نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 استادیار بخش اگرواکولوژی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی داراب

2 دانش آموخته دکتری بخش زراعت واصلاح نبات

چکیده

به منظور بررسی نقش عناصر تنظیمی سیس نواحی پروموتری بر الگوی بیان ژنهای Catalase 2 (CAT2) و Thioredoxin H5 (TRX5) در گیاه آرابیدوپسیس در پاسخ به تنشهای مختلف زیستی و غیرزیستی، توالی پروموتری ژن‌های موردنظر، عناصر تنظیمی سیس موجود در آنها و داده‌های مربوط به بیان این ژنها در تنشهای مختلف به ترتیب با استفاده از Phytozome، PlantCARE و The Bio-Array Resource for Plant Biology دریافت گردید.به منظور تعیین تفاوتهای معنی‌دار در تعداد تکرارهای هر کدام از عناصر تنظیمی سیس بین پروموترها از آزمونهای آماری مختلف موجود در ابزار بیوانفورماتیک IDEG6 استفاده شد. نتایج نشان داد که 8 عنصر تنظیمی شاملARE ، CAAT-box، ABRE، Unnamed__4، Box-W1، TGA-element، W box و TATA-box بین دو پروموتر دارای تعداد تکرار متفاوت و معنی‌داری بودند.به نظر میرسد وجود تعداد بیشتری از عناصراختصاصی تنظیمی پاسخ به پاتوژن( Box-W1 و W box) و پاسخ به اکسین(TGA-element)، ژن TRX5 را برخلاف ژن CAT2 قادر به پاسخ به تنش زیستی میکند. همچنین وجود تعداد تکرارهای متفاوتی از عنصر تنظیمی اختصاصی پاسخ به اکسین (TGA-element) در پروموتر ژن TRX5 و عناصر تنظیمی پاسخ بی‌هوازی (ARE) و پاسخ به آبسزیک اسید (ABRE) در پروموتر ژن CAT2 بخشی از الگوی بیان این دو ژن را در پاسخ به تنش‌های غیرزیستی توجیه نمود.بر اساس این نتایج، TRX5 هم در پاسخ به تنشهای زیستی و هم غیرزیستی نقش دارد. شناسایی این گونه ژنها با کارکرد پاسخ به تنشهای زیستی و غیرزیستی می‌تواند پیشرفت بزرگی در جهت انتخاب ژنهای کاندید مناسب جهت دستورزی ژنتیکی به منظور افزایش تحمل به تنشها درگیاهان به شمار رود.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

A Comparative Investigation of Catalase 2 and Thioredoxin H5 Genes Promoters in Arabidopsis to Determine of Their Functions in Response to Biotic and Abiotic Stresses

نویسندگان [English]

  • Zahra Zinati 1
  • Roohollah Shamloo-Dashtpagerdi 2

1 Assist. Prof. of plant breeding, Agroecology Department, College of Agriculture and Natural Resources of Darab, I.R. of Iran

چکیده [English]

In order to investigate of cis-regulatory elements'role in the promoter region in the expression pattern of genes Catalase 2(CAT2) and Thioredoxin H5(TRX5) in Arabidopsis in response to different biotic and abiotic stresses,the promoter sequences of the genes, cis-regulatory elements in them, data relating to the expression of these genes in the different stresses were received using Phytozome, PlantCARE and the Bio-Array Resource for Plant Biology, respectively. Significant differences in the number of repetitions of each cis-regulatory element among promoters were determined by a variety of statistical methods available at bioinformatics IDEG6 tool. The results showed that eight cis-regulatory elements,including ARE,CAAT-box,ABRE,Unnamed-4,Box-W1,TGA-element,W box and TATA-box had significant and different occurrences between two promoters. It can be suggested that gene TRX5 unlike gene CAT2 is able to respond to biotic stress due to the presence of a greater number of specific regulatory elements in response to pathogen(Box-W1 and W box) and auxin(TGA-element). Also, a part of the expression pattern of these genes in response to abiotic stresses can be justified due to the presence of different number of repetitions of specific regulatory element in response to auxin(TGA-element) on the TRX5 gene promoter and anaerobic regulatory element(ARE) and abscisic acid regulatory element(ABRE) on the CAT2 gene promoter. Based on these results, TRX5 plays a role in response to biotic and abiotic stresses. Identification of these genes with functional response to biotic and abiotic stresses can be considered a huge progress in order to select candidate genes for genetic manipulation to enhance plants stress tolerance.

کلیدواژه‌ها [English]

  • CAT2
  • TRX5
  • Promoter analysis
  • Gene expression

بررسی مقایسه­ای پروموترهای ژنهای Catalase2و H5Thioredoxinدر آرابیدوپسیس به منظور تعیین نحوه کارکرد آنها در پاسخ به تنشهای زیستی و غیر زیستی

زهرا زینتی1* و روح­اله شاملو دشت پاگردی2

1 داراب، دانشگاه شیراز، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، بخش اگرواکولوژی

2 شیراز، دانشگاه شیراز، دانشکده کشاورزی، بخش زراعت واصلاح نباتات

تاریخ دریافت: 19/7/94                تاریخ پذیرش: 27/4/95

چکیده

به منظور بررسی نقش عناصر تنظیمی سیس نواحی پروموتری بر الگوی بیان ژنهای Catalase 2(CAT2) و Thioredoxin H5 (TRX5) در گیاه آرابیدوپسیس در پاسخ به تنشهای مختلف زیستی و غیر زیستی، توالی پروموتری ژنهای مورد نظر، عناصر تنظیمی سیس موجود در آنها و داده­های مربوط به بیان این ژنها در تنشهای مختلف به ترتیب با استفاده از Phytozome، PlantCARE و The Bio-Array Resource for Plant Biology دریافت گردید. به منظور تعیین تفاوتهای معنی­دار در تعداد تکرارهای هر کدام از عناصر تنظیمی سیس بین پروموترها از آزمونهای آماری مختلف موجود در ابزار بیوانفورماتیک IDEG6 استفاده شد. نتایج نشان داد که 8 عنصر تنظیمی شاملARE ، CAAT-box، ABRE، Unnamed__4، Box-W1، TGA-element، W box و TATA-box بین دو پروموتر دارای تعداد تکرار متفاوت و معنی­داری بودند. به نظر می­رسد وجود تعداد بیشتری از عناصراختصاصی تنظیمی پاسخ به پاتوژن ( Box-W1 و W box) و پاسخ به اکسین (TGA-element)، ژن TRX5را برخلاف ژن CAT2 قادر به پاسخ به تنش زیستی می­کند. همچنین وجود تعداد تکرارهای متفاوتی از عنصر تنظیمی اختصاصی پاسخ به اکسین (TGA-element) در پروموتر ژن TRX5 و عناصر تنظیمی پاسخ بی­هوازی (ARE) و پاسخ به آبسزیک اسید (ABRE) در پروموتر ژن CAT2 بخشی از الگوی بیان این دو ژن را در پاسخ به تنش­های غیر زیستی توجیه نمود. بر اساس این نتایج، TRX5هم در پاسخ به تنشهای زیستی و هم غیرزیستی نقش دارد. شناسایی این گونه ژنها با کارکرد پاسخ به تنشهای زیستی و غیر زیستی می­تواند پیشرفت بزرگی در جهت انتخاب ژنهای کاندید مناسب جهت دست­ورزی ژنتیکی به منظور افزایش تحمل به تنشها درگیاهان به شمار رود.

واژه های کلیدی: CAT2، TRX5، آنالیز پروموتر، بیان ژن 

* نویسنده مسئول، تلفن: 07136139940 ، پست الکترونیکی: zahrazinati@shirazu.ac.ir 

مقدمه

 

در سیستمهای کشاورزی، تنشهای غیرزیستی و زیستی باعث تفاوت عملکرد برداشت شده نسبت به عملکرد بالقوه می­شوند. شواهد زیادی وجود دارند که بیانگر تغییر بیان ژنهای گیاهی در اثر تنشهای مختلف هستند که احتمالاً به دلیل نقش آنها در مکانیسمهای تحمل می‌باشد. مطالعه گیاهان تراریخته این نظریه را که تغییر بیان ژنها می­تواند منجر به افزایش تحمل شود، حمایت می­کند (14، 20 و 32). تنظیم بیان ژن شامل یک شبکه مولکولی پیچیده می­باشد. پروموترها نقش مهمی در تنظیم بیان ژن در مراحل مختلف رشدی و پاسخ به محیط دارند. رونویسی از ژن­ها در درجه اول توسط شناسایی عوامل رونویسی متصل شونده به DNA (TF= Transcription factors) و اتصالشان به توالی کوتاه خاصی (TFBS= Transcription factor binding site) یا عناصر تنظیمی سیس (CREs= Cis regulatory elements) در منطقه تنظیمی (پروموتر) کنترل می­شود و سپس به فعال شدن یا سرکوبی رونویسی در پاسخ به تغییرات محیطی و در طی نمو منجر می­گردد (27). بنابراین شناسایی عناصر تنظیمی سیس یکی از گامهای اساسی برای فهم شبکه تنظیمی رونویسی است که در نهایت اطلاعات لازم را برای ساخت مدلهای شبکه­های تنظیمی فراهم می­سازد (23). پروموتر منطقه بالادست مجاور شروع نقطه رونویسی (TSS= Transcription start site) می­باشد. هر ژن دارای ترکیبی منحصر به فرد از عناصر تنظیمی در نواحی پروموتری خود می­باشد که الگوی بیان زمانی و مکانی آن ژن را تعیین می­کند. پیشرفتهای اخیر تکنولوژی ریزآرایه و در دسترس بودن تعداد زیادی از توالیهای ژنوم کامل، استفاده از روشهای محاسباتی را جهت یافتن عناصر تنظیمی و شفاف سازی شبکه تنظیمی امکان پذیر ساخته است (27). Thioredoxin H5 (TRX5) یکی از هشت عضو متعلق به خانواده Thioredoxinهای H سیتوزولی می­باشد (22 و 25). در گیاهان Thioredoxin H در طول جوانه زنی و نمو اولیه گیاهچه (5، 18، 24 و 40) و احتمالاً جذب سولفات (26)، زخم، ریزش و پیری، برهمکنش­های ناسازگار با پاتوژن، تنش اکسیداتیو (21) شرکت دارد. وجود آنها در شیره آوندی برنج و طیف وسیعی از گونه­های تک لپه و دولپه نشان می­دهد که آنها می­توانند به عنوان پروتئینهای پیام رسان عمل کنند (17 و 33). Catalase 2 (CAT2) نیز یکی از سه ژن خانواده کاتالاز می­باشد (11). کاتالاز جزئی از ماشین دفاعی آنتی اکسیدانی در گیاهان در مقابل صدمات تنش اکسیداتیو است. CAT2از کنترل کننده­های اصلی H2O2است که به هم ایستایی گونه­های اکسیژن فعال کمک می­کند (13). علاوه بر این، فعالیت کاتالاز در تنشهای سرما و خشکی افزایش می­یابد (9). در این پژوهش به منظور شناسایی ارتباط عناصر تنظیمی سیس با الگوی بیان ژنهای رمز کننده CAT2و TRX5، از تلفیق آنالیز مقایسه­ای پروموترها و داده­های بیان ژن استفاده شد. این مطالعه اولین گزارش پیرامون بررسی مقایسه­ای پروموتر ژنهای رمز کننده CAT2 و TRX5می­باشد.

مواد و روشها 

آنالیز مقایسه­ای پروموترهای ژنهای CAT2 و TRX5:توالی پروموتر ژنهای CAT2 و TRX5 (شامل 1500 جفت باز بالادست نقطه آغاز رونویسی) از پایگاه اطلاعاتی www.phytozome.net دریافت شد. برای شناسایی نوع و تعداد عناصر تنظیمی توالی­های پروموتری، ازسایت http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html استفاده گردید. به منظور تعیین تفاوتهای معنی­دار در تعداد تکرارهای هر کدام از عناصر تنظیمی سیس بین پروموترها، از آزمونهای آماری مختلف (Audic and Claverie، Fisher exact test، Chi-squared 2×2، Greller and Tobin، R of Stekel and Falciani و General Chi-squared) با در نظر گرفتن P-value≤0.05 و با به کارگیری ابزار IDEG6 (29) استفاده شد (34).

بررسی الگوی بیان ژن­های CAT2 و TRX5 در پاسخ به تنش­های مختلف زیستی و غیر زیستی: سایت  The Bio-Array Resource for Plant Biology  (BAR) (http://bar.utoronto.ca) به منظور دریافت داده­های بیان ژن­های رمز کننده CAT2 (AT4G35090) و TRX5 (AT1G45145) در تنشهای مختلف زیستی و غیر زیستی مورد استفاده قرار گرفت. این سایت برای جستجو و اکتشاف در میان مجموعه داده­های بزرگ مقیاس ریزآرایه و پروژه­های با بازدهی بالا در آرابیدوپسیس و گونه­های دیگر استفاده می­شود. به منظور تسهیل تفسیر و آنالیز داده­های بیان حاصل از آزمایشهای ریزآرایه و پروژه­های با بازدهی بالا، نرم­افزاری با نام  electronic Fluorescent Pictograph (eFP) browserتوسط Winter و همکاران در سال 2007 ایجاد شده است که در سایت BAR قابل دسترس می­باشد (41). موتور مرورگر Arabidopsis eFP داده­های بیان تقریباً 22000  ژن در آرابیدوپسیس که توسط کنسرسیوم AtGenExpress (کنسرسیوم بین المللی کشف ترانسکریپتوم آرابیدوپسیس) و آزمایشگاههای دیگر تولید شده است را ارائه می­دهد. تقریباً بیشتر از 1000 مجموعه داده ریزآرایه در این نرم­افزار بارگذاری شده است. در مرورگر Arabidopsis eFP پس از وارد کردن IDهای ژن مورد بررسی، انتخاب منبع داده­ها از لیست پیش فرض و انتخاب روش تفسیری بیان ژن (مطلق، نسبی و مقایسه­ای)، مقادیر نرمال شده بیان ژن مورد نظر، بازیابی می­شود. علاوه بر این، سایر جزئیات آزمایشها، از قبیل تعداد تکرارها، شرایط رشدی، نحوه اعمال تیمارها و نوع روش نرمال سازی داده­ها در سایت BAR قابل دسترس می­باشند (41). در مطالعه حاضر با انتخاب روشهای زیستی و غیر زیستی از لیست پیش فرض منبع داده­ها و انتخاب روش تفسیری مطلق در مرورگر Arabidopsis eFP، داده­های بیان مطلق ژنهای CAT2 و TRX5 مربوط به بافت شاخساره و ریشه گیاه آرابیدوپسیس (اکوتیپ Clumbia-0) 18 روزه، در زمانهای 0، 5/0، 1، 3، 6، 12، 24  ساعت پس از اعمال تنشهای غیر زیستی (شوری، سرما، اسمزی، ژنوتوکسیک، خشکی، اکسیداتیو، اشعه ماوراء بنفش، زخم و گرما) و همچنین داده­های بیان مطلق ژنهای CAT2 و TRX5 در شاخساره گیاه آرابیدوپسیس 4 هفته­ای، در زمانهای 2، 6 و 24 ساعت پس از اعمال تنشهای زیستی (باکتریهای غیر بیماریزای  Pseudomonas Syringae، باکتریهای بیماریزای Pseudomonas Syringae و قارچ Phytophthora infestans) دریافت شدند. همبستگی بین الگوی بیان دو ژن CAT2 و TRX5 در تنشهای مختلف زیستی و غیر زیستی نیز با استفاده از نرم­افزاز SAS تعیین شد. در نهایت، ارتباط بین الگوی بیان ژنها و نتایج حاصل از بخش آنالیز مقایسه­ای پروموترها بررسی گردید.

نتایج  

بررسی توالی پروموتری ژنهای CAT2 و TRX5، 31 عنصر تنظیمی سیس را در هر ژن پیش بینی کرد. 19 عنصر تنظیمی بین دو پروموتر مشترک بود. 12 عنصر تنظیمی خاص  CAT2و 12 عنصر تنظیمی نیز خاص TRX5بود. عمده­ترین عنصر تنظیمی در نواحی پروموتری ژنهای CAT2 و TRX5، TATA-box و CAAT-box بودند که به ترتیب توالی شروع رونویسی (6) و توالی افزاینده (28) می­باشند.

نتایج آزمونهای آماری نشان داد 8 عنصر تنظیمی یعنی ARE، CAAT-box، ABRE، Unnamed__4،
  Box-W1، TGA-element، W box و TATA-box بین پروموترهای ژنهای CAT2 و TRX5دارای تعداد تکرار متفاوت و معنی­داری بودند (جدول 1). از این تعداد، عنصر تنظیمی ARE خاص ژن CAT2، سه عنصر تنظیمی Box-W1، TGA-element و W box خاص ژن TRX5و چهار عنصر تنظیمی CAAT-box، Unnamed__4، ABRE و TATA-box بین دو پروموتر مشترک بودند.

الگوی بیان ژنهای CAT2 و TRX5 در  تنشهای مختلف زیستی و غیر زیستی در شکلهای 1، 2 و 3 ارائه شده است. همچنین ضرایب همبستگی بیان ژنهای CAT2 و TRX5تحت تنشهای مختلف غیر زیستی و زیستی در جدول 2 نشان داده شده است. همبستگی مثبت بیانگر روند تغییرات بیان نسبتاً مشابه و همبستگی منفی نشان دهنده روند تغییرات بیان متفاوت ژنهای CAT2 و TRX5تحت تنشهای مختلف غیر زیستی و زیستی می­باشد. بین بیان دو ژن در تنش شوری و اشعه ماوراء بنفش (در بافت شاخساره) و تنش سرما (در بافت ریشه) همبستگی منفی معنی­داری وجود داشت. به علاوه آنالیز همبستگی بیان ژنهای CAT2 و TRX5تحت تنشهای مختلف غیرزیستی و زیستی نشان داد که در اکثر تنشها همبستگی بیان ژنهای CAT2 و TRX5 منفی می­باشد، هرچند این همبستگی از لحاظ آماری معنی­داری نبود. آنالیز مقایسه­ای پروموتر می­تواند راهکار مناسبی برای توجیه بخشی از این روند تغییرات بیان متفاوت دو ژن CAT2 و TRX5در پاسخ به تنشهای زیستی

و غیرزیستی باشد.

 

جدول 1- نتایج مقایسه جفتی تعداد تکرارهای عناصر تنظیمی واقع در نواحی پروموتری ژنهای CAT2 و TRX5 با استفاده از آزمونهای آماری Audic and Claverie، Fisher exact test، Chi-squared 2X2، Greller and Tobin، R of Stekel and Falciani و General Chi-squared. مقادیر p-valueی هر آزمون برای هر عنصر تنظیمی آورده شده است.

Cis-acting elements

کارکرد 

CAT2

TRX5

CAT2 (norm)

TRX5 (norm)

Audic and Claverie 

Fisher exact test

Chi- squared 2×2

Greller and Tobin

R of Stekel and Falciani

General Chi-squared

ABRE

cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness

10

1

657.9

88.5

0.0103

0.0269

0.0215

.

0.0133

0.0215

ARE

cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction

4

0

263.2

0

0.0620

0.1384

0.0822

.

0.0349

0.0822

CAAT-box

common cis-acting element in promoter and enhancer regions

30

14

1973.7

1238.9

0.0248

0.1337

0.1119

.

0.1400

0.1119

TATA-box

core promoter element around -30 of transcription start

62

52

4078.9

4601.8

0.03498

0.4518

0.3952

0.1531

0.5201

0.3952

Unnamed__4

 

1

5

65.8

442.5

0.02783

0.0866

0.0414

.

0.0396

0.0414

Box-W1

fungal elicitor responsive element

0

3

0

265.5

0.0444

0.0763

0.0433

.

0.0237

0.0433

TGA-element

auxin-responsive element

0

5

0

442.5

0.0080

0.0133

0.0088

.

0.0035

0.0088

W box

pathogen-induced activity

0

3

0

265.5

0.0444

0.0763

0.0433

.

0.0237

0.0433

 

جدول 2- همبستگی بیان ژنهای CAT2 و TRX5 تحت تنشهای مختلف غیر زیستی و زیستی

قارچPhytophthora infestants 

باکتریبیمار­ی­زایPseudomonas syringae 

باکتریغیربیمار­ی­زایPseudomonas syringae 

گرما

زخم

اشعه ماوراء بنفش

اکسیداتیو

ژنوتوکسیک

خشکی

اسمزی

سرما

شوری

 

669/0-

046/0-

977/0

415/0

022/0-

*790/0-

654/0

222/0

735/0-

599/0-

450/0-

**871/0-

شاخساره

 

 

 

600/0

077/0

352/0-

267/0

325/0-

164/0

675/0

**966/0-

100/0

ریشه

علامت * نشان دهنده معنی­داری درسطح 5% و علامت ** نشان دهنده معنی­داری درسطح 1% می­باشد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 1- الگوی بیان ژنهای CAT2 و TRX5 در تنشهای الف) باکتری غیر بیماریزای Pseudomonas syringae، ب) باکتری بیماریزای Pseudomonas syringae، ج) قارچ Phytophthora infestants در بافت شاخساره

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 2- میزان بیان مطلق ژنهای CAT2 و TRX5 در شرایط نرمال و تنشهای غیر زیستی (شوری، سرما، اسمزی، خشکی، ژنوتوکسیک، اکسیداتیو، اشعه ماوراء بنفش، زخم و گرما) در بافت شاخساره (الف) و بافت ریشه (ب)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 3- میزان بیان نسبی ژنهای CAT2 و TRX5 در شرایط نرمال و تنشهای غیر زیستی (شوری، سرما، اسمزی، خشکی، ژنوتوکسیک، اکسیداتیو، اشعه ماوراء بنفش، زخم و گرما) در بافت شاخساره (الف) و بافت ریشه (ب)

 

بحث

بررسی الگوی بیان ژنهای CAT2 و TRX5 در پاسخ به تنشهای ­زیستی: بر اساس نتایج حاصل از آنالیز پروموتر، عنصر تنظیمی W box به طور اختصاصی در نواحی پروموتری ژن TRX5وجود داشت. این عنصر تنظیمی جایگاه اتصال عامل رونویسی WRKY و برای فعالیت ژن در برابر عامل بیماریزا ضروری می­باشد (15). در پژوهشی که توسط Laloi و همکاران (2004) انجام شد در گیاهان با بیان بالایWRKY6 ، بیان ژن TRX5 افزایش یافت. آنها گزارش کردند کهWRKY6  در تنظیم بیان TRX5درگیر است (21).موتیف Box-W1 نیز که بطور اختصاصی در نواحی پروموتری ژن TRX5وجود داشت، عنصر تنظیمی پاسخ به حمله پاتوژن می­باشد (30). تعداد عناصر تنظیمی W box و Box-W1 در ناحیه پروموتری ژن TRX5به طور معنی­داری بیشتر از تعداد آن در ناحیه پروموتری ژن CAT2بود. از سوی دیگر، آنالیز بیان ژن نشان داد که در شرایط تنش پاتوژن نسبت به شرایط کنترل، بیان ژن TRX5به میزان قابل توجهی افزایش می­یابد در حالی که بیان ژن CAT2 کاهش می­یابد (شکل 1). بنابراین تعداد بیشتر عناصر تنظیمی W box و Box-W1 در ناحیه پروموتری ژن TRX5می­تواند دلیلی بر افزایش بیشتر بیان این ژن در شرایط تنش پاتوژن نسبت به شرایط کنترل باشد.

بررسی الگوی بیان ژنهای CAT2وTRX5 در پاسخ به تنشهای غیرزیستی: یکی دیگر از عناصری که به طور اختصاصی در نواحی پروموتری ژن CAT2 وجود داشت و بین پروموترهای دو ژن تفاوت معنی­داری نشان داد ARE (عنصر پاسخ بی­هوازی) با توالی TGGTTT بود. مطالعات پیشین نشان دادند که یک پروتئین از خانواده MYB (عامل رونویسی AtMYB2) به عنصر تنظیمی ARE با توالی TGGTTT متصل می­شود (7 و 16). برهمکنش بین عامل رونویسی AtMYB2 و توالی TGGTTT نشان داد که توالی TGGTTT نقش مهمی در نواحی پروموتری ژنهای پاسخ دهنده به تنش ایفاء می­کند (7). خانواده MYB بزرگترین خانواده عوامل رونویسی در آرابیدوپسیس می­باشند که در فرآیندهای سلولی مختلف شرکت دارند (10 و 43). MYB2 به عنوان عامل رونویسی هورمونهای آبسزیک اسید (ABA) و اتیلن (ET) در شرایط تنش عمل می­کند (8 و 43) و همچنین بیان تعدادی از ژنهای پاسخ دهنده به شوری و خشکی را مدیریت می­کند (3، 7 و 10). به نظر می­رسد AREها در شبکه­های تنظیمی طیف گسترده­ای از تنشهای غیر زیستی از جمله تنشهای بی­هوازی، خشکی و شوری با میانجیگری هورمونهای ABA و ET دخیل باشند (31).

به علاوه، در نواحی پروموتری ژنهای TRX5و CAT2 به ترتیب 1 و 10 عنصر پاسخ دهنده به ABA (ABRE) وجود داشت. Skriver و همکاران (1991) گزارش دادند که وجود چند نسخه از ­­ABRE در یک پروموتر، امکان پاسخ به ABA را به آن پروموتر می­دهد در حالی که وجود تنها یک نسخه از ABRE در پروموتر، منجر به عدم پاسخ پروموتر به ABA می­شود (36). در پژوهشی که توسط رهنما و وکیلیان (1392) انجام شد فعالیت القایی پروموتر Rd29A پس از همسانه­سازی از گیاه آرابیدوپسیس در گیاه توتون مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج حاصل از  این پژوهش، ABA، تنش شوری و تنش خشکی باعث القای پروموتر Rd29A گردید. آنها پیشنهاد کردند که با توجه به حضور عنصر  ­­ABRE در پروموتر  Rd29Aاحتمالاً تنش شوری و خشکی با استفاده از سیگنال ABA در القای پروموتر عمل می­کنند (2). حضور تعداد زیاد ABRE در نواحی پروموتری CAT2نشان می­دهد که  مسیر سیگنالینگ ABA در تنظیم بیان این ژن نقش دارد و لذا سطح ABA در پاسخ به تنشهای غیر زیستی مانند خشکی و شوری افزایش می­یابد (42). در پژوهشی که توسط جعفریه یزدی و همکاران (2007) انجام شد، عملکرد گیاهان کلزای تحت تنش خشکی زمانی که غلظت پایین آبسزیک اسید اعمال شد در مقایسه با گیاهان کلزای تحت تنش خشکی افزایش یافت (1).

بررسی داده­های بیان ژن نشان داد که میزان بیان ژن CAT2 در شاخساره تحت شرایط نرمال و تنشهای مختلف غیر زیستی بیشتر از ژن TRX5بود در حالی که در ریشه عکس آن صادق بود. به عبارتی میزان بیان ژن TRX5در ریشه تحت شرایط نرمال و تنشهای مختلف غیر زیستی بیشتر از ژن CAT2بود (شکل 2). CAT2به عنوان کاتالاز القاء شونده توسط نور شناخته شده است و بیان آن یک تناوب شبانه روزی با حداکثر بیان در صبح زود را نشان می­دهد (44 و 45). همچنین ناکارآیی CAT2، مقاومت به نور زیاد را در گیاهان آرابیدوپسیس کاهش می دهد (38). Du و همکاران (2008) گزارش کردند که CAT2 عمدتاً در بافتهای فتوسنتزی از جمله برگها بیان می­شود و میزان بیان آن بالاتر از CAT1 و CAT3 می­باشد. به علاوه فعالیت آن در تنشهای سرما، خشکی و اکسیداتیو افزایش می­یابد (9). بررسی عناصر تنظیمی نواحی پروموتری نشان داد که عناصر تنظیمی پاسخ به نور با توالیهای متفاوت در CAT2و TRX5 به ترتیب 18و 12 عدد می­باشد. از آنجا که بافت شاخساره در معرض روشنایی و بافت ریشه درون خاک در معرض تاریکی قرار دارد، احتمالاً می­توان میزان بیان بالاتر ژن CAT2 نسبت به ژن TRX5در بافت شاخساره و کمتر بودن میزان آن در بافت ریشه را به این عنصر تنظیمی نسبت داد.

بررسی بیان نسبی ژنهای CAT2 و TRX5در بافت شاخساره و ریشه نیز نشان داد که بیان ژن CAT2 تحت تنشهای مختلف غیر زیستی تفاوت معنی­داری با شرایط کنترل ندارد. بیان ژن TRX5 در بافت شاخساره تحت تنشهای مختلف غیر زیستی به میزان قابل توجهی افزایش یافت ولی در بافت ریشه تحت تنشهای مختلف تغییر بیان محسوسی وجود نداشت (شکل 3). Taji و همکاران (2004) نشان دادند که تحت تنش mM250 نمک NaCl، تعداد ژنهای کمتری در خویشاوند وحشی متحمل آرابیدوپسیس (Thellungiella halophila) در مقایسه با آرابیدپسیس القا شد. این مطلب می­تواند تأکیدی بر این نکته باشد که تحمل به تنش در Thellungiella halophile ممکن است ناشی از بیان بالای دائمی چندین ژن درگیر در تحمل به شوری باشد در حالی که این ژنها در آرابیدوپسیس القاء شونده هستند (37). همچنین از یک سو با توجه به پژوهشی که توسط Du و همکاران (2008) انجام شد که در آن فعالیت CAT2در تنشهای سرما، خشکی و اکسیداتیو در گیاهان آرابیدوپسیس افزایش یافت و از سوی دیگر با توجه با عدم تغییر بیان این ژن در سطح رونویسی در تنشهای مختلف، به نظر می­رسد فعالیت این ژن وابسته به تنظیم در سطح پس از رونویسی ­باشد (9).

TRX5به دلیل دارا بودن چندین عنصر TGA-element (عنصر پاسخ به اکسین) در نواحی پروموتری، جزء ژنهای پاسخ دهنده به اکسین می­باشد. این عنصر تنظیمی نیز به طور اختصاصی در نواحی پروموتری ژن TRX5وجود داشت. Wang و همکاران (2001) نشان دادند که هورمون اکسین در پاسخ به تنشهای غیر زیستی در آرابیدوپسیس دخیل است (39). همچنین در پژوهشی که توسط Ghanashiam و Jain (2009) انجام شد تعداد زیادی ژن پاسخ دهنده به اکسین علاوه بر تنشهای غیر زیستی به تنش زیستی نیز پاسخ دادند. نتایج آزمایشات حاکی از آن بود که اکسین یکی از اجزای مهم درگیر در پاسخهای دفاعی از طریق تنظیم بیان بسیاری از ژنها می­باشد و تداخلی بین مسیرهای انتقال پیام تنشهای زیستی و غیرزیستی ایجاد می­کند (12). Bari  وJones نیز شواهدی برای درگیری مسیر انتقال پیام اکسین در پاسخهای دفاعی ارائه دادند (4). از آنجا که تعداد این عنصر تنظیمی در نواحی پروموتری ژن TRX5و CAT2 به ترتیب 5 و 0 بود و نیز بیان ژن TRX5 در بافت شاخساره تحت تنشهای مختلف غیر زیستی به میزان قابل توجهی افزایش یافت و با توجه اینکه تغییر بیان ژن CAT2تحت تنشهای مختلف غیر زیستی محسوس نبود شاید بتوان القای TRX5 در تنشهای غیرزیستی را به حضور این عنصر تنظیمی در نواحی پروموتری آن نسبت داد.

عنصر تنظیمی دیگر با اختلاف معنی­دار بین نواحی پروموتری دو ژن، Unnamed__4 با توالی CTCC بود. تعداد این عنصر تنظیمی در نواحی پروموتری ژن TRX5و CAT2 به ترتیب 5 و 1 بود. کارکرد این عنصر تنظیمی کاملاً شناخته شده نیست. لذا این احتمال وجود دارد که ممکن است یکی از دلایل القای بیان TRX5  تحت تنشهای مختلف ناشی از عنصر تنظیمی CTCC باشد. به عبارتی این عنصر تنظیمی در پاسخ به تنشهای غیرزیستی نقش داشته باشد. این فرضیه برای اثبات نیاز به آنالیز پروموتری ژنهای بیشتری دارد. تا کنون مطالعات زیادی پیرامون کارکرد دقیق  این عنصر تنظیمی انجام نشده است. با این حال، در پژوهشی که توسط Shumin و همکاران (2015) انجام شد، با توجه به حضور این عنصر در چند ژن تنظیمی لایه مغذی دانه گرده از جمله DYT1، AMS، AtMYB103 پیشنهاد شد که این عنصر تنظیمی احتمالاً به طور گسترده­ای در تنظیم بیان ژنی خاص بساک نقش دارد. آنها بیان کردند موتیف Unnamed__4 با توالی CTCC یک عنصر تنظیمی بالقوه می­باشد که یک سر نخ جدید برای بررسی ارتباط بین DYT1 و ژنهای بالادست آن فراهم می­کند (35). در پژوهش دیگری که توسط Ku و همکاران (2011) انجام شد، تغییر توالی CCCC به توالی CTCC در ناحیه  5'-UTR ژن TAC1 (ژن کنترل کننده زاویه برگ) در ذرت منجر به افزایش بیان این ژن و تغییر زاویه برگ گردید (19).

تلفیق نتایج آنالیز مقایسه­ای پروموتر و نتایج الگوی بیان ژنها، ارتباط قوی و آشکاری را بین بیان ژنها و عناصر تنظیمی سیس شناسایی شده نشان داد. با بررسی عناصر تنظیمی موجود در نواحی پروموتری مشخص گردید که ژن TRX5با دارا بودن عناصر اختصاصی تنظیمی پاسخ به پاتوژن ( Box-W1و W box) و پاسخ به اکسین (TGA-element) در پاسخ به تنش زیستی نقش مؤثری ایفا می­کند. همچنین ژن TRX5 با دارا بودن عنصر تنظیمی اختصاصی پاسخ به اکسین (TGA-element) و ژن CAT2 با دارا بودن عناصر تنظیمی پاسخ بی­هوازی (ARE) و پاسخ به آبسزیک اسید (ABRE) در تنشهای غیر زیستی نقش دارند.

در کل TRX5هم در پاسخ به تنشهای زیستی و هم غیرزیستی نقش دارد. شناسایی این گونه ژنها با کارکردهای مقاومت در تنشهای زیستی و غیر زیستی پیشرفت بزرگی در زمینه انتقال ژن به شمار می­رود. به علاوه شناسایی عناصر تنظیمی می­تواند افق جدیدی را در درک مکانیسم پاسخ به تنشها و ارتباط ژنهای مورد نظر با ژنهای بالادست باز نماید.

  1. جعفریه یزدی ا.، مجد 1.، فلاحیان ف.، خاوری­نژاد ر.، برنارد ف. و جاویدفر ف. 1385. مجله زیست شناسی ایران، جلد 19. شماره 2. ص 125-135.
  2. رهنما ح. و مجد ا. 1392. همسانه­سازی و ارزیابی فعالیت پیشبر Rd29A در گیاهان تراریخت توتون. مجله پژوهش­های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران)، جلد 26. شماره 4. ص 480-490.

 

3. Abe H., Urao T., Ito T., Seki M., Shinozaki K. and Yamaguchi-Shinozaki K. 2003. Arabidopsis AtMYC2 (bHLH) and AtMYB2 (MYB) function as transcriptional activators in abscisic acid signaling. Plant Cell, 15: 63-78.

4. Bari R. and Jones J.D.G. 2009. Role of plant hormones in plant defence responses. Plant Molecular Biology, 69:473-88.

5. Besse I., Wong J.H., Kobrehel K. and Buchanan B.B. 1996. Thiocalsin: a thioredoxin-linked, substrate-specific protease dependent on calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93: 3169–3175.

6. Burley S.K. and Roeder R.G. 1996. Biochemistry and structural biology of transcription factor IID (TFIID), Annual Review of Biochemistry, 65: 769–799.

7. Dolferus  R., Klok  E.J., Ismond  K., Delessert  C., Wilson  S., Good  A., Peacock J. and Dennis L. 2001. Molecular basis of the anaerobic response in plants. International Union of Biochemistry and Molecular Biology life, 51: 79-82.

8. Du H., Zhang L., Liu L., Tang X.F., Yang W.J. and Wu Y.M. 2009. Biochemical and molecular characterization of plant MYB transcription factor family. Biochemistry (Moscow), 74: 1-11.

9.  Du Y.Y., Wang P.C., Chen J. and Song C.P. 2008. Comprehensive functional analysis of the catalase gene family in Arabidopsis thaliana. Journal of Integrative Plant Biology, 50:1318-1326.

10. Dubos  C., Stracke  R., Grotewold  E., Weisshaar  B., Martin C. and Lepiniec  L. 2010.  MYB transcription factors in Arabidopsis. Trends in Plant Science, 15: 573-581.

11. Frugoli J.A., Zhong H., Nuccio M.L., McCourt P., McPeek M.A., Thomas T.L. and McClung C.R. 1996. Catalase is encoded by a multigene family in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Plant Physiology, 112: 327–336.

12. Ghanashyam C. and Jain M. 2009. Role of auxin-responsive genes in biotic stress responses. Plant Signaling and Behavior, 4: 846-848.

13. Gill S.S. and Tuteja N. 2010. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry, 48: 909–930. 

14. Hao D., Liu X., Yu Y., Liu Y., Qu Y., Yang S., Han S. and Feng S. 2014. A novel chitinase gene homologue from Chinese wild rye enhances tolerance to biotic and abiotic stress in transgenic tobacco. New Biotechnology, 31: S207.

15. Himmelbach A., Liu L., Zierold U., Altschmied L., Maucher H., Beier F., Müller D., Hensel G., Heise A., Schützendübel A., Kumlehn J. and Schweizer P. 2010. Promoters of the barley germin-like GER4 gene cluster enable strong transgene expression in response to pathogen attack. Plant Cell, 22: 937–952.

16. Hoeren F.U., Dolferus R., Wu Y., Peacock W.J. and Dennis E.S. 1998. Evidence for a role for AtMYB2 in the induction of the Arabidopsis alcohol dehydrogenase gene (ADH1) by low oxygen. Genetics, 149: 479-490.

17. Ishiwatari Y., Honda C., Kawashima I., Nakamura S., Hirano H., Mori S, Fujiwara T., Hayashi H. and Chino M. 1995. Thioredoxin h is one of the major proteins in rice phloem sap. Planta, 195: 456–463.

18. Kobrehel K., Wong J.H., Balogh A., Kiss F., Yee B.C. and Buchanan B.B. 1992. Specific reduction of wheat storage proteins by thioredoxin h. Plant Physiology, 99: 919–924.

19. Ku L., Wei X., Zhang S., Zhang J., Guo S. and Chen Y. 2011. Cloning and characterization of a putative TAC1 ortholog associated with leaf angle in maize (Zea mays L.). PLoS ONE, 6: e20621.

20. Kumar S., Asif M., Chakrabarty D., Tripathi R.D., Dubey R.S. and Trivedi P.K. 2015. Expression of a rice Lambda class of glutathione S-transferase, OsGSTL2, in Arabidopsis provides tolerance to heavy metal and other abiotic stresses. Journal of Hazardous Materials, 248–249: 228-237.

21. Laloi C., Mestres-Ortega D., Marco Y., Meyer Y. and Reichheld J.P. 2004. The Arabidopsis cytosolic thioredoxin h5 gene induction by oxidative stress and its W-Box-mediated response to pathogen elicitor. Plant Physiology, 134:1006-16.

22. Laloi C., Rayapuram N., Chartier Y., Grienenberger J.M., Bonnard G. and Meyer Y. 2001. Identification and characterization of a mitochondrial thioredoxin system in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 98: 14144–14149.

23. Lee T.I., Rinaldi N.J., Robert F., Odom D.T., Bar-Joseph  Z., Gerber G.K., Hannett N.M., Harbison C.T., Thompson  C.M., Simon  I., Zeitlinger J., Jennings E.G., Murray H.L., Gordon D.B. Ren B., Wyrick J.J., Tagne J.B., Volkert T.L., Fraenkel E., Gifford D.K. and Young R.A. 2002. Transcriptional regulatory networks in Saccharomyces cerevisiae. Science, 298: 799-804.

24. Marx C., Wong J.H. and Buchanan B.B. 2003. Thioredoxin and germinating barley: targets and protein redox changes. Planta, 216: 454–460.

25. Meyer Y., Vignols F. and Reichheld J.P. 2002. Classification of plant thioredoxins by sequence similarity and intron position. Methods in enzymology, 347: 394–402.

26. Mouaheb N., Thomas D., Verdoucq L., Monfort P. and Meyer Y. 1998. In vivo functional discrimination between plant thioredoxins by heterologous expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95: 3312–3317.

27. Qiu P. 2003. Recent advances in computational promoter analysis in understanding the transcriptional regulatory network. Biochemical and Biophysical Research Communications, 309:495–501.

28. Ramji D.P. and Foka P. 2002. CCAAT/enhancer-binding proteins: structure, function and regulation. Biochemical Journal, 365: 561–575.

29. Romualdi C., Bortolzuzz S., Dalessi F. and Danieli G.A. 2003. IDEG6: a web tool for detection of differentially expressed genes in multiple tag sampling expriments.  Physiological Genomics, 12: 159-162.

30. Rushton P.J., Reinstadler A., Lipka V., Lippok B. and Somssich I.E. 2002. Synthetic plant promoters containing defined regulatory elements provide novel insights into pathogen- and wound-induced signaling. Plant Cell, 14:749–762.

31. Sadeghnezhad E., Askari H., Soltani S. and Honarvar F. 2014. Identification and distribution of anaerobic responsive elements (AREs) in genes functional categorization of Arabidopsis thaliana. Journal of Applied Biotechnology Reports, 4: 135-141.

32. Safi H., Saibi W., Alaoui M.M., Hmyene A., Masmoudi K., Hanin M. and Brini F. 2015. A wheat lipid transfer protein (TdLTP4) promotes tolerance to abiotic and biotic stress in Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry, 89: 64-75.

33. Schobert C., Baker L., Szederkenyi J., Grossmann P., Komor E., Hayashi H., Chino M. and Lucas W.J. 1998. Identification of immunologically related proteins in sieve-tube exudate collected from monocotyledonous and dicotyledonous plants. Planta, 206: 245-252.

34. Shamloo-Dashtpagerdi R., Razi H., Aliakbari M., Lindlöf A., Ebrahimi M. and Ebrahimie E. 2015. A novel pairwise comparison method for in silico discovery of statistically significant cis-regulatory elements in eukaryotic promoter regions: Application to Arabidopsis. Journal of Theoretical Biology, 364: 364–376.

35. Shumin Z., Yan C., Hulin S., Bang Z., Licheng S. and Wei Z. 2015. One novel cis-element is essential for correct DYSFUNCTIONAL TAPETUM 1 (DYT1) expression in Arabidopsis thaliana. Plant cell reports, 34: 1773–1780.

36. Skriver K., Olsen F.L., Rogers J.C. and Mundy J. 1991. cis-acting DNA elements responsive to gibberellin and its antagonist abscisic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 88: 7266-7270.

37. Taji T., Seki M., Satou M., Sakurai T., Kobayashi M., Ishiyama K., Narusaka Y., Narusaka M., Zhu J.K. and Shinozaki K. 2004. Comparative genomics in salt tolerance between Arabidopsis and Arabidopsis-related halophyte salt cress using Arabidopsis microarray. Plant Physiology, 135: 1697–1709.

38. Vanderauwera S., Zimmermann P., Rombauts S., Vandenabeele S., Langebartels C., Gruissem W., Inzé D. and Van Breusegem F. 2005. Genome-wide analysis of hydrogen peroxide-regulated gene expression in Arabidopsis reveals a high light-induced transcriptional cluster involved in anthocyanin biosynthesis. Plant Physiology, 139: 806–821.

39. Wang Y., Mopper S. and Hasenstein K.H. 2001. Effects of salinity on endogenous ABA, IAA, JA, and SA in Iris hexagona. Journal of Chemical Ecology, 27: 327–342.

40. Wong J.H., Kim Y.B., Ren P.H., Cai N., Cho M.J., Hedden P., Lemaux P.G. and Buchanan B.B. 2002. Transgenic barley grain overexpressing thioredoxin shows evidence that the starchy endosperm communicates with the embryo and the aleurone. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99: 16325–16330.

41. Winter D., Vinegar B., Nahal H., Ammar R., Wilson G.V. and Provart N.J. 2007. An‘‘electronic fluorescent pictograph’’ browser for exploring and analyzing large-scale biological data sets. PLoS ONE, 8:e718.

42. Xiong L. and Zhu J.K. 2003. Regulation of abscisic acid biosynthesis. Plant Physiology, 133: 29-36.

43. Yanhui  C., Xiaoyuan  Y., Kun  H., Meihua  L., Jigang  L., Zhaofeng  G., Zhiqiang L., Yunfei Z., Xiaoxiao W., Xiaoming Q., Yunping S., Li Z., Xiaohui D., Jingchu L., Xing-Wang D., Zhangliang C., Hongya G. and Li-Jia Q. 2006. The MYB transcription factor superfamily of Arabidopsis: expression analysis and phylogenetic comparison with the rice MYB family. Plant Molecular Biology, 60: 107-124.

44. Zhong H. and McClung C. 1996. The circadian clock gates expression of two Arabidopsis catalase genes to distinct and opposite circadian phases. Molecular and General Genetics, 251: 196–203.

45. Zhong H.H., Young J.C., Pease E.A., Hangarter R.P. and McClung C.R. 1994. Interactions between light and the circadian clock in the regulation of CAT2 expression in Arabidopsis. Plant Physiology, 104: 889–898.