نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانش آموخته پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

2 دانش آموخته دانشگاه شاهرود

3 عضو هیات علمی دانشگاه شاهرود

4 عضو هیات علمی دانشگاه شهید بهشتی

5 عضو هیات علمی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، پژوهشکده زیست فناوری صنعت و محیط زیست، گروه مهندسی زیست فرآیند

چکیده

پپلی‌گالاکتورونازها (GH28)، عمدتاً در گیاهان سبب هیدرولیز سوبسترای پکتینی می‌شوند. پلی‌گالاکتورونازها به طور گسترده در گیاهان عالی و میکروارگانیسم‌ها موجود می‌باشند. استخراج پلی‌گالاکتوروناز از منابع قارچی، به علت بازدهی بالای تولید، کاربرد فراوان دارد. در این پژوهش، قارچ M. phaseolina، عامل بیماری پوسیدگی ذغالی، برای تولید پلی گالاکتوروناز در محیط تولید آنزیم کشت و عصاره قارچی جدا گردید. بیشترین فعالیت پلی‌گالاکتورونازی محلول آنزیمی، در دمای 60 درجه سانتی‌گراد بود. این آنزیم از پایداری دمایی و اسیدیته بالایی برخوردار است به‌طوریکه، نیمه عمرحرارتی آن در دمای 50 و 70 درجه سانتی‌گراد به-ترتیب حدود 627 و 345 دقیقه و میزان تغییرات انرژی آزاد غیر فعال‌سازی حرارتی آنزیم در دمای 70 درجه سانتی‌گراد تقریبا معادل 114 کیلو ژول بر مول بود که حاکی از پتانسیل بالای این آنزیم جهت کاربرد در صنایع می‌باشد. این آنزیم از پایداری بسیار بالایی در شرایط بسیار اسیدی و قلیایی برخوردار است. بررسی و مقایسه خصوصیات بیوشیمیایی پلی‌گالاکتورونازهای منابع مختلف قارچی با استفاده از برنامه ProtParam نیز پلی‌گالاکتورونازهای M. phaseolina را در گروه پایدارترین پلی‌گالاکتورونازهای قارچی قرار داد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Extraction of a polygalacturonase from Macrophomiona phaseolina and analysis of its stability

نویسندگان [English]

  • Elnaz Fahimi 1 2
  • Naser Farrokhi 3 4
  • Saeed Aminzadeh 5

5 Academic Staff

چکیده [English]

Polygalacturonases (GH28) hydrolyze the pectic substances, present mostly in plants. Polygalacturonases are widely distributed among some bacteria, fungi, and higher plants. Microbial polygalacturonases, mainly produced by fungi, are utilized in many large-scale industrial processes. Production of a polygalacturonase from a fungal phytopathogen, M. phaseolina was evaluated in this study. M. phaseolina was cultured in the production medium. The crude extract was separated from fungal cells. The highest enzyme activity was observed at 60 °C. This enzyme had a high stability at wide ranges of pH and temperature and exhibited a t1/2 of 400 min at 70 °C. The value for free energy of the heat inactivation at the temperature of 70 °C was about 108 kJ, suggesting its potential to be used as an industrial enzyme. Analysis of biochemical characteristics of polygalacturonase from different fungi using ProtParam demonstrated that the M. phaseolina polygalacturonase was amongst the most stable fungal polygalacturonases.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Polygalacturonases
  • Macrophomiona phaseolina
  • Thermal and pH stability

استخراج و بررسی پایداری و پارامترهای ترمودینامیکی یکی از پلی­گالاکتورونازهای قارچ Macrophomiona phaseolina

الناز فهیمی بایرامی1و2، ناصر فرخی2و 3 و سعید امین زاده1*

1 تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، پژوهشکده زیست فناوری صنعت و محیط زیست، گروه مهندسی زیست فرآیند

2 شاهرود، دانشگاه شاهرود، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات

3 تهران، دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده مهندسی فناوریهای نوین، گروه بیوتکنولوژی

تاریخ دریافت: 21/2/94                تاریخ پذیرش: 10/5/94

چکیده

پلی­گالاکتورونازها (GH28)، عمدتاً در گیاهان سبب هیدرولیز سوبسترای پکتینی می­شوند. پلی­گالاکتورونازها به طور گسترده در گیاهان عالی و میکروارگانیسم­ها موجود می­باشند. استخراج پلی­گالاکتوروناز از منابع قارچی، به علت بازدهی بالای تولید، کاربرد فراوان دارد. در این پژوهش، قارچ M. phaseolina، عامل بیماری پوسیدگی زغالی، برای تولید پلی گالاکتوروناز  در محیط تولید آنزیم کشت و عصاره قارچی جدا گردید. بیشترین فعالیت پلی­گالاکتورونازی محلول آنزیمی، در دمای 60 درجه سانتی گراد  بود. این آنزیم از پایداری دمایی و اسیدیته بالایی برخوردار است به­طوری که، نیمه عمر حرارتی آن در دمای 50 و 70 درجه سانتی گراد به­ترتیب حدود 627 و 345 دقیقه و میزان تغییرات انرژی آزاد غیر فعال­سازی حرارتی آنزیم در دمای 70 درجه سانتی گراد تقریباً معادل 114 کیلو ژول بر مول بود که حاکی از پتانسیل بالای این آنزیم جهت کاربرد در صنایع می­باشد.  این آنزیم از پایداری بسیار بالایی در شرایط بسیار اسیدی و قلیایی برخوردار است. بررسی و مقایسه خصوصیات بیوشیمیایی پلی­گالاکتورونازهای منابع مختلف قارچی با استفاده از برنامه ProtParam  نیز پلی­گالاکتورونازهای  M. phaseolina را در گروه پایدارترین پلی­گالاکتورونازهای قارچی قرار داد.

واژه های کلیدی: M. phaseolina، پلی­گالاکتوروناز، پایداری حرارتی و اسیدیته، ProtParam

* نویسنده مسئول، تلفن: 44787412-021 ، پست الکترونیکی: aminzade@nigeb.ac.ir

مقدمه

 

در طبیعت میکروارگانیسم ها با پتانسیلهای مختلف موجود می­باشند. آنها مجموعه­ای از آنزیمها را تولید می­نمایند که در ابعاد تجاری مورد استفاده قرار می­گیرند (8). در میان آنزیمها، پکتینازها بسیار حائز اهمیت و دارای پتانسیل فوق­العاده جهت ارائه در صنعت می­باشند؛ به­طوری که 25 درصد از کل آنزیمهای با تولید تجاری صنایع غذایی را شامل می­شوند (13 و 14). پکتیناز­ها دارای کاربرد گسترده در صنایع گوناگون مانند نساجی، پردازش فیبرهای گیاهی(14) ، چای (6)، قهوه (13)، استخراج نفت، کاغذسازی (24 و 25) و خالص سازی ویروسهای گیاهی (26) می­باشند و از اجزای کوکتل آنزیمی مورد استفاده جهت آماده­سازی غذای حیوانات می­باشد (11). این آنزیمها دارای اهمیت بیولوژیکی، در تکنولوژی امتزاج پروتوپلاست و بیماری­شناسی گیاهی می­باشند. همچنین این آنزیمها، به­عنوان جایگزین عملی و اقتصادی فرآیندهای سنتی، جهت کاهش زباله­های آنیونی و آلودگیهای پساب صنایع کاغذسازی مورد استفاده قرار می گیرند (15 و 16). فرآیندهای صنایع گیاهی، منجر به ایجاد پساب حاوی مواد پکتینی­می­گردند. کاربرد گسترده پلی­گالاکتورونازها در صنایع پالایش زیستی فاضلابهای حاوی مواد پکتینی نیز گزارش شده است (11). پلی­گالاکتورونازها، گروهی از آنزیمهای دارای ساختار گلیکوپروتئینی و عملکرد  پکتینولیتیک می­باشند که از طریق اکسیژن مولکول آب (حمله اکسیژن مولکول آب به کربن گروه کربونیل)، برش هیدرولیتیکی زنجیره پلی­گالاکتورونیک اسید را کاتالیز می­نمایند (27). مواد پکتینی ترکیب اصلی دیواره سلولهای گیاهی می­باشند (1). پلی­گالاکتورونازها با تجزیه پلیمرهای پکتینی دیواره سلولی، تشکیل کلنیهای قارچی را روی گیاه میسر می­سازند (9، 12 و 21) و فاکتور اصلی تخریب بافتهای گیاهی در فرآیند نفوذ فیتوپاتوژن می­باشند (4). این آنزیمها به طور گسترده در گیاهان عالی و میکروارگانیسم­ها موجود می­باشند (32) و در میان خانواده آنزیمهای پکتینولیتیک بیشترین سهم مطالعات را به خود اختصاص داده­اند. تقریباً تمام ظرفیتهای تجاری آنزیمهای پکتینولیتیک متعلق به منابع قارچی می­باشند (13). انتخاب منبع میکروبی مناسب جهت تولید پلی­گالاکتورونازها به فاکتورهای مختلف، از قبیل ویژگیهای فیزیکی و شیمیایی، مانند pH و پایداری حراتی آنزیمها بستگی دارد. با توجه به کاربرد گسترده آنزیم پلی­گالاکتوروناز در صنایع گوناگون، مطالعه خواص بیوشیمیایی این آنزیمها جهت ارتقای سطح تولید و فعالیت آنها و نیز تعیین منبع مناسب تولید آنزیم ضروری می­باشد. در این مطالعه تولید و بررسی ویژگیهای کاتالیتیکی و پایداری حرارتی و اسیدیته آنزیم پلی­گالاکتوروناز قارچ M. phaseolina به­منظور تعیین پتانسیل این آنزیم جهت کاربرد در صنعت و البته شناخت نسبی ساختار آنزیم، مورد توجه قرار گرفته است. خصوصیات بیوشیمیایی پلی­گالاکتورونازهای این قارچ و سایر منابع قارچی به لحاظ بیوانفورماتیکی نیز مورد بررسی و مقایسه قرار گرفت.

مواد و روشها

قارچ M. phaseolina  اهدایی آقای دکتر ابوالفضل سرپله از مؤسسه تحقیقات گیاه­پزشکی کشور بود. پلی­گالاکترونیک­اسید، α-D-گالاکترونیک­اسید و 5،3-دی­-نیتروسالیسیلیک­اسید (DNS) از شرکت سیگما و سایر مواد شیمیایی از شرکت مرک (Darmstadt,Germany) تهیه گردید.

تولید پلی­گالاکتوروناز از قارچ M. phaseolina : قارچ M. phaseolina، پس از تکثیر در محیط مایع PDB، جهت نگهداری در محیط جامد PDA کشت شد. جهت القای  تولید آنزیم پلی­گالاکتوروناز، قارچ M. phaseolina در شرایط استریل از محیط PDA  به محیط بهینه تولید پلی­گالاکتوروناز (۵ گرم در لیتر پلی­گالاکتورونیک اسید، ۳ گرم در لیتر سولفات آمونیوم، ۱۰ گرم در لیتر فسفات دی­هیدروژن پتاسیم، ۲ گرم در لیتر سولفات منیزیم، 7/0 میلی­گرم در لیتر بورات سدیم، 5/0میلی­گرم در لیتر مولیبدات آمونیوم، ۱۰ میلی­گرم در لیتر فرو­سولفات آهن، 3/0 میلی­گرم در لیتر سولفات مس، 11/0 میلی­گرم در لیتر سولفات منگنز، ۱۷/۶ میلی­گرم در لیتر سولفات روی، 4­ = pH) منتقل گردید و به مدت 72 ساعت در شیکر انکوباتور (35 درجه سانتی گراد و 180 دور در دقیقه) قرار گرفت. محیط کشت حاوی قارچ تکثیر یافته، از کاغذ صافی  عبور داده ­شد. عصاره حاوی آنزیمهای ترشحی، مورد سنجش پایداری حرارتی و اسیدیته فعالیت پلی­گالاکتورونازی قرار گرفت.

سنجش فعالیت پلی­گالاکتورونازی: میزان فعالیت پلی­گالاکتورونازی محلول واکنش با استفاده از روش DNS (20) تخمین زده ­شد. در این روش، محلول واکنش برای مدت زمان مشخصی انکوبه ­گردید و با حرارت و معرف رنگی حاوی سود، واکنش متوقف شد و میزان فعالیت آنزیمی بر اساس میزان محصول تولیدی محاسبه گردید. فعالیت پلی­گالاکتورونازی با اندازه­گیری میزان واحدهای D-گالاکترونیک اسید آزاد شده (میزان محصولی که تولید شده است) به عنوان گروههای احیاءیی سنجیده شد. محلول سوبسترای پلی­گالاکتورونیک اسید یک درصد وزنی/ حجمی در بافر استات 20 میلی­مولار (4pH = ) و محلول رنگی3و5-دی­نیتروسالیسیلیک اسید (DNS) برای سنجش فعالیت آنزیم به کار رفت. . جهت سنجش فعالیت پلی­گالاکتورونازی، 200 میکرولیتر محلول پروتئینی به 200 میکرولیتر محلول سوبسترا افزوده شد. ویال محتوی محلول واکنش به­مدت 45 دقیقه در بن ماری دمای 50 درجه سانتی گراد قرار داده شد. پس از این مدت 400 میکرولیتر محلول رنگی 3 و 5 دی نیترو سالیسیک اسید(DNS) افزوده شد تا فعالیت آنزیمی متوقف گردد. ویالها به مدت 5 دقیقه در آب جوش قرار داده شد. پس از خنک شدن در دمای اتاق در g × 8000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ گردید و جذب مایع رویی در 530 نانومتر خوانده شد. DNS  قادر به شناسایی انتهای احیاءکننده گروه هیدروکسیل (OH-) کربن شماره یک کربوهیدرات می­باشد و با آن تشکیل کمپلکسی می­دهد که دارای جذب در طول موج 530 نانومتر می­باشد. نواحی احیاءیD -گالاکتورونیک اسید تولیدی(در اثر فعالیت آنزیم پلی­گالاکتوروناز­ بر سوبسترای پلی­گالاکتورونیک اسید) در واکنش با معرف­ DNS، موجب افزایش جذب (رنگ قرمز تیره) در محلول واکنش می­گردد. هر چه میزان جذب بالاتر(رنگ تشکیل شده تیره­تر) باشد، حاکی از تولید میزان بیشتری ازD -گالاکتورونیک اسید و به تبع آن فعالیت و غلظت (5) پلی­گالاکتورونازی بیشتر می­باشد.

بررسی تأثیر دما بر فعالیت آنزیم  و به دست آوردن دمای بهینه (Temperature Profile): جهت تعیین دمای بهینه فعالیت آنزیمی، تأثیر دماهای 20 تا 80 درجه سانتی گراد بر فعالیت آنزیم اندازه­گیری شد. برای این منظور، 200 میکرولیتر از محلول سوبسترا به 200  میکرولیتر آنزیم، افزوده­ شد و به مدت 15 دقیقه در دماهای 20 تا 80 درجه سانتی گراد قرار گرفت. بعد از گذشت این زمان به مخلوط سوبسترا ­ و آنزیم، 400 میکرولیتر DNS اضافه گردید و از طریق سنجش فعالیت آنزیمی جذب هر کدام از نمونه­ها در 530 نانومتر خوانده شد.

بررسی غیر فعال شدن حرارتی برگشت­ناپذیر آنزیم در زمانهای مختلف و در درجه حرارت 70 درجه سانتی گراد: به­منظور بررسی غیر فعال­سازی حرارتی برگشت­ناپذیر پلی­گالاکتوروناز، آنزیم در دماهای 50 و 70 درجه سانتی گراد در زمانهای صفر تا 60 دقیقه انکوبه و سپس در حضور محلول سوبسترای پلی­گالاکتورونیک اسید، مورد سنجش فعالیت آنزیمی، قرار گرفت. باقیمانده فعالیت آنزیمی از طریق رابطه (1) محاسبه می­شود (3):

 

رابطه 1   Residual PG activity % = 100(At/Ao)

در این رابطه  At  میزان فعالیت آنزیم در زمان t و بر حسب ثانیه، A0  میزان فعالیت آنزیم در زمان صفر می­باشد.

غیر فعال شدن حرارتی آنزیم اغلب با مدل کینتیکی first-order توصیف می­شود. یعنی فعالیت آنزیم به صورت لگاریتمی خطی با گذشت زمان کاهش پیدا می­کند که به صورت رابطه (2) نشان داده می­شود (3):

رابطه 2              Ln(At/AO)= -kt

در این رابطه  At میزان فعالیت آنزیم در زمان t و A0 میزان فعالیت اولیه آنزیم، t زمان تیمار آنزیم و k ثابت سرعت غیر فعال شدن می­باشد.

محاسبه پارامترهای ترمودینامیکی: میزان انرژی آزاد برای غیر فعال سازی آنزیم پلی­گالاکتوروناز (ΔG#)، با استفاده از رابطه (3) محاسبه می­گردد (3):

رابطه 3 ΔG# = -RT ln(kh/KBT)

که (6.62 × 10-34 J.s) h ثابت پلانک و (1.3806 × 10-23 JK-1) KB ثابت بولتزمن می­باشد.

جهت محاسبه میزان نیمه عمر حرارتی آنزیم، از رابطه (4) استفاده می­شود (3):

رابطه 4   T1/2 = ln(2) /k (min-1)

که در آن t1/2 نیمه عمر حرارتی آنزیم و k ثابت سرعت غیر فعال سازی است که از روی شیب منحنی لگاریتم درصد فعالیت نسبت به زمان قابل محاسبه می­باشد.

بررسی پایداری آنزیم در pHهای مختلف: جهت بررسی پایداری فعالیت پلی­گالاکتورونازی محلول پروتئینی در pHهای مختلف، ابتدا بافر مخلوط 5 میلی­مولار از فسفات سدیم، استات سدیم و گلایسین در pH­های 3 تا 12 تهیه شد. محلولهای آنزیمی به هر یک از بافر­های مخلوط (pH­های 3 تا 12) افزوده­شد و این محلولهای آنزیمی در pH­های مختلف به مدت 90 دقیقه در دمای اتاق قرار داده شد. بعد از گذشت این زمان، محلول سوبسترای پلی­گالاکتورونیک اسید به نمونه­ها افزوده ­شد و ویالهای محتوی محلول واکنش به­مدت 15 دقیقه در بن­ماری و در دمای بهینه فعالیت آنزیم قرار گرفت. سپس از طریق سنجش فعالیت آنزیمی، جذب هر کدام از نمونه­ها در 530 نانومتر خوانده­شد.

بررسی و مقایسه بیوانفورماتیکی خصوصیات بیوشیمیایی پلی­گالاکتورونازهای M. phaseolina و سایر منابع قارچی: توالی پروتئینی پلی­گالاکتورونازهای قارچی از سایتCaZy   (www.afmb.cnrs-mrs.fr/cazy) جمع­آوری گردید. تمامی این آنزیمها در خانواده 28 طبقه­بندی شده­اند. تنها پلی­گالاکتورونازهایی که به عنوان اندو و اگزو پلی­گالاکتوروناز معرفی شده‎اند جهت آنالیز استفاده شد. نتایج آنالیز ژنوم M. phaseolina، حاکی از وجود هفت پلی­گالاکتوروناز در این قارچ، با شماره دستیابی 40792390، 407922771، 407917170، 407925949، 407924329، 407921266، 407920911 و 407925004 در پایگاه داده های بیوتکنولوژی (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) می­باشد. خصوصیات بیوشیمیایی پلی­گالاکتورونازهای قارچ M. phaseolina و سایر منابع قارچی با استفاده از برنامه ProtParam  (/tools/ch.expasy.www//:http) مورد بررسی و مقایسه قرار گرفت (10).

نتایج و بحث

اغلب فرآیندهای آنزیمی در صنعت، در دمای بسیار بالا صورت می­گیرند و در این رابطه آنزیمهای ترموفیل از اهمیت ویژه­ای برخوردار می­باشند. افزایش حلالیت سوبسترا و سرعت واکنش و کاهش خطر آلودگی میکروبی که عمدتاً از منبع استخراج آنزیم ناشی می­شود، از مزایای مهم استفاده از دمای بالا در این صنایع می­باشند. اکثر پلی­گالاکتورونازها در محدوده دمایی 40-30 درجه سانتی گراد فعالیت می­نمایند (13) اما معدودی از آنها مانند پلی­گالاکتورونازهای جدا شده از Bacillus licheniformis (27) و Fusarium oxysporum  (23)، ترموفیل می­باشند و دارای اپتیمم فعالیت در محدوده دمایی50 تا 60 درجه سانتی گراد می­باشند (13) در این مطالعه پلی­گالاکتوروناز قارچ M. phaseolina در دمای 60 درجه سانتی گراد دارای بیشترین میزان فعالیت بود. همچنین مشخص گردید آنزیم مورد بررسی در دماهای 70 و 80 درجه سانتی گراد دارای بیش از 50 درصد فعالیت حداکثر می­باشد (شکل 1).

 

 

 

 

 

شکل1 - بررسی تأثیر دما بر میزان فعالیت آنزیم پلی­گالاکتوروناز در حضور سوبسترای پلی­گالاکتورونیک اسید و 3pH = ، آنزیم در دمای 60 درجه سانتی گراد دارای فعالیت بیشینه می باشد.

پایداری دمایی پروتئینهای ترموفیل ویژگی ذاتی است و به ترتیب و نوع اسیدهای آمینه موجود در ساختار اول آنها بستگی دارد. پایداری دمایی پروتئینها، نتیجه بهینه نمودن برهمکنشهای درون مولکولی،  تراکم ساختاری و آرایش داخلی اسیدهای آمینه هیدروفوب و در سطح پروتئین قرار گرفتن اسیدهای آمینه هیدروفیل می­باشد. پایداری آنزیم پلی­گالاکتوروناز در دماهای 50 و 70 درجه سانتی گراد بررسی گردید (شکل 2). این آنزیم پس از 60 دقیقه تیمار در این دماها، حدود 93 درصد از فعالیت خود را حفظ نمود. در هیچ یک از مطالعاتی که تاکنون در مورد پایداری حرارتی پلی­گالاکتورونازهای منابع گوناگون صورت گرفته این میزان از پایداری حرارتی آنزیم گزارش نشده است به­طوری که مارتینز و همکاران (2013) دمای اپتیمم فعالیت آنزیم را 60 درجه سانتی گراد گزارش نمودند، با این­حال آنها اعلام نمودند این آنزیم نسبتاً ترموفیل، پس از 60 دقیقه انکوباسیون در دمای 60 درجه سانتی گراد ، 90 درصد فعالیت خود را از دست می­دهد (19).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2 - نمودار بررسی پایداری حرارتی پلی­گالاکتوروناز در زمانهای 20 و 60 دقیقه در دماهای 50 و 70 درجه سانتی گراد، این آنزیم پس از 60 دقیقه تیمار در دمای 50 و70 درجه سانتی گراد، 93 درصد از فعالیت خود را حفظ نمود.

 

محاسبه نیمه عمر حرارتی و میزان انرژی آزاد برای غیر فعال سازی حرارتی آنزیم (ΔG#) با استفاده از ثابت سرعت غیر فعال­سازی حرارتی آنزیم صورت گرفت. این ثابت، معادل شیب خطوط نمودار غیر فعال­سازی حرارتی برگشت­ناپذیر آنزیم می باشد که در دمای 50 درجه سانتی گراد معادل (min/1) 0011/0 تخمین زده­ شد (شکل 3). به­همین ترتیب ثابت سرعت غیر فعال­سازی آنزیم در دمای 70 درجه سانتی گراد معادل(min/1) 002/0 تخمین زده شد. نتایج نشان داد پلی­گالاکتوروناز قارچ M. phaseolina در دمای 50 و 70 درجه سانتی گراد احتمالاً به­ترتیب دارای نیمه عمر حرارتی معادل تقریباً 627 و 345 دقیقه می­باشد. مقدار نیمه عمر حرارتی پلی­گالاکتوروناز این قارچ بسیار بزرگتر از مقدار محاسبه شده برای پلی­گالاکتوروناز Tetracoccosporium sp. (01/63 دقیقه)(3) و Aspergillus giganteus (30 دقیقه)(22)، در دمای 60 درجه سانتی گراد، می­باشد که بر پایداری حرارتی بسیار بالای پلی­گالاکتوروناز قارچ M. phaseolina دلالت دارد. مقدار تغییرات انرژی آزاد غیر فعال­سازی حرارتی آنزیم در دمای50 و 70 درجه سانتی گراد، به­ترتیب حدود 109 و 114 کیلو ژول بر مول بود. میزان بالای این پارامتر حاکی از ثبات قابل ملاحظه ساختمان شیمیایی و سه­بعدی آنزیم و مقاومت آن نسبت به حرارت می­باشد. بنابراین مشخص گردید، آنزیم قادر به حفظ فعالیت خود در درجه حرارت بسیار بالا در مدت زمان طولانی می­باشد. مقدار تقریباً مشابهی برای تغییرات انرژی آزاد غیر فعال­سازی حرارتی پلی­گالاکتوروناز Tetracoccosporium sp. (35/94 کیلوژول بر مول)(3) و Erwinia carotovora (83 تا 1/86 کیلوژول بر مول)(17) تخمین زده شده است.

مطالعات صورت گرفته تاکنون، پایداری پلی­گالاکتورونازهای منابع مختلف را در pHهای اسیدی (18)، قلیایی (17) و یا در بازه میانی اسیدیته (7، 28، 29، 30 و 31) گزارش نموده­اند. بررسی پایداری اسیدیته پلی­گالاکتوروناز M. phaseolina نشان داد ساختار آنزیم در pHهای 2 تا 12 از پایداری قابل توجهی برخوردار می­باشد. به­طوری که در pH های 2 و 12 پس از 90 دقیقه به­ترتیب حدود 60 و 50 درصد فعالیت آنزیم حفظ گردید. امین­زاده و فرخی (2013) گزارش نمودند پلی­گالاکتوروناز
M. phaseolina، در3 =  pH  دارای حداکثر فعالیت آنزیمی می باشد (2). براساس نتایج حاصل از بررسی پایداری اسیدیته پلی­گالاکتوروناز M. phaseolina در مطالعه حاضر، آنزیم در pH 5 و 7 به­میزان 14 درصد، پایداری بیشتری نسبت به pH بهینه نشان داد. همچنین مشخص شد میزان پایداری آنزیم پس از 90 دقیقه تیمار در pH بهینه، بیشتر از میزان پایداری پس از 30 دقیقه تیمار در این pH است. به­نظر می­رسد ساختار آنزیم جهت داشتن حداکثر فعالیت در pH بهینه تا حدی از حالت فولدینگ خارج و همچنین احتمالاً شکل تاخورده کامل آنزیم در این pH  تشکیل نمی­شود. میزان پایداری در pHهای 7 تا 12 کاهش یافت و به­نظر می­رسد بررسی حدواسطهای ساختار آنزیمی در این pH ها امکان­پذیر باشد. تاکنون چنین گزارشی از الگوی پایداری اسیدیته پلی­گالاکتورونازها ارائه نشده است.

 

 

 

 

 

 

 

شکل 3 - نمودار بررسی غیر فعال شدن حرارتی برگشت­­ناپذیر آنزیم در زمانهای مختلف و در دمای 50 درجه سانتی گراد، شیب خط معادل ضریب سرعت غیرفعال­سازی آنزیم در این دما می­باشد.

بررسی و مقایسه بیوانفورماتیکی خصوصیات بیوشیمیایی پلی­گالاکتورونازهای M. phaseolina و سایر منابع قارچی: خصوصیات بیوشیمیایی تمامی اندو و اگزو پلی­گالاکتورونازهای قارچی(جدول1) و پلی­گالاکتورونازهای M. phaseolina (جدول 2) مورد بررسی قرار گرفت. بررسی خصوصیات بیوشیمیایی پلی­گالاکتورونازها با استفاده از برنامه protparam نشان داد، وزن مولکولی محاسبه شده و نقطه ایزو الکتریک پیش­بینی شده، دارای تنوع فاحشی بین انواع پلی­گالاکتورونازها در منابع مختلف قارچی می­باشد. مطالعات انجام گرفته بر روی ساختار مولکولی ایزو­آنزیمهای مختلف این آنزیم نشان داده است که توالی اسید آمینه­ای کلیه ایزوآنزیمها جز در بخشی از ناحیه کربوکسیلی آنها، که جایگاه فعال آنزیم در آن قرار دارد، دارای همولوژی بسیار کمی می­باشد و این عامل سبب بروز خصوصیات فیزیکی و شیمیایی متفاوت ایزوآنزیمهای مختلف این آنزیم در بین سویه­های مختلف قارچی و حتی در درون یک سویه، خصوصاً از نظر وزن مولکولی و pH ایزو­الکتریک آنها شده است (18). شاخص ناپایداری پروتئینها بیانگر میزان پایداری آنها در لوله آزمایش می­باشد به طوری که پروتئینهایی با شاخص کمتر از 40 جزء پروتئینهای پایدار تقسیم­بندی می­شوند (8). شاخص ناپایداری اندو­پلی­گالاکتورونازها بین (67/5) در قارچ Heterobasidion aff.annosum که دارای اندو­پلی­گالاکتوروناز با 79 اسید آمینه تا 39/36 در قارچ Aspergilus niger که دارای اندو­پلی­گالاکتوروناز با 495 اسید آمینه می­باشد، متفاوت است، که حاکی از پایداری این آنزیم در قارچ H.annosum نسبت به قارچ A.niger می­باشد. میزان شاخص ناپایداری پلی­گالاکتورونازهای قارچ M. phaseolina نیز بر پایداری این آنزیمها دلالت دارد. همان­طور که اشاره شد، پایداری حرارتی و فعالیت پلی­گالاکتورونازها در فرآیندهای بیوتکنولوژیکی بسیار حائز اهمیت می‎باشد. شاخص آلیفاتیک به عنوان یک عامل مهم به منظور برآورد مقاومت پروتئینها در برابر حرارت می­باشد، پلی­گالاکتورونازهای قارچ M. phaseolina براساس این پارامتر نیز در گروه پایدارترین پلی گالاکتورونازهای قارچی قرار می­گیرد.

جمع­بندی

نتایج حاصل از بررسی میزان فعالیت و پایداری حرارتی و اسیدیته پلی‎گالاکتورونازی که توسط قارچ M. phaseolina تولید گردید، حاکی از ثبات بسیار بالای ساختار شیمیایی و مولکولی این آنزیم و مقاومت بسیار بالای آن نسبت به حرارت و شرایط گوناگون اسیدیته می­باشد. بنابراین این قارچ به عنوان منبع مناسب جهت تولید آنزیم پلی‎گالاکتوروناز به منظور استفاده در صنعت، پیشنهاد می‎گردد.

بر اساس نتایج حاصل از بررسی خصوصیات بیوشیمیایی پلی‎گالاکتورونازهای منابع مختلف قارچی، پلی‎گالاکتورونازهای M. phaseolina، مقاوم در برابر حرارت می‎باشند. همچنین قارچ Chondrostereum purpureum با شاخص ناپایداری 96/14 به عنوان منبع میکروبی مناسب جهت تولید آنزیم پلی‎گالاکتوروناز به منظور استفاده در صنعت، پیشنهاد می‎گردد.

 

جدول 1 - خصوصیات بیوشیمیایی پلی­گالاکتورونازهای منابع مختلف قارچی

 

ProtParam

 

 

شاخص آلیفاتیک

شاخص ناپایداری

نقطه ایزوالکتریک

وزن مولکولی (دالتون)

ماهیت پلی­گالاکتورونازی

قارچ­ها

 

04/75

88/21

85/4

1/38812

اندو

Alternaria macrospora 

 

03/84

92/31

51/5

1/49161

اگزو

Emericella nidulans 

 

53/74

39/36

28/4

5/50782

اندو

Aspergillus niger 

 

35/86

71/32

64/4

2/48383

اگزو

                         Aspergillus niger 

 

48/69

48/32

26/4

4/49014

اندو

Bispora sp. MEY-1 

 

41/78

15/27

94/5

7/35005

اندو

Botryotinia fuckeliana 

 

68/78

23/38

97/4

0/49468

اگزو

Botryotinia fuckeliana 

 

06/75

07/29

70/4

1/46722

اندو

Botrytis fabae 

 

43/72

96/14

97/4

3/155652

اندو

Chondrostereum purpureum 

 

03/71

84/29

56/8

4/51654

اگزو

Fusarium oxysporum f.  cubense 

 

10/76

67/24

13/6

8/38769

اندو

Gibberella intermedia 

 

20/96

67/5

93/7

7/7915

اندو

Heterobasidion aff. annosum

 

44/85

77/21

09/7

5/38145

اندو

Penicillium sp. CGMCC 1669

 

65/72

92/30

21/5

2/39368

اندو

Sclerotinia sclerotiorum

 

85/58

54/34

38/6

3/28644

اگزو

Sclerotinia sclerotiorum

 

91/72

96/20

93/8

9/37517

اندو

Thanatephorus cucumeris

 

جدول 2 - خصوصیات بیوشیمیایی پلی­گالاکتورونازهای M. phaseolina

شاخص آلیفاتیک

شاخص ناپایداری

نقطه ایزوالکتریک

وزن مولکولی (دالتون)

شماره دستیابی

46/74

81/33

41/4

6/46542

gi|407923909|

61/67

96/33

77/4

8/44328

gi|407922771|

48/87

19/22

4/6

8/37429

gi|407917170|

61/67

32/29

4/4

2/54638

gi|407925949|

63/75

6/21

4/4

9/38198

gi|407924329|

51/77

64/34

58/4

7/48671

gi|407921266|

60/81

78/29

49/4

9/41316

gi|407920911|

1- دشت بزرگی، س، سپهری، ح، گلیایی، ب، دلفی، ل، جان زمین، الف، 1392، بررسی اثر مشتقات پکتینی در القای مرگ برنامه­ریزی شده یا آپاپتوز در دودمان سلولی سرطان پروستات انسانی DU145، مجله پژوهش­های سلولی و مولکولی (مجله زیست­شناسی ایران)، شماره 2، جلد 26. 

 

2- Aminzadeh, S, Farrokhi, N, 2013, Product optimization, purification and characterization of a novel polygalacturonase produced by Macrophomina phaseolina, Biological Journal of Microorganism, 1(4), 21-34.

3- Aminzadeh, S, Naderi-Manesh, H, Khajeh, Kh, Naderi-Manesh, M, 2006, Purification, characterization, kinetic properties, and thermal behavior of extracellular polygalacturonase produced by filamentous fungus Tetracoccosporium sp, Applied Biochemistry and Biotechnology, 135(3), 193-208

4- Angayarkanni, J, Palaniswami, M, Murugesan, S. & Swaminathan, k, 2002, Improvement of tea leaves fermentation with Aspergillus spp. Pectinase, Journal of Bioscience and Bioengineering, 94(4), 299-303.

5- Bradford, M.M, 1976, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem, 72, 248-254.

6- Carr, JG, 1985, Tea, coffee and cocoa, In:Wood BJB, editor. Microbiology of fermented foods, vol. 2. London: Elsevier Science Ltd. p, 133–54.

7- Day, A, Karmakar, M, Ray, R.R, 2011, Extracellular Thermostable Polygalacturonase from Bacillus sp, AD 1. Der Pharmacia Lettre, 3(2), 358-367.

8- Dayanand, A, Patil S. R, 2003, In: Detection of potential fungal isolates for the production of pectinase from deseeded dried sunflower head.

9- D'Ovidio, R, et al, 2004, Polygalacturonases, polygalacturonase-inhibiting proteins and pectic oligomers in plant–pathogen interactions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 1696(2), 237-244.

10- Gasteiger, E, Hoogland, C, Gattiker, A, Duvaud, S, Wilkins, M.R, Apple, R.D, et al, 2005, Protein identification analysis tools on the EXPAZY server, 571-607.

11- Hoondal, GS, Tiwari, RP, Tiwari, R, Dahiya, N,  2000, Microbial alkaline pectinases and their applications: a review. Appl Microbiol Biotechnol, 59,409–18.

12- Idnurm, A, Howlett, B.J, 2001, Pathogenicity genes of phyto-pathogenic fungi, Mol. Plant Pathol, 2, 241–255.

13- Jayani, R.S, Saxena, S, Gupta, R, 2005, Microbial pectinolytic enzymes: a review. Process Biochemistry, 40(9), 2931-2944.

14- Kapoor, M, Beg, QK, Bhushan, B, Singh, K, Dadhich, KS & Hoondal, GS, 2001, Application of an alkaline and thermostable polygalacturonase from Bacillus sp. MG-cp-2 in degumming of ramie (Boehmeria nivea) and sunn hemp (Crotalaria juncea) bast fibers, Process Biochemistry, 36, 803–807.

15- Kirk, T.K, Jeffries, T.W, 1996, Roles for microbial enzymes in pulp and paper processing. in ACS Symposium Series, Washington, DC: American Chemical Society,[1974].   

16- Maijala, P, et al., 2008, Biomechanical pulping of softwood with enzymes and white-rot fungus Physisporinus rivulosus. Enzyme and microbial technology, 2008. 43(2),169-177.

17- Maisuria, V.B, et al, 2010, Biochemical and Thermal Stabilization Parameters of Polygalacturonase from Erwinia carotovora subsp. carotovora BR1. J. Microbiol. Biotechnol., 20(7), 1077-1085.

18- Margo, P, Varvaro, L, Chilosi, G, Avanzo, C, Balestra, GM, 1994, Pectinolytic enzymes produced by Pseudomonas syringae pv. Glycinea, FEMS Microbiol Lett,117,1–6.

19- Martins, E.d.S, et al, 2013, Purification and Properties of Polygalacturonase Produced by Thermophilic Fungus Thermoascus aurantiacus CBMAI-756 on Solid-State Fermentation, Enzyme research.

20- Miller, G.L, 1959, Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Anal. Chem, 31, 426-428.

21- Niture, S.K, et al, 2008, Inactivation of polygalacturonase and pectate lyase produced by pH tolerant fungus Fusarium moniliforme NCIM 1276 in a liquid medium and in the host tissue, Microbiological research, 163(1), p. 51-62.

22- Pedrolli, D.B, et al, 2008, Studies on productivity and characterization of polygalacturonase from Aspergillus giganteus submerged culture using citrus pectin and orange waste, Appl Biochem Biotechnol, 2008. 144(2),191-200.

23- Pietro, AD, Roncero, MIG. 1996, Purification and characterization of an exo-polygalacturonase from the tomato vascular wilt pathogen Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, FEMS Microbiol Lett,145, 295–8.

24- Viikari, L, Tenakanen, M, Suurnakki, A, 2001,  Biotechnology in the pulp and paper industry, In: Rehm HJ, editor. Biotechnology, VCH-Wiley, 523–46.

25- Reid, I, Richard, M, 2004, Purified pectinase lowers cationic demand in peroxide-bleached mechanical pulp, Enzyme Microbial Technol, 34,499–504.

26- Salazar, L, Jayasinghe, U, 1999, Fundamentals of purification of plant viruses, In: Techniques in plant, virology, CIP, Training Manual, J.O, Virus Purification, International Potato Centre, Peru, 1–10.

27- Schnitzhofer, W, Weber, H.-J, Vrˇsansk´, M, Biely, P, Cavaco-Paulo, A, Guebitz, G.M, 2007 Purification and mechanistic characterisation of two polygalacturonases from Sclerotium rolfsii,40, 1739–1747.

28- Singh, .SA, Ramakrishna, M, Rao AGA, 1999, Optimization of downstream processing parameters for the recovery of pectinase from the fermented broth of Aspergillus carbonarious, Process Biochem, 35, 411–7.

29- Takao, M, Nakaniwa, T, et al, 2001, Molecular cloning, DNA sequence, and expression of the gene encoding for thermostable pectate lyase of thermophilic Bacillus sp. TS 47, Biosci Biotechnol Biochem, 65,322–9.

30- Torres, S, et al, 2011, A colorimetric method to quantify endo-polygalacturonase activity. Enzyme and microbial technology, 48(2),123-128.

31- Wakabayashi, K, and Huber, D, 2001, Purification and catalytic properties of polygalacturonase isoforms from ripe avocado (Persea americana) fruit mesocarp. Physiologia-Plantarum, 113, 210-216.

32- Whitaker JR, 1990, Microbial pectinolytic enzymes. In: Fogarty WM, Kelly CT, editors. Microbial enzymes and biotechnology. 2nd ed. London, Elsevier Science Ltd.,1990. P, 133–76.