نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه بیوتکنولوژی، دانشکده علوم و فناوری‌های نوین، دانشگاه اصفهان

2 اصفهان، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، مرکز تحقیقات بیوسنسور

3 گروه علوم تشریحی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان

چکیده

ساخت نانوسامانه‌های هدفمند انتقال دارو از یک طرف امکان دسترسی زیستی به دارو را بهبود بخشیده و از طرف دیگر اثرات جانبی زیان‏بار آن را بر سایر نقاط بدن به حداقل ممکن رسانده است. از جمله‌ی این نانوسامانه‌ها می‌توان به نانوذرات اکسید آهن اشاره کرد که امروزه به صورت گسترده در تصویربرداری تشدید مغناطیسی به عنوان عامل بهبود کیفیت تصویر استفاده می‌شود. این خاصیت ممتاز این نانوذرات همراه با قابلیت هدفمند کردن آن‌ها از طریق میدان مغناطیسی خارجی سبب جلب توجه بسیاری از محققین به آن‌ها شده است. پوشش‌دهی سطح نانوذرات توسط پلیمرهای زیست‌سازگار سبب بهبود خواص زیستی آن‌ها می‌شود. در این زمینه می‌توان به پلیمرهای پرشاخه اشاره کرد که با دارا بودن تعداد زیادی گروه عاملی سطحی می‌توانند به صورت هدفمند داروها را منتقل کنند. هدف از این پژوهش ساخت نانوذرات اکسید آهن، پوشش‌دهی آن توسط پلیمر پرشاخه‌ی پلی‌گلیسرول و مقایسه‌ی زیست‌سازگاری نانوذرات پوشش‌دار و بدون پوشش است. در ابتدا نانوذرات با استفاده از روش تجزیه‌ی حرارتی ساخته شده و سپس توسط روش حلقه‌گشا پوشش‌دهی شد. در انتها به منظور ارزیابی زیست‌سازگاری از آزمون‌ سمیت سلولی (MTT assay) استفاده شد. نتایج مربوط به بررسی و مشخصه‌یابی نانوذرات به خوبی نشان‌دهنده‌ی ساخت نانوذرات‌ با قطر متوسط 11 نانومتر و پوشش‌دهی موفق آن‌ها توسط پلیمر پرشاخه بود. به علاوه بررسی‌های مربوط به زیست‌سازگاری سلولی نشان داد که نمونه‌های بدون پوشش از غلظت µg/ml200 به بالا دارای سمیت سلولی بودند در حالی‌که نمونه‌های پوشش‌دار فاقد این اثر سمیت بود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Design, synthesis, characterization and bioactivity evaluation of polyglycerol-grafted Fe3O4 nanoparticles

نویسندگان [English]

  • Atefeh Zarepour 1
  • mohammad rafieenia 2

چکیده [English]

The development of drug delivery nano-systems has improved the drug bioavailability while reducing their adverse side effects. Among them, iron oxide nanoparticles have gained lots of attention due to their applications as contrast agent in MRI technique as well as being targeted through an external magnetic field. The biological properties of these nanoparticles have been improved through surface modifications by different kinds of polymers. Hyperbranched polymers are of great interest due to existence of plenty of surface functional groups which could be utilized in conjugation of targeting and/or tracing agents. In this study, we have synthesized iron oxide nanoparticles using thermal decomposition method, modified its surface with hyperbranched polyglycerol through ring opening polymerization and compared its biocompatibility with naked iron oxide nanoparticles. The results confirmed the synthesis of iron oxide nanoparticles with average diameter of 11 nm coated with hyperbranched polyglycerol. The comparative biocompatibility tests revealed that naked nanoparticles show cytotoxicity when the concentration reaches above 200 µg/ml, whereas they are safe when coated with hyperbranched polyglycerol.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Iron oxide nanoparticles
  • Biocompatible polymers
  • Cytotoxicity test

طراحی، ساخت، مشخصه­یابی و ارزیابی زیستی نانوذرات اکسید آهن پوشش داده شده با پلیمر پرشاخه پلی­گلیسرول

عاطفه زارع­پور1، محمد رفیعی نیا2، علی ضرابی1 و حسین صالحی3* 

1 اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم و فناوریهای نوین، گروه بیوتکنولوژی

2 اصفهان، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، مرکز تحقیقات بیوسنسور 

3 اصفهان، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، دانشکده پزشکی، گروه علوم تشریحی 

تاریخ دریافت: 21/2/94                تاریخ پذیرش: 1/6/94 

چکیده

ساخت نانوسامانه­های هدفمند انتقال دارو از یک طرف امکان دسترسی زیستی به دارو را بهبود بخشیده و از طرف دیگر اثرات جانبی زیان‏بار آن را بر سایر نقاط بدن به حداقل ممکن رسانده است. از جمله این نانوسامانه­ها می­توان به نانوذرات اکسید آهن اشاره کرد که امروزه به صورت گسترده در تصویربرداری تشدید مغناطیسی به عنوان عامل بهبود کیفیت تصویر استفاده می­شود. این خاصیت ممتاز این نانوذرات همراه با قابلیت هدفمند کردن آنها از طریق میدان مغناطیسی خارجی سبب جلب توجه بسیاری از محققین به آنها شده است. پوشش­دهی سطح نانوذرات توسط پلیمرهای زیست­سازگار سبب بهبود خواص زیستی آنها می­شود. در این زمینه می­توان به پلیمرهای پرشاخه اشاره کرد که با دارا بودن تعداد زیادی گروه عاملی سطحی می­توانند به صورت هدفمند داروها را منتقل کنند. هدف از این پژوهش ساخت نانوذرات اکسید آهن، پوشش­دهی آن توسط پلیمر پرشاخه پلی­گلیسرول و مقایسه زیست­سازگاری نانوذرات پوشش­دار و بدون پوشش است. در ابتدا نانوذرات با استفاده از روش تجزیه حرارتی ساخته شده و سپس توسط روش حلقه­گشا پوشش­دهی شد. در انتها به منظور ارزیابی زیست­سازگاری از آزمون­ سمیت سلولی  (MTT assay) استفاده شد. نتایج مربوط به بررسی و مشخصه­یابی نانوذرات به خوبی نشان­دهنده­ی ساخت نانوذرات­ با قطر متوسط 11 نانومتر و پوشش­دهی موفق آنها توسط پلیمر پرشاخه بود. به علاوه بررسیهای مربوط به زیست­سازگاری سلولی نشان داد که نمونه­های بدون پوشش از غلظت µg/ml200 به بالا دارای سمیت سلولی بودند در حالی­که نمونه­های پوشش­دار فاقد این اثر سمیت بود. 

واژه های کلیدی: نانوذرات اکسید آهن، پلیمرهای زیست­سازگار، آزمون سمیت سلولی.

* نویسنده مسئول: تلفن: 03137922443 ، پست الکترونیکی:  ho_salehi@med.mui.ac.ir

مقدمه 

 

با وجودی که هنوز چند دهه بیشتر از ظهور علم نانو در جهان نمی­گذرد اما خصوصیات منحصر به فرد آن سبب کاربرد گسترده آن در زمینه­های مختلف علم، از برق و مکانیک گرفته تا زیست­شناسی و پزشکی شده است. نانومواد به موادی اطلاق می­شود که حداقل در یک بعد دارای اندازه نانومتری - بین 1 تا 100 نانومتر-  باشند. این کاهش اندازه سبب تغییر در خصوصیات ماده شده و خواص جدید و بعضاً بهبود یافته­ای را به آن می­بخشد (7، 9، 16، 26 و 28).

در چند سال اخیر استفاده از نانوذرات در زمینه پزشکی توجه بسیاری از محققین را به خود جلب کرده است. اندازه بسیار کوچک این ذرات به آنها اجازه می­دهد که بتوانند به راحتی وارد بافتها، سلولها و حتی اندامکهای داخل سلولی شوند و به این ترتیب می­توان از آنها برای تصویربرداری داخل سلولی و یا انتقال داروها و عوامل درمانی به داخل سلولها استفاده کرد (13).

نانوذرات مغناطیسی از جمله این نانوذرات است که به علت خصوصیات ویژه خود کاربرد گسترده­ای را در علم پزشکی پیدا کرده است. از فلزات مختلفی به منظور ساخت این نانوذرات استفاده شده است که به عنوان مثال می­توان به آهن، کبالت و نیکل اشاره کرد. از میان این فلزات نانوذرات مغناطیسی بر پایه اکسید آهن، شامل مگنتیت (Fe3O4) و ماقمیت (γ-Fe2O3)، بیشترین کاربرد را دارند که از جمله کاربردهای آنها می­توان به عامل بهبود دهنده تضاد در تصویربرداری مغناطیسی، دارورسانی هدفمند، گرمادرمانی، ترمیم بافت و ... اشاره کرد (10، 23، 30، 34، 36 و 41).

نکته قابل توجه، بررسی زیست­سازگاری این نانوذرات به منظور کاربرد آن در داخل بدن است. پژوهشهای متعددی به منظور بررسی زیست­سازگاری این نانوذرات انجام شده که نتایج متفاوت و بعضاً متضادی را در برداشته است (3، 14، 19، 21، 23 و 40).

زمانی­که ابعاد این نانوذرات از محدوده خاصی کوچک­تر شود خاصیت مغناطیسی آنها به خاصیت سوپر پارامغناطیس تغییر می­کند. مواد سوپر پارامغناطیس موادی هستند که دارای تک حوضه مغناطیسی بوده و  تمام‌ اسپینهای اتمی آنها به‌طور یکنواخت در جهت یکسان مغناطیسی می‌شوند. در مورد این نانوذرات به محض تغییر در جهت میدان خارجی تمامی حوضه­های داخلی نیز تغییر جهت می­دهند (44).

کاربرد نانوذرات سوپر پارامغناطیسی اکسید آهن در زمینه زیست­شناسی و پزشکی، به ویژه در دو حوزه تشخیص و درمان، نیازمند پایداری آنها در محیطهای آبی و همین­طور  pHو شرایط فیزیولوژیک طبیعی بدن می­باشد. این پایداری کلوئیدی وابسته به شکل ذرات، اندازه آنها، بار سطحی و ساختار شیمیایی سطح این ذرات است (35).

به منظور افزایش زیست­سازگاری نانوذرات می­توان از پوشش­دهی آنها توسط پلیمرهای زیست­سازگار استفاده کرد. این پوشش­دهی نه تنها سبب افزایش پایداری کلوئیدی آنها خواهد شد بلکه از سمیت آنها نیز کاسته و سبب افزایش زمان حضور این نانوذرات در سیستم گردش خون خواهد شد زیرا مانع از اتصال و جذب سطحی پروتئینها بر سطح این نانوذرات می­شود (27). در این زمینه از پلیمرهای مختلفی استفاده شده که از جمله می­توان به چیتوسان، دکستران، پلی اتیلن اکسید، پلی وینیل الکل، پلی اتیلن گلیکول و ... اشاره کرد که هر کدام مزایا و معایب خاص خود را دارا می­باشند (4، 20، 22، 37 و 39).

پلیمر جدیدی که اخیراً مورد توجه بسیار واقع شده پلی­گلیسرول می­باشد. این پلیمر زیر مجموعه­ای از پلیمرهای پلی­اتر با زیست­سازگاری بسیار بالا می­باشد که از پلیمریزاسیون حلقه گشای واحدهای مونومری گلایسیدول ایجاد می­شود. زیست­سازگاری بالای آن در مقایسه با پلیمرهای قبلی به همراه خصوصیات دیگری مانند پایداری حرارتی بالا، ویسکوزیته کم و عدم جذب پروتئین بر سطح آن باعث شده تا این پلیمر به عنوان یک کاندید بسیار مناسب جهت کاربردهای درون­تنی معرفی شود (17، 31 و 38).

پوشش­دهی سطح نانوذرات مغناطیسی توسط پلیمر پرشاخه پلی­گلیسرول نه تنها سبب بهبود زیست­سازگاری آنها می­شود بلکه این پلیمر می­تواند به عنوان محلی جهت بارگذاری دارو عمل کند. ساختار این پلیمر به گونه­ایست که دارای گروههای آب­دوست و آب­گریز بوده و در نتیجه جهت حمل عوامل دارویی آب­دوست و آب­گریز می­تواند مورد استفاده واقع شود. وجود تعداد زیادی گروه عاملی هیدروکسیل در سطح این پلیمر سبب افزایش آب­دوستی سطح نانوذرات پوشش­دار شده و به علاوه می­تواند محلی برای اتصال عوامل ردیاب یا عوامل هدفمندکننده عمل کند (6، 32 و 33).

هدف از این پژوهش در ابتدا ساخت نانوذرات اکسیدآهن و پوشش­دهی آن توسط پلیمر پرشاخه پلی­گلیسرول می­باشد. سپس به منظور بررسی اثر پوشش بر زیست­سازگاری نانوذرات ساخته شده از آزمون MTT استفاده شد. بدین منظور از دو رده سلولی MG-63 و MCF-7 استفاده گردید و اثر نانوذرات در دو حالت پوشش­دار و بدون پوشش در غلظتهای مختلف برروی میزان مرگ سلولی این دو رده مورد ارزیابی قرار گرفت.

مواد و روشها

مواد: جهت ساخت نانوذرات اکسید آهن از آهن (ІІІ) استیل استانوآت (Merck-803912)، تری اتیلن گلیکول (Merck-808245) و اتیل استات (Merck-109623) استفاده شد. جهت پوشش­دهی نانوذرات از مونومر گلایسیدول (Aldrich-G5809) استفاده شد. جهت انجام آزمون کشت سلولی از رده­های سلولیMCF-7 و MG-63 (انستیتوپاستور ایران)، بافر نمکی فسفات (CMG)، محیط کشت DMEM (BioIdia)، آنزیم تریپسین (BioIdia-B11033)، آنتی­بیوتیک پنی­سیلین- استرپتومایسین (BioIdia-BI1036)، سرم جنین گاوی (Gibco-106-10270) استفاده شد.

ساخت نانوذرات اکسید آهن و پوشش­دهی آن توسط پلیمر پرشاخه پلی­گلیسرول: به منظور ساخت نانوذرات اکسید آهن از روش تجزیه حرارتی پیش ماده آهن در حضور حلال تری اتیلن گلیکول استفاده شد (43). بدین منظور 2 میلی مول از آهن (ІІІ) استیل استانوآت با 30 میلی­لیتر تری اتیلن گلیکول مخلوط شده و در اثر حرارت­دهی تا دمای رفلاکس تری اتیلن گلیکول نانوذرات اکسید آهن ساخته شد. پس از خنک­سازی محلول حاصل تا دمای اتاق 20 میلی­لیتر اتیل استات به محلول اضافه شده و نانوذرات توسط آهن­ربا رسوب داده شدند. در نهایت رسوب حاصل توسط آون خلا خشک گردید.

جهت پوشش­دهی نانوذرات ساخته شده از روش پلیمریزاسیون حلقه گشا استفاده شد. برای این منظور مقدار 30 میلی­گرم از نانوذرات ساخته شده با 4 میلی­لیتر مونومر گلیسیدول مخلوط شده و به مدت 20 ساعت تحت دمای 140 درجه سانتی­گراد قرار داده شد. 

تصویربرداری نیروی اتمی: از میکروسکوپ نیروی اتمی (مدل Dual ScopeTM C-26 controller- DME Company، ساخت کشور دانمارک) جهت بررسی مورفولوژی و زبری سطح نانوذرات ساخته شده استفاده شد. بدین منظور محلول رقیقی از نانوذرات پوشش­دار و بدون پوشش در الکل تهیه شده و یک قطره از هر محلول برروی لام قرار داده شد. پس از تبخیر الکل و تثبیت نانوذرات برروی لام تصاویر آنها توسط میکروسکوپ مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور از مد تماسی میکروسکوپ و تیپ pyramid با ارتفاع 15-10 میکرون استفاده شده و تصاویر حاصل از آن در ابعاد mµ1 * mµ1 تهیه گردید.

تصویربرداری میکروسکوپ الکترونی: از میکروسکوپ الکترونی عبوری (مدل JEM-2100F، ساخت کشور ژاپن و تحت ولتاژ kV200) به منظور تعیین اندازه نانوذرات ساخته شده استفاده شد.

آزمون طیف‌سنجی تبدیل فوریه‌ی‌ مادون قرمز: از دستگاه طیف‌سنجی تبدیل فوریه‌‌ مادون قرمز ( مدل JACSO FT/IR 6300 ساخت کشور ژاپن) به منظور بررسی ساخت نانوذرات و پوشش­دهی موفق آنها توسط پلیمر پرشاخه پلی­گلیسرول استفاده گردید. بدین منظور مقدار بسیار کم از نانوذرات پوشش­دار و بدون پوشش، به طور جداگانه، با نمک KBr، با نسبت 5: 95 درصد، مخلوط گردیده و به شکل قرص درآمد. سپس قرص حاصل توسط دستگاه مورد ارزیابی قرار گرفت.

آزمایشهای سلولی: «کشت سلول»: به منظور بررسی و مقایسه زیست­سازگاری نانوذرات پوشش­دار و بدون پوشش از دو رده سلولی MG-63 و MCF-7 استفاده شد. بدین منظور ابتدا سلولها از فریز خارج شده و سپس درون فلاسک حاوی محیط کشت DMEM حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) و 1 درصد آنتی­بیوتیک کشت داده شده و به مدت 24 ساعت داخل انکوباتور 37 درجه و 5 درصد CO2 نگهداری شد تا سلولها به کف ظرف کشت متصل شوند. سلولها مرتباً وارسی شده و هر چهار روز یک بار پاساژ داده شدند تا برای انجام آزمایش آماده شوند.

پس از چندین مرحله پاساژ سلولی، سلولها به ظروف 96 چاهکی جهت انجام آزمایش سمیت سلولی منتقل شدند. بدین منظور تعداد 5000 سلول در داخل هر چاهک که حاوی 100 میکرولیتر محیط کشت می­باشد کاشته شده و به مدت 24 ساعت داخل انکوباتور 37 درجه قرار داده شد.

بررسی سمیت سلولی: از هر دو نمونه پوشش­دار و بدون پوشش، غلظتهای مختلفی (5، 25، 50، 100 و 200 میکروگرم بر میلی­لیتر) تهیه شده و پس از 24 ساعت بر نمونه­های سلولی داخل چاهکها اثر داده شد. تعداد سه چاهک به هر نمونه اختصاص داده شد. سلولها به مدت 24، 48 و 72 ساعت دیگر داخل انکوباتور قرار داده شدند. گروه شاهد تحت تأثیر هیچ کدام از نمونه­ها قرار نگرفت.

به منظور بررسی سمیت سلولی از آزمون MTT استفاده شد. این روش بر اساس احیای محلول زرد رنگ MTT به یک ترکیب نامحلول بنفش رنگ به نام فورمازان می­باشد که توسط آنزیم سوکسینات دهیدروژناز میتوکندریایی سلولهای زنده انجام می­گیرد (1و 2). جهت تهیه محلول MTT با غلظت 5/0میلی گرم بر میلی­لیتر، مقدار 5 میلی­گرم از پودر MTT در 10 میلی­لیتر از PBS، M 1/0 حل شد. پس از اتمام اثردهی نانوذرات بر سلولها، محیط کشت داخل چاهکها تخلیه شده و چاهکها دو بار توسط PBS شستشو داده شدند. سپس 100 میکرولیتر محیط کشت بدون سرم به هر چاهک افزده شده و مقدار 10 میکروگرم بر میلی­لیتر از محلول MTT به آن اضافه شد و پس از 4 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی­گراد محلول رویی سلولها خارج شده و به­جای آن 100 میکرولیتر محلول DMSO به چاهکهای مربوطه اضافه شد، سپس ظرف کشت به مدت یک ساعت دیگر داخل انکوباتور قرار گرفت. در انتها جذب نوری هر چاهک توسط دستگاه ELISA reader در طول موج nm570 خوانده شده و درصد زنده بودن سلولها با استفاده از فرمول زیر مورد محاسبه قرار گرفت:

100*(میانگین جذب نمونه شاهد/ میانگین جذب خوانده شده برای هر غلظت) = درصد زنده بودن سلولها

آزمون MTT در سه بازه زمانی 24، 48 و 72 ساعت بر روی سلولها انجام گرفت.

بررسی آماری: از نرم افزار SPSS (Version 21) برای تحلیل آماری نتایج استفاده گردید. نتایج به صورت (انحراف معیار ± مقدار میانگین) برای هر داده بررسی شده و معنی­دار بودن نتایج براساس مقدار 05/0p< گزارش شد. برای بررسی آماری از آنالیز پارامتری واریانس [ANOVA (Tukey)] استفاده شد.

نتایج 

تصویربرداری میکروسکوپ AFM: شکل 1 نتایج مربوط به تصویربرداری دوبعدی و سه بعدی میکروسکوپ AFM را نشان می­دهد. تصاویر نشان­دهنده اثر پوشش­دهی بر جلوگیری از خاصیت خود تجمعی نانوذرات اکسیدآهن می­باشد. به علاوه زبری سطح در حالت بدون پوشش pm499 بود که با انجام پوشش­دهی مقدار آن به pm514 افزایش یافت. افزایش مقدار زبری سطح در نمونه پوشش­دار تأیید کننده پوشش­دهی موفق آن می­باشد. 

 

 

 

شکل1 – نتایج مربوط به تصویربرداری AFM، نانوذرات اکسیدآهن الف) تصویر دو بعدی، ب) نمودار Height Histogram، ج) تصویر سه بعدی، نانوذرات اکسیدآهن پوشش­دهی شده د) تصویر دو بعدی، ه) نمودار Height Histogram، و) تصویر سه بعدی.


تصویربرداری میکروسکوپ الکترونی TEM: شکل 2 نتایج مربوط به تصویربرداری میکروسکوپ الکترونی از نانوذرات پوشش­دار و بدون پوشش را نشان می­دهد. تصاویر گرفته شده نشان داد که نانوذرات سنتز شده دارای توزیع همگون اندازه ذرات با قطر متوسط 5/11 نانومتر بود. همچنین مشخص شد که نانوذرات بدون پوشش خاصیت تجمع­یافتگی داشته و به صورت خوشه­ای در کنار یکدیگر قرار می­گیرند، این در حالی بود که نانوذرات پوشش­دار به صورت کاملاً مشخصی از یکدیگر مجزا هستند و در نتیجه اندازه یکنواخت­تری را نسبت به نمونه بدون پوشش داشته باشند. 

آزمون FTIR: شکل 3 نتایج مربوط به آنالیز FTIR را برای نانوذرات بدون پوشش و پوشش­دار نشان می­دهد. پیک قوی در ناحیه cm-1 577 در نمودار مربوط به نانوذرات Fe3O4 نشانگر گروه Fe-O بوده که بیان­کننده این است که Fe عنصر اصلی سازنده نانوذرات است. وجود پیکهای مشخص در بازه cm-1 2925-2809 و cm-1 1116-1050 به ترتیب مربوط به ارتعاشات C-H و C-O است که تأییدکننده اتصال تعدادی از مولکولهای تری اتیلن گلیکول بر روی سطح نانوذرات Fe3O4 است. پیک گسترده در محدوده cm-1 3600-2500 مربوط به ارتعاشات پیوند هیدروژنی است که بیان­کننده حضور گروه O-H در سطح نانوذرات سنتز شده می­باشد (5 و 24).

مقایسه نمودار ذرات پوشش­دار با نمودار مربوط به نانوذرات بدون پوشش بیان­کننده افزایش قابل توجهی در پیکهای ارتعاشی در محدوده نواحی cm-1 3400، 2900 و 1100 است که به ترتیب مربوط به باندهای O-H، C-H و C-O-C است. این نتیجه به خوبی تأییدکننده پوشش­دهی موفق نانوذرات توسط پلیمر پرشاخه می­باشد (24، 38 و 43).

آزمون MTT: بررسی سمیت سلولی اولین گام در بررسی زیست­سازگاری یک ماده می­باشد زیرا که روشی آسان و ارزان در جهت فهم سمیت آن ماده است. به علاوه در مقایسه با آزمونهای درون­تنی، این روش بسیار ساده­تر، قابل کنترل و فاقد موانع اخلاقی است. آنچه در اینجا مهم است کنترل شرایط محیطی است زیرا سلولها به شدت به تغییر شرایط محیطی حساس بوده و این تغییرات می­تواند نتایج مثبت کاذب در افزایش سمیت را نشان دهد (12 و 18).

 

 

 


 


 


شکل 2- نتایج مربوط به تصویر برداری میکروسکوپ الکترونی از الف) نانوذرات بدون پوشش، ب) نانوذرات پوشش داده شده و ج) نمودار توزیع اندازه نانوذرات اکسیدآهن بدون پوشش.

 

شکل3- نتایج مربوط به آنالیز FTIR از نانوذرات Fe3O4 و Fe3O4@HPG

 

در میان روشهای مختلفی که به منظور بررسی سمیت سلولی به­کار می­روند آزمون MTT به علت سادگی و در دسترس بودن ازجمله فراوان­ترین روشهای مورد استفاده می­باشد که براساس احیای محلول ­MTT به ترکیبی نامحلول به­ نام فورمازان توسط میتوکندری سلولهای زنده عمل می­کند (29 و 42).

در این قسمت نتایج مربوط به آزمون MTT نانوذرات پوشش­دار و بدون پوشش برروی دو رده سلولی MG-63 و MCF-7 بیان می­شود. با توجه به کاربرد این نانوذرات در درمان بیماری سرطان از دو رده سلولی گفته شده استفاده شد.

رده سلولی MG-63 : نتایج حاصل از بررسی زیست­سازگاری نانوذرات پوشش­دار و بدون پوشش در شکل 4 آورده شده است.

نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد که نانوذرات بدون پوشش در هر سه بازه زمانی 24، 48 و 72 ساعت در غلظت μg/ml 200 دارای اثر سمیت بر این رده سلولی بوده و سبب کاهش حدود 30 درصدی در میزان زنده بودن این سلولها شده است. به علاوه همان­طور که در تصاویر مشخص شده با کاهش غلظت نانوذرات اثر سمیت نیز کاهش یافته است.

این امر در حالی بوده که نمونه پوشش داده شده توسط پلیمر پرشاخه پلی­گلیسرول فاقد این اثر سمیت بوده و حتی در روز اول و دوم به عنوان یک عامل تقویتی در رشد سلولها عمل کرده است.

نتایج حاصل از این داده­ها توسط نرم­افزار SPSS (ANOVA Ver.22) مورد تجزیه و تحلیل واقع شده و مشاهده شد که نتایج مربوط به غلظت مزبور (μg/ml 200) نسبت به نمونه کنترل (که فقط شامل نمونه سلولی به تنهایی بوده) معنی­دار بوده که این خود تأیید کننده نتیجه گرفته شده از نمودارها است.

رده سلولی MCF-7: نتایج حاصل از تست MTT بعد از گذشت 24، 48 و 72 ساعت در شکل 5 آمده است.  

همان­طور که در تصویر مشخص است در اینجا نیز نانوذرات بدون پوشش در غلظت μg/ml 200 سبب کاهش در میزان زنده بودن سلولها شده­اند اگرچه مقدار کاهش مشاهده شده نسبت به رده قبلی کمتر است. نتایج مربوط به نمونه پوشش­دار نشان­دهنده اثر پوشش پلیمری بر کاهش مرگ سلولی و درنتیجه کاهش سمیت ناشی از نانوذرات اکسید آهن به ویژه در غلظتهای بالا می­باشد.

بحث و نتیجه­گیری

همان­طور که گفته شد در این پژوهش از روش تجزیه حرارتی به منظور ساخت نانوذرات آهن استفاده شد. از جمله مزایای این روش نسبت به سایر روشهای مرسوم می­توان به این موارد اشاره کرد: استفاده از یک پیش­ماده آهن و عدم نیاز به عوامل احیاء کننده و سورفاکتانت، بهبود خواص مغناطیسی و کریستالی نانوذرات ساخته شده به علت دمای بالا در حین فرآیند ساخت و در نهایت توزیع اندازه یکنواخت نانوذرات ساخته شده، که مجموعه این عوامل سبب انتخاب این روش جهت ساخت نانوذرات به منظور کاربردهای درون­تنی است (5 و 25). نانوذرات ساخته شده با استفاده از روش پلیمریزاسیون حلقه گشای مونومر گلیسیدول پوشش­دهی شد. اندازه نانوذرات ساخته شده با استفاده از میکروسکوپ الکترونی و میکروسکوپ نیروی اتمی تعیین شده و پوشش­دهی آن توسط پلیمر پلی­گلیسرول تأیید شد. سپس به منظور بررسی اثر پوشش­دهی بر زیست­سازگاری نانوذرات اکسید آهن از آزمون سمیت سلولی استفاده شد. بدین منظور دو رده سلولی MG-63 و MCF-7 مورد استفاده قرار گرفت. نتایج بیان کننده تأثیر مثبت پوشش­دهی بر افزایش میزان زنده بودن سلولها به ویژه در غلظت μg/ml 200 می­باشد.

 

 

 

الف

 

 

ب

 

 

ج

شکل4- نتایج مربوط به آزمون سمیت سلولی نانوذرات پوشش­دار و بدون پوشش بر روی رده سلولی MG-63 در سه بازه زمانی الف)24، ب)48 و ج)72 ساعت (05/0 p< ® *). 

 

مطالعات مختلفی به منظور بررسی اثر نانوذرات اکسید آهن برروی سلولهای مختلف انجام شده و نتایج بیان­کننده تأثیر غلظت نانوذرات و همین­طور رده سلولی به­کار برده شده بر مرگ سلولی است به گونه­ای که با افزایش غلظت نانوذرات سمیت سلولی آنها نیز افزایش می­یابد البته این اثر سمیت در همه سلولها مشاهده نمی­شود (28). بیشتر مطالعات ثابت کرده­اند که نانوذرات اکسید آهن از غلظت μg/ml 100 به بالا دارای اثر سمیت بر رده­های سلولی مختلف می­باشند (3، 14 و 19). مهم­ترین مکانیسمی که می­توان برای وجود اثر سمیت برای این نانوذرات در نظر گرفت تولید رادیکال آزاد اکسیژن است که زمانی که غلظت آن از مقدار مشخص و کنترل شده داخل سلول بیشتر شود سبب بروز تأثیرات منفی بر عملکرد اندامکهای داخل سلول، مانند میتوکندری، پروتئینها و حتی DNA خواهد شد که در نهایت به مرگ سلولی منجر می­شود (8 و 15).

 

 

الف

 

 

 

ب

 

 

 

ج

 

شکل5- نتایج مربوط به آزمون سمیت سلولی نانوذرات پوشش­دار و بدون پوشش بر روی رده سلولی MCF-7 در سه بازه زمانی آ)24، ب)48 و ج)72 ساعت (05/0 p< ® *).

 

 

مطالعات مختلفی برروی پوشش­دهی نانوذرات انجام گرفته و از پلیمرهای مختلفی بدین منظور استفاده شده است. یکی از پلیمرهایی که اخیراً بسیار مورد توجه قرار گرفته پلی­گلیسرول می­باشد که به علت دارا بودن خواص ویژه مانند آبدوستی بالا، زیست­سازگاری مناسب، مقاومت حرارتی و ... می­تواند جایگزین مناسبی برای انواع مشابه خود مانند PEG باشد (11). 

در پژوهشی که توسط ضرابی و همکاران به منظور بررسی زیست­سازگاری این پلیمر انجام شد نشان داده شد که این پلیمر در غلظتهای بالا نیز زیست­سازگار بوده و حتی اثرات مثبتی در افزایش میزان زنده بودن سلولها داشته است. هرچند هنوز مکانیسم اصلی مؤثر در این افزایش مشخص نشده اما این گروه معتقد بودند که علت می­تواند ناشی از مصرف الیگوساکاریدهای ناشی از ساختار پلیمر توسط سلولها به عنوان یک منبع غذایی باشد (42).  

در این پژوهش از پلیمر پرشاخه پلی­گلیسرول به منظور پوشش­دهی نانوذرات آهن استفاده شد. نتایج حاصل اثبات کرد که پوشش­دهی این نانوذرات توسط این پلیمر نه تنها مانع از تأثیرات منفی نانوذرات بر سلولها شده بلکه سبب بهبود میزان زنده بودن آنها نیز خواهد شد، که با نتایج حاصل از پژوهشهای قبلی تطابق دارد.

1. محمدپور ر، صفریان ش، نوروزی س، رزازان ع، 1392، بررسی اثرات سلولی آنتی­باکتریهای سولفاتیازول و سولفاستامید بر روی سلولهای سرطان سینه (رده‏ سلولی T-47D)، مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی، دوره 26، شماره 4، 549-532. 

2. زهری ص، بضاعت پور ا، عبدالملکی آ، 1393، اثرات تراتوژنیک و سمیت سلولی سالن، یک لیگاند رایج در کمپلکسهای وانادیوم، دوره 27، شماره 3، 376-367.  

 

3. Ankamwar B, Lai T, Huang J, Liu R, Hsiao M, Chen C, Hwu Y, 2010, Biocompatibility of Fe3O4 nanoparticles evaluated by in vitro cytotoxicity assays using normal, glia and breast cancer cells, Nanotechnology, 21(7):075102-075111.

4. Berry CC, Wells S, Charles S, Curtis AS, 2003, Dextran and albumin derivatised iron oxide nanoparticles: influence on fibroblasts in vitro, Biomaterials, 24(25):4551-4557.

5. Cai W, Wan J, 2007, Facile synthesis of superparamagnetic magnetite nanoparticles in liquid polyols Journal of colloid and interface, science, 305(2):366-370.

6. Calderón M, Quadir MA, Sharma SK, Haag R, 2010, Dendritic polyglycerols for biomedical applications, Advanced Materials, 22(2):190-218.

7. Calderón M, Quadir MA, Strumia M, Haag R, 2010, Functional dendritic polymer architectures as stimuli-responsive nanocarriers, Biochimie, 92(9):1242-1251.

8. Chobot V, Hadacek F, Kubicova L, 2014, Effects of Selected Dietary Secondary Metabolites on Reactive Oxygen Species Production Caused by Iron (II) Autoxidation, Molecules, 19(12):20023-20033.

9. Choi JY, Lee SH, Na HB, An K, Hyeon T, Seo TS, 2010, In vitro cytotoxicity screening of water-dispersible metal oxide nanoparticles in human cell lines, Bioprocess and biosystems engineering, 33(1):21-30.

10. Chomoucka J, Drbohlavova J, Huska D, Adam V, Kizek R, Hubalek J, 2010, Magnetic nanoparticles and targeted drug delivering, Pharmacological Research, 62(2):144-149.

11. Deng Y, Saucier-Sawyer JK, Hoimes CJ, Zhang J, Seo Y-E, Andrejecsk JW, Saltzman WM, 2014, The effect of hyperbranched polyglycerol coatings on drug delivery using degradable polymer nanoparticles, Biomaterials, 35(24):6595-6602.

12. Edwards V, Markovic E, Matisons J, Young F, 2008, Development of an in vitro reproductive screening assay for novel pharmaceutical compounds, Biotechnology and applied biochemistry, 51(2):63-71.

13. Fadeel B, Garcia-Bennett AE, 2010, Better safe than sorry: understanding the toxicological properties of inorganic nanoparticles manufactured for biomedical applications, Advanced drug delivery reviews, 62(3):362-374.

14. Gupta AK, Gupta M, 2005, Cytotoxicity suppression and cellular uptake enhancement of surface modified magnetic nanoparticles, Biomaterials, 26(13):1565-1573.

15. Huang G, Chen H, Dong Y, Luo X, Yu H, Moore Z, et al., 2013, Superparamagnetic iron oxide nanoparticles: amplifying ROS stress to improve anticancer drug efficacy, Theranostics, 3(2):116-126.

16. Huang Q, Yu H, Ru Q, 2010, Bioavailability and delivery of nutraceuticals using nanotechnology, Journal of Food Science, 75(1):R50-R57.

17. Kainthan RK, Brooks DE, 2007, In vivo biological evaluation of high molecular weight hyperbranched polyglycerols, Biomaterials, 28(32):4779-4787.

18. Lewinski N, Colvin V, Drezek R, 2008, Cytotoxicity of nanoparticles, Small, 4(1):26-49.

19. Liu S-Y, Long L, Yuan Z, Yin L-P, Liu R, 2009, Effect and intracellular uptake of pure magnetic Fe3O4 nanoparticles in the cells and organs of lung and liver, Chinese Med J, 122(15):1821-1825.

20. Liu Y, Kong M, Feng C, Yang KK, Li Y, Su J, et al., 2013, Biocompatibility, cellular uptake and biodistribution of the polymeric amphiphilic nanoparticles as oral drug carriers, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 103:345-353.

21. Mahmoudi M, Hofmann H, Rothen-Rutishauser B, Petri-Fink A, 2011, Assessing the in vitro and in vivo toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles, Chemical reviews, 112(4):2323-2338.

22. Mahmoudi M, Shokrgozar MA, Simchi A, Imani M, Milani AS, Stroeve P, et al., 2009, Multiphysics flow modeling and in vitro toxicity of iron oxide nanoparticles coated with poly (vinyl alcohol), The Journal of Physical Chemistry C, 113(6):2322-2331.

23. Mahmoudi M, Simchi A, Imani M, Milani AS, Stroeve P, 2009, An in vitro study of bare and poly (ethylene glycol)-co-fumarate-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles: a new toxicity identification procedure, Nanotechnology, 20(22): 225104-225112.

24. Maity D, Chandrasekharan P, Si-Shen F, Xue J-M, Ding J, 2010, Polyol-based synthesis of hydrophilic magnetite nanoparticles, Journal of Applied Physics, 107(9):09B310-09B310-3.

25. Maity D, Kale S, Kaul-Ghanekar R, Xue J-M, Ding J, 2009, Studies of magnetite nanoparticles synthesized by thermal decomposition of iron (III) acetylacetonate in tri (ethylene glycol), Journal of Magnetism and magnetic Materials, 321(19):3093-3098.

26. Markides H, Rotherham M, El Haj A, 2012, Biocompatibility and toxicity of magnetic nanoparticles in regenerative medicine, Journal of Nanomaterials, 2012(13):1-11.

27. Mukhopadhyay A, Joshi N, Chattopadhyay K, De G, 2011, A facile synthesis of PEG-coated magnetite (Fe3O4) nanoparticles and their prevention of the reduction of cytochrome C, ACS applied materials & interfaces, 4(1):142-149.

28. Neethirajan S, Jayas DS, 2011, Nanotechnology for the food and bioprocessing industries, Food and bioprocess technology, 4(1):39-47.

29. Nikzad S, Hashemi B, Hassan Z-M, Mozdarani H, 2013, The cell survival of F10B16 melanoma and 4T1 breast adenocarcinoma irradiated to gamma radiation using the MTT assay based on two different calculation methods, Journal of Biomedical Physics & Engineering, 3(2):29-36.

30. Polyak B, Fishbein I, Chorny M, Alferiev I, Williams D, Yellen B, et al., 2008, High field gradient targeting of magnetic nanoparticle-loaded endothelial cells to the surfaces of steel stents, Proceedings of the National Academy of Sciences, 105(2):698-703.

31. Saatchi K, Gelder N, Gershkovich P, Sivak O, Wasan KM, Kainthan RK, et al., 2012, Long-circulating non-toxic blood pool imaging agent based on hyperbranched polyglycerols, International journal of pharmaceutics, 422(1):418-427.

32. Steinhilber D, Seiffert S, Heyman JA, Paulus F, Weitz DA, Haag R, 2011, Hyperbranched polyglycerols on the nanometer and micrometer scale, Biomaterials, 32(5):1311-1316.

33. Steinhilber D, Sisson AL, Mangoldt D, Welker P, Licha K, Haag R, 2010, Synthesis, reductive cleavage, and cellular interaction studies of biodegradable, polyglycerol nanogels, Advanced Functional Materials, 20(23):4133-4138.

34. Sun C, Lee JS, Zhang M, 2008, Magnetic nanoparticles in MR imaging and drug delivery, Advanced drug delivery reviews, 60(11):1252-1265.

35. Tartaj P, Serna CJ, 2003, Synthesis of monodisperse superparamagnetic Fe/silica nanospherical composites, Journal of the American Chemical Society, 125(51):15754-15755.

36. Turaga KK, Kvols LK, 2011, Recent progress in the understanding, diagnosis, and treatment of gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors, CA: a cancer journal for clinicians, 61(2):113-132.

37. Veiseh O, Gunn JW, Zhang M, 2010, Design and fabrication of magnetic nanoparticles for targeted drug delivery and imaging, Advanced drug delivery reviews, 62(3):284-304.

38. Wang L, Neoh K, Kang E, Shuter B, Wang SC, 2009, Superparamagnetic hyperbranched polyglycerol‐grafted Fe3O4 nanoparticles as a novel magnetic resonance imaging contrast agent: an in vitro assessment, Advanced Functional Materials, 19(16):2615-2622.

39. Weinhart M, Becherer T, Schnurbusch N, Schwibbert K, Kunte HJ, Haag R, 2011, Linear and hyperbranched polyglycerol derivatives as excellent bioinert glass coating materials, Advanced Engineering Materials, 13(12):B501-B510.

40. Wu J, Ding T, Sun J, 2013, Neurotoxic potential of iron oxide nanoparticles in the rat brain striatum and hippocampus, Neurotoxicology, 34(1):243-253.

41. Yuanbi Z, Zumin Q, Huang J, 2008, Preparation and analysis of Fe3O4 magnetic nanoparticles used as targeted-drug carriers, Chinese Journal of Chemical Engineering, 16(3):451-455.

42. Zarrabi A, Shokrgozar MA, Vossoughi M, Farokhi M, 2014, In vitro biocompatibility evaluations of hyperbranched polyglycerol hybrid nanostructure as a candidate for nanomedicine applications, Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 25(2):499-506.

43. Zhao L, Chano T, Morikawa S, Saito Y, Shiino A, Shimizu S, et al., 2012, Hyperbranched polyglycerol‐grafted superparamagnetic iron oxide nanoparticles: synthesis, characterization, functionalization, size separation, magnetic properties, and biological applications, Advanced Functional Materials, 22(24):5107-5117.

44. 2012, Magnetic Force Microscopy (MFM) Characterization of Superparamagnetic Nanoparticles (SPIONs), Waterloo, Ontario, Canada.