نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانش آموخته کارشناسی ارشد دانشگاه تبریز، دانشکده علوم طبیعی، گروه زیست شناسی گیاهی

2 هیأت علمی دانشگاه تبریز، دانشکده علوم طبیعی، گروه زیست شناسی گیاهی

3 هیأت علمی دانشگاه تبریز، دانشکده علوم طبیعی، گروه زیست شناسی جانوری

چکیده

ژنهای rooting locus) rol) بر روی Transferred DNA) T-DNA) باکتری Agrobacterium rhizogenes قرار دارند که با انتقال به میزبان گیاهی باعث ایجاد تغییرات مورفولوژیک و رشد و نموی در گیاه می شوند. این تحقیق با هدف بررسی تاثیر ژن rolC از این باکتری و هومولوگ گیاهی آن یعنی ژن trolC از گیاه توتون، بر رشد و نمو گیاه Nicotiana tabacum cv.samsun انجام گرفته است. در این تحقیق ابتدا DNA گیاهان تراژن rolC و trolC استخراج و از حضور ژنهای مورد نظر اطمینان حاصل شد. با توجه به اینکه گیاهان تراژن با بیان ژنهای rolC وtrolC، فنوتیپ کلروزه نشان می دهند انتظار میرفت که بیان ژنهای کلروپلاستی نیز با بیان تراژنها کاهش یابد. برای بررسی این موضوع، استخراج RNA از گیاهان تراژن، سنتز cDNA و در نهایت واکنش PCR بر روی نمونه‌ها با پرایمرهای اختصاصی ژن psbA کلروپلاستی انجام گرفت. نتایج حاصل از RT-PCR نشان داد که بیان ژن فوق که کد کننده یکی از پروتئینهای فتوسیستم II می باشد در گیاهان تراژن و کلروزه بشدت کاهش یافته یا متوقف میشود و به عبارت دیگر یکی از دلایل ایجاد کلروز ناشی از این تراژنها از نقطه نظر مولکولی میتواند نقص بیان ژن psbA در گیاهان بیان کننده ژنهای rolC و trolC باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Study of the effect of rolC and trolC genes on chlorosis in Tobacco plants

نویسندگان [English]

  • Hossein Gardoonpar 1
  • hanieh mohajal 2
  • Mohammad ali Hosseinpour feizi 3

3 Chairman of EAST Azarbijan Science & Technology park

چکیده [English]

The rol (rooting locus) genes are located on T-DNA (Transferred DNA) of Agrobacterium rhizogenes and induce the morphological and developmental abnormalities upon the integration in to the plant genome. In this study we investigated the effect of bacterial rolC gene and its homologue in Tobacco -tobacco rolC or ''trolC'' gene- on growth of Nicociana tabaccum cv.samsun plants. In the first time, the presence of rolC and trolC genes was confirmed in transgenic lines and then using RT-PCR technique, we have shown that the transgenic plants expressing the bacterial rolC or tobacco trolC genes -which demonstrate the chlorotic phenotype-, have very low or no expression of the chloroplastic gene ''psbA''. This gene encodes for one of the proteins of photosystem II. We conclude that the lack of expression of chloroplastic psbA gene and thus the defective feature of chloroplasts in rolC/trolC transgenic plants may cause the chlorotic phenotype of these plants.

کلیدواژه‌ها [English]

  • ''Agrobacterium''
  • ''chlorosis''
  • ''RT-PCR''
  • ''rolC''
  • ''trolC''

بررسی مولکولی القای کلروز توسط ژنهای rolC و trolC در گیاه توتون 

حسین گردونپر1، هانیه محجل شجاء1* و محمدعلی حسینپور فیضی2

1 تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده علوم طبیعی، گروه زیست شناسی گیاهی

2  تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده علوم طبیعی، گروه زیست شناسی جانوری

تاریخ دریافت: 10/1/94                تاریخ پذیرش: 5/5/94

چکیده

ژنهای rooting locus (rol) بر روی Transferred DNA (T-DNA) باکتری Agrobacterium rhizogenes قرار دارند که با انتقال به میزبان گیاهی باعث ایجاد تغییرات مورفولوژیک و رشد و نمو در گیاه می­شوند. این تحقیق با هدف بررسی تأثیر ژن rolC از این باکتری و هومولوگ گیاهی آن یعنی ژن trolC از گیاه توتون، بر رشد و نمو گیاه Nicotiana tabacum cv.samsun انجام گرفته است. در این تحقیق ابتدا DNA گیاهان تراژن  rolC و trolC استخراج و از حضور ژنهای مورد نظر اطمینان حاصل شد.  با توجه به اینکه گیاهان تراژن با بیان ژنهای rolC وtrolC، فنوتیپ کلروزه نشان می­دهند انتظار می­رفت که بیان ژنهای کلروپلاستی نیز با بیان تراژنها کاهش یابد. برای بررسی این موضوع، استخراج RNA از گیاهان تراژن، سنتز cDNA و در نهایت واکنش PCR بر روی نمونه­ها با پرایمرهای اختصاصی ژن psbA کلروپلاستی انجام گرفت. نتایج حاصل از RT-PCR نشان داد که بیان ژن فوق که کد کننده یکی از پروتئینهای فتوسیستم II می باشد در گیاهان تراژن و کلروزه به شدت کاهش یافته یا متوقف می شود و به عبارت دیگر یکی از دلایل ایجاد کلروز ناشی از این تراژنها از نقطه نظر مولکولی می­تواند نقص بیان ژن psbA در گیاهان بیان کننده ژنهای rolC و trolC باشد.

واژه های کلیدی: آگروباکتریوم، T-DNA، rolC، trolC، RT-PCR، کلروز

* نویسنده مسئول، تلفن: 04133379762، پست الکترونیکی:  h_mohajjel@tabrizu.ac.ir

مقدمه

 

آگروباکتریوم ریزوژنز(Agrobacterium rhizogenes) دارای ژنهای مورد نیاز برای همیوغی (tra, trb) و تولید مثل رویشی (rep or reproduction) بر روی ژنوم اصلی خود است. پلاسمید  (Root inducing) Ri این باکتری نیز دارای ژنهای بیماریزایی (vir or virulence) و قسمتی موسوم به(Transferred DNA) T-DNA   می باشد که بر روی آن انکوژنها و ژنهای سنتز اوپین ((opine­ وجود دارند (12). انکوژنها رشد نئوپلاستیکی یا توموری سلولهای میزبان را موجب شده (13) و با سنتز هورمونهای گیاهی موجب تکثیر سلولهای توموری می­گردند (30). اوپین ها ترکیباتی با وزن مولکولی کم هستند که حاصل تجمع یک اسید­آمینه با یک قند یا یک α-کتو­اسید می باشند و به عنوان منبع کربن و نیتروژن برای باکتری محسوب می شوند.

آگروباکتریوم جهت تراژن نمودن میزبان از ژنهای متعددی استفاده می­کند که شامل: الف) ژنهای chv (chromosomal virulence) بر روی کروموزوم باکتری جهت شناسایی و اتصال باکتری به میزبان، ب) ژنهای vir جهت فرآیندهایی چون آماده سازی، انتقال و الحاق T-DNA در ژنوم میزبان و ج) برخی از ژنهای میزبان که برای انتقال T-DNA در سیتوپلاسم سلول گیاهی و الحاق آن در ژنوم به کار می­روند، می باشد (33).

سندرم ریشه­های موئین یا حصیری (root-mat disease) (23) که ناشی از انتقال T-DNA به ژنوم میزبان گیاهی می باشد با ایجاد ریشه­های بسیار منشعب که عدم تمایل به جاذبه (ageotropic) را دارند مشخص می گردد. از لحاظ مورفولوژیک این ریشه­ها بسیار مشابه انواع طبیعی هستند. ریشه­های تراژن قابلیت باززایی گیاهان زایا را دارند که در بسیاری از گونه­ها این گیاهان با ویژگیهایی چون کندی رشد، میان گره­های کوتاه شده، برگهای چروکیده، کاهش غالبیت رﺃسی و ریشه­های حجیم و آژئوتروپیک متمایز می­شوند. به مجموع این صفات سندرم ریشه­های موئین (hairy roots) گفته می­شود (31). مهم ترین ویژگی ریشه­های موئین قابلیت رشد سریع آنها در عدم حضور هورمونها است که به دلیل حضور ژنهای القا­گر ریشه (rol genes) و ژنهای  سنتز هورمون اکسین (aux genes) بر روی T-DNA می­باشد (22).

خانواده ژنهای rol مستقر برروی T-DNA­ی آ. ریزوژنز عامل اصلی ایجاد سندرم ریشه­های موئین محسوب می­شوند. این ژنها شامل rolA، rolB، rolC و rolD است (27). مهمترین تأثیرات ژنهای rol در گیاهان بالا بردن میزان حساسیت گیاه به هورمونها از جمله اکسین است (6) که از طریق آزمایشهای انجام گرفته بر روی گیاهانی چون N. tabacum و L. corniculotus مورد تأیید قرار گرفته است ( 25 و 28). ژن rolC به لحاظ اهمیتی که در بهبود صفات تزئینی و باغبانی بر روی گیاه دارد بیشتر از ژنهای دیگر مورد بررسی و مطالعه محققین قرار گرفته است (7). به لحاظ بیماریزایی بیان ژن rolC با ایجاد سندرم ریشه­های موئین و تغییراتی همچون تولید ترکیبات ثانویه جدید، تغییر توازن هورمونی گیاه و ایجاد کلروز توأم است. افزایش شاخه­های جانبی، ایجاد برگهای سوزنی شکل، گلدهی زود­هنگام، کاهش اندازه گلها و ایجاد نر عقیمی با کاهش تولید دانه گرده از دیگر تغییرات مورفولوژیکی ناشی از بیان ژن rolC در گیاهان می باشد (8، 10، 18 و 24). یکی از مهم ترین تنظیم­کننده­های بیان ژن rolC، ساکارز است. طبق بررسیهای به عمل آمده ناحیه پاسخ به ساکارز در پروموتر این ژن در ناحیه 94- تا 135-  قرار دارد. وجود منابع بالای ساکارز در بافتهای فلوئم منجر به بیان بالای ژن rolC در این بافتها شده است (35).

از نقطه نظر تأثیر ژنrolC  بر هورمونهای گیاهی باید اشاره نمود که این ژن بر میزان سایتوکینین­ها، اکسین­ها و جیبرلین­ها (GA) تأثیر می­گذارد. تغییراتی چون کاهش غالبیت رأسی و افزایش میزان شاخه­های فرعی اشاره بر تغییر میزان هورمون سایتوکینین دارد (24و 36). Maurel و همکارانش (1991) با بررسی پروتوپلاست­های تراژن rolC توتون افزایش هایپرپلاریزاسیون غشای این سلولها را در مواجهه با اکسین به اثبات رساندند. به عبارت دیگر تحریک­پذیری غشای پروتوپلاستها در مواجهه با این هورمون افزایش می یابد (19).

در گیاه سیب­زمینی تراژن rolC کاهش اندازه گیاه همراه با تعداد جوانه­های بیشتر مشاهده شده است (14). همچنینSchmulling  و همکارانش (1988) مشاهده نمودند که در گیاهان تراژن rolC به علت کاهش میزان کلروفیل، فتوسنتز کمتری انجام می­گیرد و در مقایسه با انواع گیاهان طبیعی برگها به رنگ سبز متمایل به زرد (کلروزه) نمایان می­شوند. گیاهان تراژن 35S-rolC (ژن rolC تحت کنترل پروموترقوی 35S ویروس CaMV) نیز دارای میزان بیان بالای این ژن در برگها بوده و در نتیجه چنین برگهایی کلروز بیشتری نشان می­دهند (24).

علاوه بر موارد ذکر شده در بالا تحریک تولید متابولیتهای ثانویه و پروتئینهای دفاعی در گیاهان تراژن و نیز رابطه آن با رادیکالهای آزاد اکسیژن و پروتئین کینازهای وابسته به سایکلین (CDPK) از دیگر نقشهای ژن rolC در گیاهان می باشد(5 و26).

برخی از گونه­های گیاهی به طور طبیعی دارای توالیهای مشابه با قسمتهایی از توالی T-DNA آگروباکتریوم می باشند که به cT-DNA (cellular T-DNA) یا  T-DNA سلولی موسوم است(32) . آزمایشات متعددی شباهت عملکردی ژنهای T-DNA و cT-DNA را به اثبات رسانده اند (3و 29). توالی مشابه با ژن rolC در گیاه توتون،   (tobacco rolC) trolC نامیده می شود ‌(20) که از نظر مورفولوژیک تغییرات مشابه ژن rolC را در گیاهان تراژن ایجاد میکند (21). از نظر مولکولی شباهت عملکردی بین ژن rolC وtrolC  همچنان ناشناخته می­باشد و لذا در این تحقیق تصمیم بر آن است تا گوشه­ای از عملکرد مولکولی القای کلروز توسط ژن rolC و trolC با بررسی نحوه بیان ژنهای کلروپلاستی در گیاهان تراژن مورد بررسی و مطالعه قرار گیرد.

مواد و روشها

گیاهان مورد استفاده: گیاهان توتون تراژن مورد استفاده در این تحقیق (Nicotiana tabacum cv.samsun) دارای ژن­ rolC وtrolC   در ژنوم خود می باشند که ژنها تحت کنترل پروموتر القا شونده با گلوکوکورتیکوئید  دگزامتازون (dexamethasone) می باشند. گیاهان در حضور دگزامتازون در شرایط تیمار و در غیاب آن در شرایط کنترل یا شاهد هستند. به علاوه از گیاهان غیر تراژن به عنوان شاهدین دیگر نیز استفاده شد. بذر گیاهان تراژن در تحقیق قبلی (21) توسط نویسندگان در "انستیتو بیولوژی مولکولی گیاهی" شهر استراسبورگ فرانسه تهیه شدند.

استرلیزاسیون بذرها: بذرها به مدّت 2 دقیقه در اتانول 70 درصد و سپس به مدّت 15 دقیقه در هیپوکلریت سدیم 10 درصد (حاوی یک قطره 20 Tween) استریل سطحی شدند. سپس 3 بار، هر یک به مدّت 10 دقیقه با آب مقطر استریل شستشو داده شدند و در انتها بذرها بر روی کاغذ صافی قرار داده شدند تا سطح بذرها خشک شود (حدود 1 ساعت در هود لامینار). سپس بذرها روی محیط جوانه زنی MS (Murashig and Skoog) قرار داده شدند (حدود 20-30 بذر در هر ظرف کشت گیاه) و در دمای 23 درجه سانتی گراد، شرایط 16 ساعت روشنایی و هشت ساعت تاریکی رشد داده شدند. بعد از جوانه­زنی بذرها جهت القای بیان ژن مورد نظر به محیط دگزامتازون افزوده شد.

آزمایشات مولکولی: - استخراج DNA (مطابق با متد CTAB ) : حدود 300 میلی‌گرم از برگ­ گیاه درون هاون چینی همراه با 500 میکرولیتر از بافر CTAB به خوبی ساییده شد. در ادامه محتویّات هاون به مدّت 20 دقیقه در دمای ۶5 درجه سانتی گراد قرار گرفت. سپس یک حجم از کلروفورم به نمونه ها اضافه و به مدت 5 دقیقه ورتکس گردید. سپس سانتریفیوژ در دمای اتاق با سرعت rpm13500 انجام و فاز رویی به تیوب جدید منتقل شد. در انتها DNA به روش اتانول رسوب داده شد و بعد از خشک شدن 50-30 میکرو­لیتر آب استریل اضافه و در 20- درجه سانتی گراد نگهداری گردید.

استخراج RNA : حدود 200 میلی­گرم از برگ­ گیاه درون هاون و در حضور ازت مایع ساییده شدند. در ادامه 700 میکرولیتر تریزول اضافه شد و کاملاً مخلوط گردید تا محلول یکنواختی ایجاد شود. سپس به آن 200 میکرولیتر کلروفرم اضافه گردید و پس از ورتکس کردن، سانتریفیوژ با سرعت rpm14000 به مدّت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد صورت گرفت. مایع رویی به تیوب جدید منتقل و به میزان 2 حجم ایزوپروپانول اضافه گردید. تیوبها به مدّت یک شب در 20- درجه سانتی گراد نگهداری شدند و روز بعد سانتریفیوژ به مدّت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد با سرعت rpm14000 انجام شد. در ادامه رسوب­دهی به روش اتانول انجام شد و بعد از خشک شدن، به میزان 50-30 میکرولیتر آب مقطر استریل عاری از RNase به آن اضافه گردید. به منظور حذف مولکولهای DNA ازRNA  استخراج شده، واکنش DNase توسّط کیت Qiagen انجام گرفت و بررسی کمّی RNA با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Eppendorf) و محاسبه نسبت میزان جذب طول موج 260 نانومتر بر طول موج 280 نانومتر (A260/280) صورت پذیرفت.

سنتز cDNAو واکنش PCR: برای سنتز cDNA از کیت) Superscript III ساخت شرکت  (Invitrogene استفاده گردید. پرایمرهای ژن housekeeping به نام rRNA 16s برای سنجش کیفیّت cDNA سنتز شده مورد استفاده قرار گرفت و جهت نرمالیزاسیون باندهای حاصل، محصولات واکنش روی ژل آگارز 1 درصد الکتروفورز گردید. بعد از نرمالیزاسیون، در واکنشهای PCR بعدی (با همان شرایط) از پرایمرهای اختصاصی قطعه ژنی، استفاده گردید.

نتایج

همان گونه که اشاره شد ژن­ rolC آگروباکتریوم و هومولوگ گیاهی آن- trolC - فنوتیپ کلروز را در گیاهان بیان کننده این ژنها اعمال میکنند (21و 23). در این تحقیق به منظور شناسایی عملکرد مولکولی این ژنها در ایجاد کلروز در گیاه توتون، مبنا بر این قرار گرفت تا با طراحی پرایمرهای گوناگون ژنوم کلروپلاستی، میزان بیان این ژنها در گیاهان تراژن القاء شده با دگزامتازون توسط تکنیکRT-PCR  (Reversetranscription-PCR) بررسی گردد و آنها با گیاهان تراژن القاء نشده و نیز گیاهان غیر تراژن (#) که به عنوان شاهد به کار می روند مقایسه شود. در ابتدا بذر گیاهان طبق دستورالعمل ذکر شده در بخش مواد و روشها استریل شده و در محیط جوانه­زنی قرار گرفتند تا اندازه گیاهچه­ها به حدی برسد که برای انتقال به محیط حاوی dex (دگزامتازون) جهت القاء بیان ژنها مناسب باشد (حدود 15 روز). پس از رسیدن گیاهچه­ها به این مرحله، آنها در محیط کشت حاوی dex قرار گرفتند. البته برای هر نمونه نیمی از گیاهچه­ها در محیط فاقد dex (به عنوان شاهدی دیگر) قرار داده شدند تا تغییرات فنوتیپی ایجاد شده در هر گروه به صورت واضحی مورد تشخیص قرار گیرد (تصویر1، الف و ب).

در این مرحله صفات مورفولوژیکی همچون کلروزه شدن گیاه ، کوتولگی و تولید ریشه­های منشعب و کوتاه­تر از حد نرمال حتی ریشه­های نابه جا در ساقه­های گیاه و گاهاً با انتهای پیچ خورده مشاهده شدند (تصویر1، ج تا ز). این صفات مربوط به گیاهان تراژن­ rolC و trolC و پس از القاء بودند و در گیاهان تراژن بدون القاء و گیاهان غیر تراژن (# یا شاهد) مشاهده نشدند.

 

 

تصویر1- الف و ب) گیاهچه­های 21 روزه تراژن  rolC و trolC در محیط دارای دگزامتازون (+) یا فاقد آن (-). ج تا ه) هر کدام از گیاهچه­ها را به صورت مجزا نشان داده شده است. تفاوتهای مورفولوژیک ناشی از ژنهای ­ rolC و trolC به خوبی آشکار است.  در گیاهچه­های  # تفاوتی بین حالت القاء (+) یا عدم آن (ـ) مشاهده نمی­شود. و) تولید ریشه­های نابه جا بر روی ساقه در گیاه القاء شده rolC. ز)رشد گیاهچه­های rolC  بر روی پارچه نازک. کاهش رشد کلی گیاه و فنوتیپ کلروزه در گیاهان القاء شده آشکار است.

 

DNA ژنومی از بافت برگ گیاهچه­های توتون  rolC ,trolCو شاهد استخراج گردید و برای اطمینان از تراژن بودن گیاهچه­ها، واکنش PCR  با پرایمر ژنهای rolC و trolC انجام و نتیجه بر روی ژل آگارز 1 درصد مورد بررسی قرار گرفت. همان طوری که در تصویر2 مشاهده می­شود باند مربوط به ژنهای rolC و trolC در لاین 1و 2 کاملاً قابل مشاهده است (bp500)، در حالی که در ستون مربوط به نمونه شاهد (لاین 3) این باند مشاهده نمی­شود. این آزمایش تراژن بودن گیاهان مورد بررسی را تأیید کرد.

  

تصویر 2- PCR  بر روی DNAهای استخراج شده از گیاهچه­های rolC (لاین 1)،  trolC (لاین 2) و شاهد # (لاین 3). M معرف مارکر وزن مولکولی می­باشد.

جهت سنجش کیفی RNAهای استخراج شده و اطمینان از عاری بودن DNA در آنها، واکنش PCR بر روی این RNAها با استفاده از پرایمرهای یک ژن house keeping به نام 16srRNA انجام شد و نتیجه بر روی ژل آگارز الکتروفورز بررسی گردید (تصویر مربوطه آورده نشده است). مطابق انتظار در هیچ کدام از نمونه­ها باند مربوط به rRNA16s مشاهده نشد و به عبارت دیگر ­RNAهای استخراجی به دلیل عملکرد خوب آنزیم DNase عاری از DNA بودند.

رونویسی معکوس از روی RNAها به کمک آنزیم ترانس­کریپتاز معکوس انجام گرفت و واکنش PCR بر روی DNA سنتز شده با استفاده از پرایمر ژنهای rolC و trolC، جهت اطمینان از بیان این ژنها در گیاهان تراژن القاء شده و عدم بیان آنها در صورت عدم القاء استفاده شد. PCR  دیگری نیز با پرایمرهای ژن rRNA16s جهت نرمالیزه نمودن باندها انجام شد و نتیجه واکنش بر روی ژل آگارز 1 درصد مورد بررسی قرار گرفت. نتایج الکتروفورز ژل آگارز نشان داد که این ژن به خوبی در همه گیاهان بیان می­شود (تصویر 3).

 

تصویر3- RT-PCR توسّط پرایمرهای اختصاصی ژنهای rolC و trolC. M) مارکر وزن مولکولی، 4-1) گیاهان تراژن و5 و 6) گیاه تیپ وحشی #. باندهای مشاهده شده مربوط به ژنهای rolC و trolC همراه با القاء توسط dex (+) می­باشند (bp400) و در گیاهانی که القاء نشده اند (-) حضور ندارد  . تصویر پایین مربوط به نتیجه واکنش PCR توسّط پرایمرهای ژن rRNA16s می باشد.

در مرحله بعد، بیان ژن­ psbA که یکی از مهم ترین ژنهای کلروپلاستی گیاه توتون می باشد بررسی گردید. این ژن­، از ژنهای اصلی درگیر در مسیر فتوسنتز می­باشد و اختلال در بیان آن می تواند موجب کاهش یا قطع تولید کلروفیل و در نتیجه ایجاد کلروز ­گردد.

 

تصویر 4- RT-PCR توسّط پرایمرهای ژن­ کلروپلاستی psbA. M) مارکر وزن مولکولی، لاینهای 1 و 4 به ترتیب مربوط به گیاهان القاء شده trolC و rolC و لاینهای شماره 2 و 3 مربوط به گیاهان القاء نشده مذکور می باشد.

همان گونه که در تصویر4 مشاهده می­شود در گیاهان تراژن trolC و rolCی  بدون القاء، ژن psbA  به خوبی بیان می­شود (لاین 2 و 3)، در صورتی که در گیاهان  rolC  القاء شده بیانی از ژن psbA  مشاهده نمی­شود(لاین 4)   و در گیاهان trolC  القاء شده  نیز این بیان بسیار ضعیف است (لاین 1). آزمایشات فوق مؤید این مطلب است که با بیان ژنهای rolC و trolC، بیان ژن کلروپلاستی psbA مختل شده که نتیجه آن می تواند اختلال در سنتز طبیعی متابولیتهای فتوسنتزی و در نهایت تولید طبیعی کلروفیل و در نتیجه ایجاد کلروز ­گردد. ژن psbA کد کننده­ یکی از پروتئینهای فتوسیستم II می­باشد که عدم بیان آن با اختلال در تشکیل فتوسیستم II و سنتز نشدن کلروفیل و در نتیجه عاملی برای ایجاد کلروز است.

بحث و نتیجه گیری

یکی از دغدغه­های بسیار مهم که امروزه ذهن بسیاری از محققان علوم گیاهی را به خود مشغول نموده است، رفع پدیده کلروز در بسیاری از گیاهان به ویژه انواع زینتی و خوراکی است. علت­یابی این موضوع به خصوص از نقطه نظر ژنتیکی و مولکولی آن در عصر حاضر از اهمیت بسیار زیادی برخوردار است. کاهش محتوای کلروفیل در برگها می­تواند به خاطر عواملی چون اختلال در مسیر تولید کلروفیل ویا تجزیه­ آن (1 و 4) ، کمبود مواد معدنی مانند آهن (17)، به کارگیری ترکیبات سمی مانند تنتوکسین و افزایش رادیکالهای آزاد اکسیژن (2 و 16) باشد.

ژنهای بسیاری در ژنوم کلروپلاست گیاهان وجود دارند که بیان یا عدم بیان آنها مستقیم یا غیر مستقیم می­تواند موجب بروز کلروز در گیاهان گردد. مطالعات گسترده­ای در زمینه­ یافتن ارتباط میان این دسته از ژنها با پدیده کلروز در گیاهان مدل صورت گرفته است که نشان دهنده وجود ارتباط میان آنها است. Yoshida و همکارانش (1996) با بررسیهایی که بر روی گیاه برنج انجام دادند متوجه وجود ارتباط بین میزان بیان ژن rpoB کلروپلاستی (کدکننده زیرواحد β از RNA پلیمراز پلاستی) و ایجاد کلروز در این گیاه شدند (34). در یک بررسی دیگر محققان با استفاده از گیاهان توتون جهش یافته در ژنهای کلروپلاستی rpoA، rpoB و rpoC1 (rpo¯) فنوتیپ سفید رنگ (کلروزه) را در گیاهان مشاهده نمودند (11). ژنهای psbA و psbB نیز دسته­ دیگری از ژنهای کلروپلاستی هستند که عدم بیانشان موجب ایجاد کلروز می­گردد. این ژنها کد­کننده پروتئینهای مربوط به کمپلکس فتوسیستم II می­باشند. در گیاهان تراژن جو (Barley) به علت وجود جهش در ژنهای فوق الذکر، نقص عملکرد صحیح فتوسیستم II و عدم تکامل کلروپلاست و در نهایت فنوتیپ کلروزه مشاهده گردیده است (15). Chen و همکارانش (2011) با مطالعه بر روی ژن کد کننده­ زیرواحد بزرگ آنزیم روبیسکو (rbcL) گزارش کردند که افزایش بیان این ژن تحت تأثیر برخی عوامل اگزوژن همچون سولفید هیدروژن (H2S) منجر به افزایش محتوای کلروفیل در گیاهان و سبز شدن هرچه بیشتر آنها می شود (9).

پژوهش حاضر به یکی دیگر از ابعاد بسیار مهم و تأثیرگذار در ایجاد فنوتیپ کلروز در گیاهان، با به کارگیری گیاهان تراژن توتون پرداخته است. هدف از انتخاب این گیاه علاوه بر کشت آسان و راندمان بالای تراژن­سازی،  ساده بودن و آشنایی زیاد با ژنوم آن می­باشد. در این تحقیق تأثیر و نقش ژنهای خارجی وارد شده به ژنوم گیاه - یعنی ژن rolC از باکتری آ. ریزوژنز و هومولوگ گیاهی آن در توتون یا ژن trolC-  بر روی پدیده­ کلروز مورد توجه قرار گرفته شده است. نتایج به دست آمده نشان داد که ژن کلروپلاستی psbA در گیاهان تراژن  rolC و trolC در صورت  عدم القاء به خوبی بیان می شود، در حالی­که با القای ژنهای rolC و trolC، بیان ژن psbA  کاسته و حتی متوقف می گردد که در واقع با زردی گیاهان تراریخت نیز توأم است. این ژن کد کننده یکی از پروتئینهای سازنده فتوسیستم II می­باشد که عدم بیان آن با اختلال در تشکیل فتوسیستم II و سنتز نشدن کلروفیل در این گیاهان و در نتیحه ایجاد کلروز در آنها می باشد. با توجه به هومولوژی توالی نوکلئوتیدی و اسید آمینه­ای ژنهای  rolC و trolC و پروتئینهای مربوطه و شباهتهای فیزیومورفولوژیک حاصل از گیاهان تراریخت  rolC و trolC که شامل مواردی چون کاهش رشد کلی گیاه، ریشه­های کوتاه و پیچ خورده و نیز افزایش جذب قند و نشاسته (21) می­باشد و نیز وجود پروتئینهای میانکنش کننده مشابه با پروتئینهای RolC و tRolC مثل پروتئین   TCP13(نتایج منتشر نشده محجل شجا و همکاران) تحقیق پیش رو شباهت عملکردی ژنهای rolC و trolC  را در سطح مولکولی به اثبات می رساند که همراستا با مشاهدات فتوتیپی می­باشند. به عبارت دیگر rolC و trolC  با کاهش بیان یک ژن خاص (psbA) موجب تظاهر یک فنوتیپ خاص (کلروز) می­گردند.

1- زهره امینی و رحیم حداد.1392. نقش رنگیزه های فتوسنتزی و آنزیمهای آنتی اکسیدان در مقابل تنش اکسیداتیو. مجله پژوهشهای سلولی مولکولی. شماره 3. صفحه 251-265

2-مریم السادات ذکری؛ پروین صالحی شانجانی؛ حمیده جوادی؛ محمد علی علیزاده.1393. بررسی تنوع ژنتیکی جمعیت‌های سه گونه بابونه  (Anthemis sp)با استفاده از فعالیت آنزیمی پراکسیداز. مجله پژوهشهای سلولی  مولکولی. شماره 1. صفحه 35-43.  

 

3- Aoki, S. and Syono, K. 1999. Synergistic function of rolB, rolC, ORF13 and ORF14 of TL-DNA of Agrobacterium rhizogenes in hairy root induction in Nicotiana tabacum. Plant Cell Physiol. 40, 252–256.

4- Arsova, B., Hoja, U., Wimmelbacher, M., Greiner, E., Ustun, Sx., Melzer, M., Petersen, K., Lein, W. and Bornke, F. 2010. Plastidial thioredoxin z interacts with two fructokinase like proteins in a thiol-dependent manner: Evidence for an essential role in chloroplast development in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana. Plant Cell, 22, 1498–1515.

5- Bulgakov, V. P., Veselova, M. V., Tchernoded, G. K., Kiselev, K. V., Fedoreyev, S. A. and Zhuravlev, Y. N. 2005. Inhibitory effect of the Agrobacterium rhizogenes rolC gene on rabdosiin and rosmarinic acid production in Eritrichium sericeum and Lithospermum erythrorhizon transformed cell cultures. Planta, 221, 471–478.

6- Cardarelli, M., Mariotti, D., Pomponi, M., Spano, L., Capone, I. and Contantino, P. 1987. Agrobacterium rhizogenes T-DNA capable of inducing hairy root phenotype. Mol. Gen. Gene, 209, 475-480.

7- Casanova, E., Trillas, M.I., Moysset, L.a. and Vainstein, A. 2005. Influence of rol genes in floriculture. Biotechnol Adv, 23, 3-39.

8- Casanova, E., Valdes, A. E., Zuker, A., Fernandez, B., Vainstein, A. and Trillas, M. I. 2004. rolC-transgenic carnation plants: adventitious organogenesis and levels of endogenous auxin and cytokinins. Plant Sci. 167, 551–560.

9- Chen, J., Wu, F.H., Wang, W.H., Zheng, C.J., Lin, G.H., Dong, X.J., He, J.X., Pei, Z.M. and Zheng, H.L. 2011. “Hydrogen Sulphide Enhances Photosynthesis Through Promoting Chloroplast Biogenesis, Photosynthetic Enzyme Expression, and Thiol Redox Modification in Spinacia Oleracea Seedlings.” Journal of Experimental Botany, 62, 4481-4493.

10- Christensen, B., Sriskandarajah, S., Serek, M. and Müller, R. 2008. Transformation of Kalanchoe blossfeldiana with rol-genes is useful in molecular breeding towards compact growth. Plant Cell Rpt. 27, 1485–1495.

11- De Santis-Maciossek, G., Kofer, W., Bock, A., Schoch, S., Maier, R.M., Wanner, G., Rüdiger, W., Koop, H.U. and Herrmann, R.G. 1999. Targeted disruption of the plastid RNA polymerase genes rpoA, B and C1: molecular biology, biochemistry and ultra structure. Plant J. 18, 477–489.

12- Dessaux, Y., Petit, A., Farrand, S. K. and Murphy, P. J.  1998. Opines and opine-like molecules involved in plant/Rhizobiaceae interactions. In The Rhizobiaceae (eds H. P.Spaink, A. Kondorosi and P. J. Hooykaas),  173–197.

13- Draper J., Scott R., Armitage P. and Walden R. 1988. Plant Genetic Transformation and Gene Expression. A Laboratory Manual .London. Blackwell Scientific Publications Ltd.

14- Fladung, M., Ballvora, A. and Schmülling, T. 1993. Constitutive or light regulated expression of the rolC gene in transgenic potato plants has different effects on yield attributes and tuber carbohydrate composition. Plant Molecular Biology, 23, 749-757.

15- Gamble, P. E. and Mullet, J. E. 1989. J. Biol. Chem. 264, 7236-7242

16- Holland, N., Evron, Y., Jansen, A.k., Edelman, M. and Pick, U. 1997. lnvolvement of Thylakoid Overenergization in Tentoxin induced Chlorosis in Nicotiana spp. Plant Physiol. 114, 887-892.

17- Koenig, R. and M.R. Kuhns. 1996. Control of iron chlorosis in ornamental and crop plants. Utah StateUniv. AG-SO-01. Electronic publication.

18- Kurioka, Y., Suzuki, Y., Kamads, H. and Harada, H. 1992. Promotion of flowering and morphological alteration in Atropa belladonna transformed with CaMV 35S-rolC chimeric gene of the Ri plasmid. Plant Cell Rpt. 12, 1–6.

19- Maurel, S., Barbier-Bryqoo, H., Spena, A., Tempe, G. and Guern, G. 1991. Single rol genes from the Agrobacterium rhizogenes TL-DNA alter some of the cellular responses to auxin in Nicotiana tobacum. Plant Physiol. 97, 212–216.

20- Meyer A. D., Ichikawa T. and Meins F. 1995. Horizontal gene transfer: regulated expression of tobacco homologue of the Agrobacterium rhizogenes rolC gene. Mol. Gen. Genet, 249, 265–273.

21- Mohajjell shoja, H., Clement, B., Perot, J. and Otten. L. 2011. Contribution to the study of the Agrobacterium rhizogenes plast genes, rolB and rolC, and their homologs in Nicotiana tabacum. Molecular Plant-Microbe Interaction, 24, 44-53.

22- Rao, S.R. and Ravishankar, G. 2002. Plant cell cultures: chemical factories of secondary metabolites. Biotechnol Adv, 20, 101–153.

23- Riker, A.J., Banfield, W.M., Wright, W.H., Keitt, G.W. and Sagen, H.E. 1930. Studies on infectious hairy root of nursery-apple tree. J Agric Res, 41, 507–540.

24- Schmülling, T., Schell, J. and Spena, A. 1988. Single genes from Agrobacterium rhizogenes influence plant development. EMBO J, 7, 2621–2629.

25- Shen, W.H., Petit, A., Guern, J. and Tempe, J. 1988. Hairy roots are more sensitive to auxin than normal roots. Proc Natl Acad Sci USA, 85, 3417-3421.

26- Shkryl, Y. N., Veremeichik, G. N., Bulgakov, V. P., Tchernoded, G. K., Mischenko, N. P., Fedoreyev, S. A. and Zhuravlev, Y. N. 2008. Individual and combined effects of the rolA, B and C genes on anthraquinone production in Rubia cordifolia transformed calli. Biotechnol. Bioeng. 1, 118-125.

27- Slightom, J. L., Durand-Tardif, M., Jouanin, L. and Tepfer, D. 1986. Nucleotide sequence analysis of TL-DNA of Agrobacterium rhizogenes agropine-type plasmid: identification of open reading frames. J. Biol.Chem, 261, 108–121.

28- Spano, L., Mariotti, D., Cardarelli, M., Branca, C. and Costantino, P. 1988. Morphogenesis and auxin sensitivity of transgenic tobacco with different complements of Ri T-DNA. Plant Physiol, 87,  479-483.

29- Suzuki, K., Yamashita, I. and Tanaka, N. 2002. Tobacco plants were transformed by Agrobacterium rhizogenes infection during their evolution. Plant J, 32, 775–787.

30- Tempe´ J., Petit A. 1982. Opine Utilization by Agrobacterium. New York: Academic.

31- Tepfer, D. 1984. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes: sexual transmission of the transformed geneotype and phenotype. Cell, 37, 959–967.

32- White, F. F., Garfinkel, D. J., Huffman, G. A., Gordon, M. P. and Nester, E. W. 1983. Sequence homologous to Agrobacteriurn rhizogenes T-DNA in the genomes of uninfected plants. Nature, 301, 348–350.

33- Winans, S. C. 1992. Two-Way Chemical Signaling in Agrobacterium-Plant Interactions. Microbiological reviews 51, 12–31.

34- Yoshida, R., Kanno, A. and Kameya, T. 1996. Cool Temperature-lnduced Chlorosis in Rice Plants. Plant Physiol. 112, 585-590.

35- Yokoyama, R., Hirose, T., Fujii, N., Aspuria, E., Kato, A. and Uchimiya, H. 1994. The role promoter of Agrobacterium rhizogenes Ri plasmid is activated by sucrose in transgenic tobacco plants. Mol Gen Genet, 244, 15–22.

36- Zuker, A., Tzfira, T., Scovel, G., Ovadis, M., Shklarman, E. and Itzhaki, H. 2001. rolC-transgenic carnation with improved agronomic traits: Quantitative and qualitative analyses of greenhouse-grown plants. J. Am. Soc. Hortic. Sci, 126, 13–18.