بررسی عملکرد میکروارگانیسم خاکزی مولد آنزیم ارگانوفسفات هیدرولاز درسم زدایی ترکیبات ارگانوفسفره (دیازینون) و ارزیابی خواص کینتیکی آن

محمد حاجی ابوالحسنی^1* و عباس صاحبقدم لطفی²

¹ ایران، تهران، سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، پژوهشکده فناوریهای شیمیایی

² ایران، تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم پزشکی، گروه بیوشیمی بالینی

تاریخ دریافت: 07/10/1398          تاریخ پذیرش: 24/02/1399

چکیده

ترکیبات ارگانوفسفره نظیردیازینون بدلیل ویژگیهای منحصربفردخود بطوروسیعی بعنوان آفت کش وحشره کش درکشاورزی مورداستفاده قرارمی گیرند. آنزیم ارگانوفسفات هیدرولاز(OPH) بطور موثری طیف وسیعی از ترکیبات استری ارگانوفسفاتها را هیدرولیز می نماید. دراین تحقیق با استفاده ازدو تکنیک غنی سازی محیط کشت و حداکثرتکرار دررقت سازی، میکروارگانیسم تجزیه کننده دیازینون از نمونه های تیمار شده بادیازینون (مزارع شالیکاری)، جداسازی وباانجام تستهای مورفولوژیکی وبیوشیمیایی شناسایی شد.سپس آنزیم ازسویه باکتریایی استخراج و بترتیب بااستفاده ازرسوب دهی باسولفات آمونیوم وکروماتوگرافی تعویض یونی تخلیص گردید. خلوص آنزیم بااستفاده ازالکتروفورزSDS-PAGE تاییدووزن مولکولی آن نیز توسط مارکرپروتئینی مشخص وخواص کینتیکی آن بررسی گردید. بااستفاده ازتکنیک غنی سازی محیط کشت و افزایش عامل تجزیه زیستی نمونه های تیمارشده بادیازینون، زمان هیدرولیز آنزیمی باکاهش قابل توجهی به کمتراز10ساعت تقلیل یافت. متابولیت اصلی حاصل ازهیدرولیزآنزیمی دیازینون،-2ایزو پروپیل--6 متیل--4هیدروکسی پیریمیدین (IMHP) بااستفاده ازدوتکنیک کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) و اسپکتروفتومتری شناسایی گردید. IMHP درمقایسه بادیازینون سمیت کمتری دارد. آنزیم OPH به میزان 48/57 مرتبه، بافعالیت ویژه 44/16 واحددر میلیگرم پروتئین از محلول عصاره آنزیمی و بازده 4/11 درصد و وزن مولکولی تقریبیKD40 خالص سازی شد. دما وpH بهینه برای ماکزیمم فعالیت آنزیم بترتیب برابر Cͦ 37 و 5/8 بود. علاوه بر این غلظت سوبسترا تا M05/0 و یونهای فلزی Ca⁺², Co⁺² بترتیب 119 و 106 درصد تاثیر مثبت بر فعالیت آنزیم داشتند. پارامترهای ثابت میکائیلیس (K_m) و حداکثر سرعت آنزیم (V_max) برای دیازینون بعنوان سوبسترای واکنش بترتیب برابر با Mµ2/434 و Mµ3/107 در دقیقه محاسبه گردید. نتیجه اینکه آنزیم OPH با فعالیت تدریجی و موثر خود علاوه بر سم زدایی، می‍تواند نقشی کلیدی درآزادسازی فسفات برای تولید کود زیستی ایفاء کند.

واژه های کلیدی:آنزیم ارگانوفسفات هیدرولاز، دیازینون، -2 ایزوپروپیل--6 متیل-4-هیدروکسی پیریمیدین (IMHP)، هیدرولیز آنزیمی

* نویسنده مسئول، تلفن:57416270 -021 ، پست الکترونیکی:abolhasani@irost.ir

مقدمه

ترکیبات ارگانوفسفره مثل پاراتیون، دیازینون، پارااکسان از جمله مواد شیمیایی شناخته شده ای هستند که بدلیل ویژگیهای منحصربفرد خود (سمیت بالا برای آفات و عملکرد سیستماتیک آنها)، بعنوان آفت کش و حشره کش بطور وسیعی در کشاورزی مورد استفاده قرار می گیرند (44،3،22)، اما اثرات ناشی از ماندگاری آنها در محصولات کشاورزی خطرات بزرگی برای سلامت انسان و سایر موجودات زنده و نیز تعادل اکوسیستم پدید می آورند که آسیبهای عصبی حاد و مزمن اینگونه ترکیبات از مدتها پیش شناخته شده و به اثبات رسیده است (24،16،2). اثرات جهش زایی و سرطانی آنها نیز در جانوران مختلف، خصوصا انسان آشکار گردیده است (8).

در واقع این ترکیبات سمیت خود را با جلوگیری از کار آنزیم حیاتی کولین استراز در سیستم عصبی اعمال می‍کنند. غالبا اتصال ترکیبات ارگانو فسفره (بعنوان مهارکننده) به آنزیم استیل کولین استراز از نوع پیوند کووالان و برگشت‍ناپذیر است که منجر به تجمع استیل کولین در محل سیناپسهای عصبی، انقباض شدید ماهیچه هاو با توقف حرکات تنفسی باعث مرگ مسموم می شوند (4،43). تقریبا ساختار کلی ترکیبات ارگانوفسفاتها شبیه هم بوده و دارای سه پیوند فسفواستر می باشند که هیدرولیز یکی از این پیوندها منجربه کاهش سمیت آنها و حذف عملکرد غیرفعال‍سازی استیل کولین استراز می گردند (14،18). از روشهای مختلف فیزیکی، شیمیایی و بیولوژیک برای تجزیه و تخریب ترکیبات ارگانو فسفره بمنظورسالم سازی آلودگیهای زیست محیطی استفاده می شود، که روش بیولوژیکی از مهمترین وکارآمدترین آنها می باشد. در این روش میکروارگانیسمهای محیطی موجود در خاک/ آب مثل Pseudomonas sp. و Flavobacterium sp. با استفاده از آنزیم ارگانوفسفات هیدرولاز (OPH)، با هیدرولیز طیف وسیعی از ترکیبات ارگانو فسفره هم منجر به حذف یا کاهش سمیت آنها گردیده و هم از آنها بعنوان منابع کربن، نیتروژن، فسفر، گوگرد برای تغذیه و یا انرژی جهت تامین فعالیتهای حیاتی مورد نیازخود بهره برداری می نمایند (7، 13، 21، 39). نتیجه این هیدرولیز، شکست در پیوندهای P-O ,P-S ,P-F P-CN و ایجاد الکل است که دراغلب اوقات بصورت ترکیبات کروموفور هستند.

آنزیم ارگانوفسفات هیدرولاز (OPH) بعنوان بهترین آنزیم تجزیه کننده ترکیبات ارگانوفسفره، یک متالوآنزیم همودایمر می باشد که تعیین ساختارسه بعدی آن توسط
X-ray حاکی ازآن است که دارای موتیف(αβ)-barrel  بوده و جایگاه فعال آنزیم بوسیله یک دسته شش تایی اسید آمینه هیستیدین احاطه گردیده و یونهای دو ظرفیتی Zn موجود در آن، یک مرکز دو هسته‌ای فلزی را تشکیل می‌دهندکه با یک پل هیدروکسیلی بیکدیگر مرتبط می‌باشند (27،17). سوبستراهای اختصاصی این آنزیم نسبتا گسترده می‌باشد، بطوریکه اکسیژنهای فسفوریل آن می‌توانند با گوگرد و یا دو گروه اتوکسی آن با گروههای متیل، پروپیل یا فنیل جایگزین شوند. در این واکنش هیدرولازی، گروه ترک کننده می‌تواند شامل فنلها یا آلکیلهای دارای تیول یا فلوراید باشد (9،20،30،31،26).

ازطرفی دیازینون  (o,o-diethyl-o-[2-isopropyl-6-methyl-4-pyrimidinyl]phosphorothioate) پنجمین ترکیب از انواع آفت‍کشهای ارگانو فسفره بوده که در کشاورزی بطور وسیعی از آن استفاده می شود، لذا سم زدایی محیط زیست از این ترکیب بسیار مورد توجه قرار گرفته است (25،1). در این تحقیق ابتدا از نمونه های خاک مزارع برنجکاری در معرض ترکیبات فسفره آلی (دیازینون)،  میکروارگانیسمهای محیطی مولدآنزیم ارگانوفسفات هیدرولاز(Pseudomonas sp.)  جداسازی و شناسایی شد. سپس-2ایزوپروپیل-6-متیل-4-هیدروکسی پیریمیدین(IMHP) بعنوان متابولیت اصلی حاصل از هیدرولیز آنزیمی دیازینون (با سمیت کمتر از آن) با استفاده از دو روش کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) و اسپکتروفتومتری شناسایی و بررسی گردید. خالص سازی آنزیم نیز انجام و خواص کینتیکی مورد ارزیابی قرارگرفت.

مواد و روشها

ﻧﻤﻮﻧﻪ ﻫﺎی ﺧﺎک در معرض دیازینون قرارگرفته از مزارع شالیکاری جمع آوری و در ظروف اﺳﺘﺮﻳﻞ ﻗﺮارداده و ﺗﺎ زﻣﺎن آزﻣﺎﻳﺶ در دمای C° 4 ﻧﮕﻬﺪاری شدند. برای انجام آزمایشات 10گرم ازهر نمونه به لوله های آزمایش منتقل و افزودن10 میلی لیتر آب، باورتکس آنها را کاملا مخلوط و مدتی بحال خود گذاشته شد، تا ته نشین گردد. سپس از مایع رویی بمیزان 10% حجمی به محیط کشت نمکی استریل محتوی ترکیبات ذیل وحاوی دیازینون3/0% استریل شده بافیلترهای میلی پور 0.45µ، تلقیح و در انکوباتور با دمای C° 2±28 قرار داده شد.

(NH₄)₂HPO₄,0.5g; MgSO₄.7H₂O,0.2g; K₂HPO₄,0.1g; Ca(NO₃)₂,0.01g; Na₂HPO₄.12H₂O,0.2g; FeSO₄, 0.01g; CuSO₄.5H₂O,0.015g; MnCl₂.4H₂O,0.025g; Yeast extract,0.5g; Agar,15g; D.W.1000mL

میزان هیدرولیز دیازینون و تشکیل-2ایزوپروپیل-6-متیل-4-هیدروکسی پیریمیدین(IMHP) بعنوان متابولیت اصلی حاصل از هیدرولیز آنزیمی دیازینون وارتباط بین افزایش میزانIMHP درطول موج210nm، همزمان با کاهش سطح دیازینون درطول موج 230nm ناشی ازهیدرولیزآن بااستفاده از اسپکتروفتومتری و خواندنO.D. آنها بررسی گردیده است(11،15).

جداسازی میکروارگانیسم تجزیه کننده دیازینون: با استفاده از تکنیک غنی سازی محیط کشت (Enrichment culture) و تکنیک حداکثرتکراردررقت سازی (Maximum dilution frequency technique) میکروارگانیسم تجزیه کننده دیازینون از نمونه هایی که با دیازینون تیمار شده اند، جداسازی شد. از روش رنگ آمیزی گرم برای مشاهده باکتری درزیر میکروسکپ و از محیط های کشت افتراقی برای آزمایشات بیوشیمیایی استفاده شد(10).

1- غنی سازی محیط کشت جهت افزایش عامل هیدرولیزکننده دیازینون: بااستفاده ازاین تکنیک، با برداشت یک لوپ از هر کدام از نمونه‌ها و تلقیح آن به محیط کشت مایع فوق الذکر، اجازه داده شد تا میکروارگانیسم رشد نماید.در ابتدا محلول مایی دیازینون به نسبت 1 : 1 با سوسپانسیون نمونه انکوبه گردید. وقتیکه دیازینون از این مخلوط ناپدید شد (باشفاف شدن محیط)،5mL از آن مجددا با 5mL محلول دیازینون مخلوط و با همان شرایط آزمایش قبلی (از نظر دما و زمان انکوباسیون) انکوبه و در طی مدت 10 روز انکوباسیون، این عمل 5 بار تکرار گردید (35،36). میزان هیدرولیز دیازینون بااستفاده از اسپکتروفتومتر وخواندنO.D. نمونه ها درطول موج 230nm کنترل شده است.

2- حداکثرتکراردررقت سازی جهت تهیه بهترین رقت تجزیه کننده دیازینون: بااستفاده ازاین تکنیک، از محیط کشت غنی شده فوق، رقتهای سریالی از10^-1 تا  10^-12بدین طریق تهیه شد. ابتدا 1mL ازمحیط کشت غنی شده در آزمایش قبلی به لوله آزمایش اول استریل شده منتقل و سپس با افزودن  9mLاز محلول مایی حاوی دیازینون به آن، تیمار گردید تا بدین ترتیب نمونه با رقت 10^-1 تهیه شود. برای تهیه رقت 10^-2، 1mL از لوله آزمایش اول برداشته به لوله آزمایش دوم استریل شده منتقل و مجددا با افزودن  9mLاز محلول مایی حاوی دیازینون به آن، تیمار گردید (37). تیمار نمونه ها دراین آزمایش نیز با همان شرایط آزمایش قبلی(ازنظردماوزمان انکوباسیون)انجام شد. میزان هیدرولیز دیازینون بااستفاده از اسپکتروفتومترو خواندن O.D. نمونه ها درطول موج230nm کنترل شده است.

استخراج دیازینون و متابولیتهای ناشی ازهیدرولیزآنزیمی آن: درطی مدت انکوباسیون وبطورهمزمان نمونه ها، ابتدا با mL60 و سپس mL 40مخلوط هگزان – استون به نسبت 1 : 1 برای 20 دقیقه در یک فلاسک با حجمmL 200 همزده ‌شد. سپس بمدت 10 دقیقه با دور  g × 10000سانتریفیوژ ‌گردید. مایع رویی به یک دکانتور منتقل، فاز استون آن با اضافه کردن آب، از فاز هگزان جدا گردید و فراکشن هگزان نگهداری ‌شد.. دراین مرحله نیز ابتدا mL60 و سپس mL40مخلوط کلروفرم – دی اتیل اتر به نسبت 1 : 1 به فازآبی (جداشده ازمرحله قبل) افزوده، برای مدت 10 دقیقه همزده و 30 دقیقه اجازه داده شد تا مخلوط ساکن شود. در اینجا نیز فاز آلی از فاز آبی جدا گردید. هر دو فراکشن هگزان و کلروفرم – دی اتیل اتر در دمای محیط (حدود ^o C 223) تبخیر و خشک شدند. سپس درmL2متانول حل و به ویالهای شیشه ای منتقل، تبخیر و خشک گردید. مجددا نمونه ها در ml 1 متانول حل شده و برای آنالیز با کروماتوگرافی لایه نازک مورد استفاده قرار گرفت (34).

کروماتوگرافی لایه نازک: نمونه ها که محتوی دیازینون ویامحصول هیدرولیز دیازینون؛ 2-ایزوپروپیل-6- متیل4--هیدروکسی پیریمیدین (IMHP) است، برروی صفحات TLC لکه گذاری و باقراردادن درحلال فازمتحرک تشکیل شده از مخلوط حلالهای بنزن - کلروفرم – اتیل استات با نسبتهای 2 : 2 : 1، بررسی وشناسایی گردید. صفحات پس از خشک شدن، ابتدا با رودامین B 1% در اتیل الکل 95% وسپس با محلول پالادیم کلراید5/0% در هیدروکسید سدیم N 5 اسپری و در معرض نور UV قرار گرفت(34،26).

تکثیرمیکروارگانیسمهای هیدرولیزکننده سموم فسفره: استوک باکتریایی بعداز کشت درمحیط کشت LB، درشیکرانکوباتور باچرخش rpm 200 و دمای °C28 انکوبه شد. بعد از بالا آمدن کامل باکتری درمحیط کشت (OD₆₀₀)، با دور  g×10000 و دمای °C4 بمدت 10دقیقه سانتریفیوژ گردید. بمنظور القاء باکتری به افزایش تولیدآنزیم OPH برای هیدرولیز دیازینون، رسوب حاصله به محیط کشت نمکی مایع حاوی دیازینون انتقال یافته و مجددا در شیکر انکوباتور با چرخش rpm 200 و دمای C ͦ28 بمدت 24ساعت انکوبه شد. در مرحله بعدی جهت جداسازی باکتریها ازمحیط کشت نمکی مایع محتوی دیازینون، بادورg×10000 و دمای °C4 بمدت 10دقیقه سانتریفیوژ گردید. به رسوب باکتریایی، mL5 بافر سدیم فسفات
mM 50 با 5/8pH= حاوی mM PMSF 5 به عنوان آنتی پروتئاز اضافه کرده و بمدت 20دقیقه استیرر شد.

تهیه عصاره آنزیمی عاری از سلول(مراحل تخلیص آن): از آنجایی که آنزیم استخراج شده از نوع آنزیمهای درون سلولی بود،لذاطی مراحل چهارگانه ذیل اقدام به جداسازی عصاره آنزیمی ازتوده سلولی وتخلیص آن گردید. همزمان فعالیت آنزیمی درهریک ازمراحل فوق بااستفاده از اسپکتروفتومتر وخواندن O.D. آنها، کنترل شده است. سپس با استفاده از الکتروفورز SDS-PAGE در ژل پلی آکریل آمید و سوبسترای اختصاصی، وزن مولکولی باند آنزیمی با استفاده از مارکر پروتئینی شناسایی و فعالیت ویژه آنزیم نیز برای دیازینون بعنوان سوبسترای واکنش مشخص گردید.

مرحله اول- از بین بردن دیواره سلولی باکتری: عمل سونیکیت کردن باکتری روی یخ دردمایC˚4 با زمان سونیکیت 60 ثانیه با فاصله 15 ثانیه و به تعداد 10 بار صورت گرفت. سپس محلول حاصل از سونیکیت بلافاصله با دور g×17500 و دمای C˚4 بمدت 30 دقیقه سانتریفیوژ گردید. محلول رویی را دور ریخته تا رسوب بدست آمده در مرحله بعد مورد استفاده قرار گیرد.

مرحله دوم- استفاده از تریتونX-100 برای افزایش حلالیت غشای سلول باکتری: رسوب حاصل ازمرحله قبل که حاوی آنزیم بود بلافاصله به بافر سدیم فسفات mM50 با 5/8pH= حاوی 5/2 درصد تریتونX-100 انتقال داده شد. محلول حاصل بمدت 24ساعت دردمای C˚4 نگهداری و سپس با دور g×20000 و دمای C˚4 بمدت 2 ساعت سانتریفیوژ گردید. نتایج حاصل از انجام سنجش فعالیت آنزیمی دراین مرحله نشان دادکه تنها محلول رویی فعالیت آنزیمی داشته و لذا جمع آوری و بعنوان محلول آنزیمی نگهداری شدتادرمراحل بعدی تخلیص ازآن استفاده شود.

مرحله سوم- رسوب دهی با سولفات آمونیوم: ابتدا عصاره آنزیمی در بافر سدیم فسفات mM50 با 5/8pH= حل و بترتیب محلولهای سولفات آمونیوم بادرصدهای مختلف (20%، 40%، 60% و 80%) دریک حمام یخ به محلول آنزیمی اضافه و بآرامی بمدت یکساعت استیرر گردید. سپس با دور g×20000و دمای C˚4 بمدت 15دقیقه سانتریفیوژ و لایه بالایی آن دور ریخته شد. آزمایش سنجش فعالیت آنزیمی با استفاده از روش اسپکتروفتومتری و خواندن O.D.بررسی و بر این اساس رسوب60 % بعنوان بهترین درصد از لحاظ میزان فعالیت بر مقدار پروتئین انتخاب گردید. نهایتا از کیسه دیالیز برای جدا کردن نمکهای سولفات آمونیوم از پروتئین استفاده شد.

مرحله چهارم-استفاده ازکروماتوگرافی: تخلیص نهایی عصاره آنزیمی با استفاده ازستون کروماتوگرافی تعویض یونی دی اتیل آمینواتیل- سفاروز (DEAE-Sepharose)(300×15mm) انجام شد. ستون با مقداراضافی بافر سدیم فسفات mM50 با 5/8pH= با شدت جریان mL/min1 شسته تا موادی که به ستون متصل نشده اند، برداشته شوند. برای جداکردن پروتئینهای متصل شده، با شیب غلظتی ازmM50 سدیم کلراید در بافر سدیم فسفات  با 5/8pH=، ستون شستشوداده و فراکشنها باحجم تقریبی mL5 جمع آوری شد. سنجش فعالیت آنزیمی فراکشنها نیزبا استفاده از روش اسپکتروفتومتری وخواندن O.D. آنها کنترل گردید.

مرحله پنجم- الکتروفورز SDS-PAGE : با استفاده از الکتروفورز SDS-PAGE خلوص تک باندعصاره آنزیمی تایید و وزن مولکولی آن نیز با استفاده از مارکر پروتئینی مشخص گردید.

تعیین فعالیت آنزیم باروش اسپکتروفتومتری: ابتدابرای شروع واکنش، دیازینون به بافرسدیم کربنات/ بی کربنات mM 20 (5/8=pH ( افزوده و سپس عصاره آنزیمی به آن اضافه کرده و محلول دائما با استیرر همزده شد. با هیدرولیز 1mol دیازینون،  1mol -2 ایزو پروپیل--6 متیل-4-هیدروکسی پیریمیدین (IMPH)ودی اتیل تیوفسفریک اسید (DEP) تولیدمی گردد.غلظت IMPH همراه باتنظیمpH  نمونه های مائی در 5/8، با استفاده از اسپکتروفتومتر اندازه گیری ‌شد.این ترکیب در nm 210 ماکزیمم جذب داردکه با اندازه گیری غلظت آن تعیین مقدار ‌گردید. همچنین بعلت تشکیل اسید در خلال هیدرولیز دیازینون ولزوم ثابت نگهداشتن pH محیط واکنش در 5/8=pH، نیاز به افزودن مداوم بافرسدیم کربنات/ بی کزبنات می باشد که میزان بافر مصرف شده بستگی به مقداراولیه دیازینون دارد (5).

خواص کینتیکی آنزیم OPH: اثرpH : pH اپتیمم (بهینه) برای ماکزیمم فعالیت آنزیم با استفاده از بافرهای ذیل با غلظت mM50 و pH های 6 تا 12 تعیین گردید: سدیم استات برای  pHبرابر با 2، 3 ،4 و 5، سدیم سوکسینات برای pH برابر با 5، 6/6 و 7، سدیم فسفات برای pH برابر با 5/8 ،7 و 5/8، سدیم بورات برایpH برابر با 5، 9/9 و 10، گلایسین سدیم هیدروکسید برای pHبرابر با 11، 10 و 12 (17).

اثر دما: سنجش فعالیت آنزیم در دماهای C ͦ 70-20 بمنظور تعیین دمای اپتیمم (بهینه) برای ماکزیمم فعالیت آنزیم انجام شد (17).

اثر غلظت سوبسترا: اثر غلظتهای متفاوت دیازینون (M05/0-01/0) بعنوان سوبسترا بر روی فعالیت آنزیم بمنظور تعیین ماکزیمم فعالیت آنزیم بررسی گردید (17).

تعیین پارامترهای کینتیکی آنزیم: مطالعات کینتیکی جهت محاسبه پارامترهای ثابت میکائیلیس- منتن (K_m) وسرعت ماکزیمم (V_max) انجام و از معادله لینویور-برگ (Lineweaver-Burk plot) برای تعیین این پارامترهای کینتیکی استفاده گردید. فعالیت آنزیم در بافر سدیم فسفاتmM50 با 8pH= حاوی غلظتهای 100-20 میکرومولار دیازینون بعنوان سوبسترادردمای C ͦ 30 به مدت 120دقیقه موردسنجش قرارگرفت. برای رسم نمودارمعکوس دو طرفه لینویور- برک ازمنحنی معکوس تغییرات غلظت سوبسترادربرابرمعکوس سرعت فعالیت آنزیمی استفاده شده است (17).

اثر  EDTA و یونهای فلزی: اثر EDTA و یونهایZn⁺², Co⁺², Mg⁺², Ca⁺², Fe⁺³ باغلظت mM2برروی فعالیت آنزیم ارزیابی گردید (31،19).

نتایج

نتایج بدست آمده نشان دادکه دیازینون در طی مدت 5-3 روز انکوباسیون، بطور کامل از بین می رود. البته عمل هیدرولیز آنزیمی دیازینون بعد از یک روز تاخیر شروع می‍گردد. درابتدای تلقیح محیطهای کشت حاوی دیازینون کدورت سفید رنگی داشتند که بعد از24ساعت، بتدریج در اطراف محل تشکیل کلنی ها شفاف گردید (شکل 1-1)که نشاندهنده فعالیت آنزیمی میکروارگانیسم های هیدرولیز کننده دیازینون می باشد. البته این شفافیت بمرور زمان وسیعتر نیز می گردد.

شکل 1-1- ایجاد شفافیت دراطراف کلنی ها

نتایج این هیدرولیز با استفاده از روش اسپکتروفتومتری و خواندن O.D. نمونه ها در طول موج 230nm در جدول
(1-1) منعکس گردیده که کاهش متوالی میزان دیازینون باقیمانده در محیط را نشان داده است.

جدول 1-1- میزان O.D. ثبت شده از اسپکتروفتومتر در طول موج230nm

نتایج حاصل ازکاربردتکنیک غنی سازی نشان دادکه بعد از اولین انتقال، دیازینون در مخلوط انکوبه شده تا مدت 120 ساعت بعدازانکوباسیون، هیدرولیز گردید. اما بعد از انتقال پنجم، هیدرولیز دیازینون به کمتر از 10ساعت کاهش یافت جدول(1-2). بعبارت دیگر غنی سازی عامل هیدرولیز آنزیمی دیازینون درنمونه های تیمارشده با آن، باعث افزایش سرعت هیدرولیز در هر انتقال گردیده است.

نتایج حاصل ازکاربرد تکنیک حداکثرتکراردررقت سازی نشان دادکه رقت 10^-7، بهترین رقت بعنوان عامل هیدرولیز دیازینون بوده است. بعبارت دیگر عامل هیدرولیز در رقت 10^-7 (نسبت به سایررقتهای تهیه شده) بیشتر غنی شده و لذا بالاترین فعالیت را نیز در هیدرولیزدیازینون داشته است.

جدول (1-2) میزان O.D. ثبت شده ازاسپکتروفتومتر در طول موج 230nm

نتایج مربوط به آزمایشات بیوشیمیایی انجام شده در جدول (1-3) نشان دادکه سویه باکتریایی (Pseudomonas sp.) جدا شده ازعصاره سلولی٬ ازنوع هوازی اجباری است.

جدول 1-3- نتایج مربوط به آزمایشات تشخیص باکتری

هیدرولیز دیازینون وتشکیل IMHP بعنوان متابولیت اصلی حاصل از آن: نتایج نشان داد که نمونه های تیمار شده با دیازینون توسط آنزیم هیدرولیزگردیده، بطوریکه در 3 روز اول انکوباسیون، غلظت دیازینون به صورت تصاعدی کاهش یافته و تا روز پنجم به پایین ترین حد ممکن رسیده است. همزمان با آن (IMHP) بعنوان متابولیت اصلی محصول هیدرولیز،تشکیل و در طی این مدت غلظت آن افزایش پیدا می کند نمودار (1-1).

آنالیز باکروماتوگرافی لایه نازک نشان ‌داد که در فراکشن هگزان، عمدتا دیازینون با 78/0= R_f و تیره رنگ (قبل ازشروع هیدرولیز) و در فراکشن کلروفرم- دی اتیل اتر، محصول هیدرولیزدیازینون یعنی-2ایزو پروپیل--6متیل-4-هیدروکسی پیریمیدین (IMHP) با16/0 = R_f زیر نور UV و به رنگ آبی ظاهرشد.

نمودار 1-1- مقایسه میزان هیدرلیز دیازینون در نمونه های تیمارشده و تیمارنشده با آن  وهمزمان تشکیل IMHP

این مطالعه نشان داد که در 3 روز اول انکوباسیون با نمونه های تیمار شده با دیازینون، ابتدا تبدیل به IMHP شده و سپس در 2روز بعدی( بین75تا100ساعت) متابولیزه و به دی اکسید کربن تبدیل ‌گردیده است. بعبارت دیگرازیک طرف باهیدرولیزدیازینون در نمونه های تیمارشده، سطح دیازینون کاهش یافته واز طرف دیگر IMHP، به همان میزان افزایش پیداکرده است. البته این حالت در مخلوط انکوباسیون تا 75 ساعت قابل رویت می باشد شکل (1-2).

شکل 1-2- نتایج آنالیزTLC ازدیازینون و IMHP بعنوان محصول هیدرولیزآنزیمی آن

لکه شماره(1)تا(5)مربوط به فراکشن هگزان بوده و دیازینون رانشان می دهند. لکه های شماره(6)تا(8)مربوط به فراکشن کلروفرم-دی اتیل اتر بوده و IMHP رانشان می دهند.لکه های انتهایی مربوط به نمونه های کاملا هیدرولیزشده بوده ولذااثری از IMHP نیز مشاهده نمی شود.

طیفهای اسپکتروفتومتری UV/Vis مربوط به دیازینون وIMHP در نمونه های شاهد و تلقیح شده: بمنظور تایید نتایج گرفته شده از آنالیز باکروماتوگرافی لایه نازک، بطور همزمان با استفاده از اسپکتروفتومتری نیز طیفهای دیازینون با _max =230nmλ و IMHP  با _max =211nmλ درنمونه های شاهد و تلقیح شده درطی مدت انکوباسیون (5روز) مورد بررسی ونتایج آن در زیر آورده شده است. درنمودارهای 1-2 و 1-3 که بترتیب مربوط به نمونه شاهد درروزاول وپنجم می باشد، فقط طیف دیازینون مشاهده شده است. درحالیکه درنمودارهای 1-4 الی 1-8 که مربوط به نمونه تلقیح شده درطی مدت پنج روزمی باشد، در روز تلقیح (نمودار1-4) فقط طیف دیازینون، اما یک روز بعد از تلقیح طیف مربوط به IMHP نیز قابل مشاهده شده است. ضمن اینکه با تشکیل IMHP و همزمان با افزایش جذب آن، میزان جذب دیازینون نیزروندی کاهشی پیدا کرده بطوریکه درانتهای زمان انکوباسیون طیف دیازینون مشاهده نگردیده است. 

                         نمودار 1-3- طیف دیازینون با  _max =230nmλ                     نمودار 1-2- طیف دیازینون با  _max =230nmλ             

                                  مربوط به نمونه شاهد در روز پنجم                                            مربوط به نمونه شاهد در روز اول                                                                                                                                                                         

نمودار 1-5- طیف مربوط به دیازینون و IMHP (درحال تشکیل)             نمودار 1-4- طیف مربوط به دیازینون در نمونه تیمار شده

   در نمونه تیمار شده                                                                              درروزتلقیح                                                       

نمودار 1-6- طیف مربوط به دیازینون و IMHP در نمونه تیمار شده         نمودار 1-7- طیف مربوط به دیازینون و IMHPدرنمونه تیمارشده

در روزاول بعدازتلقیح(کاهش دیازینون همزمان باافزایش IMHP)             در روزدوم بعدازتلقیح(کاهش دیازینون همزمان باافزایش IMHP)

نمودار (1-8) طیف مربوط به IMHP درنمونه تیمار شده در روز سوم بعد از تلقیح (حذف دیازینون وافزایش IMHP)

نتایج کمی مربوط به مراحل تخلیص آنزیم OPH : آنزیم ارگانوفسفات هیدرولاز (OPH) از Pseudomonas sp. بااستفاده از روش رسوب گذاری باسولفات آمونیوم و بدنبال آن با کرومانوگرافی تعویض یونی DEAE-Sepharose خالص سازی و نتایج آن شامل مقدار پروتئین، فعالیت کل، فعالیت ویژه، میزان خالص سازی و بازده مربوط به محلول آنزیمی خام و فراکشنها درجدول(1-4) نشان داده شده است. آنزیم OPH به میزان خلوص 48/57، با فعالیت ویژه برابر 44/16 واحد درهرمیلی گرم پروتئین برای دیازینون بعنوان سوبسترا و بازده40/11% ازمحیط کشت جدا و تخلیص شده است.

جدول 1-4- داده های کمی حاصله از تخلیص آنزیم OPH

نتایج الکتروفورز SDS-PAGE عصاره آنزیمی همراه با مارکر پروتئینی: برای تایید درجه خلوص و تعیین وزن مولکولی آنزیم تخلیص شده از روش الکتروفورز
SDS-PAGE استفاده شد. همانطور که در شکل (1-3) نشان می‍دهد پروتئینهای اضافی در هر مرحله از تخلیص آنزیم OPH حذف گردیده، بطوریکه درفراکشن خارج شده از ستون کروماتوگرافی تعویض یونی DEAE-Sepharose (چاهک چهارم)، آنزیم خالص سازی شده تنها یک باند با وزن مولکولی تقریبی 40 کیلو دالتون در ناحیه بین 36KD و 45KD مارکر پروتئینی مشاهده گردید.

اثر pH : اثرpH برروی فعالیت آنزیمOPH در محدوده pH 12-6 تعیین گردید. همانطورکه در نمودار 1-9 مشاهده میگردد، فعالیت آنزیم درpH 6 به بالا، افزایش یافته بطوریکه در pH برابر با 5/8 به ماکزیمم فعالیت خود رسیده است. بعبارت دیگرpH بهینه برای فعالیت آنزیم برابر با 5/8 می باشد. با افزایش pH از5/ 8 به بالا و درpH کمتر از 6 فعالیت آنزیم کاهش قابل ملاحظه ای را نشان داده است.

اثر دما: اثر دما برروی فعالیت آنزیمOPH ازC ͦ 70-20 در نمودار 1-10 مشخص شده است. همانطور که مشاهده می‍گردد. در ابتدا با افزایش دما فعالیت آنزیم نیز افزایش یافته و این افزایش از C ͦ 37-30 شدت گرفته، بطوریکه در دمای C ͦ 37 به بالاترین میزان خود رسیده است. بعبارت دیگر بهترین دما برای فعالیت آنزیم دمای C ͦ 37 می‍باشد. با ادامه افزایش دما از این محدوده فعالیت آنزیم با شیب تندی کاهش یافته بطوریکه در دمای C ͦ 70 به بعد تقریبا فعالیت خود را از دست داده است.

اثر غلظت: اثر غلظت دیازینون بعنوان سوبسترا در محدوده M05/0-01/0 در نمودار 1-11 حاکی از آن است که عصاره آنزیمی OPH بالاترین فعالیت را در غلظت M05/0 سوبسترا نسبت به سایر غلظتهای سوبسترا دارد. همچنین فعالیت آنزیم یک منحنی هیپربولیک با سوبسترا تا غلظت M05/0 نشان داده است. اما بالاتر از این غلظت، تغییری در فعالیت آنزیم مشاهده نشد.

ارزیابی پارامترهای کینتیکی آنزیم: پارامترهای کینتیکی بااستفاده ازنمودارلینویور- برک بوسیله دیازینون بعنوان سوبسترامحاسبه شدکه مقدار K_mو V_maxبرای محلول آنزیمی بترتیب µM2/434 و µM3/107سوبسترای هیدرولیز شده در لیتر در دقیقه تعیین گردید (نمودار1-12).

شکل 1-3- ازسمت چپ:چاهک اول مارکر، چاهکهای دوم، سوم و چهارم مربوط به مراحل دوم تاچهارم تخلیص آنزیم و چاهک پنجم تکرارچاهک چهارم می باشدکه نشان می دهد این باندآنزیمی OPH وزن مولکولی بین 36 تا 45 کیلودالتون دارد.

نمودار 1-9 – اثر pH بر فعالیت آنزیم OPH

اثرEDTA و یونهای فلزی: تاثیر EDTA و یونهایZn⁺², Co⁺², Mg⁺², Ca⁺², Fe⁺³  برروی فعالیت آنزیمOPH درpH برابربا 5/8 و دمای C ͦ 37بررسی و نتایج آن درجدول1-5 منعکس گردیده است.نتایج نشان دادیونهای Mg⁺²و Zn⁺²تاثیرمهمی بر فعالیت آنزیم ندارند. درحالیکه یونهای Co⁺²و Ca⁺² فعالیت آنزیم راافزایش داده امایون Fe⁺³ فعالیت آنزیم راکاهش داده وEDTA بیشترین اثرمنفی برفعالیت آنزیم داشته است.

جدول 1-5- مقایسه تاثیریونهای فلزی یبرروی فعالیت آنزیمOPH

نمودار 10- اثر دما بر فعالیت آنزیم OPH

نمودار1-11 - اثرغلظت سوبسترا(دیازینون)برفعالیت آنزیم

نمودار 1-12 – نمودار لینویور- برک مربوط به عصاره آنزیمی خالص سازی شده

بحث

بطور کلی فرآورده های کشاورزی همواره با خسارات بیشمار ناشی از آفات مواجه بوده است که این مسئله با توجه به نیازهای فزاینده جوامع انسانی به تامین غذا و انرژی از اهمیت فراوانی برخوردار بوده و باعث گردیده تا سموم با عنوان کلی آفت کش بطور وسیعی مورد استفاده قرار گیرند. از سوی دیگر آسیبهای ناشی از ماندگاری سموم خصوصا آفت کشهای فسفره در فرآورده های کشاورزی، خطرات بزرگی در سلامت جانوران مفید، انسان و تعادل اکوسیستم پدید می‌آورند. سمیت آفت کشها در موجودات مختلف بویژه جانوران بطور گسترده ای بررسی گردیده و شواهد متعددی از ابعاد بیوشیمی، سم شناسی، مورفولوژی، بافت شناسی و سیتوژنتیک آنها باثبات رسیده که البته این اثرات تابع عوامل مختلف ازجمله نوع، مقدار و ساختار شیمیایی سم، گونه، جنسیت و سن موجود زنده و نیز راههای ورود سم در بدن حیوان می‌باشند.

در این راستا، تحقیقات بمنظور سم زدایی و پاکسازی محیط زیست از این ترکیبات خطرناک با استفاده از روشهای فیزیکی، شیمیایی و بیولوژیکی موردتوجه قرارگرفته است. ازجمله ابعاد منفی استفاده از روشهای فیزیکی و شیمیایی سم زدایی و زدودن آلودگیهای  زیست محیطی شامل افزایش آلودگیهای جدید به محیط زیست، حذف بسیاری از فعالیتهای زیستی، بازدهی پایین و هزینه بالای آنها می باشد. درروش بیولوژیک میکروارگانیسمهای محیطی که در خاک و آب قرار دارند، در تجزیه مواد شیمیایی مختلف از جمله ترکیبات آلی فسفره توانائیهای چشمگیری دارند. باکتریها قابلیت تکثیر فوق العاده ای داشته و در شرایط مختلف رشد می‌نمایند، شرایط نگهداری و بکار گیری آنها از نظر زمان و هزینه اقتصادی مقرون بصرفه بوده و چون بسیاری از آنها بعنوان فلورطبیعی محیط زیست محسوب می‌گردند، احتمالا آلودگی دیگری ایجاد نمی‌نمایند. لذا توانایی اختصاصی میکروارگانیسمهای باکتریایی و قارچی در این است که آفت کش را به متابولیتی با سمیت کمتر تبدیل کرده و پس از آن مجددا بوسیله همان میکروارگانیسم، و یا بوسیله طیف وسیعی از میکروارگانیسمهای ثانویه ای که در محیطهای خاکی و آبی وجود دارند، متابولیت حاصل متابولیزه شده و بعنوان منبع کربن، نیتروژن، فسفر و یا انرژی در تامین فعالیتهای حیاتی باکتریها مورد استفاده قرار می‌گیرد(41).

نتایج گرفته شده با استفاده از روش TLC در این مطالعه نشان داد که درطی دوره پنج روزه انکوباسیون، دیازینون (RF=0.78) موجود درنمونه های تیمار شده، تا روز سوم انکوباسیون (البته بعدازیک تاخیریکروزه)  توسط آنزیم OPH هیدرولیز و آنزیمبه IMHP (RF=0.16) (بعنوان متابولیت اصلی ناشی ازهیدرولیز دیازینون)، با سمیت کمتر تبدیل شده که درصفحات TLC کاملا مشخص می‍باشد. در ادامه هیدرولیز آنزیمی، IMHP نیز مینرالیزه شده و به دی اکسید کربن تبدیل ‌گردیده است (شکل1-2). این نتایج مطابق با گزارشاتی است که توسط Sethunathan, N. and Yoshida, T., 1969& 1973 Sethunathan, N. and Pathak, M. D., 1971&1972; ;Sethunathan,  N. and MacRae, C. 1969; Lichtenstein, E. P. et al. 1967;  ارائه شده است (26،33،34،35،36،38).

بمنظور تایید این نتایج، درطی مدت انکوباسیون، از اسپکتروفتومتری جهت مانیتورینگ هیدرولیز آنزیمی دیازینون (λ_max=230nm) ، تشکیل IMHP (λ_max=211nm) و نیز افزایشIMHP همزمان باکاهش تدریجی دیازینون استفاده شده است. نتیجه آنکه ازیک طرف دیازینون بوسیله عملکرد هیدرولازی آنزیم OPH در نمونه های تیمار شده، هیدرولیز گشته و سطح آن بتدریج کاهش یافته و به پایین ترین حد ممکن رسیده، و از طرف دیگر محصول هیدرولیز یعنی IMHP٬ به همان میزان افزایش یافته و  بالاترین حد ممکن را نشان داده است (نمودارهای1-1 تا 1-8). این نتایج مطابق با نتایجی است که توسط Sethunathan, N., Pathak, M. D., 1971 گزارش شده است (35).

استفاده از محیط کشت غنی شده، روشی است که به افزایش تعداد میکروارگانیسمهای مورد نظر در مقایسه با سایر میکروارگانیسمها منجر می‌شود. این فرآیند، شامل ایجاد شرایط مناسب برای رشد میکروارگانیسم موردنظر، با ایجاد شرایط نامناسب برای رشد سایر میکروارگانیسمها است. دراین مطالعه بمنظورکاهش زمان هیدرولیز آنزیمی دیازینون، با استفاده از تکنیک غنی سازی محیط کشت و بدنبال آن تراکم مناسبی از جمعیت میکروارگانیسمها در آن، سرعت هیدرولیز آنزیمی دیازینون به کمتر از10 ساعت تقلیل یافته است (جدول1-2)، که حاکی از افزایش تشکیل آنزیم (OPH) در سیستم های میکروبی برای تجزیه زیستی ترکیبات آفت کش می‌باشد. در تحقیقاتی که توسط Sethunathan, N. and Pathak, M., D. 1971 و با استفاده ازتکنیک غنی سازی محیط کشت انجام شده، سرعت هیدرولیزآنزیمی مولکول دیازینون بعد ازانتقال پنجم به 6 ساعت کاهش یافته است (35).همسو با نتایج گرفته شده از سویه Pseudomonas sp. دراین تحقیق، مطالعات برروی سویه های دیگری همچونAgrobacterium sp., Arthrobacter sp. و Flavobacterium sp. نیز انجام شده که از دیازینون بعنوان منبع تامین کننده کربن برای تامین فعالیت های حیاتی خود استفاده نموده اند (15،29).

ازآنجایی که آنزیم استخراج شده ازنوع آنزیمهای درون سلولی بود، لذا طی مراحل چهارگانه ذیل شامل: استفاده از سونیکاتور، تریتون X-100 ، رسوب دهی با سولفات آمونیوم و ستون کروماتوگرافی تعویض یونی  DEAE-Sepharose جداسازی عصاره آنزیمی از توده سلولی و تخلیص آن انجام و فعالیت ویژه آنزیم به U/mg44/16 رسید، که افزایش57 برابری در فعالیت آنزیم OPH را نشان داده است (جدول1-4). دراین راستا مطالعات دیگری نیز توسط Kearney, P. C. درسال1965 برروی تخلیص آنزیم هیدرولیزکننده فنیل کارباماتها جدا شده از سویه باکتریایی Pseudomonas sp. و Mulbery, W. W. and Karns, J. S. در سال1989 برروی تخلیص آنزیم پاراتیون هیدرولاز جدا شده از سه سویه باکتریایی گرم منفی(Flavobacterium sp. strain ATCC 27551, Strain B-1, Strain SC)  و Dumas, D. P. و همکارانش در سال1989 برروی تخلیص آنزیم فسفوتری استراز جدا شده از سویه باکتریایی Pseudomonas diminuta با استفاده ازتکنیکهای ژل فیلتراسیون و کروماتوگرافی تعویض یونی انجام شده، که منجر به افزایش فعالیت ویژه آنزیم گردیده است(12،23،28).

در این تحقیق، بمنظورارزیابی خلوص آنزیم و تعیین وزن مولکولی آن، از روش الکتروفورزSDS-PAGE همراه با مارکر پروتئینی استفاده شده که تک باند آنزیمیOPH با وزن مولکولی حدود KD40 مشخص گردیده است (شکل1-3). این نتایج مشابه با نتایج گرفته شده از آنزیم OPH جدا شده از سویه باکتریایی Pseudomonas diminuta، گزارش شده توسط Dumas, D. P. و همکارانش در سال 1989 می‍باشد (12).

در این تحقیق همچنین خواص کینتیکی آنزیمOPH برای تعیین شرایط بهینه ماکزیمم فعالیت آنزیم مطالعه و تاثیر pH، دما و غلظت سوبسترا برروی فعالیت آنزیم بررسی گردیده که ماکزیمم فعالیت آنزیم، درpH برابر 5/8 و دمای C ͦ 37 نشان داده شده است (نمودار های1-9 و 1-10). درواقع اثرpH بر فعالیت کاتالیزوری آنزیم، برروی گروههای یونیزه شونده درجایگاه فعال آنزیم بوده که برروی واحد های اسیدی و بازی آمینو اسیدها قراردارند. آنزیم درpH پایین تر از 6 کمترین فعالیت را داشته، زیرا pH اسیدی باعث دناتوره شدن آنزیم و یا احتمالا خروج کوآنزیم از آن شده، لذا فعالیت کاتالیزوری آنزیم مختل می‍گردد (32). تغییر دما نیز بر فعالیت آنزیم تاثیرگذار است، در ابتدا با افزایش دما و بموجب آن افزایش تعداد مولکولهای دارای انرژی لازم برای غلبه برانرژی فعال سازی، سرعت واکنش افزایش پیدا می کند. در این حالت انتقالی، انرژی کینتیکی آنزیم با غلبه بر سد انرژی، پیوندهای ضعیف هیدروژنی و هیدروفوبیک را که حافظ ساختار دوم و سوم آنزیم هستند، شکسته باعث افزایش سرعت واکنش می گردد. در این دما اگر دناتوراسیون آنزیم اتفاق بیفتد، منجر به تغییر در ساختار جایگاه فعال آنزیم شده و همراه با آن فعالیت کاتالیتیکی آنزیم از دست می رود. بنابراین آنزیمها ماکزیمم فعالیت خود را در یک دمای بهینه نشان می دهند (6). همچنین بین فعالیت آنزیم و غلظت سوبسترا تا M05/0 یک منحنی هیپربولیک مشاهده شد (نمودار1-11). غلظت سوبسترا یک فاکتور مهم برای ارزیابی فعالیت آنزیم می باشد، بطوریکه در غلظت پایین سوبسترا، بیشتر آنزیم بشکل آزاد وجود دارد و لذا در این حالت سرعت واکنش متناسب با غلظت سوبسترا افزایش پیدا می کند. افزایش غلظت سوبسترا منجر به تشکیل بیشتر کمپلکس سوبسترا-آنزیم گردیده و نهایتا تمامی آنزیم تبدیل به کمپلکس سوبسترا-آنزیم شده، لذا سرعت واکنش آنزیمی به حداکثر میزان خود (V_max ) می رسد. اما اگر غلظت سوبسترا افزایش یابد و تغییری در فعالیت آنزیم مشاهده نشود، نشان دهنده اشباع شدن آنزیم از سوبسترا بوده و افزایش بیشتر آن تاثیری برروی سرعت واکنش نخواهد داشت. این حالت زمانی بوقوع می پیونددکه غلظت سوبسترا باندازه کافی بالا بوده و تمامی آنزیم آزاد بشکل کمپلکس سوبسترا=آنزیم درآمده و تقریبا غلظت آنزیم آزاد صفر شده است. حال اگر غلظت آنزیم بالا و غلظت سوبسترا کمتر از غلظت آنزیم باشد، فعالیت آنزیم افزایش نخواهد یافت، چون دراین حالت سوبسترا نمی تواند تمام جایگاههای فعال آنزیم را اشغال کند. (32،40). همچنین نتایج نشان داد که باکاتیون دوظرفیتی بویژه Co⁺²  فعالیت آنزیم افزایش، اما با EDTA کاهش یافته است (جدول1-5). چون  EDTA با شلاته کردن یونهای دوظرفیتی باعث کاهش فعالیت آنزیم می گردد. بنابراین ضرورت وجود کاتیونهای دوظرفیتی در انجام عمل هیدرولیز آنزیم تایید می گردد (42).

دراین تحقیق ثابت میکائیلیس (K_m) آنزیم برای دیازینون برابر µM434 (0.434mM) بدست آمده (نمودار1-12)، که نزدیک به نتایج گزارش شده توسط Dumas و همکارانش در سال1989 (K_m=0.45mM) می باشد. همانطور که نتایج نشان داده است علیرغم اینکه دیازینون سوبسترای اختصاصی آنزیمOPH (نسبت به سایر سوبستراهای گزارش شده توسط Dumas و همکارانش در سال 1989) نمی‍باشد (12)، اما حضورآن همچنان منجربه القاء فعالیت میکرو ارگانیسمها درتولید آنزیمOPH  جهت سم زدایی خاکهای در معرض ترکیبات ارگانوفسفره نظیر دیازینون گردیده است. مضافا اینکه K_m بالا نشاندهنده آنستکه فعالیت سم زدایی آنزیم OPH بصورت تدریجی انجام گرفته و همانند فعالیت آنزیمهای لیپاز، عملکرد بهینه آن بطئی بوده و به زمان احتیاج داردکه البته دراین تحقیق با استفاده از تکنیک غنی سازی عامل هیدرولیز آنزیمی دیازینون در محیط کشت، زمان هیدرولیز با کاهش چشمگیری به کمتر از 10ساعت تقلیل یافته است. بعبارت دیگر بحث اپتیمم فعالیت آنزیم و بهینه سازی شرایط، نقش مهمی درکارآیی عملکرد این آنزیم بعهده دارد. علاوه براین، ازآنجائیکه این آنزیم بعنوان آنزیم فسفوتری استراز PTE (Phosphotriesterase) نیز معرفی شده، لذا علاوه برسم زدایی و حذف یا کاهش آلودگیهای ناشی از مصرف ترکیبات ارگانوفسفره همراه با توانایی اختصاصی آن در آزادسازی فسفات سوم از تری استر های ارگانو فسفره، بعنوان کود زیستی (Biofertilizer) نقش موثری نیز در بازیافت فسفات و نتیجتا حاصلخیزنمودن خاک، ایفا نموده است.

نتیجه گیری

توانایی میکروارگانیسمهای خاک شالیزارها دراستفاده ازترکیبات ارگانوفسفره نظیر دیازینون (بعنوان آفت کش) برای تامین فعالیتهای حیاتی خود، با القاء تولید آنزیمOPH  صورت می گیردکه منجر به هیدرولیز طیف وسیعی از این ترکیبات گردیده و سمیت آنها را حذف یاکاهش می دهد. علاوه براین، آنزیم با عملکرد فسفوتری استرازی خود می تواند نقشی موثر در بازیافت فسفات برای تولید کود زیستی، جهت حفظ حاصلخیزی خاک، ایفاء نماید. دراین تحقیق نتایج حاصل از عملکرد تدریجی و موثر آنزیم OPH در شرایط بهینه از نظر pH و دما نشان داد که این آنزیم مناسبترین کاتالیست زیستی در سم زدایی از زمینهای کشاورزی با کارآیی بالا (با حذف یا کاهش ترکیبات ارگانوفسفره نظیر دیازینون) می باشد. البته این نتایج با استفاده ازفعالیت محلول آنزیمی گرفته شده از میکروارگانیسم مولد آنزیم OPH بدست آمده، که درصورت استفاده از آنزیم خالص شده، به نتایج مطلوبتری نیز خواهد رسید.