Document Type : Research Paper
Authors
Department of biology, Ardabil Branch, Islamic Azad University, Ardabil, Iran.
Abstract
Obesity is currently a risk factor for many diseases and health problems that one of the main causes of its incidenceare genetic factors. One of the genetic factors that recently considered for obesity is polymorphisms of GNB3. This study aimed to investigate the association between C825T polymorphism in GNB3 with obesity in the population of Ardabil. In this case-control study, 100 obese subjects (case group) and 100 healthy subjects (control group) were included basis of their body mass index. 42% of healthy and 44% of obese subjects were male, and 58% of healthy and 56% of obese subjects were female (P = 0.775). The mean age of healthy and obese subjects was 41.5±16.7 and 41.6±13.8, respectively (P<0.001). The TT genotype frequency in obese individuals was significantly greater than its frequency in healthy individuals (38% versus 13%, P=0.0001). Also, the T allele frequency in obese individuals was significantly greater than its frequency in healthy individuals (60% versus 39%, P=0.0029). The Findings showed that TT genotype increases the risk of obesity with an odds ratio of 2.92. In other words, the risk of obesity in people with TT genotype of C825T polymorphism is 75%. The results of this study showed that C825T polymorphism of GNB3 gene is associated with obesity in Ardebil population and can represent one of the possible genetic causes of obesity incidence in this area.
Keywords
Main Subjects
بررسی ارتباط بین پلی مورفیسم C825T در ژن GNB3 با چاقی در جمعیت استان اردبیل
فاطمه ناطق، هاشم یعقوبی* و کیوان رجبعلیزاده
اردبیل، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد اردبیل، گروه زیست شناسی
تاریخ دریافت: 17/3/96 تاریخ پذیرش: 10/8/96
چکیده
امروزه چاقی یکی از معضلات بهداشتی و عامل خطر بروز بسیاری از بیماریهاست که از علل عمده بروز آن، عوامل ژنتیکی هستند. یکی از عوامل ژنتیک که اخیراً برای چاقی مورد توجه قرار گرفته، پلیمورفیسمهای ژن GNB3 میباشد. این مطالعه با هدف بررسی ارتباط بین پلیمورفیسم C825T در ژن GNB3 با چاقی در جمعیت استان اردبیل انجام گرفت. این مطالعه از نوع موردی شاهدی بود که 100 نفر فرد چاق (گروه مورد) و 100 نفر سالم (گروه شاهد) بر اساس شاخص توده بدنی وارد طرح شدند. از این افراد 5 میلیلیتر خون جهت آزمایشات مولکولی گرفته شد. DNA کلیه نمونههای خون با استفاده از روش استاندارد فنل کلرفرم استخراج شدند. ژنوتیپ های پلیمورفیسم C825T در ژن GNB3 با استفاده از تکنیک PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism Reaction - Polymerase Chain ) تعیین گردید. فراوانی ژنوتیپ TT در افراد چاق بهطور معنادار بیشتر از فراوانی آن در افراد سالم بود (38 درصد در مقابل 13 درصد و P=0.0001). همچنین، فراوانی آلل T در گروه چاق بهطور معنادار بیشتر از گروه سالم بود (60 درصد در مقابل 39 درصد و P=0.0029).یافتههای حاصل از این تحقیق نشان می دهد که پلیمورفیسم C825T ژن GNB3 با چاقی در جمعیت استان اردبیل ارتباط داشته و میتواند نشان دهنده یکی از دلایل احتمالی ژنتیک در بروز عارضه چاقی در افراد این منطقه باشد.
واژه های کلیدی: چاقی، اردبیل، پلی مورفیسم C825T ، ژن GNB3، PCR-RFLP
* نویسنده مسئول، تلفن: 09125798735 ، پست الکترونیکی: yaghoubi_h@iauardabil.ac.ir
مقدمه
امروزه چاقی یکی از معضلات بهداشتی و عامل خطر برای بروز بسیاری از بیماریها است. شیوع این عارضه در بسیاری از کشورهای صنعتی و نیز کشورهای در حال توسعه بهسرعت در حال افزایش است، در حال حاضر 15% مردم دنیا چاق هستند و مطالعات نشان میدهد بالای 58% از مردم جهان به چاق بودن تا سال 2030 دچار میشوند (10). چاقی عامل خطرزای بیماریهای دیابت، هیپرلیپیدمی، فشارخون بالا، سندرم متابولیک، سکته و بیماری عروق کرونراست (2).
چاقی ناشی از افزایش عمومی یا موضعی چربی در بدن میباشد. اگر تجمع چربی اضافی در نواحی تنه و به ویژه شکم صورت گیرد، به آن چاقی آندروئید گفته میشود که بیشتر در مردان مشاهده میگردد. چنانچه چربی اضافی در قسمتهای محیطی بدن بویژه اطراف رانها و باسن متمرکز شود، به آن چاقی ژینوئید میگویند که عمدتاً در زنان دیده میشود(14).
اضافه وزن و چاقی بسته به نوع و دقت کار به طرق مختلف ارزیابی میشوند. روشهای ساده آن عبارتند از جداول وزن، قد، شاخص توده بدنی (BMI : Body mass index)، دور کمر، نسبت دور کمر به دور باسنو نسبت دور شکم به دور لگن. معیار پیشتاز در این زمینه BMI است؛ BMI بین kg/m2 9/29-25 را اضافه وزن و BMI بالاتر از 30 را چاق مینامند(25). علل متعددی در بروز چاقی دخالت دارند؛ عوامل ژنتیکی، افزایش دریافت انرژی نسبت به مصرف آن، زندگی بدون تحرک، عوامل محیطی- اجتماعی و روانی، اختلالات عصبی و تغذیه بیش از حد در دوران کودکی از جمله این عوامل هستند (18).
یکی از ژنهایی که برای چاقی مورد توجه قرار گرفته است ژن GNB3 است(28). ژن GNB3 (Guanine nucleotide –binding protein G sub unit beta 3) بر روی کروموزوم 12p13 قرار گرفته است. پروتئین G، یک ارتباط دهنده بین سیگنالها (پروتئینهای موثر بر سلول) و گیرندههای سطح سلولی است و زیر واحد بتا این پروتئین به وسیله ژن GNB3 کد میشود (17). جهشC825T شایعترین جهش ژن GNB3 میباشد که در نتیجه آن 41 اسید آمینه در این پروتئین حذف میشود. این فرایند باعث پر کار شدن پروتئین G و در نتیجه افزایش تاثیر سیگنالهای سلولی میشود و بدنبال آن یکسری اختلالات و بیماریها رخ میدهد (3). در مطالعات مختلفی تاثیر این پلیمورفیسم بر پرفشاری خون و بیماریهای کاردیووسکولار تایید شده است (12، 16، 19 و 21). در مطالعه حاضر ارتباط بین پلیمورفیسم C825T در ژن GNB3 با چاقی در جمعیت استان اردبیل مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
انتخاب و جمع آوری نمونه و استخراج DNA از نمونه ها: این مطالعه مورد–شاهدی بر روی 200 نفراز افراد مراجعه کننده به بیمارستان امام خمینی اردبیل و نمین انجام شد که بر اساس شاخص توده بدنی (BMI) به دو گروه چاق (BMI≥30) و کنترل (BMI<25) تقسیم شدند. نمونه ها با رضایت افراد و با پر کردن فرم رضایت نامه جهت انجام مراحل مختلف جمع آوری شدند. به منظور تعیین ژنوتیپ از هر فرد مقدار ۵ میلیلیترخون گرفته شد و در فالکونهای حاوی EDTA، به عنوان ماده ضد انعقادکننده، ریخته شد و نمونهها به آزمایشگاه منتقل و در فریزر20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. DNA کلیه نمونههای خون با استفاده از روش استاندارد فنل کلرفرم استخراج شده و میزان آن با استفاده از اسپکتروفوتومتر اندازهگیری شد و در 20- درجه سانتیگراد برای PCR (Polymerase Chain Reaction) ذخیره شد.
اجزاء و مواد مورد استفاده برای PCR: واکنش PCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر که شامل 5/2 میکرولیتر بافر 10X،1/2 میکرولیترکلرید منیزیم 50 میلی مولار، 2/0 میکرولیتر Taq Polymerase، 5/0 میکرولیتر dNTP(10mM)s،1 میکرولیتر ازپرایمر رفت با توالی : 5' TGACCCACTTGCCACCCGTGC-3’ و 1 میکرولیتراز پرایمر برگشت با توالی GCAGCAGCCACCGCTGGC-3 : 5' 7/14 میکرولیتر آب مقطر و 3 میکرولیترDNA در نظر گرفته شد. برنامه PCR به صورت دناتوراسیون اولیه در دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت 3دقیقه و سپس 34 سیکل شامل دناتوراسیون 94 درجه سانتی گراد به مدت 20 ثانیه، اتصال پرایمرها 51 درجه سانتی گراد به مدت30 ثانیه و طویل سازی 72 درجه سانتی گراد به مدت 20 ثانیه انجام گرفت و در نهایت طویل سازی در دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت 3 دقیقه صورت گرفت. سپس جهت بررسی تکثیر موفق قطعه مورد نظر، 5 میکرولیتر از محصول PCR بر روی ژل آگارز 2 درصد و به کمک رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید مورد آزمایش قرار گرفت .
تکنیک RFLP: پس از واکنش PCR جهت انجام تکنیک RFLP ، 5/7 میکرولیتر از محصول PCR تحت اثر هضم با آنزیم BSaJI به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه گردید و با الکتروفورز نمونه ها ژنوتیپ TT با باند 268 جفت باز، ژنوتیپ CT با باند های268، 154، 114 جفت باز و ژنوتیپ CC با باند های 154 و 114 جفت باز روی ژ ل آگارز 2 درصد مشخص شدند.
آنالیز آماری: در این مطالعه ارتباط بین ژنوتیپ ها با استعداد چاقی در افراد توسط آنالیز آماری از آزمونهای کایدو، تیتست و به کمک نرم افزار SPSS نسخه 16 بررسی شد. سطح معنی دار 05/0 در نظر گرفته شد. به عبارتی 05/0P-value< بیان کننده این است که اختلاف بین افراد سالم و چاق معنادار است ولی 05/0 P-value > بیان کننده این است که هیچ اختلاف معناداری بین افراد کنترل و بیمار وجود ندارد.
نتایج
شکل 1 ژل تهیه شده از الکتروفورز محصول PCR ژن GNB3 را نشان می دهد پس از تکثیر قطعات مورد نظر باند bp268 حاکی از تکثیر موفق این ناحیه بود (شکل1) و بریده شدن این قطعات تحت اثر آنزیم BSaJI الگوی قطعات حاصل پس از الکتروفروز روی ژل آگاروز بصورت یک قطعه با طول bp 268 نمایانگر ژنوتیپ TT ،سه قطعه با طول bp 268 ،154،114 نمایانگر ژنوتیپ CT و دو قطعه با طول bp 154 ،114 نمایانگر ژنوتیپ CC میباشد. شکل 2 الگوی باندهای حاصل را روی ژل آگاروز نشان می دهد.
شکل1- ژل تهیه شده از الکتروفورز محصول PCR ژن GNB3
شکل 2 - ژل تهیه شده از RFLP و الکتروفورز با ژنوتیپهای مختلف (ستون I: محصول uncut، ستون II: هموزیگوت TTبا باند(bp268 )، ستون III: هتروزیگوت CTبا باندهای( bp268 ،154، 114)ستون IV: هموزیگوتCC با باندهای(bp 154،114)
توزیع جنسی افراد مورد مطالعه: در مجموع در مطالعه حاضر 200 نفر مورد بررسی قرار گرفتند که از این تعداد، 86 نفر (43 درصد) مرد و 114 نفر (57 درصد) زن بودند. از 100 فرد واقع در گروه سالم، 42 نفر مرد و 58 نفر زن، و از 100 فرد واقع در گروه افراد چاق، 56 نفر مرد و 44 نفر زن بود. جدول 1 توزیع جنسیتی افراد مورد مطالعه را نشان میدهد. همان طور که از این جدول دیده میشود، مقدار معنیداریِ آزمون کایدو بیشتر از 05/0 آمده است (sig.=0.775) که نشان دهنده این است که دو گروه مورد مطالعه از نظر توزیع جنسی افراد اختلاف معنادار ندارند.
جدول 1-توزیع جنسی افراد مورد مطالعه
جنسیت گروه چاق گروه سالم فراوانی کای اسکویر تعداد درصد تعداد درصد مجموع درصد
|
مرد 44 44% 42 42% 86 43% 775/0
زن 56 56% 58 58% 114 114%
میانگین سنی و BMI افراد مورد مطالعه: بررسی شاخص های تن سنجی نشان داد که میانگین BMI افراد سالم (2/3±5/23) و میانگین BMI افراد چاق(7/2±3/34) بود. مقدارمعنیداریِ آزمون تیتست کمتر از 05/0 آمده است (sig.<0.001) که نشان دهنده این است که دو گروه مورد مطالعه از نظر BMI افراد اختلاف معنادار دارند به طوری که میانگین BMI افراد گروه چاق به طور معنادار بیشتر از افراد گروه سالم است (جدول2). کم سن ترین و مسن ترین فرد مورد مطالعه برای گروه سالم به ترتیب 20 و 61 سال و برای گروه چاق 23 و 65 سال بود.
جدول 2 - میانگین سنی و BMI افراد مورد مطالعه در دو گروه سالم و چاق
متغیر |
گروه چاق(میانگین± انحراف معیار |
گروه سالم (میانگین± انحراف معیار) |
p-value |
سن
|
8/13±6/41
|
7/16±5/41
|
963/0 |
BMI |
7/2±3/34 |
2/3±5/23 |
کمتر از 001/0 |
مقایسه فراوانی ژنوتیپی و آللی پلیمورفیسم C825T ژن GNB3 در بین دو گروه چاق و سالم: فراوانی ژنوتیپی و آللی پلیمورفیسم C825T ژنGNB3 در بیماران مبتلا به چاقی و افراد کنترل سالم در جمعیت مورد مطالعه در جدول 3 مشاهده میشود. همان طور که از این جدول مشاهده میشود، فراوانی ژنوتیپ TT در افراد چاق بیشتر از فراوانی آن در افراد سالم بود (38 درصد در مقابل 13 درصد). همچنین فراوانی آلل T در گروه چاق بیشتر از گروه سالم بود (60 درصد در مقابل 39 درصد).
فراوانی ژنوتیپ های CC ،CTوTT به ترتیب در افراد چاق 18، 44و 38 درصد و در افراد کنترل سالم 35، 52 و 13 درصد بودند و آلل C و T نیز در افراد چاق 40و 60 درصد و در افراد سالم 61 و 39 درصد بود. نتایج بدست آمده از آزمون کایدو برای هر دو متغیر کمتر از 05/0 بدست آمد (sig.=0.0001 برای ژنوتیپ و sig. =0.0029 برای آلل) که نشان دهنده این است که دو گروه موردِ مطالعه از نظر توزیع فراوانی ژنوتیپی و آللی پلیمورفیسم C825T ژنGNB3 تفاوت دارند به طوری که فراوانی ژنوتیپ TT و آلل T در افراد چاق به طور معنادار بیشتر از فراوانی آن در افراد سالم بود.
جدول3- مقایسه ارتباط ژنوتیپ ها و آلل های پلی مورفیسم C825T در ژن GNB3 بین دو گروه چاق و سالم
ژنوتیپ ها گروه چاق گروه سالم p-value تعداد درصد تعداد درصد |
CC 18 18% 35 35% 0001/0
CT 44 44% 52 52%
TT 38 38% 13 13%
فراوانی آلل C 80 40% 122 61% 0029/0
فراوانی آلل T 120 60% 78 39%
|
بحث
چاقی به تجمع زیاد یا غیر طبیعی چربی بدن که اختصاص به کل یا قسمتهای خاصی از بدن دارد اطلاق میشود(1) که مانند بسیاری دیگر از وضعیتهای پزشکی، نتیجه تعامل بین عوامل ژنتیکی و محیطی میباشد (2و 15). از آنجایی که کمتر کشوری در دنیا وجود دارد که با معضل چاقی درگیر نباشد، چاقی و بیماریهای مرتبط با آن مورد توجه بسیاری از پژوهشگران قرار گرفته است. در این راستا محققان به دنبال نشانگرهای بیولوژیکی و مولکولی هستند که از طریق آن بتوانند، افراد مستعد این معضل اجتماعی را شناسایی کرده و تاثیر چاقی بر دستگاههای مختلف فیزیولوژیک بدن را به خوبی شناسایی نمایند (8 و 23). ژنهایی که در شکلهای مختلف چاقی مشارکت میکنند، به راحتی قابل شناسایی نیستند، اما نتایج مطالعات ژنومی گسترده بر روی جمعیت کثیری از افراد نشان دهنده ارتباط پلیمورفیسم ژنها و افزایش خطر ابتلاء به عارضه چاقی میباشد (24).
یکی از ژنهایی که برای چاقی بیشتر مورد توجه قرار گرفته است ژن GNB3 است که شامل 12 اگزون بوده، از 340 آمینو اسید تشکیل شده و در کروموزوم 12p13 واقع شده است و زیر واحد B3، پروتئینهای هتروتری مریک G را رمز میکند. (13). پلیمورفیسم C825T (جایگزینی سیتوزین به تیمین در نوکلئوتید 825 در اگزون 10) در ژن GNB3)) منجر به یک اتصال کوتاه (GB3) میشود که در آن نوکلئوتیدهای 620-498 از اگزون 9 حذف میشوند. محصول GNB3 825T، 41 آمینو اسید کمتر از نوع وحشی محصول آلل 825C است (20). بررسی حاضر ارتباط بین پلیمورفیسم C825T در ژن GNB3 با چاقی بررسی نموده است.
یافتههای مطالعه حاضر نشان داد که فراوانی ژنوتیپ TT در افراد چاق به طور معنادار بیشتر از فراوانی آن در افراد سالم بود (38 درصد در مقابل 13 درصد؛ P=0.0001)، و نیز فراوانی آلل T در گروه چاق به طور معنادار بیشتر از گروه سالم بود (60 درصد در مقابل 39 درصد؛ P=0.0029).
در راستای تحقیق حاضر، مطالعه ایر و همکاران (7) در عربستان نشان داد که آلل 825T عاملی برای چاقی میباشد. مطالعه هگلا و همکاران (5) نشان داد که وزن بدن، دور کمر، و دور باسن در افراد با GNB3 825T به طور معنادار بالاتر است ولی این تغییر ژنتیکی ارتباطی با فشار خون ندارد. نتایج مطالعه کیانی و همکاران (11) نشان داد که ژنوتیپ TT در پلیمورفیسم C825T GNB3 در مقایسه با ژنوتیپ CC/CT ارتباط معناداری با چاقی دارد. کلنک و همکارانش (12) در سال 2011 مشاهده کردند که آلل 825T با بیماری فشار خون، افسردگی و چاقی ارتباط دارد. شیفرت و همکاران (21)، طی تحقیقاتی که انجام دادند به این نتیجه رسیدند آلل825T باخطر فشار خون بالا، سندرم متابولیک، اختلالات چربی و چاقی همراه است. استفان و همکاران (25) به این نتیجه رسیدند که پلیمورفیسم C825T در ژن GNB3 نقش مهمی در تعیین چاقی ایفا میکند. مطالعه ونگ و همکارانش در چین (26) نشان داد که افراد دارای ژنوتیپ نوع TT ارتباط معناداری با چاقی دارند نسبت به کسانی که دارای ژنوتیپCT و یا CC بودند. شیفرت و همکاران (22) در مطالعهای به بررسی توزیع قومی C825T در ژن GNB3 در سراسر جهان و ارتباط آن با چاقی در مردان جوان آلمانی، چینی و آفریقایی پرداختند. در هر یک از این سه گروه، فراوانی آلل 825T در افراد چاق (BMI> 27 kg / m2) نسبت به کسانی که وزن طبیعی داشتند، به طور معنادار افزایش یافته بود. در تحقیقاتی که سمپلیسینی و همکاران (19) انجام دادند به این نتیجه رسیدند که آلل GNB3 825T یک نشانگر مفید ژنتیکی برای تعیین بهتر مشخصات ریسک بیماران مبتلا به فشار خون بالا و چاقی است. زیرا افزایش فشار خون و چاقی با خطر سکته مغزی همراه است. در پژوهشی که توسطK.D.KO و همکاران (9) در کره روی زنان چاق کره ای صورت گرفت یافته ها نشان دادکه پلی مورفیسم GNB3 825T با چربی خون ارتباط معناداری دارد و این پلی مورفیسم یک عامل تعیین کننده در متابولیسم مربوط به چاقی در این جمعیت است. مطالعات نشان دادند که پلی مورفیسم در C825Tژن GNB3 در استعداد چاقی تاثیر گذار است و این پلی مورفیسم تاثیر آشکاری روی BMI افراد چاق دارد.
ولی بر خلاف یافتههای فوق که نشاندهنده وجود ارتباط بین پلیمورفیسم C825T ژن GNB3 با چاقی بودند، مطالعه سیا و همکارانش (6) در سال 2013 در جمعیت تایوانی ارتباط معناداری بین این پلیمورفیسم با چاقی افراد نشان نداد. همچنین، تتسوهایاکاوا و همکارانش (4) در مطالعه خود به این نتیجه رسیدند که این پلیمورفیسم در ژاپن با چاقی، فشار خون و دیابت ارتباطی ندارد. همانند مطالعه حاضر، اکثر مطالعات انجام شده در سطح جهان نیز، نشان دهنده وجود ارتباط بین پلیمورفیسم C825T ژن GNB3 و چاقی هستند. در تحقیق حاضر نیز ژنوتیپ TT ارتباط معنی داری با چاقی نشان داد P=0.0001)). البته در چند مطالعه، ارتباطی بین این پلیمورفیسم و چاقی مشاهده نشده است. شاید این تناقض به دلیل تفاوت در ژنتیک جمعیتهای مورد مطالعه و روش زندگی افراد باشد.به هر حال مسلم است که چاقی نتیجه یک مجموعه پیچیده از عوامل متعدد ارثی و محیطی بوده و ژنهای بسیاری در بروز آن دخالت دارند.
نتیجهگیری کلی
یافتههای حاصل از این تحقیق نشان داد که پلیمورفیسم C825T ژن GNB3 با چاقی در جمعیت استان اردبیل ارتباط داشته و میتواند نشان دهنده یکی از دلایل احتمالی ژنتیک در بروز عارضه چاقی در افراد باشد.
تشکروقدردانی
این مقاله نتیجه پایان نامه کارشناسی ارشد می باشد. نویسندگان این مقاله از مسئولین محترم دانشگاه آزاد اسلامی واحد اردبیل به خاطر فراهم کردن امکانات انجام این تحقیق و نیز از تمام کسانی که در انجام این پروژه همکاری و حمایت نمودند، کمال تشکر و قدردانی را دارند.