نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانش آموخته کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی دانشگاه رازی
2 استادیار گروه زراعت و اصلاح نباتات دانشگاه رازی
چکیده
در این مطالعه با استفاده از روش آنالیز نسبی بیان ژنها بهکمک تکنیک (qRT-PCR) Quantitative Real Time PCR تاثیر دو سطح تنش خشکی 12 و 16 روزه بر بیان خانواده ژنی رمزکننده آنزیم اس-آدنوزیل-المتیونین: فسفواتانولآمینان-متیلترانسفراز (PEAMT) در سه اندام آرابیدوپسیس؛ شامل برگهای درحال توسعه، برگهای توسعه یافته و ریشه؛ ارزیابی شد. این آنزیم نقش کلیدی در بیوسنتز فسفوکولین دارد. تاکنون یک ژن به طور قطع (AtNMT1) و دو ژن به صورت احتمالی (AtNMT2 و AtNMT3) به عنوان رمزکننده آنزیمهای خانواده PEAMT در آرابیدوپسیس معرفی شدهاند. رفتار این سه ژن در مواجهه با تنش خشکی متفاوت بود. درحالیکه بیان ژن AtNMT2 چندان متاثر از تنش و نوع اندام نبود، بیان دو ژن AtNMT1 و AtNMT3 بسیار به این عوامل وابسته بودند. بیان AtNMT1 در پاسخ به 12 روز قطع آبیاری در برگهای درحال توسعه و توسعه یافته کاهشی تقریبا 8/0 برابری داشت، اما بیان آن در ریشه تا حدود 5/4 برابر شاهد افزایش یافت. پس از 16 روز قطع آبیاری بیان این ژن در برگهای در حال توسعه تقریبا 5/2 برابر افزایش یافت و در ریشه با کاهش روبرو و به سطح شاهد بازگشت. بیان ژن AtNMT3 در 12 و 16 روز قطع آبیاری، به رغم عدم تغییر و کاهش در اندامهای هوایی، به ترتیب در حدود 5/3 و 9 برابر در ریشه افزایش یافت. به نظر میرسد AtNMT3 احتمالا ژن حساس به خشکی در ریشه است. بهطور کلی، شاید بتوان گفت که دو ژن AtNMT1 و AtNMT3 ایزوفرمهای موثر رمزکننده آنزیمهای PEAMTدر شرایط مواجهه با تنش خشکی در آرابیدوپسیس هستند.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Monitoring the Expression Pattern of Genes encoding S-adenosyl-L-methionine:phosphoethanolamine N-methyltransferase (PEAMT) enzyme in Arabidopsis under Drought Stress
نویسندگان [English]
2 assistant profesor of Razi University
چکیده [English]
In this study we use relative expression analysis via quantitative Real-Time PCR to evaluate the effects of drought on the expression pattern of genes coding for the enzyme S-adenosyl-L-methionine: phosphoethanolamine N-methyltransferase (PEAMT) in Arabidopsis thaliana. Tissues including fast-expanding leaves, fully expanded leaves, and roots have been considered. PEAMT plays a key role in the biosynthesis of phosphocholine. According to the Arabidopsis thaliana genome database (TAIR) there is one known gene At3g18000 (AtNMT1) and two putative genes At1g48600 (AtNMT2) and At1g73600 (AtNMT3) coding for the PEAMT enzyme. The tissue mRNA induction level of AtNMT1and AtNMT3 genes varied in response to drought levels, while AtNMT2 gene expression was affected negligibly by these factors. While withholding water for 12 days reduced the expression level of AtNMT1 in fast expanding and fully expanded leaves by about 0.8 folds, the expression level of the gene increased in roots by about 4.5 folds. In contrast, after 16 days without watering, the expression level of AtNMT1 rose about 2.5 folds and reduced to the level of control in fast expanding leaves and roots, respectively. The expression pattern of AtNMT3 suggests that AtNMT3 may be a drought responsive gene in roots. AtNMT3 expression in roots increased about 3.5 and 9 folds in response to 12 and 16 days of water deficit, respectively, despite the lack of changes and/or reduction in leaves. We conclude that the genes AtNMT1 and AtNMT3 may influence the response to drought stress in Arabidopsis.
کلیدواژهها [English]
اثر تنش خشکی بر بیان ژنهای کدکننده آنزیم اس-آدنوزیل-المتیونین: فسفواتانولآمینان-متیلترانسفراز (PEAMT) در آرابیدوپسیس
زهرا زنگیشهای و هومن سالاری*
کرمانشاه، دانشگاه رازی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی
تاریخ دریافت: 11/6/94 تاریخ پذیرش: 16/9/94
در این مطالعه با استفاده از روش آنالیز نسبی بیان ژنها بهکمک تکنیک (qRT-PCR) Quantitative Real Time PCR تأثیر دو سطح تنش خشکی 12 و 16 روزه بر بیان خانواده ژنی رمزکننده آنزیم اس-آدنوزیل-المتیونین: فسفواتانولآمینان-متیلترانسفراز (PEAMT) در سه اندام آرابیدوپسیس؛ شامل برگهای درحال توسعه، برگهای توسعه یافته و ریشه؛ ارزیابی شد. این آنزیم نقش کلیدی در بیوسنتز فسفوکولین دارد. تاکنون یک ژن به طور قطع (AtNMT1) و دو ژن به صورت احتمالی (AtNMT2 و AtNMT3) به عنوان رمزکننده آنزیمهای خانواده PEAMT در آرابیدوپسیس معرفی شدهاند. رفتار این سه ژن در مواجهه با تنش خشکی متفاوت بود. درحالی که بیان ژن AtNMT2 چندان متأثر از تنش و نوع اندام نبود، بیان دو ژن AtNMT1 و AtNMT3 بسیار به این عوامل وابسته بودند. بیان AtNMT1 در پاسخ به 12 روز قطع آبیاری در برگهای درحال توسعه و توسعه یافته کاهشی تقریباً 8/0 برابری داشت، اما بیان آن در ریشه تا حدود 5/4 برابر شاهد افزایش یافت. پس از 16 روز قطع آبیاری بیان این ژن در برگهای در حال توسعه تقریباً 5/2 برابر افزایش یافت و در ریشه با کاهش روبرو و به سطح شاهد بازگشت. بیان ژن AtNMT3 در 12 و 16 روز قطع آبیاری، به رغم عدم تغییر و کاهش در اندامهای هوایی، به ترتیب در حدود 5/3 و 9 برابر در ریشه افزایش یافت. به نظر میرسد AtNMT3 احتمالاً ژن حساس به خشکی در ریشه است. بهطور کلی، شاید بتوان گفت که دو ژن AtNMT1 و AtNMT3 ایزوفرمهای مؤثر رمزکننده آنزیمهای PEAMT در شرایط مواجهه با تنش خشکی در آرابیدوپسیس هستند.
واژه های کلیدی: آرابیدوپسیس تالیانا، تنش خشکی، اس-آدنوزیل-المتیونین: فسفواتانولآمینان-متیلترانسفراز، فسفاتیدیلکولین،qRT-PCR
* نویسنده مسئول، تلفن: 38324929-083، پست الکترونیکی: hsalari@yahoo.com
ترکیب شیمیایی فسفوکولین به خاطر پیشسازی فسفاتیدیلکولین و کولین در گیاهان و جانوران اهمیت بسیار دارد. فسفاتیدیلکولین فسفولیپید عمده در غشای سلولهای یوکاریوتی است (7 و 17). علاوه بر نقش مهم به عنوان جزئی از غشای سلولی، فسفاتیدیلکولین دارای عملکرد حیاتی در سیگنالینگ سلولی نیز میباشد. پژوهشها نشان دادهاند که فسفاتیدیکاسید که یکی از مشتقات فسفاتیدیلکولین میباشد، یک مولکول سیگنالینگ است که به عنوان پیغامبر ثانویه در انواع فرآیندهای سلولی و پاسخ به تنشها عمل میکند (35). کولین، ترکیب دیگری است که از فسفوکولین حاصل میشود. این ترکیب به جهت پیشسازی گلایسینبتائین که از متابولیتهای حیاتی در گیاهان به شمار میرود، اهمیت زیادی دارد. به طوری که در کنار اهمیت کولین در واکنش گیاه به تنشها، این ماده در راستای بهبود ارزش غذایی گیاهان نیز مورد توجه است. در گیاهان و برخی از یوکاریوتها کولین همچنین میتواند به عنوان پیشساز فسفاتیدیلکولین مورد استفاده قرار گیرد (16).
بیوسنتز فسفاتیدیلکولین در گیاهان با سایر یوکاریوتها متفاوت به نظر میرسد. گزارشهایی مبنی بر وجود مسیرهای مختلف بیوسنتز فسفوکولین وجود دارد، اما شواهد مختلف نشان دادهاند که آنزیم اس-آدنوزیل-المتیونین: فسفواتانولآمینان-متیل ترانسفراز (PEAMT) مهمترین آنزیم کنترل کننده در تمامی این مسیرهاست. مک نیل و همکاران در سال 2001 نشان داده اند که ان-متیلاسیون فسفواتانولآمین، رخداد اصلی کنترل در مسیر بیوسنتز فسفاتیدیلکولین میباشد که توسط آنزیم PEAMT تسهیل میگردد (16). سپس دو ان-متیلاسیون متوالی رخ میدهد که نتیجه آن به ترتیب فسفو-دیمتیلاتانولآمین و فسفوکولین است (شکل 1)(25). تسهیل دو متیلاسیون اخیر نیز همچون متیلاسیون نخست توسط آنزیم PEAMT انجام میشود (2 و20 و 28). همان طور که پیشتر اشاره شد، به طور کلی میتوان گفت که آنزیم PEAMT و فعالیت آن مهمترین عامل کنترل بیوسنتز فسفاتیدیلکولین و سایر مشتقات این ماده آلی است (7، 8، 16، 19، 20و 32). بررسی فعالیتهای آنزیمی در گیاهان مختلف مسیرهای جایگزین دیگری را هم برای بیوسنتز فسفاتیدیلکولین پیشنهاد داده است (15 و 29) اما تاکنون درباره شواهد ژنتیکی که مستقیماً این مسیرها را به اثبات برساند گزارشی ارائه نشده است. پس از تولید فسفوکولین، سنتز فسفاتیدیلکولین از طریق CDP-کولین (مسیر کندی) و توسط دو آنزیم CCT-فسفوکولین سیتیدیل ترانسفراز (CCT) و آمینوالکلفسفوترانسفراز (AAPT) کاتالیز میشود (11). علاوه بر تولید فسفاتیدیلکولین، کولین هم میتواند در ادامه این مسیر تولید شود (15 و 25).
در شرایط تنش، کولین توسط آنزیمهای کولینمونواکسیژناز (CMO) و بتائینآلدهیددهیدروژناز (BADH) در کلروپلاستها اکسید شده و به گلایسینبتائین تبدیل میشود. گلایسینبتائین از محلولهای سازگاری است که به عنوان تنظیم کنندههای اسمزی غیرسمی در سیتوپلاسم شناخته میشوند. این ترکیبات در بسیاری از گیاهان در پاسخ به اثرات سوء تنشهای غیرزیستی سنتز و انباشت مییابند (5، 24 و 33).
شکل 1- مسیر متابولیکی بیوسنتز فسفوکولین، کولین، فسفاتیدیلکولین و گلایسینبتائین در گیاهان عالی (براساس سالاری، 2008)
مطالعات مختلف نشان دادهاند که فسفاتیدیلکولین ممکن است در پاسخ گیاه به تنشهای غیرزیستی، به ویژه در گونههایی که قادر به انباشت گلایسینبتائین نیستند، ایفای نقش کند. برای نمونه نشان داده شده که در طی سازگاری به سرما، کمیت و سهم نسبی فسفاتیدیلکولین نسبت به دیگر لیپیدها افزایش مییابد (4، 9، 10، 12 و 14). طبق بررسی صورت گرفته، غلظت فسفاتیدیلکولین با درجه تحمل یخ زدگی در 13 رقم سرما دیده گندم همبستگی نشان داده است (9). همچنین محتوای فسفاتیدیلکولین روزت آرابیدوپسیس در روز اول و چهارم بعد از قرارگرفتن گیاه در سرمای 2 درجه سانتی گراد به ترتیب به میزان 15 و 26 درصد افزایش یافته است (10). گزارشهایی وجود دارند که نشان میدهند تحمل یخزدگی با تغییر در مقدار و درجه غیراشباعیت چندگانه فسفاتیدیلکولین همبستگی دارد (12 و 27). مطالعات دیگری درباره نقش فسفاتیدیلکولین در تنشهای شوری و اسموتیک انجام شده است. پیکال و همکارانش (1999) نشان دادند که، در سلولهای کشت سوسپانسیونی آرابیدوپسیس مقدار فسفاتیدیلکولین پس از تیمار با 400 میلی مولارNaCl در حدود 35 برابر افزایش یافته است. این درحالی بود که، تیمار با سوربیتول (800 میلی مولار) محتوای فسفاتیدیلکولین را متأثر نساخت (22).
گزارشهایی درباره رفتار ژنهای کدکننده آنزیمهای خانواده PEAMT که عامل مهم و اصلی در کنترل مسیر بیوسنتز فسفوکولین و سایر مشتقات این ماده آلی است، در پاسخ به تنشهای غیرزیستی ارائه شده است. خاموشکردن ژنهای خانواده AtNMT - کدکننده آنزیمهای خانواده PEAMT - در آرابیدوپسیس به نرعقیمی حساس به دما و همچنین حساسیت شدید به نمک منتج شده است (18). آنالیز بیان ژنهای خانواده فوق الذکر به روش نورترن بلاتینگ، نشان داد که شش ساعت پساز تیمار سرمایی بیان کاهش مییابد، ولی 48 ساعت بعد به سطح نرمال باز میگردد (30). براساس گزارش صورت گرفته توسط چرن و همکاران (2002)، تجمع رونوشتهای ژن PEAMT گندم پس از تیمار با آبسیزیک اسید و قرار گرفتن در معرض شوری، تنش رطوبتی و دمای پایین در سطوح بالایی صورت میگیرد. فعالیت ویژه آنزیم نیز 5 برابر پس از شش روز تنش سرمایی، 4 برابر بعد از افزودن نمک، 3 برابر پس از تیمار با آبسیزیک اسید و حدود 1 برابر پس از اعمال تنش آبی افزایش یافت. علاوه بر این، رابطه مثبت و معنیداری بین ظرفیت انطباق با سرما و تجمع رونوشتهای PEAMT در طیف وسیعی از ارقام مختلف گندم مشاهده شد (4). آنالیز RT-PCR صورت گرفته توسط وو و همکاران (2007) هم حاکیاز القای بیان ژن PEAMT ذرت در شرایط تنش شوری و عدم بیان در دمای بالا بود. بیش بیانی این ژن در آرابیدوپسیس افزایش تحمل شوری، طول ریشه و تعداد سیلیک را بهدنبال داشت (34).
براساس اطلاعات موجود در پایگاه داده ژنوم آرابیدوپسیس تالیانا (تارنمای TAIR) تاکنون یک ژن به طور قطع ((AtNMT1) (At3g18000و دو ژن به صورت احتمالی At1g48600 (AtNMT2)) و At1g73600 (AtNMT3)) آنزیمهای خانواده PEAMT را در گیاه آرابیدوپسیس کد میکنند. مطالعه الگوی بیان کمی این ژنها در شرایط بدون تنش نشان داد که همه اعضای این خانواده در هر دو بخش ریشه و اندام هوایی بیان میشوند، اما میزان بیان آنها متفاوت است (26). براساس این مطالعه، AtNMT3 ایزوفرم غالب در برگ آرابیدوپسیس گزارش شد، به طوری که بیان آن به ترتیب 17 و 2 برابر بیشتر از میزان بیان AtNMT1 و AtNMT2 در این اندام بود. درمقابل، AtNMT2 ایزوفرمی بود که بیشترین بیان را در ریشه نشان داد؛ این درحالی بود که میزان بیان دو ایزوفورم AtNMT1 و AtNMT3 در مقادیر قابل مقایسهای از برگ پایینتر بود.
با وجود آنکه اثرات تنشهای غیرزیستی بر عملکرد، ویژگیهای رشدی و فیزیولوژیک گیاهان به فراوانی مورد بررسی قرار گرفته است، اما تأثیر اولیه این تنشها بر رفتارهای بیوشیمیایی و مولکولی به خوبی مطالعه نشده است. لذا به نظر میرسد آگاهی از پاسخهای مولکولی گیاهان به تغییر محیط پیرامون و تنشهای غیرزیستی یکی از حوزههای مهم در پژوهشها به شمار میرود. این آگاهی میتواند منجر به به کارگیری فناورهای زیستی به منظور ایجاد ارقام متحمل به تنشها گردد. براساس اطلاعات در دسترس تاکنون از چگونگی تغییر در بروز سه ژن AtNMT1، AtNMT2و AtNMT3 بر اثر قطع آبیاری درگیاه آرابیدوپسیس، به عنوان مهمترین گیاه مدل در بررسیهای زیست شناسی و زیست فناوری، گزارشی منتشر نشده است. از سوی دیگر، هرگونه دستکاری ژنتیکی در ژنهای کدکننده این آنزیم در مسیر متابولیکی مربوطه پیشتر نیازمند پاسخ به این پرسش است که آیا بروز این ژنها متأثر از وقوع تنشها میباشد یا خیر؟ در مطالعه حاضر برای نخستین بار تلاش شده است تا با بهرهگیری از روش آنالیز نسبی بیان ژنها بهکمک تکنیک qRT-PCR، چگونگی تأثیر دو دوره قطع آبیاری بر بروز این ژنها در سه اندام گیاه آرابیدوپسیس تالیانا شامل برگهای درحال توسعه، برگهای توسعه یافته و ریشه مورد ارزیابی قرار گیرد.
مواد و روشها
آزمایشهای این پژوهش در آزمایشگاههای تحقیقاتی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه رازی کرمانشاه انجام شد. اکوتیپ Col-0 گیاه آرابیدوپسیس تالیانا، مورد استفاده قرار گرفت. بذور مربوطه از پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی ایران تهیه شد. بذور مطابق روش پیشنهادی ویگل و همکاران (2002) ضد عفونی شدند (31). بذور ضدعفونی شده به مدت 48 ساعت در تاریکی کامل و دمای 4 درجه سانتی گراد سرمادهی و در یک نوبت کشت شدند. گلدانهایی به قطر و ارتفاع نه سانتیمتر از جنس پلی اتیلن شفاف و با گنجایش تقریبی 170 گرم خاک مورد استفاده قرار گرفت. خاک مورد استفاده نسبت مساوی حجمی از ورمیکولایت سایز 3-0 (کاندیس- ایران) و پیت ماس (ای دی فری پیت- هلند) و 2 گرم بهازای هر لیترخاک، کود آماده اگرویت (آگلوکن- آلمان) بود. در هر گلدان پنج بذر کشت و در دو نوبت (درمرحله 4-3 برگی) از طریق تنککردن به یک گیاه در هر گلدان کاهش یافت. گلدانها در سینیهایی به ابعاد 50×25×9 سانتیمتر و در اتاقک رشدی با دمای 25 درجه سانتی گراد، رطوبت نسبی 30 درصد، شدت نور 120 میکروانشتین (لامپ فلوئورسنت سفید) و طول روز 10 ساعت که در اواخر مرحله رشد به تدریج به 12 ساعت رسانیده شد، نگهداری شدند. آبیاری از کف و با آب شرب شهری انجام شد. بدین منظور هشت سوراخ با فاصله مساوی در لبه مماس بر ته هر گلدان تعبیه شد. آبیاری تا رسیدن به ظرفیت زراعی، هر چهار روز یکبار انجام گرفت. تنش خشکی از هفته هفتم و در دو سطح قطع کامل آبیاری به مدت 12 روز (خشکی سطح 1) و قطع کامل آبیاری به مدت 16 روز (خشکی سطح 2) اعمال شد. پس از اعمال تنش نمونهگیری انجام شد (شکل 2). از تیمار شاهد متناظر با هر سطح تنش همزمان با تیمار تنش مربوطه نمونهگیری به عمل آمد. نمونهها بلافاصله در ازت مایع منجمد و تا زمان استفاده در فریزر 80- درجه سانتی گراد نگهداری شدند. سه اندام مورد مطالعه شامل برگهای درحال توسعه، برگهای توسعه یافته و ریشه، بود. هر نمونه آزمایشی متشکل از بالک (مخلوط) اندام مدنظر از دو گیاه مجزا در نظر گرفته شد.
از روش پیشنهادی بوتلا و همکاران (1992) برای استخراج RNA استفاده شد (3). کیفیت RNAهای حاصل با بارگذاری در ژل آگارز 8/0 درصد بررسی شد. مقدار کمی RNA با استفاده از دستگاه نانودراپ (NanoDrop 2000c, Thermo Scientific, USA) و بررسی جذب در طول موجهای 260 و 280 نانومتر تعیین شد. آغازگرهای مورد استفاده از طریق نمایه pick primers در سایت NCBI طراحی شد (جدول 1). محل آغازگرها تا حد امکان نزدیک به انتهای '3 انتخاب شدند. طراحی آغازگرها به نحوی انجام شد که حداقل یکیاز دو آغازگر رفتی یا برگشتی در نواحی اگزون پیشین- اگزون پسین قرار گیرد تا از تکثیر غیراختصاصی ناشیاز آلودگیهای ژنومی جلوگیری شود. بازده تکثیر آغازگرها با استفاده از منحنیهای استاندارد و نیز رگرسیون خطی منحنی تکثیر نرمفزار LinRegPCR (23) بررسی شدند.
شکل 2- وضعیت نمونههای آرابیدوپسیس در روز نمونهگیری. خشکی سطح 1(D1) و کنترل خشکی سطح 1 (CD1). خشکی سطح 2 (D2) و کنترل خشکی سطح 2 (CD2). مقیاس (اندازه خط افقی) = cm5/4
برای این هدف یک سری رقت 10 واحدی (25 نانوگرم تا 25 پیکوگرم) از یکی از نمونههای RNA آماده شد. راندمان پرایمرها براساس رابطه E = 10(-1/slope)-1 محاسبه شد (21). این روش همچنین جهت تعیین غلظت مطلوب RNA در آنالیزهای qRT-PCR به کار رفت و غلظت 25 نانوگرم به عنوان مقدار مطلوب RNA در واکنشهای بعدی تعیین شد. بیان کمی ژنها به روش qRT-PCR با استفاده از کیت تک مرحلهایSG OneStep qRT-PCR (EURx, Poland) و در دستگاه ترموسایکلر Rotor-GeneQ, Corbett Research, Australia) ) اندازه گیری شد. براساس پروتکل پیشنهادی شرکت سازنده در برنامه واکنش ابتدا یک مرحله 30 دقیقهای در دمای 50 درجه سانتی گراد جهت رونویسی معکوس درنظر گرفته شد. سپس qRT-PCR با یک مرحله واسرشت سازی اولیه در دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 3 دقیقه شروع و پس از آن 40 سیکل شامل سه مرحله متوالی 94 درجه سانتی گراد به مدت 15 ثانیه، 55 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه و 72 درجه سانتی گراد به مدت 20 ثانیه انجام شد. در پایان و به منظور دستیابی به منحنی ذوب، آغازگرها در محدوده دمایی 95-60 درجه سانتی گراد طی یک مرحله ذوب شدند. بررسی کیفیت آغازگرها و اختصاصی بودن تکثیر محصول هدف، بعد از هر دور qRT-PCR و به کمک تجزیه منحنیهای ذوب انجام شد. مقادیر چرخه آستانه (CT) به روش Fit Point توسط نرمافزار دستگاه rotor-gene_1_7_87)) و براساس منحنیهای استاندارد تولید شده، تعیین شد. در وارد کردن دادهها و انجام تجزیههای آماری، میانگین مقادیر CT حاصل از 3 تکرار فنی برای هر نمونه به کار گرفته شد. از میانگین ژئومتریک مقادیر CT سه ژن مرجع AtPDF2، AtUBC9 و AtYLS8 برای نرمال کردن دادهها، استفاده شد (6). دو روش غیرمبتنی بر تصحیح راندمان 2^-ΔΔCT (13) با کمک نرم افزار آفیس 2010 در محیط اکسل و روش مبتنی بر تصحیح راندمان پافل در نرم افزار REST 2009 (21) جهت آنالیز داده ها مورد استفاده قرار گرفتند.
نتایج
نتایج بررسی به روش غیرمبتنی بر تصحیح راندمان 2^-ΔΔCT در شکل 3 نشان داده شده است. بررسی بیان ژن AtNMT1 در اندامهای مورد مطالعه نشان داد که 12 روز قطع آبیاری بیان این ژن را در برگهای درحال توسعه و توسعه یافته به صورت معنیدار و به ترتیب به میزان 80 و 90 درصد ( 2/0 و 1/0 برابر) نسبت به شرایط بدون تنش- شاهد- کاهش داده است.
جدول 1. اسامی آغازگرها و اندازه مورد انتظار قطعات ژنهای هدف و مرجع
نام آغازگر |
ژن هدف |
(5’ à 3΄) توالی آغازگر |
دمای اتصال (0C) |
اندازه قطعه مورد انتظار (bp) |
AtNMT1-qPCR-F01 |
AtNMT1 |
GCCCCAAAACTCCATCTGCT |
59.4 |
100 |
AtNMT1-qPCR-R01 |
CCAGCGTCTTTTAGCATCTGTC |
60.3 |
||
AtNMT2-qPCR-F01 |
AtNMT2 |
ATCCAGACTCGCCGTTGAAG |
59.4 |
114 |
AtNMT2-qPCR-R02 |
TCTTCCTTGTATGGTGTCGCC |
59.8 |
||
AtNMT3-qPCR-F01 |
AtNMT3 |
ACAGTCATCTCCGTCTCGAA |
57.3 |
127 |
AtNMT3-qPCR-R01 |
TTTCACGCTCCTCGCCATA |
56.7 |
||
AtPDF2_ Ref -F01 |
AtPDF2 |
AATCGGTAGGGAGTGATTTGAGT |
53.5 |
231 |
AtPDF2_ Ref -R01 |
AGCCAAAAGCACCTCATCGT |
51.8 |
||
AtUBC9_ Ref -F01 |
AtUBC9 |
GGATTGGTTTTCGATTGCAGAG |
53 |
134 |
AtUBC9_ Ref -R01 |
ACGGGTCCTGCGCTACA |
51.9 |
||
AtYLS8_ Ref -F01 |
AtYLS8 |
GCAGATGGATGAGGTGCTTG |
53.8 |
212 |
AtYLS8_ Ref -R01 |
GCTTGTCCTTGAGAGCCCAG |
55.9 |
برخلاف اندامهای هوایی، 12 روز قطع آبیاری موجب افزایش تقریباً 5 برابری بیان ژن AtNMT1در ریشه در مقایسه با شرایط بدون تنش شده است. رفتار این ژن در اندامهای مورد مطالعه پس از افزایش زمان تنش قطع آبیاری از 12 روز به 16 روز تغییر کرد. دوره 16 روزه قطع آبیاری در برگهای درحال توسعه به افزایش حدوداً 3 برابری بروز ژن AtNMT1 نسبت به شاهد منجر شد که افزایش بسیار چشمگیری را در مقایسه با 12 روز تنش نشان میدهد. اما مقایسه بروز این ژن در دورههای تنش 12 روزه و 16 روزه در برگهای توسعه یافته تفاوتی را نشان نمیدهد، اگر چه بروز این ژن کاهش بسیار چشمگیری را نسبت به شاهد نشان داده است. نکته قابل توجه کاهش معنیدار بیان این ژن در 16 روز قطع آبیاری درمقایسه با 12 روز قطع آبیاری و برگشت بیان به سطح شاهد در ریشه است. به نظر میرسد که افزایش مدت قطع آبیاری رابطه نسبی بیان این ژن بین برگهای درحال توسعه و ریشه را معکوس میکند (شکل 3-الف).
الگوی تغییر بیان ژن AtNMT2 نشان داد که، 12 روز قطع آبیاری و افزایش این زمان به 16 روز نتوانسته در مقایسه با شرایط بدون تنش تغییر محسوسی را در بیان این ژن در دو اندام هوایی ایجاد کند. 12 روز قطع آبیاری در ریشه همچون اندامهای هوایی موجب تغییر در بیان ژن AtNMT2 نشد. اما افزایش مدت تنش به 16 روز بیان این ژن را در ریشه در مقایسه با شرایط بدون تنش شدیداً کاهش داده و تقریباً به صفر رسانیده است. بنابراین، علی رغم اینکه بیان این ژن در اندامهای هوایی از تنش و تغییرات شدت/مدت آن متأثر نیست، در ریشه افت بیان در پاسخ به افزایش شدت/مدت خشکی چشمگیر است (شکل 3-ب).
درخصوص ژن AtNMT3 مشاهده شد که 12 روز قطع آبیاری در مقایسه با شرایط بدون تنش تغییری را در بیان این ژن در برگهای توسعه یافته ایجاد نکرد. در برگهای درحال توسعه بیان ژن AtNMT3 تا حدود 50 درصد (5/0 برابر) در مقایسه با شاهد کاهش یافت. نکته قابل توجه آن است که رفتار این ژن در پاسخ به قطع آبیاری در ریشه کاملاً متفاوت بود. اعمال تنش 12 روزه موجب افزایش نزدیک به 9 برابری بیان ژن AtNMT3 در ریشه در مقایسه با شرایط بدون تنش شد. افزایش مدت تنش به 16 روز همچنان تغییر معنیداری را در بیان ژن AtNMT3 در برگهای درحال توسعه نسبت به شاهد ایجاد نکرد، اما بیان آن را در برگهای توسعه یافته کاهش داد و تقریباً میزان بیان به صفر رسید. 16 روز قطع آبیاری موجب کاهش نسبتاً چشمگیر بیان این ژن نسبت به مدت 12 روز قطع آبیاری در ریشه شد، اما همچنان میزان بیان آن 5/3 برابر شاهد بود (شکل 3-ج). به طور کلی، میتوان گفت که رفتار سه ژن خانواده AtNMT در مواجهه با قطع آبیاری متفاوت است (شکل 3).
شکل 3- الگوی تغییر بیان کمی ژنهای خانواده AtNMT در پاسخ به خشکی در دو بازه زمانی 12 و 16روزه. الف: AtNMT1. ب: AtNMT2. ج: AtNMT3. **= تفاوت بسیار معنیدار نسبت به شاهد، *= تفاوت معنیدار نسبت به شاهد.
آنالیز دادهها به روش مبتنی بر تصحیح راندمان پافل نتایج حاصل از روش غیرمبتنی بر تصحیح راندمان 2^-ΔΔCT را کاملاً تأیید نمود (شکل 4).
شکل 4- بیان کمی سه ژن AtNMT1، AtNMT2 و AtNMT3 در برگهای درحال توسعه(Fast Expanding Leaves) ، برگهای توسعه یافته (Fast Expanded Leaves) و ریشه(Root) ، در دو بازه زمانی 12(D1) و 16(D2) روزه پساز قطع آبیاری، به روش مبتنی بر تصحیح راندمان پافل. باکسها نشاندهنده 50 درصد مشاهدات، خطوط نقطهچین نشاندهنده میانه بیان ژن، و خطوط دنباله نشاندهنده 25 درصد بیشینه و 25 درصد کمینه مشاهدات هستند. بیان ژنها در کالیبراتور (شاهد) معادل 1 درنظرگرفته میشود، که بهوسیله خط مبنا مشخص شدهاست.
بحث
در این مطالعه بررسی سطوح تجمع رونوشتها، که به وسیله تعداد سیکلهای مورد نیاز جهت رسیدن به نقطه CT (ΔCT) تعیین شد، نشان داد که میزان بیان ژن AtNMT2 در همه اندامهای مورد بررسی و در شرایط بدون تنش- شاهد- علی رغم وجود تنوع بروز در اندامهای مختلف زیاد است (شکل 5). همان طور که پیش تر گفته شد، رخ دادن تنش و افزایش شدت/مدت آن تغییر محسوس و معنیداری را در بیان ژن AtNMT2 در اندامهای هوایی ایجاد نکرد. همچنین تنش اثری در رفتار این ژن پس از 12 روز قطع آبیاری در ریشه نداشت اما افزایش شدت/مدت تنش بیان این ژن را نسبت به حالت بدون تنش در این اندام شدیداً کاهش داد (شکل 3-ب). این مشاهده با نتیجه آزمایش تاسوا و همکاران (2004) که اثر تنشهای غیرزنده را بر گیاهچه آرابیدوپسیس مطالعه کردهاند و نشان دادهاند که ژن AtNMT2 در پاسخ به سطوح گوناگون تنش سرما و سطوح اولیه تنشهای شوری و اسمتیک عکسالعملی را نشان نمیدهد، ولی با افزایش شدت/مدت دو تنش اخیر بیانش کاهش مییابد، تا حدودی تطابق نشان میدهد (30). همچنین سالاری در سال 2008 نشان داده است که در میان ژنهای خانواده AtNMT ژن AtNMT2 ایزوفرم غالب ریشه است، بنابراین تفاوت رفتار این ژن در اندامهای هوایی و ریشه شاید مرتبط با اختصاصی بودن این ایزو فرم برای ریشه باشد (26). به طور کلی ممکن است بتوان گفت بروز زیاد این ژن در شرایط غیر تنش به علت نقش مهمتر و احتمالی این ژن در سایر مسیرهای متابولیکی است که نیازمند مطالعه دیگری است. همچنین ممکن است عدم تغییر معنیدار بیان این ژن به اعمال تنش بدان دلیل باشد که با توجه به بروز نسبتاً چشمگیر این ژن در شرایط بدون تنش، پس از نسبی سازی بروز آن در شرایط تنش نسبت به شرایط بدون تنش، علی رغم تغییر قابل ملاحظه مطلق بروز، در مقام قیاس با شرایط بدون تنش ناچیز مینماید.
بیان ژن AtNMT3 در نمونههای مربوط به شرایط بدون تنش-شاهد- بسیار کم و نزدیک به صفر بود؛ به نحوی که مقادیر CT متناظر با این ژن معمولاً در محدوده سیکلهای 28 تا 32 قرار داشت (شکل 3-ج). لذا امکان دخالت این ژن در سایر مسیرهای متابولیکی در شرایط بدون تنش کم به نظر میرسد. تغییر چشمگیر بروز نسبی این ژن در ریشه به هنگام مواجه شدن گیاه با تنش این فرضیه را که احتمالاً ژن AtNMT3 ژن حساس به خشکی برای این مسیر متابولیکی در ریشه است را بسیار تقویت میکند. گفتنی است براساس مطالعه سالاری (2008)، AtNMT3 ایزوفرم غالب در برگ و AtNMT2 ایزوفرم غالب ریشه بوده است که نتایج این پژوهشگر در توافق با الگوی ارائه شده در سایتhttp://www.bar.utoronto.ca/efp/cgibin/efpWeb.cg میباشد (26). به نظر میرسد نتایج پژوهش حاضر با گزارش پیشتر گفته تفاوت دارد، اما بسیار محتمل است که الگوی بیان این ژن در شرایط تنش با شرایط بدون تنش متفاوت باشد. از سوی دیگر چون بررسی حاضر در مرحله رشدی دیگری صورت پذیرفته است، مرحله رشدی نیز میتواند علت تفاوت مشاهدات در نظر گرفته شود (10). با این حال هرگونه اظهارنظر درباره این تفاوت به مطالعه و آزمایشهای بیشتر نیازمند است.
توجه به مقدار بیان ژن AtNMT1در شرایط بدون تنش و مقایسه آن با تغییرات بروز آن در شرایط تنش خشکی این فرضیه که ژن AtNMT1 به هنگام مواجه گیاه با تنش خشکی نقش دارد را تقویت مینماید (اشکال 3-الف و 5). با این حال تشخیص یک الگوی منسجم متأثر از شدت/مدت تنش و اندامهای مورد بررسی برای رفتار این ژن در مواجه با تنش خشکی امکانپذیر نیست. به طور کلی شاید بتوان گفت که ژن AtNMT1 در سطوح اولیه تنش خشکی در ریشه تحریک شده و نقش ایفاء مینماید، ولی با شدت گرفتن تنش این وظیفه را در برگهای درحال توسعه دنبال میکند. همچنین با توجه به نتایج مطالعات پیشین محتمل است ژن AtNMT1 با افزایش سطح تنش خشکی نقش بیشتری نسبت به سایر ژنهای این خانواده در گیاه ایفاء نماید. راستی آزمایی چنین فرضیهای به بررسی موتانتها و لاینهای ترانسژنیک ژنهای خانوادهAtNMT نیاز دارد.
شکل 5- بیان کمی سه ژن AtNMT1، AtNMT2 و AtNMT3 در برگهای درحال توسعه، برگهای توسعه یافته و ریشه در شرایط بدون تنش (شاهد) برحسب مقادیر 2^-Δ.
به طور کلی و براساس نتایج بدست آمده میتوان گفت که ژن AtNMT2 از تنش خشکی و تغییرات شدت/مدت آن متأثر نیست. براساس این نتایج و شواهدی همچون عدم تولید موتان بدون عملکرد برای ژن AtNMT2 (26)، به نظر میرسد که این ژن در مسیرهای متابولیکی احتمالاً حیاتی و متفاوت از پاسخ به تنشها دخالت داشته باشد. با پذیرش این فرضیه و کنار گذاشتن ژن AtNMT2 به عنوان عضوی از خانواده ژنی دخیل در مسیر بیوسنتز فسفوکولین و مشاهده الگوی مشابه کاهش در بیان دو ژن AtNMT1 و AtNMT3 در پاسخ به سطوح مختلف تنش خشکی در برگهای توسعه یافته، به نظر میرسد که مسیر بیوسنتز فسفوکولین در این اندام از مکانیسمهای اصلی مواجه با تنش خشکی نباشد. با این حال شواهد ژنتیکی که بتواند مستقیماً این فرضیه را تأیید کند، در دست نیست. در عین حال دیده میشود که بیان دو ژن AtNMT1 و AtNMT3 در پاسخ به اولین سطح تنش خشکی در ریشه به شدت افزایش مییابد. همچنین میتوان گفت دلیل رفتار متفاوت ریشه با اندامهای هوایی میتواند بدان جهت باشد که ریشه نخستین اندامی است که با تنش مواجه میشود. نتایج حاضر همچنین نشان میدهد که اگرچه ژن AtNMT1 درسطوح اولیه تنش خشکی در ریشه –اولین اندام متأثر از تنش- تحریک میشود، اما با تشدید تنش و احتمالاً رسیدن سیگنالهای القایی ناشی از آن به بخشهای هوایی، به عنوان ایزوفرم غالب در برگهای درحال توسعه عمل میکند. AtNMT3 احتمالاً ژن حساس به خشکی در ریشه است. به عبارت دیگر، به نظر میرسد که بیان دو ژن AtNMT1 و AtNMT3 در میان اندامها تاحدودی از الگوی القای مختص به بافت پیروی میکند. همچنین دیده شد که افزایش شدت/مدت خشکی بیان این دو ژن در ریشه را در مقایسه با 12 روز خشکی کاهش داده است (اشکال 3-الف و ج). این مشاهده براساس گزارشات پیشین درخصوص حساسیت آنزیم PEAMT به بازخورد منفی فسفوکولین توجیه پذیر است (16). این مسئله همچنین میتواند ناشی از این باشد که با افزایش تنش گیاه از مکانیسمهای جایگزین استفاده کرده و نقش این مسیر بیوسنتزی در پاسخ به شرایط موجود در حال کم اثر شدن است. به عبارت دیگر، ممکن است که مسیر متابولیکی تولید فسفوکولین که محصول این ژنها در آن دخالت دارد، در شرایط تشدید عدم دسترسی به آب چندان فعال نبوده یا کم فعالیت گردد. همین روند در مطالعه پیش تر صورت گرفته توسط این تیم تحقیقاتی بر روی ژنهای خانواده BADH که در بیوسنتز گلایسین بتائین –به عنوان یکی از فرآوردههای پایین دستی مسیر بیوسنتزی فسفوکولین- نقش دارند مشاهده شد؛ یافتهای که میتواند به فرضیه فوق قوت بیشتری ببخشد (1). با توجه به نتایج این آزمایش و مطالعات قبلی به نظر میرسد که دو ژن AtNMT1 و AtNMT3 ایزوفرم NMT مفروض مؤثر در مواجهه با تنش خشکی در آرابیدوپسیس هستند. بر این اساس اندازهگیری فعالیت آنزیمهای کدشده توسط این ژنها و محتوای درونی فرآوردههای آنها در شرایط مشابه با شرایط این آزمایش، و همچنین ارزیابی بیان این ژنها در شرایط رفع تنش (آبیاری مجدد) ضروری به نظر میرسد.
1. زنگیشهای ز. و سالاری ه. 1394. اثر تنش خشکی بر بیان ژنهای رمزگذارآنزیمهای خانواده بتائینآلدهیددهیدروژناز (BADH) در آرابیدوپسیس. ژنتیک نوین. در دست چاپ.