نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانش آموخته کارشناسی ارشد دانشگاه تبریز، دانشکده علوم طبیعی، گروه زیست شناسی گیاهی
2 هیأت علمی دانشگاه تبریز، دانشکده علوم طبیعی، گروه زیست شناسی گیاهی
3 هیأت علمی دانشگاه تبریز، دانشکده علوم طبیعی، گروه زیست شناسی جانوری
چکیده
ژنهای rooting locus) rol) بر روی Transferred DNA) T-DNA) باکتری Agrobacterium rhizogenes قرار دارند که با انتقال به میزبان گیاهی باعث ایجاد تغییرات مورفولوژیک و رشد و نموی در گیاه می شوند. این تحقیق با هدف بررسی تاثیر ژن rolC از این باکتری و هومولوگ گیاهی آن یعنی ژن trolC از گیاه توتون، بر رشد و نمو گیاه Nicotiana tabacum cv.samsun انجام گرفته است. در این تحقیق ابتدا DNA گیاهان تراژن rolC و trolC استخراج و از حضور ژنهای مورد نظر اطمینان حاصل شد. با توجه به اینکه گیاهان تراژن با بیان ژنهای rolC وtrolC، فنوتیپ کلروزه نشان می دهند انتظار میرفت که بیان ژنهای کلروپلاستی نیز با بیان تراژنها کاهش یابد. برای بررسی این موضوع، استخراج RNA از گیاهان تراژن، سنتز cDNA و در نهایت واکنش PCR بر روی نمونهها با پرایمرهای اختصاصی ژن psbA کلروپلاستی انجام گرفت. نتایج حاصل از RT-PCR نشان داد که بیان ژن فوق که کد کننده یکی از پروتئینهای فتوسیستم II می باشد در گیاهان تراژن و کلروزه بشدت کاهش یافته یا متوقف میشود و به عبارت دیگر یکی از دلایل ایجاد کلروز ناشی از این تراژنها از نقطه نظر مولکولی میتواند نقص بیان ژن psbA در گیاهان بیان کننده ژنهای rolC و trolC باشد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Study of the effect of rolC and trolC genes on chlorosis in Tobacco plants
نویسندگان [English]
3 Chairman of EAST Azarbijan Science & Technology park
چکیده [English]
The rol (rooting locus) genes are located on T-DNA (Transferred DNA) of Agrobacterium rhizogenes and induce the morphological and developmental abnormalities upon the integration in to the plant genome. In this study we investigated the effect of bacterial rolC gene and its homologue in Tobacco -tobacco rolC or ''trolC'' gene- on growth of Nicociana tabaccum cv.samsun plants. In the first time, the presence of rolC and trolC genes was confirmed in transgenic lines and then using RT-PCR technique, we have shown that the transgenic plants expressing the bacterial rolC or tobacco trolC genes -which demonstrate the chlorotic phenotype-, have very low or no expression of the chloroplastic gene ''psbA''. This gene encodes for one of the proteins of photosystem II. We conclude that the lack of expression of chloroplastic psbA gene and thus the defective feature of chloroplasts in rolC/trolC transgenic plants may cause the chlorotic phenotype of these plants.
کلیدواژهها [English]
بررسی مولکولی القای کلروز توسط ژنهای rolC و trolC در گیاه توتون
حسین گردونپر1، هانیه محجل شجاء1* و محمدعلی حسینپور فیضی2
1 تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده علوم طبیعی، گروه زیست شناسی گیاهی
2 تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده علوم طبیعی، گروه زیست شناسی جانوری
تاریخ دریافت: 10/1/94 تاریخ پذیرش: 5/5/94
چکیده
ژنهای rooting locus (rol) بر روی Transferred DNA (T-DNA) باکتری Agrobacterium rhizogenes قرار دارند که با انتقال به میزبان گیاهی باعث ایجاد تغییرات مورفولوژیک و رشد و نمو در گیاه میشوند. این تحقیق با هدف بررسی تأثیر ژن rolC از این باکتری و هومولوگ گیاهی آن یعنی ژن trolC از گیاه توتون، بر رشد و نمو گیاه Nicotiana tabacum cv.samsun انجام گرفته است. در این تحقیق ابتدا DNA گیاهان تراژن rolC و trolC استخراج و از حضور ژنهای مورد نظر اطمینان حاصل شد. با توجه به اینکه گیاهان تراژن با بیان ژنهای rolC وtrolC، فنوتیپ کلروزه نشان میدهند انتظار میرفت که بیان ژنهای کلروپلاستی نیز با بیان تراژنها کاهش یابد. برای بررسی این موضوع، استخراج RNA از گیاهان تراژن، سنتز cDNA و در نهایت واکنش PCR بر روی نمونهها با پرایمرهای اختصاصی ژن psbA کلروپلاستی انجام گرفت. نتایج حاصل از RT-PCR نشان داد که بیان ژن فوق که کد کننده یکی از پروتئینهای فتوسیستم II می باشد در گیاهان تراژن و کلروزه به شدت کاهش یافته یا متوقف می شود و به عبارت دیگر یکی از دلایل ایجاد کلروز ناشی از این تراژنها از نقطه نظر مولکولی میتواند نقص بیان ژن psbA در گیاهان بیان کننده ژنهای rolC و trolC باشد.
واژه های کلیدی: آگروباکتریوم، T-DNA، rolC، trolC، RT-PCR، کلروز
* نویسنده مسئول، تلفن: 04133379762، پست الکترونیکی: h_mohajjel@tabrizu.ac.ir
مقدمه
آگروباکتریوم ریزوژنز(Agrobacterium rhizogenes) دارای ژنهای مورد نیاز برای همیوغی (tra, trb) و تولید مثل رویشی (rep or reproduction) بر روی ژنوم اصلی خود است. پلاسمید (Root inducing) Ri این باکتری نیز دارای ژنهای بیماریزایی (vir or virulence) و قسمتی موسوم به(Transferred DNA) T-DNA می باشد که بر روی آن انکوژنها و ژنهای سنتز اوپین ((opine وجود دارند (12). انکوژنها رشد نئوپلاستیکی یا توموری سلولهای میزبان را موجب شده (13) و با سنتز هورمونهای گیاهی موجب تکثیر سلولهای توموری میگردند (30). اوپین ها ترکیباتی با وزن مولکولی کم هستند که حاصل تجمع یک اسیدآمینه با یک قند یا یک α-کتواسید می باشند و به عنوان منبع کربن و نیتروژن برای باکتری محسوب می شوند.
آگروباکتریوم جهت تراژن نمودن میزبان از ژنهای متعددی استفاده میکند که شامل: الف) ژنهای chv (chromosomal virulence) بر روی کروموزوم باکتری جهت شناسایی و اتصال باکتری به میزبان، ب) ژنهای vir جهت فرآیندهایی چون آماده سازی، انتقال و الحاق T-DNA در ژنوم میزبان و ج) برخی از ژنهای میزبان که برای انتقال T-DNA در سیتوپلاسم سلول گیاهی و الحاق آن در ژنوم به کار میروند، می باشد (33).
سندرم ریشههای موئین یا حصیری (root-mat disease) (23) که ناشی از انتقال T-DNA به ژنوم میزبان گیاهی می باشد با ایجاد ریشههای بسیار منشعب که عدم تمایل به جاذبه (ageotropic) را دارند مشخص می گردد. از لحاظ مورفولوژیک این ریشهها بسیار مشابه انواع طبیعی هستند. ریشههای تراژن قابلیت باززایی گیاهان زایا را دارند که در بسیاری از گونهها این گیاهان با ویژگیهایی چون کندی رشد، میان گرههای کوتاه شده، برگهای چروکیده، کاهش غالبیت رﺃسی و ریشههای حجیم و آژئوتروپیک متمایز میشوند. به مجموع این صفات سندرم ریشههای موئین (hairy roots) گفته میشود (31). مهم ترین ویژگی ریشههای موئین قابلیت رشد سریع آنها در عدم حضور هورمونها است که به دلیل حضور ژنهای القاگر ریشه (rol genes) و ژنهای سنتز هورمون اکسین (aux genes) بر روی T-DNA میباشد (22).
خانواده ژنهای rol مستقر برروی T-DNAی آ. ریزوژنز عامل اصلی ایجاد سندرم ریشههای موئین محسوب میشوند. این ژنها شامل rolA، rolB، rolC و rolD است (27). مهمترین تأثیرات ژنهای rol در گیاهان بالا بردن میزان حساسیت گیاه به هورمونها از جمله اکسین است (6) که از طریق آزمایشهای انجام گرفته بر روی گیاهانی چون N. tabacum و L. corniculotus مورد تأیید قرار گرفته است ( 25 و 28). ژن rolC به لحاظ اهمیتی که در بهبود صفات تزئینی و باغبانی بر روی گیاه دارد بیشتر از ژنهای دیگر مورد بررسی و مطالعه محققین قرار گرفته است (7). به لحاظ بیماریزایی بیان ژن rolC با ایجاد سندرم ریشههای موئین و تغییراتی همچون تولید ترکیبات ثانویه جدید، تغییر توازن هورمونی گیاه و ایجاد کلروز توأم است. افزایش شاخههای جانبی، ایجاد برگهای سوزنی شکل، گلدهی زودهنگام، کاهش اندازه گلها و ایجاد نر عقیمی با کاهش تولید دانه گرده از دیگر تغییرات مورفولوژیکی ناشی از بیان ژن rolC در گیاهان می باشد (8، 10، 18 و 24). یکی از مهم ترین تنظیمکنندههای بیان ژن rolC، ساکارز است. طبق بررسیهای به عمل آمده ناحیه پاسخ به ساکارز در پروموتر این ژن در ناحیه 94- تا 135- قرار دارد. وجود منابع بالای ساکارز در بافتهای فلوئم منجر به بیان بالای ژن rolC در این بافتها شده است (35).
از نقطه نظر تأثیر ژنrolC بر هورمونهای گیاهی باید اشاره نمود که این ژن بر میزان سایتوکینینها، اکسینها و جیبرلینها (GA) تأثیر میگذارد. تغییراتی چون کاهش غالبیت رأسی و افزایش میزان شاخههای فرعی اشاره بر تغییر میزان هورمون سایتوکینین دارد (24و 36). Maurel و همکارانش (1991) با بررسی پروتوپلاستهای تراژن rolC توتون افزایش هایپرپلاریزاسیون غشای این سلولها را در مواجهه با اکسین به اثبات رساندند. به عبارت دیگر تحریکپذیری غشای پروتوپلاستها در مواجهه با این هورمون افزایش می یابد (19).
در گیاه سیبزمینی تراژن rolC کاهش اندازه گیاه همراه با تعداد جوانههای بیشتر مشاهده شده است (14). همچنینSchmulling و همکارانش (1988) مشاهده نمودند که در گیاهان تراژن rolC به علت کاهش میزان کلروفیل، فتوسنتز کمتری انجام میگیرد و در مقایسه با انواع گیاهان طبیعی برگها به رنگ سبز متمایل به زرد (کلروزه) نمایان میشوند. گیاهان تراژن 35S-rolC (ژن rolC تحت کنترل پروموترقوی 35S ویروس CaMV) نیز دارای میزان بیان بالای این ژن در برگها بوده و در نتیجه چنین برگهایی کلروز بیشتری نشان میدهند (24).
علاوه بر موارد ذکر شده در بالا تحریک تولید متابولیتهای ثانویه و پروتئینهای دفاعی در گیاهان تراژن و نیز رابطه آن با رادیکالهای آزاد اکسیژن و پروتئین کینازهای وابسته به سایکلین (CDPK) از دیگر نقشهای ژن rolC در گیاهان می باشد(5 و26).
برخی از گونههای گیاهی به طور طبیعی دارای توالیهای مشابه با قسمتهایی از توالی T-DNA آگروباکتریوم می باشند که به cT-DNA (cellular T-DNA) یا T-DNA سلولی موسوم است(32) . آزمایشات متعددی شباهت عملکردی ژنهای T-DNA و cT-DNA را به اثبات رسانده اند (3و 29). توالی مشابه با ژن rolC در گیاه توتون، (tobacco rolC) trolC نامیده می شود (20) که از نظر مورفولوژیک تغییرات مشابه ژن rolC را در گیاهان تراژن ایجاد میکند (21). از نظر مولکولی شباهت عملکردی بین ژن rolC وtrolC همچنان ناشناخته میباشد و لذا در این تحقیق تصمیم بر آن است تا گوشهای از عملکرد مولکولی القای کلروز توسط ژن rolC و trolC با بررسی نحوه بیان ژنهای کلروپلاستی در گیاهان تراژن مورد بررسی و مطالعه قرار گیرد.
مواد و روشها
گیاهان مورد استفاده: گیاهان توتون تراژن مورد استفاده در این تحقیق (Nicotiana tabacum cv.samsun) دارای ژن rolC وtrolC در ژنوم خود می باشند که ژنها تحت کنترل پروموتر القا شونده با گلوکوکورتیکوئید دگزامتازون (dexamethasone) می باشند. گیاهان در حضور دگزامتازون در شرایط تیمار و در غیاب آن در شرایط کنترل یا شاهد هستند. به علاوه از گیاهان غیر تراژن به عنوان شاهدین دیگر نیز استفاده شد. بذر گیاهان تراژن در تحقیق قبلی (21) توسط نویسندگان در "انستیتو بیولوژی مولکولی گیاهی" شهر استراسبورگ فرانسه تهیه شدند.
استرلیزاسیون بذرها: بذرها به مدّت 2 دقیقه در اتانول 70 درصد و سپس به مدّت 15 دقیقه در هیپوکلریت سدیم 10 درصد (حاوی یک قطره 20 Tween) استریل سطحی شدند. سپس 3 بار، هر یک به مدّت 10 دقیقه با آب مقطر استریل شستشو داده شدند و در انتها بذرها بر روی کاغذ صافی قرار داده شدند تا سطح بذرها خشک شود (حدود 1 ساعت در هود لامینار). سپس بذرها روی محیط جوانه زنی MS (Murashig and Skoog) قرار داده شدند (حدود 20-30 بذر در هر ظرف کشت گیاه) و در دمای 23 درجه سانتی گراد، شرایط 16 ساعت روشنایی و هشت ساعت تاریکی رشد داده شدند. بعد از جوانهزنی بذرها جهت القای بیان ژن مورد نظر به محیط دگزامتازون افزوده شد.
آزمایشات مولکولی: - استخراج DNA (مطابق با متد CTAB ) : حدود 300 میلیگرم از برگ گیاه درون هاون چینی همراه با 500 میکرولیتر از بافر CTAB به خوبی ساییده شد. در ادامه محتویّات هاون به مدّت 20 دقیقه در دمای ۶5 درجه سانتی گراد قرار گرفت. سپس یک حجم از کلروفورم به نمونه ها اضافه و به مدت 5 دقیقه ورتکس گردید. سپس سانتریفیوژ در دمای اتاق با سرعت rpm13500 انجام و فاز رویی به تیوب جدید منتقل شد. در انتها DNA به روش اتانول رسوب داده شد و بعد از خشک شدن 50-30 میکرولیتر آب استریل اضافه و در 20- درجه سانتی گراد نگهداری گردید.
استخراج RNA : حدود 200 میلیگرم از برگ گیاه درون هاون و در حضور ازت مایع ساییده شدند. در ادامه 700 میکرولیتر تریزول اضافه شد و کاملاً مخلوط گردید تا محلول یکنواختی ایجاد شود. سپس به آن 200 میکرولیتر کلروفرم اضافه گردید و پس از ورتکس کردن، سانتریفیوژ با سرعت rpm14000 به مدّت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد صورت گرفت. مایع رویی به تیوب جدید منتقل و به میزان 2 حجم ایزوپروپانول اضافه گردید. تیوبها به مدّت یک شب در 20- درجه سانتی گراد نگهداری شدند و روز بعد سانتریفیوژ به مدّت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد با سرعت rpm14000 انجام شد. در ادامه رسوبدهی به روش اتانول انجام شد و بعد از خشک شدن، به میزان 50-30 میکرولیتر آب مقطر استریل عاری از RNase به آن اضافه گردید. به منظور حذف مولکولهای DNA ازRNA استخراج شده، واکنش DNase توسّط کیت Qiagen انجام گرفت و بررسی کمّی RNA با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Eppendorf) و محاسبه نسبت میزان جذب طول موج 260 نانومتر بر طول موج 280 نانومتر (A260/280) صورت پذیرفت.
سنتز cDNAو واکنش PCR: برای سنتز cDNA از کیت) Superscript III ساخت شرکت (Invitrogene استفاده گردید. پرایمرهای ژن housekeeping به نام rRNA 16s برای سنجش کیفیّت cDNA سنتز شده مورد استفاده قرار گرفت و جهت نرمالیزاسیون باندهای حاصل، محصولات واکنش روی ژل آگارز 1 درصد الکتروفورز گردید. بعد از نرمالیزاسیون، در واکنشهای PCR بعدی (با همان شرایط) از پرایمرهای اختصاصی قطعه ژنی، استفاده گردید.
نتایج
همان گونه که اشاره شد ژن rolC آگروباکتریوم و هومولوگ گیاهی آن- trolC - فنوتیپ کلروز را در گیاهان بیان کننده این ژنها اعمال میکنند (21و 23). در این تحقیق به منظور شناسایی عملکرد مولکولی این ژنها در ایجاد کلروز در گیاه توتون، مبنا بر این قرار گرفت تا با طراحی پرایمرهای گوناگون ژنوم کلروپلاستی، میزان بیان این ژنها در گیاهان تراژن القاء شده با دگزامتازون توسط تکنیکRT-PCR (Reversetranscription-PCR) بررسی گردد و آنها با گیاهان تراژن القاء نشده و نیز گیاهان غیر تراژن (#) که به عنوان شاهد به کار می روند مقایسه شود. در ابتدا بذر گیاهان طبق دستورالعمل ذکر شده در بخش مواد و روشها استریل شده و در محیط جوانهزنی قرار گرفتند تا اندازه گیاهچهها به حدی برسد که برای انتقال به محیط حاوی dex (دگزامتازون) جهت القاء بیان ژنها مناسب باشد (حدود 15 روز). پس از رسیدن گیاهچهها به این مرحله، آنها در محیط کشت حاوی dex قرار گرفتند. البته برای هر نمونه نیمی از گیاهچهها در محیط فاقد dex (به عنوان شاهدی دیگر) قرار داده شدند تا تغییرات فنوتیپی ایجاد شده در هر گروه به صورت واضحی مورد تشخیص قرار گیرد (تصویر1، الف و ب).
در این مرحله صفات مورفولوژیکی همچون کلروزه شدن گیاه ، کوتولگی و تولید ریشههای منشعب و کوتاهتر از حد نرمال حتی ریشههای نابه جا در ساقههای گیاه و گاهاً با انتهای پیچ خورده مشاهده شدند (تصویر1، ج تا ز). این صفات مربوط به گیاهان تراژن rolC و trolC و پس از القاء بودند و در گیاهان تراژن بدون القاء و گیاهان غیر تراژن (# یا شاهد) مشاهده نشدند.
تصویر1- الف و ب) گیاهچههای 21 روزه تراژن rolC و trolC در محیط دارای دگزامتازون (+) یا فاقد آن (-). ج تا ه) هر کدام از گیاهچهها را به صورت مجزا نشان داده شده است. تفاوتهای مورفولوژیک ناشی از ژنهای rolC و trolC به خوبی آشکار است. در گیاهچههای # تفاوتی بین حالت القاء (+) یا عدم آن (ـ) مشاهده نمیشود. و) تولید ریشههای نابه جا بر روی ساقه در گیاه القاء شده rolC. ز)رشد گیاهچههای rolC بر روی پارچه نازک. کاهش رشد کلی گیاه و فنوتیپ کلروزه در گیاهان القاء شده آشکار است.
DNA ژنومی از بافت برگ گیاهچههای توتون rolC ,trolCو شاهد استخراج گردید و برای اطمینان از تراژن بودن گیاهچهها، واکنش PCR با پرایمر ژنهای rolC و trolC انجام و نتیجه بر روی ژل آگارز 1 درصد مورد بررسی قرار گرفت. همان طوری که در تصویر2 مشاهده میشود باند مربوط به ژنهای rolC و trolC در لاین 1و 2 کاملاً قابل مشاهده است (bp500)، در حالی که در ستون مربوط به نمونه شاهد (لاین 3) این باند مشاهده نمیشود. این آزمایش تراژن بودن گیاهان مورد بررسی را تأیید کرد.
تصویر 2- PCR بر روی DNAهای استخراج شده از گیاهچههای rolC (لاین 1)، trolC (لاین 2) و شاهد # (لاین 3). M معرف مارکر وزن مولکولی میباشد.
جهت سنجش کیفی RNAهای استخراج شده و اطمینان از عاری بودن DNA در آنها، واکنش PCR بر روی این RNAها با استفاده از پرایمرهای یک ژن house keeping به نام 16srRNA انجام شد و نتیجه بر روی ژل آگارز الکتروفورز بررسی گردید (تصویر مربوطه آورده نشده است). مطابق انتظار در هیچ کدام از نمونهها باند مربوط به rRNA16s مشاهده نشد و به عبارت دیگر RNAهای استخراجی به دلیل عملکرد خوب آنزیم DNase عاری از DNA بودند.
رونویسی معکوس از روی RNAها به کمک آنزیم ترانسکریپتاز معکوس انجام گرفت و واکنش PCR بر روی DNA سنتز شده با استفاده از پرایمر ژنهای rolC و trolC، جهت اطمینان از بیان این ژنها در گیاهان تراژن القاء شده و عدم بیان آنها در صورت عدم القاء استفاده شد. PCR دیگری نیز با پرایمرهای ژن rRNA16s جهت نرمالیزه نمودن باندها انجام شد و نتیجه واکنش بر روی ژل آگارز 1 درصد مورد بررسی قرار گرفت. نتایج الکتروفورز ژل آگارز نشان داد که این ژن به خوبی در همه گیاهان بیان میشود (تصویر 3).
تصویر3- RT-PCR توسّط پرایمرهای اختصاصی ژنهای rolC و trolC. M) مارکر وزن مولکولی، 4-1) گیاهان تراژن و5 و 6) گیاه تیپ وحشی #. باندهای مشاهده شده مربوط به ژنهای rolC و trolC همراه با القاء توسط dex (+) میباشند (bp400) و در گیاهانی که القاء نشده اند (-) حضور ندارد . تصویر پایین مربوط به نتیجه واکنش PCR توسّط پرایمرهای ژن rRNA16s می باشد.
در مرحله بعد، بیان ژن psbA که یکی از مهم ترین ژنهای کلروپلاستی گیاه توتون می باشد بررسی گردید. این ژن، از ژنهای اصلی درگیر در مسیر فتوسنتز میباشد و اختلال در بیان آن می تواند موجب کاهش یا قطع تولید کلروفیل و در نتیجه ایجاد کلروز گردد.
تصویر 4- RT-PCR توسّط پرایمرهای ژن کلروپلاستی psbA. M) مارکر وزن مولکولی، لاینهای 1 و 4 به ترتیب مربوط به گیاهان القاء شده trolC و rolC و لاینهای شماره 2 و 3 مربوط به گیاهان القاء نشده مذکور می باشد.
همان گونه که در تصویر4 مشاهده میشود در گیاهان تراژن trolC و rolCی بدون القاء، ژن psbA به خوبی بیان میشود (لاین 2 و 3)، در صورتی که در گیاهان rolC القاء شده بیانی از ژن psbA مشاهده نمیشود(لاین 4) و در گیاهان trolC القاء شده نیز این بیان بسیار ضعیف است (لاین 1). آزمایشات فوق مؤید این مطلب است که با بیان ژنهای rolC و trolC، بیان ژن کلروپلاستی psbA مختل شده که نتیجه آن می تواند اختلال در سنتز طبیعی متابولیتهای فتوسنتزی و در نهایت تولید طبیعی کلروفیل و در نتیجه ایجاد کلروز گردد. ژن psbA کد کننده یکی از پروتئینهای فتوسیستم II میباشد که عدم بیان آن با اختلال در تشکیل فتوسیستم II و سنتز نشدن کلروفیل و در نتیجه عاملی برای ایجاد کلروز است.
بحث و نتیجه گیری
یکی از دغدغههای بسیار مهم که امروزه ذهن بسیاری از محققان علوم گیاهی را به خود مشغول نموده است، رفع پدیده کلروز در بسیاری از گیاهان به ویژه انواع زینتی و خوراکی است. علتیابی این موضوع به خصوص از نقطه نظر ژنتیکی و مولکولی آن در عصر حاضر از اهمیت بسیار زیادی برخوردار است. کاهش محتوای کلروفیل در برگها میتواند به خاطر عواملی چون اختلال در مسیر تولید کلروفیل ویا تجزیه آن (1 و 4) ، کمبود مواد معدنی مانند آهن (17)، به کارگیری ترکیبات سمی مانند تنتوکسین و افزایش رادیکالهای آزاد اکسیژن (2 و 16) باشد.
ژنهای بسیاری در ژنوم کلروپلاست گیاهان وجود دارند که بیان یا عدم بیان آنها مستقیم یا غیر مستقیم میتواند موجب بروز کلروز در گیاهان گردد. مطالعات گستردهای در زمینه یافتن ارتباط میان این دسته از ژنها با پدیده کلروز در گیاهان مدل صورت گرفته است که نشان دهنده وجود ارتباط میان آنها است. Yoshida و همکارانش (1996) با بررسیهایی که بر روی گیاه برنج انجام دادند متوجه وجود ارتباط بین میزان بیان ژن rpoB کلروپلاستی (کدکننده زیرواحد β از RNA پلیمراز پلاستی) و ایجاد کلروز در این گیاه شدند (34). در یک بررسی دیگر محققان با استفاده از گیاهان توتون جهش یافته در ژنهای کلروپلاستی rpoA، rpoB و rpoC1 (rpo¯) فنوتیپ سفید رنگ (کلروزه) را در گیاهان مشاهده نمودند (11). ژنهای psbA و psbB نیز دسته دیگری از ژنهای کلروپلاستی هستند که عدم بیانشان موجب ایجاد کلروز میگردد. این ژنها کدکننده پروتئینهای مربوط به کمپلکس فتوسیستم II میباشند. در گیاهان تراژن جو (Barley) به علت وجود جهش در ژنهای فوق الذکر، نقص عملکرد صحیح فتوسیستم II و عدم تکامل کلروپلاست و در نهایت فنوتیپ کلروزه مشاهده گردیده است (15). Chen و همکارانش (2011) با مطالعه بر روی ژن کد کننده زیرواحد بزرگ آنزیم روبیسکو (rbcL) گزارش کردند که افزایش بیان این ژن تحت تأثیر برخی عوامل اگزوژن همچون سولفید هیدروژن (H2S) منجر به افزایش محتوای کلروفیل در گیاهان و سبز شدن هرچه بیشتر آنها می شود (9).
پژوهش حاضر به یکی دیگر از ابعاد بسیار مهم و تأثیرگذار در ایجاد فنوتیپ کلروز در گیاهان، با به کارگیری گیاهان تراژن توتون پرداخته است. هدف از انتخاب این گیاه علاوه بر کشت آسان و راندمان بالای تراژنسازی، ساده بودن و آشنایی زیاد با ژنوم آن میباشد. در این تحقیق تأثیر و نقش ژنهای خارجی وارد شده به ژنوم گیاه - یعنی ژن rolC از باکتری آ. ریزوژنز و هومولوگ گیاهی آن در توتون یا ژن trolC- بر روی پدیده کلروز مورد توجه قرار گرفته شده است. نتایج به دست آمده نشان داد که ژن کلروپلاستی psbA در گیاهان تراژن rolC و trolC در صورت عدم القاء به خوبی بیان می شود، در حالیکه با القای ژنهای rolC و trolC، بیان ژن psbA کاسته و حتی متوقف می گردد که در واقع با زردی گیاهان تراریخت نیز توأم است. این ژن کد کننده یکی از پروتئینهای سازنده فتوسیستم II میباشد که عدم بیان آن با اختلال در تشکیل فتوسیستم II و سنتز نشدن کلروفیل در این گیاهان و در نتیحه ایجاد کلروز در آنها می باشد. با توجه به هومولوژی توالی نوکلئوتیدی و اسید آمینهای ژنهای rolC و trolC و پروتئینهای مربوطه و شباهتهای فیزیومورفولوژیک حاصل از گیاهان تراریخت rolC و trolC که شامل مواردی چون کاهش رشد کلی گیاه، ریشههای کوتاه و پیچ خورده و نیز افزایش جذب قند و نشاسته (21) میباشد و نیز وجود پروتئینهای میانکنش کننده مشابه با پروتئینهای RolC و tRolC مثل پروتئین TCP13(نتایج منتشر نشده محجل شجا و همکاران) تحقیق پیش رو شباهت عملکردی ژنهای rolC و trolC را در سطح مولکولی به اثبات می رساند که همراستا با مشاهدات فتوتیپی میباشند. به عبارت دیگر rolC و trolC با کاهش بیان یک ژن خاص (psbA) موجب تظاهر یک فنوتیپ خاص (کلروز) میگردند.