نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه آزاد واحد تهران شمال

2 موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع

3 هیئت علمی دانشگاه آزاد تهران شمال

چکیده

به منظور بررسی اسانس سه گونه مرزه (S. spicigera ,S. rechingeri ,S. macrantha) علیه باکتری های عامل عفونت بیمارستانی و قارچ کاندیدا آلبیکنس، ابتدا از هر سه گونه مرزه فوق دو اکسشن از باغ گیاه شناسی موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور در سال 1391جمع آوری شده و سپس اسانس این گیاهان به روش تقطیر با آب جداسازی گردید.
آنالیز ترکیبات تشکیل دهنده اسانس‌ها توسط دستگاه GC/MS صورت گرفت که نتایج نشان می دهد از اسانس Satureja macrantha و Satureja spicigera٬ 16 ترکیب و از اسانس rechingeri Satureja٬ 15 ترکیب شناسایی شدند. ترکیبات غالب در این اسانس ها Thymol، Carvacrol، p-cymene و Gamma-terpinene بود.
در این آزمایش، رقت اسانس در 3 سطح شامل یک‌پنجم، یک‌بیست‌وپنجم و یک‌پنجاهم بود و مقایسه آنها با آنتی‌بیوتیک‌های سفتی‌زوکسیم و سیپروفلوکسازین و میکروارگانیسم های مورد بررسی نیز در 5 سطح شامل Bacillus subtilis، Staphylococcus aureus، Escherichia coli،Pseudomonas aeroginosa و Candida albicans انجام گرفت.
اثرات ضد میکروبی اسانس های حاصل با استفاده از روش انتشار در آگار در مقابل 5 گونه فوق سنجیده شد. حداقل غلظت بازدارنده (MIC) و حداقل غلظت کشندگی (MBC) اسانس ها با روش میکرودیلوشن اندازه گیری شد. Pseudomonas aeruginosa مقاوم ترین باکتری به این 3 اسانس بود و مخمر Candida albicans نسبت به اسانسها حساستر از باکتری ها بود. اسانس Satureja macrantha بیشترین اثر ضدمیکروبی و اسانس Satureja spicigera کمترین اثر ضدمیکروبی را از خود نشان داد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Evaluation of three Satureja species essential oil (S. macrantha, S. rechingeri, S. spicigera) against bacteria that cause hospital infections and Candida albicans

نویسندگان [English]

  • elmira ehsani 1
  • Fatemeh Sefidkon 2
  • farzaneh Hoseini 3

1 Islamic Azad University

2 Research Institute of Forest and Rangeland, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Tehran, I.R. of Iran

3 Islamic Azad University

چکیده [English]

Abstract:
In order to evaluation of three Satureja species essential oils (S. macrantha, S. rechingeri, S. spicigera) against the bacteria that cause hospital infections and Candida albicans, in the first two accessions of every three species collected in 1391 from The Botanical Garden of Research Institute of Forests and Rangelands, the essential oil was isolated by water distillation .
analyzed constituents of essential oils by GC/MS and the results show the essence of Satureja macrantha and Satureja spicigera, 16 components and essence of the Satureja rechingeri, 15 components were identified. The major compounds in the essential oils were Thymol, Carvacrol, p-cymene and -terpinene.
In this experiment , essence dilution was in three levels including one-fifth, one twenty-fifth and one fiftieth, and compare them with antibiotics (Ciprofloxacin and Ceftizoxime) and micro organisms at 5 levels , including Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans.
The antibacterial activity was determined by disk diffusion method and estimate against five species. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of the essential oils were determined with microdilution. Pseudomonas aeruginosa was the most resistant bacteria and Candida albicans Was more sensitive than bacteria. Satureja macrantha Showed the highest antimicrobial activity and Satureja spicigera showed the lowest antimicrobial activity.

کلیدواژه‌ها [English]

  • S. spicigera
  • S. rechingeri
  • S. macrantha
  • essential oil
  • Antibacterial activity and GC/MS

بررسی اثر اسانس سه گونه مرزه (Satureja spicigera , S.rechingeri , S. macrantha) علیه باکتریهای عامل عفونت بیمارستانی و قارچکاندیدا آلبیکنس

المیرا احسانی1، فاطمه سفیدکن2* و فرزانه حسینی3

1 ساری، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی مازندران 

2 تهران،سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور 

3 تهران، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال، گروه میکروبیولوژی

تاریخ دریافت: 16/2/94                تاریخ پذیرش: 27/2/95

چکیده 

به‌منظور بررسی اثر اسانس سه گونه مرزه (Satureja spicigera ,S. rechingeri ,S. macrantha) علیه باکتریهای عامل عفونت بیمارستانی و قارچ کاندیدا آلبیکنس٬ سرشاخه گلدار دو جمعیت از هر سه گونه مرزه فوق از مزرعه تحقیقاتی باغ گیاه‌شناسی ملی ایران در سال 1391جمع آوری شده و اسانس آنها به روش تقطیر با آب جداسازی شد. آنالیز ترکیبات تشکیل‌دهنده اسانسها توسط دستگاه GC وGC/MS انجام شد. نتایج نشان داد که ترکیبات غالب در همه اسانسها تیمول، کارواکرول، پارا-سیمن و گاما-ترپینن بودند. در این آزمایش، رقت اسانس در 3 سطح شامل یک‌پنجم، یک‌بیست‌وپنجم و یک‌پنجاهم تهیه و مقایسه آنها با آنتی‌بیوتیکهای سفتی‌زوکسیم و سیپروفلوکسازین و میکروارگانیسم‌های مورد بررسی نیز در 5 سطح شامل Bacillus subtilis، Staphylococcus aureus، Escherichia coli،Pseudomonas aeroginosa  و Candida albicansانجام گردید. اثرات ضد میکروبی اسانسهای حاصل با استفاده از روش انتشار از دیسک در مقابل 5 گونه فوق سنجیده شد. حداقل غلظت بازدارنده (MIC) و حداقل غلظت کشندگی (MBC) اسانسها با روش رقیق سازی در محیط مایع اندازه‌گیری شد. Pseudomonas aeruginosaمقاوم‌ترین باکتری به این 3 اسانس بود و مخمر Candida albicansنسبت به اسانسها حساستر از باکتریها بود. اسانس Satureja macranthaبیشترین اثر ضدمیکروبی و اسانسSatureja spicigeraکمترین اثر ضدمیکروبی را از خود نشان داد.

واژه‌های کلیدی: S.spicigera٬S.rechingeri ٬S.macrantha ٬ اسانس٬ اثر ضدمیکروبی و GC/MS

* نویسنده مسئول، تلفن: 02144787279 ، پست الکترونیکی: sefidkon@rifr-ac.ir

مقدمه

 

با وجود تولید آنتی­بیوتیکهای جدید توسط کارخانجات دارویی، به علت افزایش مقاومت به آنتی بیوتیکها در میکروارگانیسم ها و نیز وجود اثرات جانبی مضر داروهای سنتزی، چالش جدی برای مبارزه با بیماریهای عفونی وجود دارد که در نتیجه باعث افزایش تقاضا برای مواد ضد میکروبی جدید شده است (34). گیاهان همواره منبع ارزشمندی از ترکیبات متعدد برای تأمین بهداشت و سلامتی جوامع هم به لحاظ درمان و هم پیشگیری از بیماریها بوده اند. این بخش از منابع طبیعی قدمتی همپای بشر داشته و یکی از مهم ترین منابع تأمین غذایی و دارویی بشر در طول زمان بوده است. مرزه از خانواده نعناعیان، گیاه دارویی است که در طب سنتی از آن برای درمان بیماریهای ریوی، درمان سرفه و کاهش دردهای روماتیسمی و عصبی استفاده می شود. بخشهای هوایی آن دارای ترکیبات متعددی است که منجر به استفاده از آن در صنایع دارویی و غذایی می شود (1). مرزه در مناطق مختلف دنیا از جمله ایران، آذریایجان، ترکمنستان، ترکیه، قفقاز، ماواری قفقازو عراق می روید. این جنس در ایران 15 گونه یکساله و چند ساله دارد که 9 گونه آن انحصاری کشور ایران هستند، شامل S. edmondi، S. Bachtiarica ، S. kallarica ، S. sahandica،S. Khuzestanica ،
S. Isophylla، S. Intermedia،S rechingeri ،
 S. Atropatana و گونه­های S. mutica، S. boissieri ،
S. spicigeraو S. macrantera . گونه های این جنس بیشتر در دامنه های کوهستانی مناطق شمال ، شمال غربی، شمال شرقی ، مرکزی و جنوب غربی ایران پراکندگی داشته و روی صخره های آهکی یا دامنه­های سنگلاخی می‍رویند (6).

مرزه به علت داشتن ترکیبات فنولی در اسانس و ترکیبات تاننی در برگ، دارای خاصیت ضد قارچی، ضد میکروبی، ضد اسپاسم و ضد اسهال می باشد. مطالعات زیادی بر روی ترکیبات اسانس مرزه انجام شده است که نشان می دهد ترکیباتی مانند تیمول، کارواکرول، گاما ترپینن و پاراسیمن در گونه های مرزه جمع آوری شده از عرصه های طبیعی یا گونه های زراعی با نسبتهای مختلف وجود دارد (7 و 32). کارواکرول که ترکیب اصلی اسانس مرزه را تشکیل می‌دهد یک منوترپن فنولی، به صورت مایع بیرنگ و تا اندازه ای چسبناک که در مجاورت نور و هوا تیره می شود. از کارواکرول در تولید محصولات بهداشتی به عنوان یک ضد عفونی کننده، در اسپریهای خوشبو کننده و به عنوان دافع حشرات استفاده می شود. ترکیب کارواکرول درتولید صابون به عنوان خوشبو کننده و ضد­عفونی کننده کاربرد دارد. در تهیه برخی اسانسهای مصنوعی نیز از کارواکرول استفاده می شود (9).

Satureja macranthaگیاهی بوته ای به ارتفاع 30 تا 50 سانتیمتر، از قاعده با انشعابهای زیاد، شاخه ها  نازک و پیچ و تاب دار، پوشیده از کرکهای زبر است. برگها خطی، بدون دمبرگ و زمان گلدهی در پاییز است (3).

S. rechingeriگیاهی چند ساله بسیار معطر، با قاعده چوبی، از قاعده منشعب، ساقه به ارتفاع حدود 50 سانتیمتر، تمام گیاه پوشیده از کرکهای بلند خاکستری رنگ و زمان گلدهی در پائیز است (3).

S. rechingeriبه طور کلی به واسطه گلهای زرد و پرزهای متراکم سفید و غدد ناهموار گسترده در هر دو سطح برگ توصیف می گردد (20).

S. spicigera گیاهی علفی با قاعده چوبی، به ارتفاع 25 تا 60 سانتیمتر، با ساقه های نازک، پیچ و تاب دار و گسترده، با برگهای متراکم و با انشعابهای زیاد از قسمت قاعده است. برگها همگی علفی، در دو سطح برگ به یک رنگ، سبز روشن و زمان گلدهی در پاییز است (3).

مطالعات متعددی بر روی ترکیبات تشکیل دهنده اسانس گونه های مختلف مرزه انجام شده است. سفیدکن و همکاران در سال 2004 با بررسی اسانس سرشاخه گلدار گونه S. specigeraجمع آوری شدهاز استان گیلان، بازده اسانس را 82/3 درصد و ترکیبات اسانس را تیمول (1/35 درصد)، پاراسیمن (1/22 درصد)، گاماترپینن(7/13 درصد) و کارواکرول (0/4 درصد) گزارش کردند (33).

در مطالعه دیگری که بر روی اسانس سرشاخه گلدار گونه S. rechingeriجمع آوری شده از استان ایلام انجام شد، بازده اسانس 72/4-6/2 درصد و ترکیب اصلی آن کارواکرول (89-83%) گزارش شده است (31).

بررسی ترکیبهای موجود در اسانس سه گونه مرزه به نام­های S. mutica،S. intermedia  وS. macrantha نشان داده که اسانس S. muticaبه طور عمده دارای کارواکرول (9/30 درصد) و تیمول (5/26 درصد) و اسانس
S. macranthaدارای پاراسیمن (8/25) و لیمونن (3/16 درصد) و اسانس S. intermedia دارای تیمول (3/32 درصد) و گاماترپینن(3/29 درصد) می باشد (32).

در تحقیق دیگری که بر روی اسانس 20 نمونه وحشی و کشت شده Satureja hortensisانجام شده است، کارواکرول با 63-42 درصد و تیمول با 43-29 درصد اجزای اصلی اسانس بودند (12).

مطالعه بر روی اسانس حاصل از S. hortensisنشان می‍دهد که تیمول نقش مهمی در فعالیت ضدمیکروبی این اسانس دارد (24). ترکیبات اصلی بسیاری از گونه های مرزه تیمول، کارواکرول، پاراسیمن و گاماترپینن گزارش شده است(31). وجود این ترکیبات که اثرات ضد میکروبی آنها ثابت شده است نشان دهنده پتانسیل اسانس این گونه در مقابله با عوامل مولد بیماریهای عفونی است.

فاکر باهر و همکاران (1380) در مطالعه ای نشان دادند که اسانس S. hortensisبه شدت مانع از رشد Staphylococcusaureusو نیز Escherichia coli وPseudomonas aeruginosaمی شود. به نظر می­رسد اثر ممانعت کننده اسانس مرزه علیه Staphylococcus aureusو  Escherichia coliبستگی به مقدار ترکیب گاما -ترپینن دراسانس دارد، درحالی که مقدار کارواکرول در ممانعت از رشد Pseudomonas aeruginosa اهمیت بیشتری دارد (8).

در تحقیقی که به منظور بررسی فعالیت ضد میکروبی عصاره های متانولی و هگزانS. hortensis  انجام شد، فعالیت ضد میکروبی عصاره، برعلیه 55 گونه باکتری و یک مخمر و 4 گونه قارچ، بوسیله روش انتشار دیسک مورد آزمایش قرار گرفتند. نتایج نشان داد که عصاره هگزان، فاقد اثر ضد قارچی بوده ولی مانع رشد گونه های باسیلوس می­شود، در حالیکه عصاره متانولی هم اثر ضد قارچی و هم اثر ضد باکتریایی دارد (30).

بررسی های Skocibusic و Bezic  در سال 2004 بر روی اسانس دو گونه S. Montana و S. cuneifolia نشان داد که روغن مرزه اثرات ضدمیکروبی قوی بر علیه اشرشیاکلی، Staphylococcus aureus مقاوم به متی­سیلین و کاندیدا آلبیکنس دارد، بعلاوه نتایج نشان دهنده اثرات بازدارنده قوی اسانس مرزه در جلوگیری از رشد باکتریهایی مانند  اشرشیاکلی و  Staphylococcus aureus بود. اثرات ضد قارچی اسانس بر علیه C. albicans و S. cerevisiae نیز مشاهده شد. با بررسی ترکیبات تشکیل دهنده اسانس
S. Cuneifolia و S. Montana توسط GC/MS کارواکرول با 7/45 درصد مهمترین ترکیب اسانس شناسایی شد (36).

هدف از این مطالعه بررسی ترکیبات تشکیل دهنده اسانس سه گونه از مرزه Satureja spicigera،  S.rechingeri و
 S. macrantha و وجود اثرات ضدمیکروبی اسانس بر علیه باکتریهای عامل عفونت بیمارستانی و قارچ کاندیدا آلبیکنس و تعیین حداقل غلظت بازدارنده از رشد و کشنده است.

مواد و روشها

جمع آوری گیاه و استخراج اسانس: دو جمعیت از گونه هایS. spicigera , S. rechingeri , S. macranthaاز باغ گیاه شناسی ملی ایران جمع‌آوری شده و در سایه و دمای محیط خشک شدند. بخش مورد استفاده این گیاهان سرشاخه های گلدار گیاه در زمان اوج گلدهی بودند. سپس آنها را مقداری خرد کرده و به روش تقطیر با آب (Hydro distillation) استخراج شدند.

محاسبه شاخص بازداری و شناسایی ترکیبها: برای محاسبه اندیسهای بازداری ترکیبات،آلکانهای نرمال C9–C22 به دستگاه GC تزریق گردید. شناسایی ترکیبها با مطالعه طیفهای جرمی و مقایسه با طیف جرمی ترکیبهای استاندارد، با استفاده از اطلاعات موجود در کتابخانه ترپنوئیدها در رایانه و به کمک شاخصهای بازداری محاسبه شد و مقایسه آنها با شاخصهای بازداری استاندارد که در منابع مختلف منتشرگردیده، انجام شد. محاسبات کمی (تعیین درصد هر ترکیب) به کمک داده پردازR3A–Chromatepac به روش نرمال کردن سطح (Area normalization method) ونادیده گرفتن ضرایب پاسخ (Response factors) مربوط به طیفها انجام شد.

مشخصات دستگاه مورد استفاده: مشخصات گاز کروماتوگرافی (GC) : کروماتوگراف گازی مدل Shimadzu – 9A مجهز به دتکتورF.I.D (یونیزاسیون شعله هیدروژن) و داده پرداز Chromatepac استفاده شد. ستون دستگاه DB–5 به طول 30 متر، قطرداخلی 25 میکرون وضخامت لایه فاز ساکن برابر 25/0 میکرون بود. سرعت جریان گاز حامل هلیم cm/s 7/22 بود. دمای محفظه تزریق 265 درجه سانتی‌گراد، برنامه ریزی حرارتی ستون از دمای اولیه 50 درجه سانتیگراد تا دمای نهایی 250 درجه سانتی گراد که در هر دقیقه 4 درجه سانتی گراد به آن افزوده شد.

دستگاه GC/MS: کروماتوگراف گازی Varian-3400متصل شده با طیف سنج جرمی (saturn II)، ستون دستگاه DB-5 به طول 30 متر قطر داخلی 25 میکرون و ضخامت لایه فاز ساکن برابر 25/0 میکرون بود. دتکتور""Ion Trap گاز حامل هلیم٬ سرعت جریان گاز حامل ml/min35 و انرژی یونیزاسیون در طیف سنج جرمی برابر 70 الکترون ولت بود. برنامه­ حرارتی ستون از60 درجه سانتی گراد تا 240 درجه سانتی گراد با سرعت 3 درجه سانتی گراد در دقیقه تنظیم شد. دمای محفظه تزریق 220 درجه سانتی گراد بود.

 

جدول 1- میکروارگانیسم‌های مورد استفاده در این تحقیق

باکتری‌های گرم مثبت

باکتری‌های گرم منفی                                                     قارچ

                      Staphylococcus aureus

Escherichia coli                                 Candida albicans

                        Bacillus subtilis

                                           Pseudomonas aeruginosa


بررسی اثرات ضدباکتریایی: میکروارگانیسم­های فوق از کلکسیون میکروبی مرکز پژوهشهای علمی صنعتی ایران تهیه شدند. به کمک دو روش انتشار از دیسک (Disk Diffusion method) و روش رقیق سازی در محیط مایع (Microbroth dilution method) اثرات ضدباکتریایی اسانسها بررسی شد (جدول 1).

در روش انتشار از دیسک ((Disk Diffusion method از کشت 24 ساعت باکتریها در محیط کشت Tryptic SoyAgar (ساخت شرکت مرک) سوسپانسیونی با رقت برابر استاندارد 1 مک فارلند (cfu/ml8 10 ×3) در محیط کشت Tryptic Soy Broth تهیه شد. سپس 5/0 میلی لیتر از سوسپانسیون هریک از میکروارگانیسم­ها به محیط کشت جامد منتقل و با سواپ استریل به شکل یکنواخت پخش شدند. اسانس­ها به نسبت­های یک پنجم (1:5)، یک بیست­ و­پنجم (1:25) و یک پنجاهم (1:50) رقیق و30 میکرولیتر بر روی دیسکهای کاغذی استریل بلانک 6 میلی­متر (ساخت شرکت پادتن طب) قرار داده شده و بر روی پلیتهای کشت­شده قرار گرفتند. برای رقیق کردن اسانسها از دی متیل سولفوکساید که فاقد اثر ضد­میکروبی است، استفاده شد. از آنجا که اسانس روغنی است و بر روی سطح محیط کشت به صورت یکنواخت پخش نمی شود، حلالDMSO  مورد استفاده قرار گرفت. پلیتها در 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور قرار داده شدند و پس از 24 ساعت هاله عدم رشد اندازه گیری شد. آزمایش تعیین اثر ضدباکتریایی با 3 تکرار انجام شد و متوسط فعالیت ضدمیکروبی گزارش شده است. برای مقایسه فعالیت ضدمیکروبی اسانسها از دیسکهای سفتی‌زوکسیم (μg 30) و سیپروفلوکسازین (μg 5) استفاده شد که از شرکت پادتن طب تهیه شده بودند.

روش رقیق سازی در محیط مایع (Microbroth dilution method): حداقل غلظت مهار یا بازدارندگی رشد (MIC) و حداقل غلظت کشندگی (MBC) برای میکروارگانیسم های مورد نظر با استفاده از روش رقیق سازی در محیط مایع تعیین شد. رقیق کردن اسانسها در محیطTryptic Soy  Broth به نحوی که بالاترین غلظت مورد نظر µg/ml256 باشد. از این غلظت 6 رقت متوالی تهیه شد، به نحوی که آخرین غلظت  µg/ml8 بود. در تمام چاهکها 100 میکرولیتر TSB ریخته شد.

انتقال 100 میکرولیتر اسانس به چاهک اول و پس از پیپتینگ انتقال 100 میکرولیتر از آن به چاهک بعدی و پس از پیپتینگ دوباره، این کار برای چاهکهای بعدی انجام شد و در نهایت از چاهک آخر (رقت ششم) 100 میکرولیتر دور ریخته شد. بنابراین به ترتیب از چاهک اول تا آخر غلظت اسانس 256، 128، 64، 32، 16 و µg/ml8 بود. به تهیه سوسپانسیون میکروبی با غلظتی برابر 5/0 مک فارلند از کشت 24 ساعت میکروارگانیسمها که در محیطTryptic  SoyBroth رقیق شدند، سوسپانسیون میکروبی به میزان 10 میکرولیتر به هر 6 چاهک اضافه شد.

پلیتها در 37 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت گرمخانه گذاری شدند. برای هر باکتری یک چاهک کنترل منفی(حاوی محیط کشت) و یک چاهک کنترل مثبت (حاوی محیط کشت و باکتری مورد نظر) در نظر گرفته شد. بعد از 24 ساعت ابتدا چاهک کنترل منفی بررسی می‍شد٬ این چاهک باید کاملا شفاف باشد. غلظت اولین چاهک بدون کدورت حاصل از رشد باکتری٬ به عنوان MIC در نظر گرفته می شود. برای تعیین MBC٬ 100 میکرولیتر از هر چاهک بدون کدورت در یک پلیت Tryptic Soy Agar کشت چمنی داده می شود و پلیتها به مدت زمان یکسان در تمام آزمایشها گرمخانه گذاری می‌شوند. تعداد کلنیها پس از 24 ساعت گرمخانه گذاری 37 درجه سانتی گراد شمرده شده، پلیتی که حاوی کمتر و یا دارای 5 کلنی باشد به عنوان MBC در نظر گرفته شده و غلظت اسانس موجود در چاهک مربوطه  به عنوان MBC گزارش می شود (26).

نتایج

شناسایی ترکیب­های اسانس­ها: از اسانس
Satureja macrantha٬ 16 ماده جداسازی شد که تیمول(1/39 درصد) بیشترین ترکیب جداسازی شده از این اسانس بود. دومین ماده‌ای که بالاترین مقدار را داشت، پاراسیمن(1/25 درصد) وسومین ماده گاماترپینن(0/21 درصد) بود و کمترین مقدار مربوط به آلفافلاندرن (2/0 درصد) بود.

از اسانسSatureja rechingeri ٬ 15ماده جداسازی شد که کارواکرول(2/85 درصد) بیشترین ماده جداسازی شده از این اسانس بود. دومین ماده‌ای که بالاترین مقدار را داشت، پاراسیمن(1/3 درصد) وسومین ماده گاماترپینن(7/1 درصد) و کمترین مقدار مربوط به آلفافلاندرن (1/0 درصد) بود.

از اسانس Satureja spicigera٬ 16 ماده جداسازی شد که تیمول(7/46 درصد) بیشترین ماده جداسازی شده از این اسانس بود. دومین ماده‌ای که بالاترین مقدار را داشت پاراسیمن(8/18 درصد) و سومین ماده گاماترپینن(9/12 درصد) بود و کمترین مقدار مربوط به آلفافلاندرن(2/0 درصد) بود (جدول 2).

تعیین اثرات ضدمیکروبی اسانسها: در اسانس
Satureja macrantha  بیشترین هاله عدم رشد در رقت 1:5 در Bacillus subtilisوکمترین هاله عدم رشد در هر سه رقت در Pseudomonas aeruginosaمشاهده شد. در اسانس Satureja rechingeriبیشترین هاله عدم رشد در رقت 1:5 و 1:25 در Candida albicansوکمترین هاله عدم رشد در هر سه رقت در Pseudomonas aeruginosaمشاهده شد و در اسانس Satureja spicigera بیشترین هاله عدم رشد در رقت 1:5 و 1:50 در Candida albicansوکمترین هاله عدم رشد در هر سه رقت در Pseudomonas aeruginosaمشاهده شد (جدول 3). 

 

جدول 2- ترکیبات شناسایی شده در سه گونه مرزه مورد تحقیق

ردیف

نام ترکیب

شاخص بازداری (RI)

درصد

Satureja macrantha

درصد

Satureja

rechingeri

درصد

Satureja spicigera

1

α-pinene

937

3/1

3/0

5/0

2

β-pinene

984

2/0

_

_

3

α –thujene

930

_

4/0

 

4

Myrcene

989

0/2

0/1

6/1

5

α-phellandrene

1002

2/0

1/0

2/0

6

α-terpinene

1013

5/1

3/0

5/1

7

p-cymene

1021

1/25

1/3

8/18

8

Limonen

1026

5/0

_

_

9

g-terpinene

1058

0/21

7/1

9/12

10

P-mentha-3,8-diene

1072

3/0

_

_

11

Borneol

1165

8/0

5/0

4/0

12

Terpinene-4-ol

1175

5/0

4/0

3/0

13

Thymol

1290

1/39

3/1

7/46

14

Carvacrol

1295

5/3

2/85

9/7

15

E-carryophyllene

1417

8/0

4/0

9/2

16

Spathulenol

1575

6/0

_

4/0

17

Carryophyllene oxide

1589

3/0

_

_

18

1,8-cineole

1029

-

4/0

7/0

19

Terpinolene

1080

_

9/0

4/0

20

Germacerene D

1483

_

9/0

2/0

21

Methyl ether thymol

1234

_

_

0/2


نتایج MIC و MBC نشان داد که اسانس
Satureja macrantha روی Escherichia coli و
Bacillus subtilisو Candida albicans(μg/ml16-8)٬ روی Staphylococcus aureus(μg/ml16) و رویPseudomonas aeruginosa(μg/ml>256- 128) اثر ضدمیکروبی نشان داد. اسانسSatureja rechingeri  روی Candida albicans(μg/ml16-8)٬ روی
Bacillus subtilis(μg/ml16) ، روی
Escherichia coli وStaphylococcus aureus(μg/ml32-16) و روی Pseudomonas aeruginosa(μg/ml>256- 128) اثر ضدمیکروبی نشان داد.

همجنین اسانسSatureja spicigera  روی
Candida albicans(μg/ml16-8)، روی  Ecoliو Bacillus subtilis(μg/ml32-16)، روی
Staphylococcus aureus(μg/ml64-32) و روی Pseudomonas aeruginosa(μg/ml>256- 128) اثر ضدمیکروبی نشان داد ( جدول 4).

نتایج تحقیق حاضر به این صورت بررسی گردید که Pseudomonas aeruginosa مقاوم ترین باکتری به این 3 اسانس بود. قارچ Candida albicansحساس‌تر از باکتریها به این 3 اسانس بود. اسانس Satureja macrantha بیشترین اثر ضدمیکروبی را از خود نشان داد. اسانس
Satureja spicigeraکمترین اثر ضدمیکروبی را از خود نشان داد.

تعیین مقدار MIC و MBC اسانس‌ها در مقابل میکروارگانیسم‌های مورد آزمایش به روش میکرودیلوشن انجام گرفت.

 

جدول 3- میانگین هاله عدم رشد اسانسها علیه میکروارگانیسم­ها در غلظتهای مختلف برحسب میلی متر

1:50

1:25

1:5

اسانس

میکروارگانیسم

7/13 ±58/0

7/13 ±58/0

3/19±15/1

23 ±4

7/51±58/12

37 ±41/1

 Saturejamacrantha جمعیت1

Saturejamacrantha  جمعیت2  

E. coli

7/ 14 ±53/1

11±1

7/23  ±53/1

7/17  ±58/0

7/38±73/4

3/35   ±05/3

Satureja rechingeri  جمعیت1

Satureja rechingeri  جمعیت2  

E. coli

12±1

3 /13  ±08/2

3/20±53/1

7/18±15/1

3/42±51/3

7/36±09/7

Satureja spicigera  جمعیت1

Satureja spicigera  جمعیت2

E. coli

13  ±0

7/11   ±53/1

20 ± 1

19    ±73/1

39 ±1

7/35  ±13/5

Saturejamacrantha جمعیت1

Saturejamacrantha  جمعیت2  

S. aureus

7/11   ±58/0

7/10   ±58/0

7/21 ±  53/1

7/14 ±  53/1

7/31 ±51/3

28±1

Satureja rechingeri  جمعیت1

Satureja rechingeri  جمعیت2  

S. aureus

3/11   ±58/0

12  ±1

7/ 17 ±  08/2

 3/17 ±  53/1

 30 ±2

3/30 ±79/3

Satureja spicigera  جمعیت1

Satureja spicigera  جمعیت2

S. aureus

7/9±58/0

9±0

11±1

11±0

20   ±1

7/20  ±53/1

Saturejamacrantha  جمعیت1

Saturejamacrantha  جمعیت2

P. aeruginosa

3/9  ± 58/0

3/9±58/0

3/9±58/0

7/9  ±58/0

7/9  ±58/0

7/9   ±58/0

Satureja rechingeri  جمعیت1

Satureja rechingeri  جمعیت2

P. aeruginosa

7/9±58/0

9±0

3/10±58/0

  10  ± 1

3/15  ±15/1

3/16  ±15/1

Satureja spicigera  جمعیت1

Satureja spicigera  جمعیت2

P. aeruginosa

3/ 13  ±53/1

3/11 ±15/1

3/23± 52/2

20  ±2

54±55/7

40±1

Saturejamacrantha  جمعیت1

Saturejamacrantha  جمعیت2

B. subtilis

3/13  ±  21/3

10±0

7/23±37/7

7/19±58/0

3/40±77/5

42±4

Satureja rechingeri  جمعیت1

Satureja rechingeri  جمعیت2

B. subtilis

7/13 ±58/0

3 /12 ±15/1

7/20±53

20   ±65/2/1

 36±29/5

37±57/5

Satureja spicigera  جمعیت1

Satureja spicigera  جمعیت2

B. subtilis

3/12±53/1

3 /13±53/1

20 ±2

25 ±2

3 /49    ±58/0

3/38±23/7

Saturejamacrantha  جمعیت1

Saturejamacrantha  جمعیت2

C. albicans

14±1

7/10±58/0

3/24 ±31/2

20 ±73/1

48    ±65/2

47   ±65/2

Satureja rechingeri  جمعیت1

Satureja rechingeri  جمعیت2

C. albicans

7/13±58/0

7/ 13±15/1

3/24 ±51/3

3/19 ±05/3

7/49±04/4

3/40±08/2

Satureja spicigera  جمعیت1

Satureja spicigera  جمعیت2

C. albicans

جدول 4- تعیین مقدار MIC و MBC در سه گونه مرزه مورد تحقیق علیه میکروارگانیسم‌ها برحسب µg/ml

میکروارگانیسم

 

MIC

اکسشن1

MBC

اکسشن1

MIC

اکسشن2

MBC

اکسشن2

E. coli

S. macrantha

S. rechingeri

S. spicigera

8

16

16

16

16

16

16

16

32

16

32

32

S. aureus

S. macrantha

S. rechingeri

S. spicigera

16

16

32

16

16

32

16

32

32

16

32

64

 P. aeruginosa

S. macrantha

S. rechingeri

S. spicigera

128

128

128

128

256

256

>256

256

>256

>256

>256

>256

B. subtilis

S. macrantha

S. rechingeri

S. spicigera

8<

16

16

8<

16

16

8

16

16

16

16

32

C. albicans

S. macrantha

S. rechingeri

S. spicigera

8

8

8

8

8

16

16

16

16

16

16

16


بحث

آنتی بیوتیکها داروهای ارزشمندی برای درمان بسیاری از بیماریهای انسانی می باشند، با این حال استفاده بیش از حد این داروها مقاومتهای میکروبی را در پی خواهد داشت. بنابراین دانشمندان تحقیقات بر روی قسمتهای مختلف گیاهان دارویی، برای کشف داروهای جدید با منشأ گیاهی را در اولویت قرار داده اند (2 و 11). با شناسایی ترکیبات موجود در هر اسانس می‌توان به این نکته پی برد که بین ترکیبات موجود در هر اسانس و خواص ضد میکروبی آن رابطه مستقیمی وجود دارد. برخی از محققان ارتباط بین ساختارهای شیمیایی برخی از اجزای غالب موجود در اسانسها را با فعالیت ضدباکتریایی آنها گزارش کرده‌اند. اسانسها دارای ترکیبهای فنولی مانند تیمول، کارواکرول، گاماترپینن و پاراسیمن هستند که خاصیت ضدباکتریایی شدید آنها گزارش شده است (13).

همچنین Ulte و همکاران در سال 2002 اظهار نمودند که گروه هیدروکسیل موجود در مولکول اجزای اسانس مانند کارواکرول، تیمول، پاراسیمن و منتول برای بروز خاصیت ضدباکتریایی آنها بسیار مهم است (40).

علاوه برترکیبات فوق، در تحقیقات انجام شده از سوی سایر محققان ترکیباتی مانند آلفاپینن، لیمونن، ترپینن 4 ال، اسپاتولنول، جرماکرنB، دلتاکادینن، کامفور، آلفاترپینئول، ژرانیل استات و ژرانیول هم اثرضد میکروبی­شان اثبات شده و 1و8 سینئول نیز روی قارچها اثرضدمیکروبی دارد.

طبق نتایج به دست آمده از این تحقیق، ترکیبات جداسازی شده از اسانس Satureja macrantha٬شامل تیمول (1/39 درصد)، پاراسیمن (1/25 درصد)، گاماترپینن (0/21 درصد)، کارواکرول (5/3)، آلفاپینن (3/1)، لیمونن (5/0)، ترپینن 4 ال (5/0) و اسپاتولنول (6/0) بود. در اسانسSatureja rechingeri ٬ ترکیبات کارواکرول (2/85 درصد)، پاراسیمن (1/3 درصد)، گاماترپینن (7/1 درصد)، تیمول (3/1)، آلفاپینن (3/0)، 1و8 سینئول (4/0) وترپینن 4 ال (4/0) یافت شد. همچنین ترکیبات جداسازی شده از اسانس specigeraSatureja، شامل تیمول (7/46 درصد)، پاراسیمن (8/18 درصد)، گاماترپینن (9/12 درصد)، کارواکرول (9/7)،آلفاپینن (5/0)، 1و8 سینئول (7/0)،ترپینن4 ال (3/0) واسپاتولنول (4/0) بود. بنابراین اسانس Satureja macrantha با در نظرگرفتن مجموع اثر ترکیباتش دارای اثر ضدمیکروبی بیشتری نسبت به اسانسSatureja rechingeriو specigera Saturejaاست وطبق دو آزمون میکروبی انجام شده نیز اثر ضدمیکروبی بیشتری دارد. برهمین اساس Satureja rechingeriهم نسبت بهSatureja specigera  اثر ضدمیکروبی بیشتری دارد.

در تحقیقات سفیدکن وهمکاران (2004)، سرشاخه گلدار گونهS. Specigera  ازاستان گیلان جمع آوری و به روش تقطیر با آب اسانس گیری شد. بازده اسانس 82/3 درصد واجزای اسانس شامل تیمول (1/35 درصد)،پاراسیمن (1/22 درصد)،گاماترپینن(7/13 درصد) وکارواکرول (0/4 درصد) بوده است. در نتایج بدست آمده از تحقیق انجام شده در گونه S. specigera بازده اسانس 74/1 درصد و ترکیبات اسانس شامل تیمول (7/46 درصد)، پاراسیمن (8/18 درصد)، گاماترپینن (9/12 درصد) و کارواکرول (9/7 درصد) بوده است (33).

در تحقیقات سفیدکن و همکاران (2007)، بازده اسانس سرشاخه گلدار گونه  S. rechingeriاز استان ایلام، 72/4-6/2 درصد و ترکیب اصلی آن کارواکرول (89-83 درصد) بود. ترکیبات اصلی بسیاری ازگونه های مرزه، تیمول، کارواکرول، پاراسیمن و گاماترپینن گزارش شده است. در این تحقیق نیز بازده اسانس S. rechingeri(13/3 درصد) و ترکیب اصلی آن کارواکرول (2/85 درصد) و سایر ترکیبات اصلی تیمول، پاراسیمن و گاماترپینن بود (31).

در تحقیقات سفیدکن و جمزاد (2005)، بررسی ترکیبهای موجود در اسانس سه گونه مرزه به نام هایS.mutica،
S.  intermediaو S. macranthaنشان داده که اسانس
S. muticaبه طور عمده دارای کارواکرول (9/30 درصد) و تیمول (5/26 درصد) و اسانس S. macranthaدارای پاراسیمن (8/25) و لیمونن (3/16 درصد) و اسانس
 S. intermediaدارای تیمول (3/32 درصد) و گاماترپینن (3/29%) می باشد. در تحقیق ما نیز اسانس S. Macranthaدارای تیمول (1/39 درصد)، پاراسیمن (1/25 درصد) و گاماترپینن(0/21 درصد) بوده است (32).

تحقیقی توسط حیدری و همکاران (1390) به منظور بررسی اثر رژیم غذایی و سطوح مصرف اسانس
S. hortensisبر جمعیت میکروبی ایلئوم و بستر جوجه های گوشتی، مقاومت آنتی بیوتیکی و تأثیر ضدمیکروبی اسانس در مقابل جدایه های E.coliانجام شد. در ارزیابی تأثیر ضدمیکروبی این اسانس، نتایج حاصل از اندازه گیری قطر هاله عدم رشد غلظتهای مختلف اسانس نشان داد که اثر بازدارندگی غلظتهای بالاتر، قوی­تر می­باشد. در این بررسی، آزمون ضد­میکروبی اسانس نشان داد که این گونه از نظر مهارکنندگی رشد (MIC) و کشندگی باکتریهای مورد نظر (MBC) بسیار قوی بوده که به دلیل وجود کارواکرول موجود در این اسانس می­باشد. طبق نتایج تحقیق حاضر نیز، هاله عدم رشدE.coli   7/51-3/35 میلیمتر و (MIC) و ((MBC،32-8  µg/ml بود که نشان از قدرت ضدمیکروبی اسانس مرزه روی این باکتری دارد (4).

در تحقیقی دیگر توسط سفیدکن و همکاران (1388)، اثر اسانس سه گونه مرزه S. bachtiarica ,S. muticaو S.edmondi علیهSalmonella paratyphi A , Bمورد مطالعه قرارگرفت. نتایج حاصل نشان از قدرت مهارکنندگی و میکروب­کشی بالای اسانسهای فوق داشت. بنابراین به نظر می­رسد حضور تیمول، کارواکرول، پاراسیمن و گاماترپینن در اسانسهای مورد مطالعه می­تواند باعث وجود خواص ضدمیکروبی در آنها باشد. در تحقیق حاضر نیز این­چهار ترکیب، بیشترین مقدار را به خود اختصاص دادند (5).

همان گونه که ملاحظه می­شود شباهتها و تفاوتهایی بین نتایج این تحقیق با تحقیقات قبلی وجود دارد که ناشی از تفاوت گونه ها و محل جمع آوری نمونه های گیاهی و تأثیر شرایط اقلیمی می باشد.

از طرف دیگر بررسی نتایج نشان می‌دهد که باکتریهای گرم مثبت در مقایسه با انواع گرم منفی حساسیت بیشتری به هر دو نوع اسانس نشان می‌دهند که این موضوع با یافته های دیگران مبنی بر حساسیت بیشتر باکتریهای گرم مثبت از جمله Ouattara(1997)، Shelef(1980) و نیز Agaogolu (2007) مطابقت دارد  (10، 28 و 35).

اختلاف در حساسیت بین باکتریهای گرم مثبت و منفی را می‌توان با تفاوت در ترکیبات دیواره سلولی و نیز ﮊنهای احتمالی موجود بر روی پلاسمید که عامل مقاومت به عوامل ضدمیکروبی هستند، توضیح داد. باکتریهای گرم منفی به علت داشتن دیواره لیپوپلی ساکاریدی خارجی به عنوان یک سد در برابر ذرات سمی عمل می­کند (17).

Kalemba و Kunicka (2003) گزارش کردند که به ترتیب فنولها، آلدئیدها، کتونها، الکل‌ها، استرها و هیدروکربنها دارای فعالیت ضدمیکروبی قوی‌تر و بیشتری می‌باشند و همچنین عنوان کردند که حالت لیپوفیلیک اسکلت هیدروکربنی و حالت هیدروفیلیک گروههای عملکردی آنها اهمیت اصلی را در فعالیت ضدمیکروبی ذرات اسانس دارا می­باشند (22).

ذرات با حلقه های سیکلوهگزان ایزوپروپیل- متیل یا حلقه سیکلوهگزان اشباع نشده فعالیت ضدباکتریایی را افزایش می­دهد (19).

تحقیقات روی هیدروکربنهای منوترپن مثل سابینن و لیمونن انجام شده و همه این تحقیقات فعالیت ضدمیکروبی متوسط تا قوی را در برابر باکتریهای گرم مثبت و قارچهای بیماریزا نشان دادند (11، 14، 21، 36، 37 و 38).

Haznedaroglu و همکاران (2001) وTepe و همکاران (2005) اثر این هیدروکربنهای منوترپن را در برابر باکتریهای گرم منفی سنجیدند و مشاهده کردند که فعالیت ضدمیکروبی ضعیفی را در برابر باکتریهای گرم منفی از خود نشان دادند (18 و 39). 

طبق آزمایشهای انجام شده توسط Lis Balchin و همکاران (1999) لیمونن فعالیت قوی در برابر باکتریها و قارچها نشان داد (23).

فعالیت ضدمیکروبی آلفاپینن در برابر استافیلوکوکوس اورئوس، استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس وپروپیونی باکتریوم توسط Raman و همکاران (1995) مشخص شد (29).

Dorman وDeans(2000) گزارش کردند که حضور بخشی از استات در ترکیبات اسانس فعالیت ذرات اصلی را افزایش می­دهد. ژرانیل استات و ژرانیول افزایش فعالیت ضدمیکروبی را در برابر میکروارگانیسم‌ها نشان داده‌اند. طبق آزمایشهای آنان بورنیل استات و بورنئول قدرت یکسانی دارند ولی بورنئول از بورنیل استات فعالیت کمتری نشان داد و فقط بورنیل استات است که روی میکروکوکوس لوتئوس اثر می­گذارد. همچنین نتایج آنان نشان داد که آلفاپینن روی سراشیا مارسسنس، سودوموناس آئروژینوزا، باسیلوس سوبتیلیس و انتروباکترآئروژنز اثرممانعت کنندگی رشد ندارد و دربقیه باکتریهای موردآزمایش اثرکمی (هاله عدم رشدکوچک) را نشان داد. دلتا-3-کارن فقط در برابر سیتروباکترفروندی اثر ممانعت کنندگی نداشت و روی بقیه باکتریها اثرضدمیکروبی متوسطی را نشان داد. اثرات ضدمیکروبی دلتا-3-کارن در این آزمایش بیشتر از آلفاپینن گزارش شد. این نتایج همچنین نشان داد که آلفاپینن اثر ضدقارچی و نیز اثر ضدباکتریایی روی استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس دارد (15).

معمولا ترکیبات اصلی مسئول اثرات ضدمیکروبی در بیشتر اسانسها هستند، هرچند تحقیقاتی انجام شده که نشان‌دهنده فعالیت سینرژیکی ترکیبات مختلف اسانسها با غلظت کم و زیاد بر روی باکتریها می‌باشد(13، 16، 25 و 28).

تحقیقات Onawunmi وهمکاران (1984) مشخص کرد که میرسن با فعالیت سینرژیکی که با ذرات دیگر اسانس دارد در مقابل باکتریهایStaphylococcus aureus،
Bacillus subtilis،Pseudomonas  aeruginosaوگونه های خاصی از Ecoliدر اثر ضدمیکروبی اسانس همکاری می­کند (27).

طبق یافته­های این تحقیق،اسانس Satureja macranthaبیشترین اثر ضدمیکروبی و اسانس Satureja spicigeraکمترین اثر ضدمیکروبی را از خود نشان داد.

این نتایج پیشنهاد می کند که اسانس Satureja macrantha با خاصیت ضدباکتریایی قوی ای که دارد می تواند بعنوان عامل ضدباکتریایی در داروهای جدید برای درمان بیماریهای عفونی استفاده شود.

سپاسگزاری

با تشکر از کلیه همکارانی که ما را در اجرای این طرح یاری کردند، ‌به ویژه از مسئولان محترم مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور و از جناب آقای دکتر مهدی میرزا برای تهیه طیف ها و آنالیز GC/MS و همچنین سرکار خانم دکتر  مریم تیموری و سرکار خانم مهندس فاطمه عسکری صمیمانه سپاسگزاری می نمایم. 

1-      امید بیگی، ر.1379. رهیافتهای تولید و فرآوری گیاهان دارویی، جلد2، چاپ 2، انتشارات طراحان نشر.

2-      بکائیان، م. فرازمند، ر. کی قبادی، س. سعیدی، س.، 1394.بررسی اثر ضدمیکروبی عصاره اتانولی سیر (alliumsativum) بر روی سویه­های استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به آنتی بیوتیک­های مختلف، 28(1): 34-41.  

3-      جم زاد٬ ز.، 1388. آویشن ها و مرزه های ایران، انتشارات موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور،171 صفحه.

4-      حیدری،ا. دخیلی رنجو،م.ذوالفقاری،م.، بهار1390. بررسی تاثیر ضدمیکروبی اسانس گیاه مرزه (.Saturejahortensis L) بر جدایه های E.coliروده جوجه های گوشتی، پژوهش های علوم گیاهی، 6 (1 (پیاپی 21)): 25-35.

5-      سفیدکن، ف. عسکری، ف. صادق زاده، ل و اولیا، پ.، 1388. بررسی تاثیر اسانس سه گونه مرزه (Satureja mutica ،S. edmondiوS. bachtiarica) بر سالمونلا پاراتیفی، زیست شناسی ایران، 22(2): 249-258.

6-      سفیدکن، ف. صادق زاده، ل. تیموری، م. عسگری، ف و احمدی، ش (1386)، بررسی اثرات ضد میکروبی اسانس دو گونه مرزه Satureja bachtiarica BungeوSatureja khuzistanica Jamzadدر دو مرحله برداشت، فصلنامة علمی- پژوهشی تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 23 (2): 26-18.

7-      سفیدکن، ف.، جمزاد، ز. و برازنده، م.، 1383. اسانس Satureja bachtiarica Bungeبه عنوان منبعی غنی از کارواکرول. تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 20(4) : 425-440.

8-      فاکر باهر، ز.، رضایی، م.ب.، میرزا، م. و عباس زاده، ب .، 1380. بررسی تغییرات کمی و کیفی اسانس مرزه(S. hortensis L.). تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 11 : 37-51.

9-      میرزا، م. سفیدکن، ف و احمدی، ل.، 1375. اسانسهای طبیعی، استخراج، شناسایی کمی و کیفی، کاربرد، انتشارات مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور، 205 صفحه.

 

10-   Agaogolu, S., Dostbil, N and Almedar, S. 2007,  Antimicrobial activity of some spices used in meat industry Bull Vet Inst Pulawy 51,  53-57.

11-   Al-Burtamani,  S.K.S.,  Fatope,  M.O.,  Marwah, R.G., Onifade, A.K and Al-Saidi,  SH. 2005,  Chemical composition,  antibacterial and antifungal activities of the essential oil of Haplophyllum tuberculatum from Oman. J Ethnopharmacol 96:107-112.

12-   Baser, K.H.C., Ozek, T., Kirimer, N.and Tumen, G., 2004. A comparative study of  the essential oils of  wild and cultivated Satureja hortensis L. Jornal of  Essential Oil Research, 16(5): 422-424.

13-   Burt, S.2004, Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods—a review.Int J Food Microbiol.94:223-253.

14-   Delaquis,  PJ.,  Stanich,  K.,  Girard,  B.,  Mazza, G. 2002,  Antimicrobial activity of individual mixed fractions of dill,  Cilantrol,  coriander and eucalyptus essential oils. Int J Food Microbiol 74:101-109.

15-   Dorman, HJD., Deans, SG.2000,  Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils. J Appl Microbiol 88:308-316.

16-   Filipowicz, N., Kaminski, M., Kurlenda, J., Asztemborska, M and Ochocka, R.2003,  Anti- bacterial and Antifungal Activity of Juniper Berry Oil and its Selected Components. Phytother. Res.17, 227–231.

17-   Glisic, S.B., Milojevic, S.Z., Dimitrijevic, S.I., Orlovic, A.M. and Skala, D.U.2007,  Anti- microbial activity of the essential oil and different fractions of Juniperus Communis L. and a comparison with some commercial antibiotics. J.Serb.Chem.Soc.72:311-320.

18-   Haznedaroglu, MZ., Karabay, U., Zeybek, U.2001,  Antibacterial Activity of Salvia tomentosa Essential Oil,  Fitoterapia 72:829-831.

19-   Hinou,  J.B.,  Harvala,  C.E.,  Hinou,  E.B.1989,  Antimicrobial activity screening of 32 common constituents of Essential Oils. Die Pharmazie 44,  4,  p.302-303.

20-   Jamzad, Z.1994: A new species of  the genus Satureja (Labiatae) from  Iran. Iran .J. Bot. 6, 2 : 215-218

21-   Jirovetz, L., Buchbauer, G., Stoyanova, AS., Georgiev, EV., Damianova, ST.2003, Compos-ition,  quality control,  and antimicrobial activity of the essential oil of long-time stored dill (Anethum graveolens L.) seeds from Bulgaria.J Agric Food Chem.51:3854-3857.

22-   Kalemba, D., Kunicka, A.2003, Antibacterial and antifungal properties of essential oils. Curr Med Chem.10:813-829.

23-   Lis-Balchin, M., Ochocka, JR., Deans, S.1999, Differences in Bioactivity between the Enantiomers of "-Pinene.J Essent Oil Res 11: 393–397.

24-   Mahboubi, M., Kazempour, N., December 2011.Chemical composition and antmicrobial activity of Satureja hortensis and Trachyspermum copticum essential oil.Iranian journal of microbiology, Volume 3 Number 4  194-200.

25-   Mastelic, J., Politeo, O., Jerkovic, I., Radosevic, N.2005, Composition and antimicrobial activity of Helichrysum italicum essential oil and its terpene and terpenoid fractions.Chem Nat Comp 41:35-40.

26-   Murray, P.R., Jo Baron,  E.,  Jorgensen,  J.,  Pfaller,  M.A.,  Landry,  M.L.2007, Manual of Clin- ical Microbiology,  ASM press.

27-   Onawunmi, G.O., Yisak, W.A  and Ogunlana,  E.O. 1984,  Antibacterial constituents in the essential oil of Cymbopogon citratus (DC.) Stapf.J Ethnopharmacol 12(3):279-86.

28-   Ouattara, B., Simard, R.E., Holley, R.A., Piette, G.J.P., Begin, A.1997, Antibacterial activity of selected fatty acids and essential oils against six meat spoilage organisms.Int J Food Microbiol 37, 155-162.

29-   Raman, A., Weir, U  and Bloomfield,  S.F. 1995,  Antimicrobial effects of tea-tree oil andits major components on Staphylococcus aureus,  Staph. epidermidis and Propionibacterium acnes.Lett Appl Microbiol 21(4):242-5.

30-   Sahin, F., Karaman, I., Güllüce, M., Oğütçü, H., Sengül, M., Adigüzel, A., Oztürk, S., Kotan, R.2003 Jul.Evaluation of antimicrobial activities of Satureja hortensis L.J Ethnopharmacol. ;87(1):61-5.

31-   Sefidkon, F., Abbasi, Kh., Jamzad, Z.and Ahmadi,  Sh.,  2007. The effect of distillation methods and stage of plant growth on the essential oil content and composition of Satureja rechingeri Jamzad. FoodChemistry, 100: 1054-1058.

32-   Sefidkon, F.and Jamzad, Z., 2005.Chemical composition of the essential oils of the Iranian Satureja species (S. mutica,  S. macrantha and S. intermedia).Food Chemistry,  91: 1-4.

33-   Sefidkon, F.Jamzad, Z. and Mirza, M.(2004).Chemical Variation in the Essential Oil of Satureja sahendicaa from Iran.Food Chemistry, 88: 325–328.

34-   Serrentino, J.1991, How Natural Remedies Work.Point Robert, W.A.: Harley and Marks Publishers : 20 -22.

35-   Shelef, L.A., Naglik, O.A., Bogen, D.W.1980, Sensitivity of some common food-borne bacteria to the spices sage,  rosemary and all spice.J Food Sci 45, 1042-1044.

36-   Skocibusic, M. and Bezic, N., 2004.Phytochemical analysis and in vitro antimicrobial activity of two Satureja species essential oils. Phytother. Research, 18(12): 964-970.

37-   Sokovic, MD., Ristic, M., Grubisic, D.2004, Chemical composition andantifungal acti- vity  of  the  essential oil from Juniperus excelsa berries. Pharm Biol 42:328-331.

38-   Staniszewska, M., Kula, J., Wieczorkiewicz, M., Kusewicz, D.2005, Essential Oils of Wild and Cultivated Carrots – the Chemical Composition and Antimicrobial Activity.J Essent Oil Res. 17:579-583.

39-   Tepe, B., Sokmen, M., Sokmen, A., Daferera, D., Polissiou, M.2005, Antimicrobial and anti- oxidant activities of the essential oil and various extracts of Cyclotrichium origanifolium (Labill.) Manden. and Scheng.J Food Eng.69:335-342.

40-   Ulte, A., Bennik, M.H.J.and Moezelaar, R., 2002.The phenolic hydroxyl group of carvacrol is essential for action against the food pathogen Bacillus cereus. Applied and Environmental Microbiology, 68: 1561-1568.