نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 تهران، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور

2 هیات علمی، موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی،تهران

چکیده

گل محمدی Mill.) (Rosa damascena از مهمترین گونه‌های معطر است که دارای خواص دارویی و اثرات درمانی می‌باشد. در این تحقیق، بررسی باززایی جهت ایجاد تنوع ژنتیکی بر روی 18 ژنوتیپ مختلف گل محمدی صورت گرفت. القای کالوس بر قطعات برگ، گلبرگ، میله و گوشوارک برگ ژنوتیپ‌های مزبور انجام گردید. کشت ریزنمونه‌ها روی محیط MS نیمه جامد با غلظتهای مختلف هورمونی انجام گردید. میزان کل کال‌زایی در هر ژنوتیپ اندازه‌گیری شد و داده‌های حاصل در قالب یک آزمایش فاکتوریل بر پایه طرح کاملا تصادفی در سیستم SPSS مورد تجزیه واریانس قرار گرفت و مقایسه میانگینها با آزمون دانکن انجام شد. بین ژنوتیپ‌ها اختلاف معنی‌داری در سطح 01/0 P<مشاهده شد و همچنین نتایج حاصل از آزمون دانکن نشان داد که ژنوتیپ‌های استانهای آذربایجان شرقی و غربی دارای کمترین پتانسیل کال‌زایی و ژنوتیپ‌ اصفهان 6 بیشترین پتانسیل کال‌زایی بر روی بهترین محیط کالزایی شاملMS حاوی یک میلی‌گرم در لیتر Kinetin و 5 میلی‌گرم در لیتر PCPA (mono chloro phenoxy acetic acid) می‌باشند. جهت باززایی از محیطهای کشت پایه MS و B5 و DKW به همراه هورمون‌های متنوع در غلظت‌های مختلف استفاده گردید. از بین این هجده ژنوتیپ فقط در کالوس‌های بوجود آمده از ساقه ژنوتیپ اصفهان4 در محیط MS+3mg/l BA باززایی صورت گرفت. بر اساس نتایج حاصل، باززایی در گل محمدی تحت تأثیر ژنوتیپ، نوع ریزنمونه و غلظت تنظیم‌کننده‌های رشد قرار می‌گیرد و استفاده بهینه از این فاکتورها در نیل به ‌اندام‌زایی مناسب و باززایی گیاه از کالوس در جهت ایجاد و بکارگیری تنوع سوماکلونی، امری ضروری می‌باشد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Callus induction and regeneration of different accessions for genetic variation of Rosa damascene Mill

نویسندگان [English]

  • Leila Mirjani 1
  • mitra emam 2
  • seyed reza tabaee 2

1 Research Institute of Forests and Rangelands, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Tehran, I.R. of Iran

2 Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO)

چکیده [English]

Rosa damascenes Mill. is a most important aromatic plant that it has pharmacies properties'. In this research regeneration of 18 different accessions was studied for genetic diversity production. Callus induction was achieved on leaf, petiole, stipule and filament sections of these accessions. Culture of explants was done on semi solid MS medium supplemented with growth regulator(s) in different concentrations of 2, 4- D, IBA, NAA, PCPA, Kinetin and BAP. Total callus induction about each accession was measured and these data were analyzed at randomized complete design by using of SPSS software (2006). Averages were compared by Duncan's multiple rang test. Genotypes showed significant differences (P<0.01) for callus induction. Also, lowest and highest callus induction was observed repeatedly in genotypes of Azerbaijan ( western and eastern) and Isfahan 6 that last, cultured on MS medium contained 1 mg/l Kinetin and 5 mg/l PCPA. The media such as B5, DKW and MS with different ranges of growth regulators were used for regeneration. Within 18 accessions, regeneration of callus was done at stem explants of Isfahan 4 accession in MS medium with 3mg/l BA. The results emphasized on genotype, kind of explants and concentration of growth regulators as key factors in regeneration of Rosa damascene and optimal application of these factors was necessary for soma clonal variation followed by organogenesis and regeneration from callus.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Rosa damascenes Mill
  • organogenesis
  • Callus
  • accession and Growth regulators

بررسی کال زایی و باززایی جهت ایجاد تنوع ژنتیکی در ژنوتیپهای

مختلف گل محمدی (Rosa damascena L.)

لیلا میرجانی*،‌ میترا امام و سیدرضا طبایی عقدایی

تهران، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور

تاریخ دریافت: 10/8/94                تاریخ پذیرش: 26/4/95

چکیده

گل محمدی Mill.)  (Rosa damascena از مهم ترین گونه‌های معطر است که دارای خواص دارویی و اثرات درمانی می‌باشد. در این تحقیق، بررسی باززایی جهت ایجاد تنوع ژنتیکی بر روی 18 ژنوتیپ مختلف گل محمدی صورت گرفت. القای کالوس بر قطعات برگ، گلبرگ، میله و گوشوارک برگ ژنوتیپهای مزبور انجام گردید. کشت ریزنمونه‌ها روی محیط MS نیمه جامد با غلظتهای مختلف هورمونی انجام گردید. میزان کل کال‌زایی در هر ژنوتیپ اندازه‌گیری شد و داده‌های حاصل در قالب یک آزمایش فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی در سیستم SPSS مورد تجزیه واریانس قرار گرفت و مقایسه میانگینها با آزمون دانکن انجام شد. بین ژنوتیپها اختلاف معنی‌داری در سطح 01/0 P≤مشاهده شد و همچنین نتایج حاصل از آزمون دانکن نشان داد که ژنوتیپهای استانهای آذربایجان شرقی و غربی دارای کمترین پتانسیل کال‌زایی و ژنوتیپ‌ اصفهان 6 بیشترین پتانسیل کال‌زایی بر روی محیط منتخب کال زایی شاملMS  حاوی یک میلی‌گرم در لیتر Kinetin و 5 میلی‌گرم در لیتر PCPA (mono chloro phenoxy acetic acid) می‌باشند. جهت باززایی از محیطهای کشت پایه MS، B5 و DKW به همراه هورمونهای متنوع در غلظتهای مختلف استفاده گردید. از بین این هیجده ژنوتیپ فقط در کالوسهای به وجود آمده از ساقه ژنوتیپ اصفهان4 در محیط MS+3mg/l BA باززایی صورت گرفت. بر اساس نتایج حاصل، باززایی در گل محمدی تحت تأثیر ژنوتیپ، نوع ریزنمونه و غلظت تنظیم‌کننده‌های رشد قرار می‌گیرد و استفاده بهینه از این فاکتورها در نیل به ‌اندام‌زایی مناسب و باززایی گیاه از کالوس در جهت ایجاد و به کارگیری تنوع سوماکلونی، امری ضروری می‌باشد.

واژه‌‌های کلیدی: گل‌محمدی Mill. Rosa damascena، اندام‏زایی، باززایی، کالوس، ژنوتیپ و تنظیم‌کننده‌های رشد

* نویسنده مسئول، تلفن: 44787282-021 ، پست الکترونیکی: mirjani@rifr-ac.ir

مقدمه

 

گل محمدی از تیره Rosaceae و جنس Rosa نام علمی آن .Rosa damascena Mill می‌باشد. طبق نظر برخی از گیاه شناسان این درختچه هیبریدی از R. gallica × R. centifolia می‌باشد (13). گل محمدی (Rosa damascena Mill.) یکی از گونه‌های ارزشمند گیاهی است که در بسیاری از کشورهای دنیا از جمله ایران، بلغارستان، ترکیه، هند، امریکا، انگلستان و ژاپن سابقه کشت و کار دیرینه دارد. این گونه جزء مهم ترین رزهای دنیای قدیم است که علاوه بر جنبه زینتی از جنبه‌های دیگری نیز مانند تولید اسانس و رایحه جذاب، دارا بودن خواص دارویی گل و میوه آن مورد توجه است. گل محمدی به صورت وحشی و خودرو در مناطق مختلفی از جهان شامل سوریه، قفقاز، مراکش و اندلس (اسپانیا) رویش دارد (6). هدف از اصلاح گیاهان دارویی ومعطر افزایش کمیت و کیفیت آن دسته از مواد مؤثره در این گیاهان است که در صنایع دارویی از اهمیت خاصی برخوردار است. از این‌رو ارتقاء کمیت و کیفیت متابولیتها و مواد مؤثره موجود در سلولهای این گیاهان از اهمیت بسیاری برخوردار است (3). محدودیت استفاده از روشهای اصلاحی مرسوم و پیشرفت قابل توجه در زمینه‌های سلولی و مولکولی استفاده از بیوتکنولوژی گیاهی را اجتناب ناپذیر نموده است. برای به کارگیری موفقیت‌آمیز بیوتکنولوژی گیاهان ازطریق انتقال ژنتیکی (11 و 28) و هیبریداسیون سوماتیکی جهت اصلاح گیاهان، استفاده از سیستمهای باززایی از قبیل کشت بافت، سلول و پروتوپلاست مورد نیاز است. هر چند هنوز به کارگیری این تکنولوژیها در اصلاح رزها صورت نگرفته است و گزارشهای کمی در مورد مطالعات بر هیبریداسیون سوماتیکی (19) موجود است.

یکی از دلایل اصلی این محدودیت، مشکل باززایی این گیاهان از کالوسهای به دست آمده از قسمتهای مختلف رز با پتانسیل جنین‌زایی است. زیرا کالوسهای جنین‌زا به آسانی توانایی تولید جنین سوماتیک نرمال را در طی بازکشت از دست می‌دهند. بنابراین ایجاد روش مؤثر برای باززایی گیاه از این ساختارهای غیر نرمال ضروری است (29).

در کشت پروتوپلاست رز، به علت مشکل بودن کشت پروتوپلاست‌ها از منابع دیگر کشتهای سوسپانسیون سلولی با پتانسیل جنین‌زایی به عنوان منابع پروتوپلاست استفاده گردیده است (17 و 19). هرچند از این طریق نیز به علت از دست رفتن پتانسیل جنین‌زایی نرمال در طی کشت مشکل وجود دارد. در تحقیق جالب توجهی که توسط  Pati و Sharma (2004) برروی نقش ریزازدیادی و کشت پروتوپلاست در اصلا ح گل محمدی صورت گرفت، توسط قطعات تک گره تولید گیاهچه های ریشه دار شده و همچنین در محیط MS حاوی 2,4D (10-1 میکرومولار)، NAA (10-1 میکرومولار)،  BAP(10-1 میکرومولار) کالوسهای ترد و شکننده از ساقه و قطعات آن تشکیل گردید (25).

Pati و Path (2001) برای به دست آوردن کالوس در گل محمدی، تیمارهای هورمونی 10-1 میکرومولار NAA،10-1 میکرومولار 2,4D و 10-1 میکرومولار BA را به کار برده و کالوسهایی با مشخصات سبز روشن، فشرده، سخت و گره‌دار به دست آوردند که طی 4 تا 6 هفته به حداکثر اندازه خود رسیدند (26).

Ishioka و Tanimoto (1990) کالوسهایی را در محیط MS حاوی 10 میکرومولار NAA از ریزنمونه‌های ساقه رز بلغاری به دست آوردند و با حذف نیترات آمونیوم و افزودن ایندول استیک اسید و بنزیل آدنین موفق به ایجاد جوانه روی کالوس شدند، تعداد جوانه‌ها به طور معنی‌داری با افزایش یون کلسیم افزایش یافت (14).

Tabaeezadeh و Khoshkhui (1981) کشت بساک گونه تتراپلوئید R. damascene را بررسی کرده‌ و اثر غلظتهای مختلف اکسین و سیتوکینین بر مراحل نموی مختلف گلها مورد مطالعه قرار دادند که در نتیجه آن محیط MS کامل محتوی هورمونهای 4/0 میلی‌گرم در لیتر kin و 2 میلی‌گرم در لیتر IAA را به عنوان بهترین محیط برای ایجاد کالوس گزارش کردند (15). 

گرچه گزارشهای متنوع مؤفقیت‌آمیزی در مورد القای جنین‌زایی سوماتیک در رز وجود دارد، ولی آنها به ژنوتیپهای خاصی محدود می‌شود. بنابراین یک پروتکل خاص برای القای جنین‌زایی سوماتیک در رز وجود ندارد که بتواند برای تمام ژنوتیپهای آن به کار گرفته شود (10). طی تحقیق دیگری که توسط Murphy و همکاران (1979) صورت گرفته است، سلولهای کشت داده شده گل محمدی یک مقاومت غیرقابل انتظار در محیط کشت سلولی نسبت به خسارت حاصل از امواج ریزموج (nm254) فرابنفش نشان داده‌اند که میزان DNA و محتوی کروموزومی آنها نسبت به گیاه والدی بیشتر بود و همچنین میزان ترکیبات پلی فنولیک و فلاونوئیدهای اصلی را بیشتر تولید می‌کردند (23). در تحقیق دیگری که توسط Murphy و همکاران (1981) انجام گرفته است، میزان مقاومت و حساسیت سلولهای کشت داده شده گل محمدی نسبت به نمک (NaClO3) اندازه‌گیری شده، نور UV (nm254) در حضور 4- متوکسی متیل تیروکسیلان، مقاومت سلولها را نسبت به نمک مزبور بالا آورده و همچنین مشخص گردید که سلولهای حساس در تبدیل کلرات به کلریت نقش داشته‌اند (22).

این تحقیق به منظور بررسی پتانسیل باززایی در این گونه جهت امکان ایجاد تنوع به خصوص در جهت بالا بردن میزان مواد مؤثره و مقاومت به تنشهای محیطی صورت گرفت.

جدول 1- اسامی ژنوتیپهای مورد مطالعه

ردیف

ژنوتیپ

منشأ

1

آشرق1

آذربایجان شرقی

2

آغرب1

آذربایجان غربی

3

اردبیل1

اردبیل

4

اصفهان9

جنوب غربی کاشان

5

اصفهان10

جنوب شرقی کاشان

6

سمنان2

سمنان

7

بلوچستان1

سیستان و بلوچستان

8

فارس1

فارس

9

کهگیلویه1

کهگیلویه و بویراحمد

10

گلستان1

گلستان

11

گیلان1

گیلان

12

اراک 1

مرکزی

13

یزد2

یزد

14

اصفهان2

جنوب غربی کاشان

15

اصفهان4

غرب کاشان

16

اصفهان5

جنوب غربی کاشان

17

اصفهان6

جنوب شرقی کاشان

18

اصفهان8

جنوب غربی کاشان

مواد و روشها

مواد گیاهی: در این پژوهش 18 ژنوتیپ مختلف گل محمدیMill.)  (Rosa damascena مورد مطالعه قرار گرفت که این ژنوتیپها قبلاً از مناطقی با شرایط متفاوت آب و هوایی در 28 استان کشور جمع‌آوری گردیده و در مزرعه گل محمدی واقع در مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع در 15 کیلومتری شمال غربی تهران به طول جغرافیایی 51 درجه و 10 دقیقه شرقی، عرض جغرافیایی 35 درجه و 44 دقیقه شمالی و ارتفاع 1330 متر از سطح دریا، کشت گردیده بود (جدول 1).

استقرار و بازکشت ریزنمونه‌ها در محیط کشت: ریز‌نمونه‌ها شامل شاخه، برگ، گلبرگ، میله و گوشوارک برگ 18 ژنوتیپ بودند. قبل از قرار دادن ریز‌نمونه در محیط، در مورد شاخه 1 تا 2 میلی‏متر از انتهای قاعده آن قطع گردید.

کال‌زایی: در ابتدا جهت کال‌زایی از محیط کشت MS (21) حاوی ترکیبهای مختلف هورمونی استفاده گردید (جدول 2).

 

شکل 1- نقشه محل جمع‌آوری ژنوتیپهای مختلف

 Rosa damascena Mill.

همچنین برای حذف ترشحات فنولی ریزنمونه‌ها 01/0 گرم در لیتر pvp به محیط کشت اضافه گردید. در انتهای هر ماه نمونه‌های آلوده و نکروزه حذف و نمونه‌های سالم واکشت شدند و در این زمان، گزارشی از میزان کال‌زایی، نکروزه‌ شدن و آلودگی نمونه‏ها تهیه و تنظیم شد. میزان کل کال‌زایی در هر ژنوتیپ اندازه‌گیری شد و داده‌های حاصل در یک آزمایش فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی مورد تجزیه واریانس قرار گرفت و مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون دانکن انجام گردید. بعد از اینکه بهترین محیط جهت کال‌زایی برای 8 ژنوتیپ مشخص شد سایر ژنوتیپها در این محیط بهینه، کشت گردیدند. جهت بررسی میزان کال‌زایی، نمونه‌ها در دو تیمار تاریکی و روشنایی قرار گرفتند و سپس داده‌های حاصل بر اساس جمعیتهای مختلف و ترکیبهای هورمونی متفاوت در یک آزمایش فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی مورد تجزیه واریانس قرار گرفتند.

 

جدول 2- بهترین ترکیبهای مختلف هورمونی مورد استفاده در محیط کشت MS به کار گرفته شده در القای کالوس در ژنوتیپهای مختلف گل محمدی Mill.) (Rosa damascena

ردیف

محیط

1

(MS+5mg/l PCPA+1 mg/l Kin)

2

(MS+9mg/l PCPA+1 mg/l Kin)

3

(MS+10mg/l NAA+0.1mg/l BA+3 mg/l 2,4-D)

4

 (MS+4mg/l  2,4-D)


باززایی: پس از دوبار بازکشت جهت اندام‌زایی از محیطهای کشت پایه MS و B5 و DKW (9) به همراه هورمونهای متنوع در غلظتهای مختلف شاملIBA  mg/l) 2-1/0)، mg/l) Kinetin 6- 05/0)، mg/l) NAA 5/3-02/0)، BA  mg/l) 8-5/0)،mg/l) 2,4D  4-5/0)،mg/l) TDZ  5-1/0)،mg/l) GA3  3-5/0)،mg/l) IAA  2-1/0)، mg/l) Zeatin 6-5/0)، 2ip   mg/l)2-1) وABA mg/l) 4-2) استفاده گردید.

نتایج

جهت بررسی میزان کال‌زایی در دو تیمار تاریکی و روشنایی به عنوان نمونه، 3 ژنوتیپ (سمنان2، اصفهان2 و اصفهان6) مورد آزمون قرار گرفت. سپس داده‌های حاصل تجزیه واریانس گردید (جدول3).

 

جدول3- تجزیه واریانس میزان کال‌زایی گل محمدی در تاریکی و روشنایی

منابع تغییر

درجه آزادی (df)

مجموع مربعات (ss)

میانگین مربعات (ms)

ژنوتیپ

2

80/1510

40/755*

روشنایی

1

44/48032

43/48032 **

هورمون

3

70/2453

90/817 *

ژنوتیپ* روشنایی

2

59/468

28/470ns

ژنوتیپ* هورمون

6

15/2188

69/364ns

روشنایی* هورمون

3

54/4218

18/1406**

ژنوتیپ* روشنایی*هورمون

6

69/2128

29/234ns

ns ، * و** به ترتیب عبارتند از عدم اختلاف معنی‌دار و اختلاف معنی‌دار در سطح 5 و 1 درصد.

 

اختلاف معنی‌دار مشاهده شده در میزان کال‌زایی در تاریکی و روشنایی بیانگر این است که در تاریکی میزان کال‌زایی بیشتر از روشنایی می‌باشد و همچنین بین ژنوتیپها نیز در میزان کال‌زایی اختلاف معنی‌داری مشاهده گردید و در بین ترکیبات مختلف هورمونی محیط نیز اختلاف معنی‌داری در میزان کال‌زایی دیده شد، پس نوع ترکیبات هورمونی محیط کشت و ژنوتیپ هم علاوه بر تاریکی در میزان کال‌زایی مؤثر است. البته در بین جداکشتهای مختلف نیز برگها تنها در تاریکی کال‌زایی کردند، در نتیجه ژنوتیپهای مورد بررسی دیگر تنها در تاریکی جهت کال‌زایی برده شد. از نظر میزان کل کال‌زایی (جدول4) تأثیر ژنوتیپ، ترکیبات هورمونی و نیز اثر متقابل آنها معنی‌دار (01/0(P≤ بود. بنابراین ژنوتیپهای مورد مطالعه نسبت به ترکیبهای هورمونی واکنش متفاوتی نشان دادند.

 

 

 

شکل 3- القای کال‌زایی در گوشوارک‏های ژنوتیپ گلستان1

در محیطB5+2mg/l 2,4D+1.5 mg/l Zeatin

 

 

                شکل 2- ایجاد کالوس از گلبرگ ژنوتیپ یزد2 در محیط

       MS+9mg/l PCPA+1 mg/l Kin

 

                   شکل 5- القای کال‌زایی در برگهای گلستان1

                در MS+5mg/lمحیط PCPA+1 mg/l Kin

 

                شکل 4- ایجاد کالوس از میله ژنوتیپ اصفهان9 در

                 محیطB5+2mg/l 2,4D+1.5 mg/l Zeatin

 

 

        شکل 7- القای کال‌زایی در ساقه اصفهان4 درمحیط

           B5+2mg/l 2,4D+1.5 mg/l Zeatin

 

                شکل 6- القای کال‌زایی در ساقه بلوچستان1 درمحیط

                B5+2mg/l 2,4D+1.5 mg/l Zeatin

 

 

       شکل 9- القای کال‌زایی در ساقه اصفهان9 درمحیط

            MS+5mg/l PCPA+1 mg/l Kin

 

                شکل 8- القای کال‌زایی در ساقه بلوچستان1 درمحیط

                MS+5mg/l PCPA+1 mg/l Kin

 

جدول 4- مجموع مربعات حاصل از تجزیه واریانس تیمارها بر اساس اثر نوع ترکیب هورمونی و ژنوتیپها به طور جداگانه در میزان کل کال‌زایی.

منابع تغییر

درجه آزادی (df)

مجموع مربعات (ss)

میانگین مربعات (ms)

ژنوتیپ

7

46256

6608**

ترکیب هورمونی

3

53/2198

85/732**

تکرار

2

40/313

70/156 ns

ژنوتیپ* ترکیب هورمونی

21

01/19716

85/938**

* و** به ترتیب عبارتند از اختلاف معنی‌دار در سطح 5 و 1 درصد.

 

مقایسه میانگینهای میزان کل کال‌زایی بر حسب ژنوتیپهای مختلف (05/0P≤) (جدول5) نیز نشان داده که ژنوتیپ اصفهان6 در یک دسته جدا و ژنوتیپهای اصفهان10، سمنان2، اصفهان2 با هم در یک دسته و اصفهان9 در دسته‌ای جدا، اردبیل1 و آشرق1 نیز در یک دسته و همچنین آشرق1 با آغرب1 نیز در یک دسته قرار گرفتند. همان طور که مشاهده می‌شود بیشترین میزان کال‌زایی مربوط به ژنوتیپ اصفهان6 و کمترین آن هم مربوط به ژنوتیپهای آشرق1 و آغرب1 بوده است. در نتیجه به‌طورکلی می‌توان گفت ژنوتیپهای استانهای آذربایجان شرقی و غربی دارای کمترین و ژنوتیپ اصفهان6 دارای بیشترین پتانسیل کال‌زایی می‌باشند.

 

جدول 5- دسته‌بندی میانگینهای میزان کل کال زایی بر اساس ژنوتیپهای متفاوت با آزمون  Duncanدر سطح احتمال 05/0P≤.

ردیف

ژنوتیپ

میانگین میزان کل کال زایی

1

اصفهان6

3/63a

2

اصفهان10

18/50b

3

سمنان2

87/48b

4

اصفهان2

57/43b

5

اصفهان9

45/31c

6

اردبیل1

43/14d

7

آشرق1

95/7de

8

آغرب1

76/1e

 

مقایسه میانگینهای میزان کل کال‌زایی بر حسب ترکیبات مختلف هورمونی (05/0P≤) (جدول6) نیز نشان داده که محیط MS+4mg/l  2,4D تنها در یک دسته جدا قرار گرفته و کمترین تأثیر را در میزان کال‌زایی به نسبت بقیه داشته است.

 

جدول 6- دسته‏بندی میانگینهای میزان کل کال زایی بر اساس ترکیب هورمونی به طور جداگانه با آزمون Duncan در سطح احتمال 05/0P≤

ردیف

ترکیب هورمونی

میانگین

1

 (MS+5mg/l PCPA+1 mg/l Kin)

a42/38

2

(MS+9mg/l PCPA+1 mg/l Kin)

a82/34

3

(MS+10mg/l NAA+0.1mg/l BA+3 mg/l 2,4D)

a56/34

4

 (MS+4mg/l 2,4D)

b46/25

 

در شکلهای زیر نمونه‌هایی از کال‌زایی جداکشتهای مختلف ژنوتیپهای متفاوت آورده شده است.

باززایی: همان طور که  ذکر شد، جهت باززایی از تیمارهای مختلفی استفاده گردید، اما فقط در بعضی از موارد اندام ساقه مانند و ریشه دیده شد. به عنوان مثال در شکل10 از جداکشت ساقه ژنوتیپ اصفهان4 در محیط MS+5mg/l PCPA+1 mg/l Kin شروع اندام‌زایی دیده می‌شود. از همان جداکشت ساقه ژنوتیپ اصفهان4 در محیطB5+2mg/l 2,4D+ 1.5mg/l Zeatin+vitamin اندام ساقه مانند نیز مشاهده ‌گردید (شکل 11).

 

شکل 10- شروع اندام‌زایی در جداکشت ساقه ژنوتیپ اصفهان4 

از کالوس القایی از ریزنمونه‌های ساقه ژنوتیپ اصفهان 10 در محیط MS ریشه به دست آمد (شکل 12). همچنین ایجاد ریشه در کالوس القایی از گلبرگ ژنوتیپ یزد 2 دیده شد (شکل13).

و بالاخره بهترین اندام‏زایی در ژنوتیپ اصفهان9 و اصفهان4 مشاهده شد. القای کال‌زایی از ریزنمونه ساقه ژنوتیپ اصفهان9 در محیط  MS+10mg/l NAA+0.1mg/l BA+3 mg/l 2,4Dصورت گرفت، سپس چندین بار بازکشت انجام شد

 

شکل 11- اندام ساقه مانند در جداکشت ساقه ژنوتیپ اصفهان4 

 

شکل 12- ایجاد ریشه در کالوس القایی از ساقه ژنوتیپ اصفهان

 

شکل 13- ایجاد ریشه در کالوس القایی از گلبرگ ژنوتیپ یزد 2

در نهایت در محیط باززایی  MS+6mg/l BA +2mg/l 2,4D +2 mg/l Kinitin چندین ساقه به همراه برگ دیده ‌شد (شکل14).

 

 

شکل14- اندام‏زایی در جداکشت ساقه ژنوتیپ اصفهان9

اما القای کال‏زایی از ریزنمونه ساقه در ژنوتیپ اصفهان 4 در محیط کال‏زایی MS+5mg/l PCPA+1 mg/l Kin به دست آمد بعد از آن چندین بار بازکشت و سپس شوک گرسنگی به مدت 4 ماه به آن داده شد. آنگاه در محیط باززاییBA  MS+3mg/l انتقال و بعد از 2 هفته باززایی مشاهده گردید (شکل 15).

در نهایت گیاه باززایی شده در محیطBA+0.01mg/l IBA  MS+3mg/l تکثیر گردید تا برای اهداف بعدی مورد استفاده قرار گیرد (شکل 16).

 

 

 

 

شکل15- باززایی در جداکشت ساقه ژنوتیپ اصفهان4

 

 

شکل 16- تکثیر گیاه باززایی شده

اما در همین ژنوتیپ پس از القای کال‏زایی و شوک گرسنگی جنین‏زایی نیز در زیر میکروسکوپ مشاهده گردید (شکل 17) ولی پس از مدتی از بین رفت.

 

شکل17- جنین‌زایی در جداکشت ساقه ژنوتیپ اصفهان4

بحث

همان طور که گفته شد تیمار تاریکی جهت کال‏زایی مناسب‏تر بود و همسو با مشاهدات  Canli (2003) می‌باشد که تیمار تاریکی برگها را برای شکل‌گیری کالوس در رزها بسیار مهم گزارش کرده بود (5).

Memon و همکاران (2001) از میان گرهRosa indica  بر روی محیط MS تغییر یافته با غلظتهای مختلف IBA و NAA کالوس به دست آوردند. در این بررسی کالوسها در همان محیط پایه و همچنین محیط پایه B5 ولی با هورمونهای متفاوت دیگر به دست آمدند (20). Kim  و همکاران (2003) نشان دادند که جداکشتهای برگ Rosa hybrida کشت شده بر روی محیط کشتی با غلظت پایین NAA و 2.4D (mg/l 1/0) به میزان کم باعث القای کالوس می‌گردد و غلظت بالای هورمونهای NAA+Kin تولید کالوسهای حجیم می‌کند (16). نتایج مشابهی نیز توسط  Pirniakan و همکاران (2014) به دست آمد (4 و 27). در حالی‌که در این تحقیق Rosa damascena در غلظتهای بالای NAA و 2,4-D و همچنین غلظت بالای PCPA و Kin کالوس تشکیل داد. در طی تحقیق دیگری بر ریزنمونه های رز گالیکا، رضانژاد و همکاران (1392) با استفاده از غلظت(  mg/l 2-3) 2.4D و BA (  mg/l1) تحریک کالوس زایی بر جداکشتهای مختلف این گیاه را شاهد بودند (2).

از بین هجده ژنوتیپ به کار گرفته شده در این پژوهش فقط در کالوسهای به وجود آمده از ساقه ژنوتیپ اصفهان4 در محیط MS+3mg/l BA باززایی صورت گرفت. همچنین در طی تحقیقی توسط اطرشی و همکاران (1393) کالوس زایی مناسب از ریزنمونه کوتیلدون بر محیط کشت مشابه  این تحقیق به دست آمد (1).

کالوسهای ریشه‌زا از بافتهای سوماتیک Rosa hybrida و Rosa chinesis minima به میزان زیادی به دست آمده است (13). که در این بررسی نیز میزان زیادی کالوسهای ریزوژن در ژنوتیپ اصفهان 10 به دست آمد.

همچنین گزارشهایی در مورد ایجاد کالوسهای جنین‌زا با استفاده از ریزنمونه برگ (8) و ریزنمونه میله پرچم (24) داده شده است ولی کالوسهای القایی از این ریزنمونه‌ها در گل محمدی جنین‌زا نبودند.

همچنین بین ریزنمونه‌های انتخاب شده ساقه، برگ، میله، گوشوارک و گلبرگ بیشترین اندام‌زایی در ساقه دیده شد. نتایج این بررسی تا حدی با یافته‌های Chi-ni و Schuyler (1996) همسویی نشان می‌دهند که با استفاده از غلظت بالای 2,4-D به اندام‌زایی و حتی سلولهای جنینی از جداکشت برگ دست یافته‌اند و همچنین با انتقال کالوس ریزوژن به محیط باززایی شامل TDZ وGA3 به میزان کمی شاخه‌زایی و جنین‌زایی رسیدند (7).

Pirniakan و همکاران (2014) با استفاده از غلظتmg/l  1 هورمون TDZ بهترین نتایج را در تولید کالوسهای جنین‌زا در رز مینیاتوری هفت رنگ به دست آوردند (4 و 27) وZakizadeh  و همکاران (2008) غلظتهای بالای هورمون mg/l) TDZ  10-5) را در تولید کالوسهای جنین‌زا مؤثر دانستند (31). اما استفاده از هورمون TDZ mg/l)  5-1/0) در مورد گل محمدی تأثیری بر روی باززایی نداشت.

دست آوردهای این بررسی مبنی بر استفاده از ترکیب هورمونهای مختلف برای نیل به اندام‌زایی در توده‌های گل محمدی از نقاط مختلف با موفقیتهای  Xiangianو همکاران (2002) در دست‌یابی به اندام‌زایی بر کالوس حاصل از برگ دو کولتیوار مختلف هیبرید رز بر محیط کشت دارای هورمونهای TDZ وGA3 و BA همسو می‌باشد (30). همچنین مطالعه بر روی جنین‌زایی سوماتیک چهار کولتیوار Rosa hybrida L. نشان داد که درصد کال زایی بین کولتیوارها تفاوت معنی‌داری داشت و تیمار هورمونی شامل BA mg/l 5/0و  NAA mg/l 3/0 بالاترین میزان جنین‌زایی را داشته ‌است (27). مقایسه میانگینهای میزان کل کال‌زایی Rosa damascena بر حسب ژنوتیپهای مختلف نیز نشان داد تفاوت معنی‌داری بین آنها وجود دارد. بدین ترتیب دستورالعمل واحدی برای تمامی ژنوتیپهای گل محمدی جهت کال زایی و باززایی به دست نیامده است و تأثیر ژنوتیپ در این بین حائز اهمیت است.

Visessuwan  و همکاران (1997) از جنین نارس به دست آمده از هیبرید بین Rosa hybrida L. cv. Gelb Dagmer Hastrap * R. chinesis var. mutabilis کالوس به دست آوردند و هر یک ماه به مدت دو سال روی همان محیط بازکشت کردند و سپس روی محیط باززایی ساختار شبه جنین و سپس گیاهچه به دست آوردند (29). اما در این طرح کالوسها 4 ماه در همان محیط کال‏زایی باقی ماندند و در این زمان کاملاً قهوه‌ای شدند و سپس جنین‌زایی مشاهده گردید. قهوه‌ای شدن در این آزمایش ممکن است عامل ایجاد بافت جنین‌زای سوماتیکی باشد که توسط گرسنگی ایجاد شده است (18) و ممکن است مکانیسم زنده‌مانی گیاه در پاسخ به موقعیتهای بحرانی باشد. این حالت مرگ کالوس می‌تواند منجر به تولید سلولهایی گردد که باعث ایجاد جنینهای سوماتیکی می‌گردند (10).

Estabrooks و همکاران (2007) گزارش دادند که کالوسها پس از 8 هفته در دمای 4 درجه سانتی‏گراد در تاریکی تولید جنین می‌کنند ولی در این طرح شوک سرمایی داده شد ولی جنینی به دست نیامد (10).

به طور کلی گزارشهای محدودی از باززایی و شکل‌گیری جنین سوماتیک در بیشتر رزها وجود دارد، اما بیشتر دست آوردها غیر قابل تکرار بوده و یا فقط در معدودی از ژنوتیپها با درصد پایینی اتفاق می‌افتند. در آزمایش حاضر نیز همان طور که گفته شد بر حسب نوع جداکشت و همچنین نوع محیط در میزان کال زایی تفاوت وجود داشت و از یک قانون کلی پیروی نمی‌کردند. به همین دلیل دنبال کردن یک روش مشخص امکان پذیر نبود و مجبور به انجام همه آزمایشها بر روی کالوسهایی با منشاهای متفاوت بوده و در میان هیجده ژنوتیپ مورد بررسی تنها چهار ژنوتیپ اصفهان 10، اصفهان 4، اصفهان 9 و یزد 2 اندام‌زایی نشان دادند و تنها در دو ژنوتیپ اصفهان 4، اصفهان 9 آن هم در دو محیط کاملاً متفاوت باززایی صورت گرفت.

بر اساس نتایج حاصل، باززایی در گل محمدی تحت تأثیر ژنوتیپ، ریزنمونه و تنظیم‌کننده‌های رشد قرار می‌گیرد و استفاده بهینه از این فاکتورها در باززایی جهت ایجاد و به کارگیری تنوع سوماکلونی، امری ضروری می‌باشد.

1- اطرشی ، م.کوثرمرادی، 1393،  بررسی کالوس زایی و اندامزایی غیرمستقیم گیاه فلفل دلمه ای (Capsicum annuum) در شرایط کشت درون شیشه ای. مجله پژوهشهای گیاهی. جلد 27. شماره 3. صفحات: 346-355.

2- رضانژاد، ف. طراحی، ر، 1392،  اثر نور و تنظیم کننده های رشد گیاهی بر کالوس زایی و تجمع انتوسیانین در کالوسهای حاصل از جداکشتهای مختلف در ('Rosa galica) . مجله پژوهشهای گیاهی. جلد 26. شماره 2. صفحات: 195-184.

3- واترمن، هی.، 1379، گیاهان اسانس دار، ترجمه: بقالیان، کامبیز و نقدی بادی، حسنعلی.، انتشارات شهر اندرز.

4- ویشلقی، ن.، جلالی جواران، م. و معینی، ا. 1389.  باززایی رز مینیاتوری هفت رنگ ('Rosa hybrida,. cv 'Tanbakeda) از جنینهای سوماتیکی. مجله علوم باغبانی ایران. دوره 41. شماره 4. صفحات:357-347.

 

5- Canli, F.A., 2003. Effect of dark and TDZ on callus formation of rose leaf explant. Pakistan Journal of Biological Sciences, 6(19):1672-1674.

6- Chevallier, A., 1996. The Encyclopedia of Medicinal Plants. Dorling Kindersely, London, UK.

7- Chi-ni Hsia and Schuyler S. Korban, S., 1996. Organogenesis and somatic embryogenesis in callus cultures of Rosa hybrida and Rosa chinesis minima. Plant Cell. Tissue and Organ Culture, 44:1-6

8- De Wit, J.C., Esendam, H.F., Honkanen, J.J., Tuominen, U., 1990. Somatic embryogenesis and plant regeneration of flowering plants in rose. Plant Cell Reports. 9:456–458.

9- Driver, J. A., and Kuniyuki, H., 1984. In vitro propagation of Paradox walnut root stocks (J. hindsii× J. regia ). HortScience, 19:507-509.

10-Estabrooks, T., Browne, R. and Dong, Z., 2007. 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid promotes somatic embryogenesis in the rose cultivar ‘Livin’ Easy’ (Rosa sp.). Plant Cell Reports, 26:153–160

11- Firoozabady, E., lvloy, Y., Courtney-Gutterson,N.. Robinson. K.,1994. Biotechnology.,12: 609-613.

12- Guenther, E., 1952. The Essential Oils. Vol.5, Robert E. Krieger Publishing Company Malabar, Florida, USA

13- Hsia, C. and Korban, S., 1996. Organogenesis and somatic embrogenesis in callus cultures of Rosa hybrida and Rosa chinesis minima. Plant Cell. Tissue and Organ Culture, 44:1-6.

14- Ishioka, I., Tanimoto, S., 1990. Plant regeneration from Bulgarian rose callus. Plant Cell, Tissues and Organ Culture, 22: 197-199.

15- Jabbarzadeh, Z. Khosh – Khui. M., 2005. Factors affecting tissue culture of Damask rose, Scientia Horticulture, 105( 4): 475-482.

16- Kim, C. K., Chung, J. D., Jee, S. K., Oh, J. Y., 2003. Somatic embryogenesis from in vitro grown leaf explants of Rosa hybrida L. Journal of Plant Biotechnology, 5, 161-4.

17- Krishnamurthy, K. V., Hendre, R.R.. Godbole, D.A., Kulkarni, V.M., Mascarenhas, A.F.. Jagannathan, V, 1979. Plant Science Letters., 15: 135-137

18- Lee EK, Cho DY, Soh WY., 2001. Enhanced production and germination of somatic embryos by temporary starvation in tissue cultures of Daucus carota. Plant Cell Reports. 20(5): 408-415.

19- Matthews, D., Mottley, J., Yokoya, K., Roberts, A.V., 1994. In "Biotechnology in Agriculture and Forestry" Vol. 29. Plant Protoplasts and Genetic Engineering (ed. by Bajaj, Y.P.S), p. 146-160,Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York.

20- Memon, N.A., E. Mckyes, M.S. Soomro, I.D.M. Koondhar., 2001. Regeneration of roses via nodal segments in vitro. Sindy University. Research. Journal. (Sci. Ser.), 33: 31-34.

21- Murashige,T.and Skoog,F, 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. .Physiologia Plantarum, 15:437-494

22- Murphy, T. and Imbrie, C., 1981. Induction and characterization of chlorate resistance strain of R. damascena cultured cell.Plant Physiology, 67(5):910-916.

23- Murphy, T., Hamilton, C., 1979, A strain of R. damascena cultured cells resistant to ultra violet radation. Plant Physiology, 64:936-947.

24- Noriega, C. and Sondahl, M.R., 1991. Somatic embryogenesis in hybrid tea roses. Biotechnology. 9:991-993.

25- Pati, P. K., Sharma, M., 2004. Micropropagation and protoplast culture, ISHS Acta Horticulture, Vol. 547 III

26- Pati, P., Path, S., 2001. In vitro propagation of Rosa, Biotechnology Advances, 24: 94-114.

27- Pirniakan, B., Kalantari, S., Babalar, M., 2014. Somatic embryogenesis from leaf & petiole explants of some Rosa hybrida L. cultivars.  International Journal of Biosciences.   Vol. 5, No. 11, p. 1-7.

28- Van der Mark, F., Pijnacker-Hordijk, J.P.,Varga, G.A.1., de Vries, D.P., Dons, J.J M., 1990. Journal of  Genetic- & Breeding., 44: 263-268.

29- Visessuvvan, R., Kawai, T. and Mii., M., 1997. Plant Regeneration from Cell Suspension Culture Derived from Immature Embryo of Rose. Plant Biotechnology, 14(1), 29-33.

30- Xiangian Li, Sergei F. Krasnyanski and Schuyler S. Korban., 2002. Organogenesis and Somatic embryogenesis and shoot organogenesis in Rosa. Journal of plant physiology. 159(3):313-319.

31- Zakizadeh, H., Debnea, T., Sriskandarajah, S., Frello, S. and Serek, M., 2008. Regeneration of Miniature Potted Rose (Rosa hybrida L.) via somatic Embryogenesis. European Journal of Horticultural Science, 73(3), 111-117.