نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجو دانشگاه آزاداسلامی، واحد ارومیه، گروه زیست شناسی

2 استادیار دانشگاه آزاداسلامی، واحد ارومیه، گروه زیست شناسی

3 استادیار دانشگاه دولتی مراغه

چکیده

چکیده
با توجه به مقاومت باکتری ها نسبت به آنتی بیوتیک ها و عوامل ضد میکروبی مرسوم، تحقیقات بسیاری برای یافتن انواع جدید عوامل ضد میکروبی موثر انجام شد. با توسعه فناوری نانو، مس به طور فزاینده ای به شکل نانوذرات با فعالیت های ضد میکروبی بالا و قیمت ارزان علیه همه باکتری های گرم منفی و گرم مثبت مورد استفاده قرار گرفته است.
در این تحقیق از نانو ذره اکسیدمس با اندازه (کمتر از 10 نانومتر) برای بررسی اثر آن روی ژنوم باکتری اشریشیاکلی سویهO157:H7 به عنوان مدل برای باکتریهای گرم منفی استفاده شد. بدین منظور ابتدا باکتریها را با غلظتهای 30 و 60 میکروگرم بر میلی لیتر با این نانوذرات تیمار کرده و در فاصله های زمانی 2، 4 و 24 ساعت خاصیت ضد میکروبی نانوذره بررسی گردیده و استخراج DNA صورت گرفت. تکنیک واکنش زنجیره ای پلیمراز رپید ( RAPD-PCR) جهت بررسی اثر نانوذره اکسیدمس روی ژنوم به کار گرفته شد. با استفاده از نرم افزار NTSYS-PC، نتایج حاصل از الکتروفورزیس محصولات PCR روی ژل آگارز مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
در این تحقیق مشاهده گردید که علاوه بر اثر مهارکنندگی نانوذرات اکسیدمس، روی رشد باکتریها مشخص شد که این نانوذرات روی توالی DNA ژنومی این باکتری اثر گذاشته و باعث تغییر آن در نقاط مختلف گردید.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

An investigation of the effect of copper nanoparticles on E.coli genome by RAPD molecular markers

نویسندگان [English]

  • fariba amjady 1
  • bahram golestani imani 2
  • Farokh karimi 3

1 Student

2 Islamic Azad University URMIA

3 State University of Maragheh

چکیده [English]

Abstract
Regarding the bacterial resistence of common antibiotecs and anti-microbial agents , a great number of studies have been conducted to discover the recent types of anti-microbial agents. With the recent developments in nanotechnology, copper has been extensively used as nanoparticles against all positive-gram and to negative-gram particles due to its low price and high anti-microbial activity.In the present study, copper oxide nanoparticles of (<20 nm) have been used to study its effect on the genome of Escherichia coli strain O157: H7 as a model for Gram-negative bacteria.To this end, the bacteria were first treated with 30 and 60 µg/mL copper oxide nanoparticles at the intervals of 2, 4, and 24 hours. and then their DNA were extracted.In order to investigate the effects of copper oxide nanoparticles on the genome, the chain reaction techniques of (RAPD-PCR) was employed. Using the software NTSYS-PC, the results obtaind from electrophoresis of PCR products on agaros gel were analyzed.The results of the studiy revealed that copper oxide nanoparticles not only affects the growth of bacteris but also affect the sequencing of genomic DNA and leads to the changes of them in different points.
Key words: nanoparticles copper oxide , Escherichia coli , Rapid polymerase chain reaction (RAPD-PCR)

کلیدواژه‌ها [English]

  • Copper nanoparticles
  • Escherichia coli
  • Rapid polymerase chain reaction (RAPD-PCR)

بررسی اثر نانوذرات اکسید مس روی ژنوم باکتری اشریشیاکلی با استفاده از نشانگرهای مولکولی  RAPD

فریبا امجدی1، بهرام گلستانی ایمانی1* و فرخ کریمی2

1 ارومیه، دانشگاه آزاداسلامی، واحد ارومیه، گروه زیست شناسی

2 مراغه، دانشگاه مراغه، گروه بیوتکنولوژی

تاریخ دریافت: 12/12/93              تاریخ پذیرش: 16/4/94 

چکیده

با توجه به مقاومت باکتریها نسبت به آنتی بیوتیکها و عوامل ضد میکروبی مرسوم، تحقیقات بسیاری برای یافتن انواع جدید عوامل ضد میکروبی موثر انجام شد. با توسعه فناوری نانو، مس به طور فزاینده ای به شکل نانوذرات با فعالیتهای ضد میکروبی بالا و قیمت ارزان علیه همه باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت مورد استفاده قرار گرفته است. در این تحقیق از نانو ذره اکسیدمس با اندازه (کمتر از 20 نانومتر) برای بررسی اثر آن روی ژنوم  باکتری اشریشیاکلی سویهO157:H7 به عنوان مدل برای باکتریهای گرم منفی استفاده شد. بدین منظور ابتدا باکتریها را با غلظتهای 30 و 60 میکروگرم بر میلی لیتر با این نانوذرات تیمار کرده و در فاصله های زمانی 2، 4 و 24 ساعت خاصیت ضد میکروبی نانوذره بررسی گردیده و استخراج DNA صورت گرفت. تکنیک واکنش زنجیره ای پلیمراز رپید ( RAPD-PCR) جهت بررسی اثر نانوذره اکسیدمس روی ژنوم به کار گرفته شد. با استفاده از نرم افزار NTSYS-PC، نتایج حاصل از الکتروفورزیس محصولات PCR  روی ژل آگارز مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. در این تحقیق مشاهده گردید که علاوه بر اثر مهارکنندگی نانوذرات اکسیدمس، روی رشد باکتریها مشخص شد که این نانوذرات روی توالی DNA  ژنومی این باکتری اثر گذاشته و باعث تغییر آن در نقاط مختلف گردید.

واژه های کلیدی: نانوذره اکسیدمس، باکتری اشریشیاکلی، واکنش زنجیره ای پلیمراز رپید ( RAPD-PCR)

* نویسنده مسئول، تلفن : 32719900  ، پست الکترونیکی: golestani_bahram@yahoo.com 

مقدمه

 

باکتریها در برابر آنتی بیوتیکها  و بسیاری از عوامل ضد باکتریایی مقاومت پیدا کرده اند که این مقاومت قابل توارث بوده و باعث ادامه بیماریهای عفونی می شود که یکی از بزرگترین چالشهای سلامتی سراسر جهان است. این پیشرفت متناوب استراتژیهای درمانی باکتریها را بر می انگیزد (4 و 32).

در چند دهه اخیر، نانومواد به دلیل ویژگیهای جدید شامل بزرگ بودن نسبت سطح به حجم و فعالیت واکنشی بالا توجه زیادی پیدا کرده است (2 و 33).

در میان نانوذرات دیگر، اخیرا به نانوذره مس توجهات بیشتری شده است. نانوذرات ارزان به جای نانوذرات فلزی گران قیمت در سطح کاربردهای میکروالکتریکی پیشنهاد می شوند و احتمالاَ آنها آخرین مواد ضد میکروبی کشف شده اند (21). کاربردهای مواد ضد باکتریایی در صنعت منسوجات، ضدعفونی آب، پزشکی و بسته بندیهای غذایی و غیره به خوبی شناخته شده است. برخلاف ضد عفونی کننده های شیمیایی معمول انتظاری نیست که نانومواد ضد میکروبی، ضد عفونی کننده های مضر تولید کنند (11). همچنین قابلیت کنترل آلودگی و عفونت نانوآنتی بیوتیکها در محیط آزمایشگاهی  و  سلول زنده کشف و اثبات شده است. تهیه نانوذرات ضد میکروبی می تواند تأثیر ارزشمندی در مقایسه با سنتز آنتی بیوتیکها داشته باشد زیرا آنها پایداری بیشتر و  طولانی مدت دارند  (30). نانوذرات می تواند در شرایط نامساعد مانند دمای بالای استریلیزاسیون، که تحت آن آنتی بیوتیکهای مرسوم غیرفعال می شوند مقاومت کنند. نانوموادی که در تحویل آنتی بیوتیکها استفاده می شود دارای مزیت چندگانه 1- توزیع شکل یکنواخت در بافت هدف 2- بهبود قابلیت حل شدن 3- رهاسازی کنترل شده و تحمیل شده را دارند (17 و 27 ).

علاوه براین، گزارش شده که نانوذرات با اندازه کوچک فعالیت ضد میکروبی خوبی نشان داده است (15). بر روی فعالیت ضد میکروبی نانوذرات روی باکتریهای بیماری زای انسان مانند اشریشیاکلی (34) و استافیلوکوکوس اورئوس مطالعه زیادی شده است (23).  تشکیل بیوفیلم در باکتریها مشکل مهم شناخته شده است زیرا از باکتریها علیه آنتی بیوتیکها حفاظت می کند و به همین دلیل یکی از علل اصلی توسعه عفونتهای مزمن به شمار می رود (16 ). ویژگیهای الکترواستاتیکی نانوذره و بیوفیلم روی چگونگی واکنش آنها اثر می گذارد (28). نانوذرات از طریق واکنش الکترواستاتیکی می توانند به غشای باکتری متصل شوند و با غشای باکتری تداخل ایجاد کند و باعث تخریب کامل غشای باکتری شوند (31). آمین و گروههای کربوکسیل لایه پپتیدوگلیگان اجزاء ترکیب کننده اصلی دیواره باکتری هستند که با مس واکنش داده و باعث آسیب دیواره سلول می شوندکه یکی از مکانیسمهای ضد میکروبی نانوذرات به شمار می آید (6). البته مکانیسم القای فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات اکسید فلزی به طور کامل شناخته نشده است. اما مقدار رهاسازی یون و متعاقباً تولید ROS  دلیل اصلی فرض می شود (5 و 14 ). که هردو مکانیسم از همانندسازی DNA  و سنتز آمینو اسید در میکروبها جلوگیری می کند و باعث فعالیت ضد میکروبی می شود (14).

به هر حال استفاده هدفمند از نانوذرات اکسید مس با ویژگیهای ضد میکروبی نیازمند توجه بیشتر از نظر سازگاری با محیط زیست نیز می باشد. با توجه به اینکه نانوذرات مس دارای خاصیت کشندگی برای ارگانیسمهای دیگر است، برای مثال کشندگی نانوذرات اکسید مس برای سخت پوستان مگنا دافینیا و تامنوس فالئوس پلاتریوس و جلبک Pseudo- kirchneriella subcapitata در غلظتهای کم  (به ترتیب2/3، 18/0 و کمتر از 1 میلی گرم بر لیتر) که در سالهای 2008و 2009 گزارش شده است (3 و 13) و بدین طریق درجه ای از کشندگی نانوذرات برای ارگانیسمهای آبزی نشان داده شده است. نانوذرات اکسید مس ممکن است باعث ایجاد جهش در باکتری گردیده و با تغییر در خاصیت جفت شدن بازی بازها در  فعالیت ضد باکتریایی شرکت کند. یا  نانوذرات با حل شدن در محیط یونهای فلزی آزاد کرده که با غشای باکتری واکنش می دهند  که این قابلیت حل شدن و واکنش با غشاء یکی از مهم ترین ویژگیهایی است که دلیل اصلی اثر کشندگی روی اکثر موجودات را توضیح می دهد (8 و 12) . بنابراین ممکن است به هنگام استفاده به عنوان ماده ضد باکتریایی بر روی سلولهای یوکاریوتی و سایر ارگانیسمها نیز اثر گذارد. لذا باید برای به دست آوردن غلظتهای مؤثر ضد باکتریایی و تأثیر ژنوتوکسیکی آن  به عنوان جایگزینی مناسب برای آنتی بیوتیکها و مواد ضد عفونی کننده  بدون ضرر ، بیشتر بررسی گردد. 

از آنجایی که تاکنون اثر ضد باکتریایی از طریق اثر نانوذرات مس روی ژنوم بررسی نشده است. لذا این تحقیق  به منظور بررسی اثر دُزهای مختلف در زمانهای متفاوت تیماری نانوذرات  اکسید مس  روی ژنوم باکتری اشریشیاکلی به عنوان باکتری مدل صورت گرفت که بدین منظور از تکنیک (RAPD-PCR) در این مطالعه استفاده شده است.

مواد و روشها

کشت باکتری و شرایط کشت ویژگیهای باکتری (ATCC 25922)   ( Escherichia coli  0157:H7  بر روی محیط کشت ائوزین متیلن بلو آگار مشخص شد. باکتری در 5 میلی لیتر محیطBHB broth    کشت داده شد و قبل از تیمار به مدت یک شبانه روز در انکوباتور شیکردار در دمای 37 درجه سانتی گراد در دور rpm 200 گذاشته شد و میزان رشد باکتریها از طریق اندازه گیری چگالی نوری (OD) محیط کشت در طول موج 600 نانومتر کنترل گردید. (1 )

بررسی خاصیت ضد میکروبی نانوذرات اکسید مس: جهت بررسی اثر نانوذره بر روی باکتری غلظتهای 30 میکروگرم بر میلی لیتر و 60 میکروگرم بر میلی لیتر نانوذره اکسید مس با قطر کمتر از 20 نانومتر که توسط گروه شیمی دانشگاه دولتی مراغه سنتز و در اختیار تحقیق حاضر قرار گرفت، مشخصات و آنالیز آن توسط میکروسکوپ الکترونی در بخش نتایج در شکلها آورده شده است. و از بافر فسفات سالین با PH: 7.4  به عنوان حلال نانوذرات اکسید مس استفاده شد.

سپس نانوذرات اکسید مس ، به هرکدام از لوله ها تلقیح شد. لوله های آزمایش در انکوباتور شیکردار در دمای 37 درجه سانتی گراد در دور rpm 200 گذاشته شد  و چگالی نوری هر کدام از لوله های آزمایش در   طول موج 600 نانومتر و در فاصله های زمانی 4،2 و 24 ساعت جهت سنجش رشد باکتریها اندازه گیری شد.

استخراج DNA و واکنش زنجیره پلیمراز RAPD : DNA باکتری شاهد و تیمار شده  با استفاده از کیت استخراج دی ان آ(شرکت اکسیر آزما) مطابق با دستورالعمل کیت مذکور استخراج گردیده و کمیت و کیفیت آن با استفاده از روش اسپکتروفتومتری و الکتروفورزیس روی ژل آگارز1 درصد آنالیز گردید.

برای بررسی اثر نانوذرات روی ژنوم باکتری از روش نشانگر مولکولی RAPD- PCRاستفاده شد. که به منظور انجام روش RAPD- PCR ابتدا پرایمرهای 10 بازی رپید از شرکت سیناژن تهیه گردید. توالی و مشخصات پرایمرها در جدول 1 آمده است.

جدول 1- توالی نوکلئوتیدی پرایمرهای مورداستفاده

توالی نوکلئوتیدی پرایمر 

نام پرایمر 

ACAGGTGCGT 

OPR12

AGTCGGGTGG 

OPS11

CAATCGCCGT 

OPA11

GTCGTTCCTG

OPS.13

TCCTGGTCCC 

OPS-09

GTGATCGCAG

OPA10

GGTGACGCAG 

OPB-7

GGACGCTTCA

OPQ-14

AATGCCGCAG

OPT14

AAAGGGGTCC

OPS14

GGGTAACGCC 

OPA09

TTTGGGGCCT

OPS05

TCTGGTGAGG 

OPD04

TCTGGTGAGG 

OPT17

 

برای انجام واکنش PCR   جهت تکثیر نمونه ها در حجم 25 میکرولیتر مواد زیر در غلظتهای ذکر شده تهیه گردید. 1 میکرولیتر پرایمر، 5/2 میکرولیتر( x10 )  PCR  buffer،  3 میکرولیتر  MgCl2 ، 1  میکرولیترmix    dNTP ، 1 میکرولیتر از  نمونه  DNA  استخراج  شده و 3/0 میکرولیتر Taq  DNA polymerase که با 2/16 میکرولیتر آب مقطر دیونیزه  به حجم 25 میکرولیتر رسانده شد.مخلوط این مواد در دستگاه ترموسایکلر (Corbett research, Australia) با برنامه زیر قرار داده شد: واسرشت شدن  اولیه  DNA  الگو در دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت  5 دقیقه و در ادامه، واکنش PCR  در 40  سیکل و به ترتیب  زیر انجام گرفت: دمای  95  درجه سانتی گراد  به مدت 35  ثانیه  جهت واسرشت  شدن رشته‌های DNA  الگو، دمای 30  درجه سانتی گراد  به  مدت 45 ثانیه  جهت  اتصال پرایمرها به رشته‌های  الگو، دمای 72  درجه  سانتی گراد  به مدت  45  ثانیه  جهت پلیمریزاسیون رشته  جدید از روی رشته الگو. 7  دقیقه جهت تکمیل  پلیمریزاسیون  رشته‌های  ناقص  به  کار گرفته  شد. پس از  بهینه سازی  شرایط  PCR، این  ترکیبات  و  پروفایل دمایی برای  تمامی ‌14 پرایمر  مورد استفاده  قرار گرفت.


 

جدول 2- فعالیت ضدمیکروبی نانوذرات اکسید مس

غلظت 

شماره لوله 

  قبل از تیمار 

بعد از 2 ساعت

بعد از 4 ساعت 

بعد از 24 ساعت 



شاهد

1

0/7

0/8

0/85

1/1


 30µg/ml

2

0/6

0/6

0/6

0/8


3

0/8

0/8

0/8

0/8


 60µg/ml

4

0/7

0/7

0/7

0/8


5

0/6

0/6

0/7

0/7


 


بررسی نتایج RAPD - PCR : بعد از اتمام واکنش PCR، جهت آشکارسازی باندها،10 میکرولیتراز محصول PCR روی ژل آگارز 2 درصد ( با اندازه 14 ×26 )که حاوی  red safe بود در بافر  (1x)  TBE به مدت 4 ساعت با ولتاژ 120 ولت الکتروفورز گردید. و به منظور تعیین اندازه محصول از نشانگر Ladder  DNA به اندازه bp  - 100 استفاده شده و با  دستگاه عکسبرداری از ژل (Uvitec, France) عکس تهیه گردید.  

آنالیز داده های حاصل از الکتروفورزیس: باند های حاصل از تجزیه RAPD  براساس وجود یا عدم وجود آنها ، به ترتیب به صورت یک و صفر امتیازدهی گردید که داده ها در جدولهای 3 تا 5 آمده است. سپس داده ها بر اساس مولکولی در نرم افزار وارد گردید. ماتریس تشابه با روش Dic محاسبه شده و دندروگرام با روش UPGMA  در نرم افزار NTSYS-PC  رسم گردید.

نتایج

جهت مطالعه مورفولوژی و تخمین ‌اندازه نانوذرات اکسید مس تولیدی از میکروسکوپ الکترونی TEM و SEM ، استفاده شد. که نتایج آنها در شکلهای 1، 2 و 3 آمده است.

 

جدول3- نتایج باندهی مربوط به پرایمرهای تصویر 4

T2

T1

c

باند(bp)

پرایمر

0

0

1

1000

OPR12

0

1

1

900

1

1

1

800

0

0

1

700

1

1

1

650

1

1

1

500

1

1

1

450

1

0

0

350

1

1

1

170

0

0

1

950

OPS11

0

0

1

900

1

1

1

600

1

1

1

700

0

1

0

500

1

1

1

450

1

0

0

950

OPA11

1

0

0

850

1

1

1

800

1

1

0

650

1

1

1

550

1

1

0

500

0

0

1

900

OPS-13

0

0

1

800

1

0

1

250

جدول4- نتایج باندهی مربوط به پرایمرهای تصویر 5

T2

T1

C

باند( bp)

پرایمر

0

0

1

1000

OPS-09

0

1

0

650

0

0

1

950

OPA-10

0

0

1

900

0

1

1

750

0

1

1

650

0

0

1

600

0

0

1

800

OPB-7

0

1

1

850

OPQ-14

1

1

1

750

1

1

0

450

0

1

1

1000

OPT-14

0

0

1

950

1

1

0

800

1

1

0

700

1

1

0

650

0

1

0

400

0

1

0

350

ارزیابی خاصیت ضد میکروبی نانوذرات اکسید مس: خلاصه نتایج آزمایش فعالیت ضد میکروبی نانوذره اکسید مس یر علیه باکتری اشریشیاکلی در جدول 2 آمده است که به روشنی اثبات شد که رشد باکتری بعد از تیمار با نانوذره با غلظتهای متفاوت 30 و 60 میکروگرم بر میلی لیتر، در فاصله های زمانی 2 و4 ساعت متوقف شد و پس از 24 ساعت تنها رشد جزئی در آنها دیده شد.

جدول5- نتایج باندهی مربوط به پرایمرهای تصویر6

T2

T1

C

(bp) باند

پرایمر

0

0

1

950

OPS-14

0

0

1

900

0

0

1

800

0

1

1

600

0

0

1

175

1

0

1

950

OPA-09

0

0

1

800

OPS-05

0

0

1

700

0

1

0

900

OPD-04

1

1

0

500

1

1

1

500

OPT-17

 

 

 

شکل 1- عکس میکروسکوپی (Transmission electron microscopy (TEM از نانو ذراتCuo.

نقاط سیاه نشان دهنده نانو ذرات  Cuoمی باشد. که در مناقد سلیکا تثبت شده اند. اندازه نانوذرات اکسید مس کمتر از 20 نانو متر می باشد.


آنالیز محصولات RAPD- PCR : باندهای الکتروفورزی حاصل از تکثیر 14 پرایمر به وسیله RAPD- PCR  در شکلهای4، 5 و 6 آمده است. که در هر شکل به ترتیب برای هر پرایمر از سمت چپ به راست شامل نمونه کنترل، نمونه تیمار اول با غلظت 30 میکروگرم بر میلی لیتر ، نمونه تیمار دوم با علظت 60 میکروگرم بر میلی لیتر می باشد. سپس اندازه باندهای حاصل از تجزیه RAPD ، با استفاده از مارکر تعیین شد. براساس وجود یا عدم وجود آنها در نمونه ها، به ترتیب به صورت یک و صفر امتیازدهی گردید که نتایج آنها در جدول های 3 تا 5 آمده است. که اساس نتیجه گیری تفاوت در باندهایی هست که هر پرایمر برای نمونه های کنترل و تیمار شده ها تشکیل می دهد.

 

 

شکل2- عکس میکروسکوپی که وجودمافذ نانوذرات را نشان می دهد

 

 

شکل 3-  آنالیزXRD 

 

 

 

 

 

 

تصویر4- الکتروفورز محصول  PCRروی ژل آگارز

1-2: خالی ، 3 -5:پرایمرOPR12، ستون 6: مارکر، 7 -9: پرایمرOPS11 ، 10-12: پرایمر OPA11 ، ستون شماره13 :مارکر، 14- 16 :پرایمرOPS-13 ، 17-20 : خالی.

 

تصویر5: عکس الکتروفورز محصول  PCRروی ژل آگاروز

1: خالی ، 2-4 :پرایمرOPS-09 ،  5 : مارکر، 6-8 : پرایمرOPA-10 ، 9- 11 :پرایمر OPB -7،  شماره12   :مارکر، 13-15:پرایمرOPQ-14 ، 16- 18:پرایمرOPT-14 ، 19-20:خالی.

 

تصویر6: عکس الکتروفورز محصول  PCRروی ژل آگاروز

1: خالی، 2-4 :پرایمرOPS-14 ، 5 : مارکر، 6-8 : پرایمرOPA-09  ، 9-11 : پرایمر OPS-05، 12 : مارکر، 13-15: پرایمرOPD-04  ، 16- 18:پرایمرOPT-17 ، 19-20 :خالی.


همچنین در پرایمر  OPS-13، 3 قطعه تکثیر شد که همه آنها در گروههای شاهد و تیمار شده ها  متفاوت بودند. در هر یک از پرایمرهای  OPS-09،OPS-05،OPD-04، 2 قطعه تکثیر شد که هر دوی آنها بین گروه شاهد و تیمار شده ها متفاوت بودند. برای پرایمرهای OPA-10 وOPS-14، 5 باند روی ژل تشکیل شد که همه آنها بین گروه شاهد و تیمارشده ها متفاوت بودند. در پرایمرهای OPB -7،  OPA-09، فقط یک قطعه تکثیر شد که آن هم بین گروه شاهد وتیمار شده ها تفاوت داشت. از بین 3 قطعه تکثیر شده توسط پرایمر OPQ-14،2 قطعه بین گروه شاهد و تیمار شده ها متفاوت بودند. برای پرایمر OPT-14 از 7 قطعه تکثیر شده همه آنها بین گروه شاهد و تیمارشده ها تفاوت داشتند. برای پرایمر OPT-17  فقط یک باند روی ژل تشکیل گردید که هیچگونه تفاوتی بین گروه  شاهد و تیمارشده ها مشاهده نگردید.

براساس داده های RAPD ، ماتریکس تشابه برای نمونه های کنترل و تیمار شده  با روش Dic محاسبه شده که در جدول 6 آمده است . فاصله ژنتیکی بین نمونه ها از 000/1 تا 451616/0 متغیر بوده که هر چه اعداد به 1 نزدیک تر، شباهت ژنتیکی بین نمونه ها بیشتر شده است. که نشان می دهد با افزایش غلظت نانوذرات اکسید مس فاصله ژنتیکی ایجاد شده بین نمونه بیشتر شده است.

در شکل 7، دندروگرام که با روش UPGMA  در نرم افزار NTSYS-PC  به منظور مقایسه تنوع ژنتیکی ایجاد شده بین نمونه کنترل و نمونه های تیمار شده با نانوذرات اکسید مس رسم گردید. و مشاهده شد که نمونه کنترل و نمونه های تیمار شده در دو شاخه اصلی جداگانه قرار گرفته اند که این بیانگر ایجاد تفاوت ژنتیکی  بین آنها می باشد.  

 

جدول6-  ماتریکس تشابه برای نمونه های کنترل و تیمار شده

Proximity Matrix

Case

 Dice (Czekanowski or Sorenson) Measure

1:ctr    

2:t30   

3:t60   

1:ctr    

1.000

 

 

2:t30   

 0.5294118

1.000

 

3:t60   

 0.4516129       

0.7037037 

1.000

This is a similarity matrix

 

 

 

شکل 7- دندروگرام حاصل از تجزیه بر اساس آزمون رپید  با روش UPGMA توسط نرم افزار NTSYS-PC

 


بحث

در زمانهای گذشته، از فلز مس  به  عنوان  یک  عامل  ضد

باکتریایی و ضد عفونی کننده استفاده می شده است. امروزه نیز با پیشرفت مقاومت باکتریها نسبت به آنتی بیوتیکها و ضدعفونی کننده های معمول، باعث توجه روز افزون به نانوذرات مس و اکسید مس با فعالیت واکنشی و ضد میکروبی بالا و قیمت ارزان شده است. نانوذرات اکسید مس در غلظتهای کم برای سلولهای بدن سمی نمی باشد. در این مطالعه غلظت مشخصی از نانوذرات اکسید مس جهت تیمار باکتریها و بررسی خاصیت ضد میکروبی به کار برده شد و با توجه به اینکه براساس مطالعات زیادی اثر نانوذرات اکسید مس به عنوان ماده ضد میکروبی به اثبات رسیده است (18 و 24). پس هدف اصلی این تحقیق بررسی اثر نانوذرات اکسید مس روی ژنوم باکتری بود.

نتایج خاصیت ضد میکروبی مطالعه حاضر نیز نشان داد، نانوذره  اکسید مس با قطر کمتر از 20 نانومتر در دُزهای 30 و60 میکروگرم بر میلی لیتر دارای خواص ضدمیکروبی به نسبت خوبی بود و توانست تقریباً رشد تمامی باکتریهای موجود در نمونه را مهار کند. همچنین در طی  آزمایشات فعالیت ضد میکروبی نانوذرات مس ، بوگدانویکد و همکارانش به روشنی اثبات کردند که فقط بعد از 2 ساعت تماس باکتری اشریشیاکلی با نانوذرات مس با غلظت  ppm 32 ، باکتریها به بیش از 99 درصد کاهش پیدا کردند (6). در این تحقیق نیز مشاهده شد که رشد باکتری بعد از 2 ساعت  تیمار با غلظت 30 و 60 میکروگرم بر میلی لیتر  نانوذره اکسید مس به طور کامل متوقف گردید پس با توجه به این تحقیقات می توان نتیجه گرفت که نانوذرات مس با کمترین غلظت نیز بیشترین فعالیت ضدمیکروبی را در کمترین زمان از خود نشان می دهند. علاوه  بر اینکه خاصیت ضد باکتریایی نانوذرات اکسید فلزی به اثبات رسیده است. گزارشاتی نیز مبتنی بر اثر نانوذرات بر روی  ژنوم باکتریها نیز گزارش شده است. نانوذرات به غشای باکتری متصل شده و همچنین به داخل سلول باکتری نفوذ می کنند. غشای باکتری دارای پروتئینهای حاوی گروه سولفور می باشد و نانوذرات نقره نه تنها با این پروتئینها، بلکه با ترکیبات حاوی فسفر از جمله DNA، واکنش می دهند. نانوذرات همچنین به زنجیره تنفسی که در تقسیم سلولی مؤثر است حمله می کنند و منجر به مرگ سلولی می شوند. همچنین نانوذرات، یون نقره آزاد می کنند که این خود منجر به افزایش فعالیت ضدباکتریایی آنها می شود (10 و 20).

نانوذرات اکسید فلزی مکانیسم اثر مشابهی دارند همان طور که در تحقیقات پیشین بیان شده است نانوذرات اکسید فلزی در رونویسی و ترجمه اختلال ایجاد می کنند (25 ). همچنیین نانوذرات می توانند شکستگی   DNA تک رشته ای را القاء کرده و در بیان ژن اثر بگذارند (9 ). این تحقیق نیز به منظور تعیین اثر ژنوتوکسیک نانوذرات اکسید مس بر روی باکتری اشریشیاکلی سویهO157:H7 به عنوان مدل برای باکتریهای گرم منفی صورت گرفت.

در این راستا از مجموع 14 پرایمر به کار رفته در واکنش RAPD-PCR  وجود یا فقدان باند در تصویر ژل (شکلهای 4و 5 و6)  حاکی از ایجاد تغییر روی توالی DNA توسط نانوذرات اکسید مس می باشد. به طوری که تعداد زیادی از پرایمرها توالیهای هدف را شناسایی نکرده و لذا قطعه مربوطه تکثیر پیدا نکرد و فقدان باند روی ژل آگارز در تحقیثق حاضر موجود بود. تفاوت بین باندهای مشاهده شده در گروههای تیمار شده و کنترل باکتریها حاکی از آن است که توالیهای هدف پرایمرها دستخوش تغییراتی در باکتریهای تیمار شده، گردیده اند که باعث تفاوت در اتصال پرایمرها و تکثیر قطعات در PCR  به واسطه آنها شده است که دلیل این موضوع می تواند احتمالاً ناشی از ایجاد جهش مستقیم یا غیرمستقیم رویDNA ، توسط نانوذرات اکسید مس بوده و یا همان طوری که پال و همکارانش در سال 2007  گزارش کرده اند بخاطر ایجاد اختلال در مکانیسم همانندسازی توسط DNA پلیمراز می شود. بطوریکه احتمالاً صحت همانندسازی را مختل می نماید تا بدین گونه در خلال همانندسازی تغییراتی در توالیهای DNA ایجاد شود که منجر به بروز تفاوت در توالیهای هدف مورد اتصال پرایمرهای RAPD می شود (19). نانوذرات اکسید مس می توانند باعث القای شکستگی در DNA تک رشته ای شده و در بیان ژن اثر بگذارند (7). بنابراین نانوذرات سبب تغییرات گسترده ای در ساختار DNA کروموزومی باکتری که شکستگیهایی در مولکول DNA ایجاد کند می شود و از آنجایی که این قطعات به صورت تصادفی ایجاد شده اند بسیاری از این قطعات توسط پرایمرها شناسایی نشده و تکثیر نشدند. نانوذرات همچنین سبب اختلال در ژنهایی می شوند که سازوکارهای رونویسی و همانندسازی را کنترل می کنند. فعالیت و توالی بازهای پروموترها نیز تحت تأثیر نانوذرات قرار گرفته و خصوصاً می تواند بر روی توانایی RNA پلیمراز برای باز کردن مارپیچ و انجام نسخه برداری تأثیر بگذارد. در واقع هر عاملی که به DNA آسیب زند اساساً می تواند سبب مرگ آن موجود زنده شود. 

 Bondarenkoو همکارانش در سال 2012 میلادی، در تحقیق خود بیان نمودند نانوذرات اکسید مس، با آمین و گروههای کربوکسیل روی سطح سلولهای میکروبی  واکنش داده و همچنین در طی واکنش اکسیداسیون مس (I)Cu به (II)Cu،Ros  تولید می کنند که باعث آزاد شدن رادیکالهای هیدروکسیل می شود که به پروتئینهای ضروری و DNA آسیب رسانده و باعث فعالیت ضد باکتریایی می شود (7 و 22). 

 تغییرات مشاهده شده در توالی DNA در این تحقیق همچنین می توانند عاملی برای بازدارندگی رشد و چرخه سلولی از طریق بروز جهشها و به دنبال آن تغییر بیان ژنهای مرتبط با رشد و کنترل چرخه سلولی باشند (29). در سال 2004، Sondi  و همکارانش نشان داده اند که نانوذرات بر روی آنزیمهای دخیل در همانند سازی اثر می گذارند (26). بر همین اساس باتوجه به اینکه در این تحقیق باکتریهای در حال رشد و همانندسازی با نانوذرات اکسیدمس تیمار شده اند، می توان چنین استدلال کرد که احتمالاً در حین همانندسازی و همچنین در مکانیسمهای ترمیمی که توسط آنزیمهای مرتبط انجام می گیرد اختلال ایجاد می کند تا موجب جهشهای متعدد در توالی بازی DNA شود. فلذا می توان نتیجه گرفت که با ایجاد جهش روی توالی ژنهای درگیر در کنترل چرخه سلولی موجب کاهش بیان آنها شده و در نتیجه چرخه سلولی متوقف می گردد که نتیجه مشاهده شده در این تحقیق نیز کاهش رشد باکتریها را نشان داده و مطلب فوق را تأیید می نماید.

اما درمورد استفاده از نانوذرات نیاز به تحقیقات بیشتری است. و پیشنهاد می شود در تحقیقات آینده تأثیرات استفاده از نانوذرات در سلولهای یوکاریوتی ، اثرات نانوذرات بر روی ژنوم یوکاریوتها و تأثیر نانوذرات بر روی سلولهای سرطانی بررسی شود تا نانوذرات بتواند به عنوان جایگزینی مناسب برای آنتی بیوتیکها و ضد عفونی کننده های معمول با مضرات پایین باشد.

تقدیر و تشکر

بدینوسیله از گروه بیوتکنولوژی دانشگاه دولتی مراغه به دلیل همکاری صمیمانه در تامین پرایمرها و نانوذرات مورد استفاده سپاسگزاری می گردد.

1-       براون ،ت،(1390)،  مراد پور، ز ، قاسمیان، ع ، مقدمه ای بر کلون سازی ژن و بررسی DNA ، انتشارات خسروی با همکاری نشر دیباج.

 

2-       Amelia, M., Lincheneau, C., Silvi, S.,Credi, A. (2012), Electrochemical properties of  CdSe and CdTe quantum dots. Chem. Soc. Rev. 2012; 41: 5728–5743.

3-       Aruoja, V., Dubourguier, H.C., Kasemets, K., Kahru, A. ( 2009), Toxicity of nanoparticlesof CuO, ZnO and TiO2 to microalgae Pseudokirchneriella subcapitata. Sci. TotalEnviron. 407, 1461e1468.

4-       Baker-Austin, C., Wright, MS., Stepanauskas, R., McArthur, JV. (2006) , Co-selection of antibiotic and metalResistance. Trends Microbiol.  ;14:176–18.

5-       Beranva , J.,Seydlova, G. , Kozak, H., Benada, O., Fiser,  R., Artemenko, A., Konopasek, I., Kromka, A. (2014), Sensitivity of  bacteria  to diamond   nanoparticles of  various  size  differs   in gram-positive  and  gram- negative  cells, FEMS Microbiol. Lett. dio:http://dx.doi. org /10.1111/1574-1111/ 6968.  

6-       Bogdanovića, U., Lazić ,b V., Vodnik,V . (2014), Copper nanoparticles with high antimicrobial activity . Materials Letter.

7-       Bondarenko, O., Ivask, A., Käkinen, A., Kahru, A. (2012), Sub-toxic effects of CuO nanoparticles on bacteria: Kinetics, role of Cu ions and possible mechanisms of action. Environ. Pollut., 169, 81–89.  

8-       Brunner, T.J., Wick, P., Manser, P., Spohn, P., Grass, R. N., Limbach, L. K., Bruinink, A.,Stark, W.J. (2006), In vitro cytotoxicity of oxide nanoparticles: Comparison to asbestos, silica, and the effect of particle solubility. Environ. Sci. Technol. 40, 4374–4381.

9-        Chang ,Y., Zhang,M., Xia,L., Zhang,J., Xing,G . (2012), The Toxic Effects and Mechanisms of CuO and ZnO Nanoparticles . Materials 2012, 5, 2850-2871; doi:10.3390/ma5122850.

10-   Damm, C., Münstedt, H., Rosch, A. (2008) The antimicrobial efficacy of polyamide 6/silvernano- and microcomposites. Mater Chem Phys; 108(1): 61-6.

11-   Fahmy, B., Cormier,  S.A. (2009), Copper oxide   nanoparticle  induce  oxidative  stress  and  cytotoxiy  in  airway  epithelial  cells, Toxicol. In Vitro 7 1365-1371.

12-   Gong. P., Li. H., He. X., Wang. K., Hu. J., and Tan. W. (2007), Preparation and antibacterial activity of Fe3O4@Ag nanoparticles. Nanotechnology, Vol.18, P.604–11.

13-   Heinlaan, H., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H.C., Kahru, A. (2008), Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus paltyurus. Chemosphere 71, 1308e1316.

14-   Huh, A.J. and Kwon, Y.J. (2011), Nanoantibiotics: a new paradigm for treating infectious diseases using nanomaterials in the antibiotics resistant era. J. Control. Release 156, 128–145.

15-   Jones, N., Ray, B., Ranjit , KT., Manna, AC . (2008), Antibacteril activity of  ZnO.  FEMS Microbiol Lett. 297:71-76.

16-     Landini ,P., Antoniani, D., Burgess ,JG., Nijland, R. (2010),  Molecular mechanisms of compounds  affectin bacterial biofilm formation and dispersal. Appl. Microbiol. Biotechnol. 86, 813–823.

17-   Mansour, H.M. , Rhee, Y.S., Wu, X .  (2009), Nanomedicine in  pulmonary  delivery. Int. J. Nanomedicine   ; 4 :299–319

18-   Murugan ,V. , Sadhasivam,  S. (2012), Glucosamine functionalized copper nanoparticles: preparation, characterization and enhancement of anti-bacterial activity by  ltraviolet irradiation. chemical engineering.

19-   Pal, S., Tak, Y.K. , Song, J.M.  (2007), Does the antibacterial activity of nanoparticles depend on the shape of the nanoparticles A study of the gramnegative bacterium Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 73: 1712-1720.

20-   Panacek, A., Kvitek, SL., Prucek, R., Kolgr, M., Vecerova, R., Pizurova, N. ( 2006) Silver colloid nanoparticles: synthesis, characterization, and their antibacterial activity. J Phys Chem B; 110(33): 16248-53.

21-   Rispoli, F.,  Angelov, A.,  Badia, D., Kumar , A., Seal, S., Shahb, V. J.  (2010),  Hazard Mater.180:212–6.

22-   Robert ,Y., Pelgrift Adam, J., Friedman,M  . (2013)," Nanotechnology as a therapeutic tool to combat microbial resistance". Advanced Drug Delivery  Reviews.

23-   Ruparelia , JP., Chatterjee,  AK., Duttagupta, SP. (2008), Mukherji  S.Strain specificity in antimicrobial  activity of silver and copper nanoparticles. Acta Biomater. 2008;4:707-716.

24-   Shankar, Sh., Jong-Whan, R. (2014), Effect of copper salts and reducing agents on characteristics and antimicrobial activity of copper nanoparticles. Materials Letters.

25-    Soenen, S.J.H., Himmelreich, U., Nuytten, N., Pisanic, T.R., Ferrari, A., De Cuyper, M.  (2010), Intracellular nanoparticle coating stability determines nanoparticle diagnostics efficacy and cell functionality. Small 6, 2136–2145.

26-   Sondi .I and Sondi. SB, (2004), Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E. coli as a model for gram-negative bacteria. Colloid Interf. Sci. 275: 77-182.

27-   Sosnik ,A., Carcaboso, A.M., Glisoni, R.J., Moretton , D., Chiappetta A. (2010), New old challenges  in  tuberculosis:  potentially  effective  nanotechnologies  in   drug delivery, Adv. Drug Deliv.  Rev. 62 : 547–559.

28-   Sutherland, I. (2001), Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky Framework. Microbiology; 147: 3–9

29-   Turner, Philips, Molecular biology, 2nd, 2000. ISBN: 8397-36-8.

30-   Weir. E, A. Lawlor, A. Whelan, F. Regan .(2008), The use of nanoparticles in anti-microbial materials and their characterization.Analyst 133 835–845.

31-   Whitesides, G.M. (2005), Nanoscience, nanotechnology, and chemistry  Small. 1, 172–179

32-   Witte, W. (2004), International dissemination of antibiotic resistant strains of bacterial pathogens. Infect. Genet. Evol. 4, 187–191

33-   Yan, L., Zhao, F., Li, S., Hu, Z., Zhao,Y. (2011), Low-toxic and safe nanomaterials by surface-chemical design, carbon nanotubes, fullerenes, metallofullerenes, and graphenes. Nanoscale, 3, 362–382

34-   Yoon. KY., Byeon,  JH., PARK,  JH., Hwang,  J., (2007), constants   of  Escherichia coli and Bacillus  subtilis to silver and copper nanoparticles. Sci Total  Environ.373:572-575