→׳5 |
نام آغازگر |
ردیف |
6/47 |
GACAGACAGACAGACA |
UBC-112 |
1 |
8/51 |
GAGAGAGAGAGAGAGAC |
UBC-811 |
2 |
6/47 |
ACTGACTGACTGACTG |
UBC-820 |
3 |
8/51 |
AGAGAGAGAGAGAGAGC |
UBC-808 |
4 |
8/51 |
CACACACACACACACAG |
UBC-818 |
5 |
9/32 |
GATAGATAGATAGATA |
UBC-872 |
6 |
9/32 |
ATGATGATGATG |
UBC-864 |
7 |
8/51 |
AGAGAGAGAGAGAGAGG |
UBC-809 |
8 |
1/50 |
ACACACACACACACACT |
UBC-857 |
9 |
6/47 |
GACTGACTGACTGACT |
UBC-827 |
10 |
تجزیه و تحلیل دادهها: در این تحقیق امتیازبندی الگوهای باندی بهصورت یک (وجود) و صفر (عدم وجود) برای هر باند انجام شد. صفاتی همچون تعداد باندهای تکثیر شده (AB=Amplified Bands)، تعداد باندهای چندشکل (PB= Polymorphic Bands)، تعداد باند مؤثر (Ne=Effective number of alleles)، درصد چندشکلی (PP= Percent of Polymorphic)، شاخص چندشکلی (DI= Diversity Index)، شاخص شانن (I= Shannon's Information index) و شاخص نی (h= Nei's gene diversity) اندازهگیری شد. شاخص چندشکلی که میزان آن بین صفر تا یک است (3) با استفاده از فرمول (Pj فراوانی باند j ام در تمام ژنوتیپهای مورد ارزیابی) محاسبه شد (11). ضمناً شاخص نشانگری (MI) (24)، شاخص تنوع شانن (26)، شاخص تنوع نی (32) و تنوع بین و درون جمعیتی بر اساس هر دو نشانگر ISSR و RAPD با استفاده از نرم افزار POPGENE 1.32 محاسبه شد.
شاخص نشانگری (Marker Index) نشاندهندهی کارایی نشانگر است و با استفاده از فرمول MI=EMR * DI (or PIC) که در آن EMR نسبت چندگانه مؤثر بوده و بیانگر تعداد جایگاههای ژنی چند شکل موجود در یک ژنوم است به دست آمد. EMR با استفاده از فرمول EMR= Na * β که در آن Na تعداد مکانهای چند شکل و ß نیز نسبت مکانهای چند شکل به تعداد کل مکانها است محاسبه شد (24).
تجزیه خوشهای بر اساس الگوریتم Nj و با استفاده از نرمافزار Darwin 6.0.12 مبتنی بر ماتریس تشابه نی و لی (33) و جاکارد (21) انجام شد. ضمناً برای هر دندروگرام ضریب کوفنتیک توسط آزمون مانتل با استفاده از نرمافزار NTSYS-pc v.2.1 به دست آمد. همچنین به منظور تائید آنالیزهای کلاستر بندی آزمون کوفنتیک و بوتسترپینگ صورت گرفت.
نتایج و بحث
چندشکلی و شاخص چندشکلی: از 10 آغازگر RAPD مورد استفاده در این تحقیق، تعداد 9 آغازگر در تمام زیرههای سبز تکثیر شده و چندشکلی مناسب از خود نشان دادند (شکل 1). در مجموع 182 باند شناسایی شد که آغازگر TIBMBC08 با 3 باند کمترین تعداد و آغازگر TIBMBC03 با 27 باند بیشترین تعداد را در میان باندهای تولیدی توسط هر آغازگر داشتند. میانگین تعداد باند در کل جایگاهها برابر 11/13 بود (جدول 4) و با نتایجی که در مطالعات قبلی (36) با میانگین 66/13 برای زیره گزارش شده مشابهت داشت.
در نشانگر RAPD، بیشترین میزان شاخص نشانگری با میزان 15/12 مربوط به آغازگر TIBMBC03 و کمترین میزان شاخص نشانگری با میزان 09/0 مربوط به آغازگر TIBMBC08 و میانگین 4/5 مشاهده گردید. بیشترین میزان شاخص چندشکلی (5/0) مربوط به آغازگر TIBMBB03 و کمترین میزان شاخص چندشکلی (04/0) مربوط به آغازگر TIBMBC08 و با میانگین کل 37/0 مشاهده گردید. بیشترین میزان تعداد باند مؤثره، شاخص تنوع شانن و شاخص تنوع نی به ترتیب 71/1، 58/0 و 41/0 به ترتیب متعلق به آغازگرهای TIBMBB17، TIBMBC05 و TIBMBC08 و کمترین میزان تعداد باند مؤثره، شاخص تنوع شانن و شاخص تنوع نی به ترتیب 47/1، 45/0 و 29/0 متعلق به آغازگر TIBMBB16 بود (جدول 4).
ضمناً تمام 10 آغازگر ISSR مورد استفاده در این تحقیق در تمام زیرههای سبز تکثیر شده و چندشکلی مناسبی از خود نشان دادند (شکل 2). در مجموع 135 باند شناسایی شد که آغازگر UBC112 با 3 باند کمترین تعداد و آغازگر UBC809 با 18 باند بیشترین تعداد را در میان باندهای تولیدی توسط هر آغازگر داشتند. میانگین تعداد باند در کل جایگاهها برابر 9/9 بود (جدول 5) و با نتایجی که در مطالعات قبلی (43) از 6 تا 15 باند و میانگین 4/10 گزارش شده بود مشابهت داشت ضمنا چندشکلی بالای ISSR در پزوهش حاضر را میتوان به وسعت مناطق جغرافیایی نمونه برداری شده نسبت داد(1).
شکل 1- الگوی نواری تکثیرشده در نشانگر RAPD با استفاده از آغازگر TIBMBC05
(شمارهها بیانگر جمعیتهای مورد استفاده و M بیانگر سایز مارکر DM2300)
شکل 2- الگوی نواری تکثیرشده در نشانگر ISSR با استفاده از آغازگر UBC857
(شمارهها بیانگر جمعیتهای مورد استفاده و M بیانگر سایز مارکر DM2300)
جدول 4- تعداد باند تکثیرشده (AB)، تعداد باند چندشکلی (PB)، تعداد باند مؤثر (Ne)، درصد چندشکلی (PP)، شاخص چندشکلی (DI)، شاخص شانن (I)، شاخص نی (h) و شاخص نشانگری (MI) در نشانگر RAPD
MI |
DI |
h |
I |
PP |
Ne |
PB |
AB |
آغازگر |
52/3 |
44/0 |
3/0 |
46/0 |
100 |
5/1 |
8 |
8 |
TIBMBA02 |
7 |
5/0 |
36/0 |
54/0 |
100 |
62/1 |
14 |
14 |
TIBMBA06 |
6/3 |
38/0 |
29/0 |
45/0 |
61/86 |
47/1 |
11 |
13 |
TIBMBB16 |
17/8 |
43/0 |
40/0 |
58/0 |
100 |
71/1 |
19 |
19 |
TIBMBB17 |
15/12 |
45/0 |
38/0 |
57/0 |
100 |
67/1 |
27 |
27 |
TIBMBC03 |
15/6 |
41/0 |
40/0 |
58/0 |
100 |
69/1 |
15 |
15 |
TIBMBC05 |
09/0 |
04/0 |
41/0 |
60/0 |
75 |
75/1 |
3 |
4 |
TIBMBC08 |
8/3 |
38/0 |
39/0 |
57/0 |
100 |
66/1 |
10 |
10 |
TIBMBC12 |
18/4 |
38/0 |
32/0 |
49/0 |
100 |
54/1 |
11 |
11 |
TIBMBC16 |
در نشانگر ISSR، بیشترین میزان شاخص نشانگری با میزان 56/7 مربوط به آغازگر UB809 و کمترین میزان شاخص نشانگری با میزان 33/0 مربوط به آغازگر UBC112 و میانگین 61/3 مشاهده گردید. بیشترین میزان شاخص چندشکلی (42/0) مربوط به آغازگرهای UBC809 وUBC857 و کمترین میزان شاخص چندشکلی (11/0) مربوط به آغازگر UBC812 و میانگین کل 34/0 مشاهده گردید. بیشترین میزان تعداد باند مؤثره، شاخص تنوع شانن و شاخص تنوع نی به ترتیب 84/1، 64/0 و 45/0 بهترتیب متعلق به آغازگر UBC808 و کمترین میزان تعداد باند مؤثره، شاخص تنوع شانن و شاخص تنوع نی بهترتیب 45/1، 41/0 و 27/0 متعلق به آغازگر UBC872 بود (جدول 5).
تاکنون مقادیر مختلفی برای چندشکلی و شاخص چندشکلی گزارش شده است مثلاً عبدالهی مندولکانی(1)، 3/7، بریان و همکاران (12) میانگین 51/0، ماکافری و همکاران (27) از 07/0 تا 8/0 و با میانگین 56/0، پراساد و همکاران (37)، میانگین 9/0 (فقط برای موتیفهای دی نوکلئوتیدی)، ژو و همکاران (52) از 4/0 تا 1 و با میانگین 833/0 و بوهن و همکاران (10) میانگین 3/0 گزارش دادهاند. از تمام نتایج بالا بهعلاوه نتایج این تحقیق میتوان نتیجه گرفت که شاخص چندشکلی نمیتواند عدد ثابتی داشته باشد و بستگی به عواملی مثل تعداد باند تولیدی توسط هر جایگاه داشته و حتی تعداد ژنوتیپ، تعداد آغازگر و شاخص چندشکلی دارند (37). بهطوریکه رادر و همکاران (41) میانگین شاخص چندشکلی را در تحقیقی با 18 ژنوتیپ و 15 آغازگر در گندم را 63/0 و همین مقدار را زمانی که تعداد ژنوتیپها 6 عدد بود 54/0 بهدست آوردند.
نشانگر RAPD نسبت به ISSR از شاخص نشانگری و شاخص تنوع شانن و نی بالاتری برخوردار بود و میتواند به این دلیل باشد که نشانگر RAPD تصادفی بوده اما نشانگر ISSR نیمه تصادفی و چون نشانگرهای تصادفی معمولاً در صورت تکثیر تعداد باند بیشتر تکثیر میکنند در نتیجه RAPD توانسته تعداد باند بیشتر و پیرو آن شاخص نشانگری بالاتری نیز داشته است.
ضریب تشابه: ضریب تشابه ژنتیکی در بین 5 ژنوتیپ زیره سبز مورد استفاده با توجه به کل 182 باند تولیدشده در نشانگر RAPD، بر اساس روش نی و لی (33) محاسبه گردید و بیشترین میزان تشابه مربوط به زیره سبز نیشابور و زیره سبز گز برخوار (526/0) و کمترین میزان تشابه مربوط به ژنوتیپهای زیره سبز سبزوار و زیره سبز کاشان (144/0) با میانگین 364/0 مشاهده گردید. از طرفی ضریب تشابه ژنتیکی با توجه به کل 135 باند تولید شده در نشانگر ISSR، بر اساس روش نی و لی (33) نیز محاسبه و بیشترین میزان تشابه مربوط به زیره سبز کاشان و زیره سبز اصفهان (647/0) و کمترین میزان تشابه مربوط به ژنوتیپهای زیره سبز سبزوار و زیره سبز کاشان (085/0) با میانگین 323/0 مشاهده گردید؛ اما ضریب تشابه ژنتیکی با توجه به کل 217 باند تولید شده در نشانگر RAPD و ISSR، محاسبه و بیشترین میزان تشابه مربوط به زیره سبز کاشان و زیره سبز اصفهان (547/0) و کمترین میزان تشابه مربوط به ژنوتیپهای زیره سبز سبزوار و زیره سبز کاشان (117/0) با میانگین 346/0 به دست آمد (جدول 8).
در نشانگر RAPD، بیشترین میزان شاخص تنوع ژنی نی و شاخص اطلاعات شانن به ترتیب 32/0 و 233/0 متعلق به جمعیت زیره سبز سبزوار و کمترین میزان شاخص تنوع ژنی نی و شاخص اطلاعات شانن به ترتیب 21/0 و 23/0 متعلق به جمعیت زیره سبز کاشان بود (جدول 6) و در نشانگر ISSR نیز بیشترین میزان شاخص تنوع ژنی نی و شاخص اطلاعات شانن به ترتیب 18/0 و 27/0 متعلق به جمعیت زیره سبز سبزوار و کمترین میزان شاخص تنوع ژنی نی و شاخص اطلاعات شانن به ترتیب 113/0 و 115/0 متعلق به جمعیت زیره گز برخوار بود (جدول 7).
بنا بر نظریه واویلوف، منشأ یا خاستگاه اولیه گیاهان متعلق به مراکزی است که بیشترین تنوع را دارا هستند (2). لذا ضرورت دارد در جمعآوری ژرم پلاسم و پیدا کردن ژنهای مفید به زیره سبز سبزوار توجه بیشتری شود.
نتایج حاصل از تجزیه واریانس مولکولی که در آن تغییرات مشاهده شده داخل و بین اجزا جمعیت با استفاده از فاصلههای ژنتیکی دستهبندی میشود محاسبه و بر اساس اطلاعات حاصل از نشانگر RAPD، 79 درصد تغییرات ژنتیکی یافت شده درون جمعیتها و 21 درصد در بین جمعیتها (جدول 9) و بر اساس اطلاعات حاصل از ISSR، 77 درصد تغییرات ژنتیکی یافت شده درون جمعیتها و 23 درصد در بین جمعیتها مشاهده شد (جدول 10).
گزارش گردیده که ضریب تشابه تا حدودی تحت تأثیر تعداد ژنوتیپ، تعداد آغازگر و غیره قرار میگیرد. مثلاً پاراشهر و همکاران (35) در زیره سبز با استفاده از نشانگر ISSR تشابه را از 63/0 تا 94/0، سیدلر و همکاران (46) از 33/0 تا 78/0، بوهن و همکاران (10)، میانگین 57/0، ماکافری و همکاران (27) میانگین 44/0، آگراما و توینسترا (3) میانگین 43/0 بهدست آوردند.
چندین عامل اکولوژیکی سبب انباشته شدن تفاوت ژنتیکی بین دو جمعیت میشود. مکانهای جغرافیایی مختلف از نظر برخی ویژگیهای اکولوژیکی از جمله عرض و طول جغرافیایی، دما و رطوبت متفاوتاند. این عوامل فاکتورهای اکو جغرافیایی خوانده میشوند و سبب گوناگونی ژنتیک در بین دو جمعیت میشوند. با توجّه به نتایج، استفاده از جمعیتهای مناطق جغرافیایی بیشتر برای تأیید الگوی موجود لازم است.
در گونههای دگرگشن به علت ایجاد ترکیبات ژنی جدید، جریان ژنی بالا و فشار شرایط محیطی حاکم بر منطقه، منجر به تثبیت یک سری ژنهای خاص شده لذا فاصله ژنتیکی درون جمعیتها پراکنده بوده و در عوض تنوع بین جمعیت نسبتاً کم است (39) اما در گونههای خودگشن به دلیل وجود اللهای متفاوت درون هر جمعیت، تغییرات بیشتری درون جمعیتها وجود دارد (38) و در کل هم در گیاهان خودگشن و هم دگرگشن در اکثر حالات تنوع درون جمعیت بیشتر از تنوع بین جمعیت بوده ولی این میزان تنوع در گیاهان خودگشن بیشتر از دگرگشن است.
جدول 5- تعداد باند تکثیرشده (AB)، تعداد باند چندشکلی (PB)، تعداد باند مؤثر (Ne)، درصد چندشکلی (PP)، شاخص چندشکلی (DI)، شاخص شانن (I)، شاخص نی (h) و شاخص نشانگری (MI) در نشانگر ISSR
MI |
DI |
H |
I |
PP |
Ne |
PB |
AB |
آغازگر |
38/2 |
34/0 |
45/0 |
64/0 |
100 |
84/1 |
7 |
7 |
UBC808 |
56/7 |
42/0 |
421/0 |
6/0 |
100 |
76/1 |
18 |
18 |
UBC809 |
07/4 |
37/0 |
336/0 |
51/0 |
100 |
55/1 |
11 |
11 |
UBC811 |
33/0 |
11/0 |
329/0 |
50/0 |
100 |
54/1 |
3 |
3 |
UBC112 |
68/4 |
39/0 |
320/0 |
48/0 |
100 |
54/1 |
12 |
12 |
UBC818 |
6/3 |
36/0 |
322/0 |
49/0 |
100 |
51/1 |
10 |
10 |
UBC820 |
8/1 |
3/0 |
374/0 |
537/0 |
100 |
68/1 |
6 |
6 |
UBC827 |
32/6 |
42/0 |
394/0 |
57/0 |
11/94 |
71/1 |
16 |
17 |
UBC857 |
88/2 |
36/0 |
42/0 |
61/0 |
100 |
75/1 |
8 |
8 |
UBC864 |
48/2 |
35/0 |
27/0 |
41/0 |
88/88 |
45/1 |
8 |
9 |
UBC872 |
جدول 6- تعداد کل باندها (AB)، تعداد باند چندشکلی (PB)، درصد چندشکلی (PP)، تعداد باند مؤثر (Ne)، شاخص شانن (I) و شاخص نی (h) در نشانگر RAPD
کد جمعیت |
AB |
PB |
PP |
Ne |
h |
I |
1 |
182 |
114 |
64/62 |
35/1 |
32/0 |
333/0 |
2 |
182 |
89 |
90/48 |
2/1 |
21/0 |
23/0 |
3 |
182 |
99 |
40/54 |
25/1 |
24/0 |
26/0 |
4 |
182 |
90 |
45/49 |
21/1 |
25/0 |
23/0 |
5 |
182 |
110 |
44/60 |
379/1 |
21/0 |
23/0 |
جدول 7- تعداد کل باندها (AB)، تعداد باند چندشکلی (PB)، درصد چندشکلی (PP)، تعداد باند مؤثر (Ne)، شاخص شانن (I) و شاخص نی (h) در نشانگر ISSR
کد جمعیت |
AB |
PB |
PP |
Ne |
h |
I |
1 |
135 |
62 |
93/45 |
33/1 |
18/0 |
27/0 |
2 |
135 |
40 |
63/29 |
2/1 |
131/0 |
180/0 |
3 |
135 |
21 |
56/15 |
07/1 |
113/0 |
115/0 |
4 |
135 |
19 |
07/14 |
12/1 |
126/0 |
129/0 |
5 |
135 |
60 |
44/44 |
27/1 |
162/0 |
154/0 |
جدول 8- دورترین جمعیتهای زیره سبز مورد استفاده بر اساس ماتریس تشابه بهدستآمده از روش نی و لی و نشانگرهای RAPD، ISSR و توأم
میزان تشابه |
نشانگر مورد استفاده |
دورترین جمعیت ها |
144/0 |
RAPD |
زیره سبز سبزوار- زیره سبز کاشان |
085/0 |
ISSR |
زیره سبز سبزوار - زیره سبز کاشان |
177/0 |
ISSR - RAPD |
زیره سبز سبزوار - زیره سبز کاشان |
جدول 9- تجزیه واریانس مولکولی جمعیتهای زیره سبز بر اساس اطلاعات نشانگر RAPD
درصد واریانس |
میانگین مربعات |
مجموع مربعات |
درجه آزادی |
منابع تغییرات |
21 |
**067/60 |
267/240 |
4 |
بین جمعیت |
79 |
**467/33 |
667/34 |
10 |
درون جمعیت |
|
|
933/574 |
14 |
جمع کل |
**: تفاوت معنی دار در سطح یک درصد (P<0.01)
جدول 10- تجزیه واریانس مولکولی جمعیتهای زیره سبز بر اساس اطلاعات نشانگر ISSR
درصد واریانس |
میانگین مربعات |
مجموع مربعات |
درجه آزادی |
منابع تغییرات |
23 |
**733/67 |
933/270 |
4 |
بین جمعیت |
77 |
**467/13 |
667/134 |
10 |
درون جمعیت |
|
|
600/405 |
14 |
جمع کل |
**: تفاوت معنی دار در سطح یک درصد (P<0.01)
در تحقیق حاضر نتایج تجزیه واریانس مولکولی بر اساس نشانگر RAPD (تنوع ژنتیکی درون جمعیت ها 79 و تنوع بین جمعیتها 21 درصد) و بر اساس ناشنگر ISSRs (تنوع ژنتیکی درون جمعیت ها 77 و تنوع بین جمعیتها 23 درصد) بود. وجود تنوع بالا درون جمعیت در گیاهان دیگر با استفاده از نشانگر RAPD (شباهت بیشتر گونه M. piperita را با گونه M. aquatic) (31) و نشانگر ISSR؛ شوید (7)، لاله واژگون (30)، مازودار و ویول (5)، نعناع (42)، سیب شرقی (25) و مرزه (23) گزارش شده است
از عوامل مؤثر در توجیه تنوع بیشتر درون جمعیت مواردی از جمله خودگشن بودن گیاه، یکساله بودن، ازدیاد با بذر، تعداد مکانهای اللی موردبررسی، موقعیت اللی و ژنوتیپی جمعیت، نوع تلاقی و اندازه جمعیت را میتوان ذکر نمود (36) بررسی تنوع ژنتیکی در جمعیتها به دلیل دخالت چندین عامل از جمله پیوستگی، تلاقی خویشاوندی، مهاجرت و تفاوتهای موجود در افراد تشکیل دهنده جمعیتها دارای پیچیدگیهایی است (29).
در تحقیقی نیز آنالیز واریانس مولکولی تنوع درون و بین جمعیتی سیب شرقی را بهترتیب 94 و 6 درصد از کل تنوع نشان دادند، که بیانگر تنوع درون جمعیتی قابل ملاحظه در جمعیتهای این گونه بوده و بیان کردند که علیرغم شرایط رویشگاهی متفاوت و فاصله جغرافیایی زیاد جمعیتها از یکدیگر این مسئله میتواند حاکی از سطح بالای برقراری جریان ژن و تبادل ژنتیکی بین جمعیتهای سیب جنگلی شمال ایران باشد(25).
با توجه به اینکه فاصله ژنتیکی بیشتر در هنگام تلاقی جمعیتها یا لاینها، سبب افزایش مکانهای ژنی هتروزیگوت و بالا بردن احتمال اثر هتروزیس میشود (34)؛ و از طرفی فاصله ژنتیکی ممکن است با صفات مطلوب مرتبط باشد در نتیجه میتوان پس از بررسیهای بیشتر، از آنها در برنامههای بهنژادی استفاده کرد(7). لذا بر این اساس چون کمترین میزان تشابه مربوط به جمعیتهای تربچه French breakfast و Vikima بوده و یشترین تنوع درون جمعیتی مربوط به جمعیت French breakfast بود در نتیجه میتوان ذکر کرد که جهت هر نوع تلاقی و اصلاح گیاه دارویی تربچه بهتر است جمعیت French breakfast به عنوان یکی از پایههای پدری یا مادری و یا دهنده ژن انتخاب کرد.
تجزیه خوشهای: تجزیه خوشهای در روش RAPD، ISSR و توام، جمعیتهای زیره سبز را در سه گروه مختلف طبقهبندی کرده و مشاهده شد جمعیتها از لحاظ موقعیت جغرافیایی از همدیگر تفکیک شدند (شکل 3، 4 و 5). در گروه اول جمعیتهای زیره سبز نیشابور، سبزوار قرار گرفتند و در گروه دوم جمعیت زیره سبز گز برخوار و در گروه سوم جمعیتهای زیره سبز اصفهان و کاشان قرار گرفتند که در هر سه گروه جمعیتهای که از لحاظ موقعیت جغرافیایی نزدیک به هم بودند در یک گروه قرار گرفتند. لازم به ذکر است که جمعیت زیره سبز گز برخوار که در یک گروه جداگانه قرار گرفته دارای بیشترین میزان باند تکثیری در بین تمام جمعیتها بود (داده نشان داده نشده است).
نتیجه گیری
با توجه به اینکه RAPD و ISSR دو نشانگر غالب بوده و بر اساس کم هزینه و آسان بودن جهت انجام و قابلیت تکرار بودن ISSR در آزمایشگاههای مختلف نسبت به RAPD، از این دو نشانگر بسیار در تحقیقات مختلف استفاده شده است و از طرفی برخی محققین دریافتهاند که ISSR الگوی نشانگر پیچیدهتری نسبت به RAPD تولید میکند (45, 49, 50, 53) و همچنین برخی دیگر نیز دریافتهاند که RAPD الگوی نشانگر پیچیدهتری تولید میکند (15, 18, 24) در این تحقیق نیز تا حدودی RAPD نسبت به ISSR تنوع بیشتری تولید نمود.
یکی دیگر از اهداف این تحقیق انتخاب دورترین جمعیتها جهت تلاقیهای احتمالی و ایجاد تنوع جدید و مفیدتر است که زیره سبز سبزوار و زیره سبز کاشان دورترین جمعیتها بودند. همچنین بر اساس شاخصهای تنوع شانن و نی، سبزوار به عنوان مرکز تنوع این گیاه بر اساس جمعیتهای مورد بررسی پیشنهاد میگردد.
لازم به ذکر است که آغازگرهای ISSR که در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفت برگرفته از گوجه فرنگی (47) بودند و توانستند در زیره سبز نیز تکثیر شوند که این خود میتواند دلیلی بر روند تکاملی و مناطق حفاظت شده مشترک بین زیره سبز و گوجهفرنگی باشد.
شکل 3- تجزیه خوشهای جمعیتهای زیره سبز بر اساس نشانگر RAPD، ماتریس تشابه نی و لی و روش NJ با نرم افزار Darwin.
شکل 4- تجزیه خوشهای جمعیتهای زیره سبز بر اساس نشانگر ISSR، ماتریس تشابه نی و لی و روش NJ با استفاده از نرم افزار Darwin
شکل 5- تجزیه خوشهای جمعیتهای زیره سبز بر اساس نشانگر RAPD و ISSR، ماتریس تشابه نی و لی و روش NJ با استفاده از نرم افزار Darwin
منابع