نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه شهید مدنی آذربایجان

چکیده

آغاز گلدهی در گیاهان توسط عوامل مختلفی از قبیل طول دوره نوری، دوره سرما، هورمون ها و عوامل اپی ژنتیک کنترل می شود. یک مسیر مهم در این فرآیند، کنترل اپی ژنتیکی ژن FLC است که بیان آن موجب مهار گلدهی میگردد. حذف گروههای استیل از روی هیستون های ژن FLC توسط پروتئینMSI4 باعث توقف بیان FLC شده و بنابراین، گلدهی آغاز میشود. با این حال، مکانیسم عمل این پروتئین هنوز تا حدود زیادی ناشناخته است. در این تحقیق، برای یافتن شریک مولکولی پروتئین MSI4 در انجام فرآیند داستیلاسیون، از سیستم دوبل هیبرید مخمر که یکی از مهمترین روشهای ردیابی میان کنشهای مولکولی میباشد، استفاده شد. برای این کار، ابتدا ژن MSI4 در ناقل دوبل هیبرید مخمر همسانه سازی شد. سپس، MSI4 به عنوان طعمه برای غربال در کتابخانه cDNA گیاه آرابیدوپسیس به روش دوبل هیبرید مخمر استفاده شد. پروتئینی که با این روش به دام افتاد، PKT3 (Peroxisomal 3-Ketoacyl-CoA Thiolase 3) بود که یک استیل کوآسیل ترانسفراز است. وظیفه این پروتئین آزاد کردن و انتقال بنیانهای استیل به مولکول ها است و از این رو در بسیاری از فرآیندهای حیاتی سلول نقش دارد. این میان کنش به وسیله همسانه سازی cDNA کامل پروتئین PKT3 و همچنین هومولوگ آن PKT4 بطور مستقل تایید شد. گزارش میان کنش MSI4-PKT3 می تواند افق های روشنی را برای مطالعات بیشتر در مورد مکانیسم عمل MSI4 پیش روی پژوهشگران قرار ‌دهد. از این دستاورد مثلا با تغییر بیان ژن PKT4 می‌توان برای تنظیم زمان گلدهی در تولید محصولات زراعی و باغی استفاده کاربردی کرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Detecting a novel molecular interaction involved in epigenetic control of FLC expression in Arabidopsis using yeast two hybrid system

نویسندگان [English]

  • Maryam Hoseinpour
  • Maghsoud PAZHOUHANDEH
  • Fatemeh Mahmoudi Kordi

Azarbaijan Shahid Madani University

چکیده [English]

Initiation of flowering in plants is controlled by various factors such as photoperiod, cold, hormones and epigenetic effects. A major pathway in this process is the epigenetic control of FLC gene, whose expression inhibits the flowering initiation. Removing acetyl groups from FLC gene histons, by MSI4 protein represses FLC expression, and thus, flowering is initiated. However, the molecular mechanism of this protein is largely unknown. In this research, we used the Yeast Two Hybrid System (Y2HS) to study protein-protein interactions, to find proteins interacting with MSI4. Therefore, first, we cloned the MSI4 gene in proper Y2HS vector. Then, cDNA bank of Arabidopsis thaliana was screened by MSI4 as bait to prey the interactors of MSI4. The protein trapped by this method was PKT3 (Peroxisomal 3-Ketoacyl-CoA Thiolase 3), which is an acetylcoacyl transferase. The function of this protein is to release acetyl groups and deliver them to other molecules, and therefore, it has significant role in many crucial cell processes. This interaction was confirmed by cloning the complete cDNA of PKT3 as well as its homologue, PKT4. The interaction of MSI4-PKT3 is reported here for the first time and opens new horizons for more studies on MSI4 functional mechanism. This finding can be useful in regulation of flowering time in fruits and crops through genetic engineering of this pathway for example by alteration of PKT4 regulation.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Flowering
  • Yeast Two-Hybrid System
  • MSI4
  • Epigenetics
  • Molecular Interaction

شناسایی یک میانکنش مولکولی در کنترل اپی­ژنتیکی بیان ژن FLC در گیاه آرابیدوپسیس با استفاده از تکنیک دوبل هیبرید مخمر

مریم حسین پور1، مقصود پژوهنده2* و فاطمه محمودی کردی1

1 تبریز، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

2 تبریز، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی 

تاریخ دریافت: 12/12/93              تاریخ پذیرش: 3/4/94 

چکیده

گذر از مرحله رویشی به زایشی یکی از مهم ترین فرآیندهای تکاملی گیاهان است که سازوکار مولکولی آن هنوز به طور کامل شناخته نشده است. آغاز گلدهی در گیاهان توسط عوامل مختلفی از قبیل طول دوره نوری، دوره سرما، هورمونها و عوامل اپی­ژنتیک کنترل می­شود. یک مسیر مهم در این فرآیند، کنترل اپی­ژنتیکی ژن FLC  است که بیان آن موجب مهار گلدهی می گردد. حذف گروههای استیل از روی هیستونهای ژن FLC توسط پروتئین ­MSI4 باعث توقف بیان FLC شده و بنابراین، گلدهی آغاز می­شود. با این حال، مکانیسم عمل این پروتئین هنوز تا حدود زیادی ناشناخته است. بنابراین، بررسی هر گونه میانکنش مولکولی با این پروتئین در شناخت مکانیسم عمل آن اهمیت دارد. در این تحقیق، برای یافتن شریک مولکولی پروتئین MSI4 در انجام فرآیند داستیلاسیون، از سیستم دوبل هیبرید مخمر که یکی از مهم ترین روشهای ردیابی میانکنشهای مولکولی می­باشد، استفاده شد. برای این کار، ابتدا ژن MSI4 در ناقل دوبل هیبرید مخمر همسانه­سازی شد. سپس، MSI4 به عنوان طعمه برای غربال در کتابخانه cDNA گیاه آرابیدوپسیس به روش دوبل هیبرید مخمر استفاده شد. پروتئینی که با این روش به دام افتاد، PKT3 (Peroxisomal 3-Ketoacyl-CoA Thiolase 3) بود که یک استیل کوآسیل ترانسفراز است. وظیفه این پروتئین آزاد کردن و انتقال بنیانهای استیل به مولکولها است و از این رو در بسیاری از فرآیند­های حیاتی سلول­ نقش دارد. این میانکنش به وسیله همسانه سازی cDNA کامل پروتئین PKT3 و همچنین هومولوگ آن PKT4 به طور مستقل تأیید شد. گزارش میانکنش MSI4-PKT3 می­تواند افقهای روشنی را برای مطالعات بیشتر در مورد مکانیسم عمل MSI4 پیش روی پژوهشگران قرار ­دهد. از این دستاورد مثلاً با تغییر بیان ژن PKT4 می­توان برای تنظیم زمان گلدهی در تولید محصولات زراعی و باغی استفاده کاربردی کرد.

واژه های کلیدی: گلدهی، دوبل هیبرید مخمر، MSI4، اپی ژنتیک، میانکنش مولکولی

* نویسنده مسئول، تلفن: 09144084074  ،  پست الکترونیکی: pazhouhandeh@azaruniv.edu

مقدمه

 

گذر از مرحله رویشی به زایشی و آغاز گلدهی، فرآیندی بسیار مهم و حیاتی در گیاهان است که بایستی در زمان مناسب از نظر فیزیولوژی گیاه و شرایط محیطی صورت گیرد. در گیاه آرابیدوپسیس(Arabidopsis thaliana)  چندین مسیر مجزا شامل بهاره کردن (Vernalization)، طول دوره نوری (Photoperiod)، وضعیت اپی ژنتیک گیاه و میزان هورمونهایی از قبیل جیبرلین، برای پیشبرد فرآیند آغاز گلدهی شناسایی شده اند (2 و 4). مراحل رشد گیاه توسط شبکه منظمی متشکل از ژنهای مختلف کنترل می شود که بیان آنها در پاسخ گیاه به پیامهای محیطی مانند طول روز، کیفیت نور، دما و غیره تنظیم می­شود تا تغییرات لازم نسبت به شرایط محیطی در مراحل رشد اعمال گردد (4).

در مرکز شبکه ژنی تنظیم کننده آغاز گلدهی، پروتئین (FLC) Flowering Locus C قرار دارد که یک عامل رونویسی از خانواده MADs box بوده و با مهار عوامل محرک گلدهی، از شروع گلدهی ممانعت می‌کند (8 و 20). در آرابیدوپسیس، 505 ژن شناسایی شده اند که حاوی توالیهای متصل شونده به FLC (توالی (CArG-box در راه انداز خود بوده و در فرآیندهای مختلف نقش دارند. FLC علاوه بر گلدهی در تمام مراحل نمو گیاه از جوانه زنی بذر تا تشکیل میوه دخالت داشته و این عمل را غالباً از طریق مهار بیان ژنها و در برخی موارد، با افزایش بیان آنها انجام می­دهد (8). بیان ژن FLC نیز توسط عوامل متعددی کنترل می­شود. ازجمله این عوامل می­توان به فاکتورهای رونویسی مسیر بهاره کردن، عوامل مهارکننده کمپلکس polycomb و همچنین عوامل مهار کننده مستقل از قبیل پروتئین (MSI4) Multicopy  Suppressor of  Ira4 اشاره کرد. در تنظیم اپی­ژنتیکی بیان ژنها، متیلاسیون DNA و یا هیستون و همچنین استیلاسیون هیستونها نقش دارند که به ترتیب موجب خاموش و روشن شدن ژنها می­شوند. متیل‌ترانسفرازهای متعددی در کمپلکس polycomb بیان FLC را مهار کرده و گلدهی را تسریع می­کنند (23و24). همچنین، پروتئین MSI4 (که FVE هم نامیده می­شود)، از طریق حذف بنیانهای استیل از روی هیستونهای ژنFLC ، موجب خاموشی این ژن می شود (3). با مهار FLC اثر ممانعت­ کنندگی آن از رویSuppressor of Overexpression of Constant 1 (SOC1)   که عامل پیشبرنده گلدهی است برداشته شده و گیاه از مرحله رویشی وارد مرحله زایشی می­شود (13، 14 و 16).

نتایج حاصل از مطالعات گذشته (3) نشان می­دهد که MSI4 به تنهایی عمل نکرده بلکه از پروتئینهای دیگری کمک می گیرد، اما روش عمل آن هنوز مشخص نیست و در دو تحقیق به مولتی کمپلکس بودن MSI4 در کنترل FLC اشاره کرده­اند که از طریق تعامل با پروتئینهای مختلف مثلاً HDAC روی کروماتین عمل کرده و نقش داستیلاسیون خود را انجام می­دهد (12 و 15). بنابراین، شناخت هر گونه میانکنش مولکولی با MSI4 در شناخت مکانیسم عمل آن مهم و مؤثر خواهد بود.

ژن MSI4 با 1524 نوکلئوتید در روی کروموزوم شماره دو آرابیدوپسیس قرار دارد و یک پروتئین با 507 اسیدآمینه را کد می­کند که دارای یک ناحیه WD40 برای اتصال به پروتئینهای دیگر بوده و خصوصیت اتصال به یونهای فلزی و تشکیل کمپلکسهای مختلف دخیل در شکل­گیری کروماتین، یوبی­کوئیتیناسیون، فاکتورهای رونویسی و تعمیر DNA برای آن گزارش شده است (3، 17 و18).

روشهای زیادی برای مطالعه میانکنشهای مولکولی وجود دارند (5)، که بر اساس هدف مورد مطالعه شامل روشهای بیوشیمیایی، روشهای تصویرسازی مستقیم میانکنشها به صورت In vivo، روشهای کمی، روشهای ساختاری و مدل­سازی مولکولی و روشهای ژنتیکی هستند (6). از رایج­ترین انواع این تکنیکها می­توان به روش Affinity Purification و به دنبال آن طیف­سنجی جرمی (Mass Spectrometry) اشاره کرد که در استخراج پروتئینها به صورت کمپلکس و نزدیک به شرایط فیزیولوژیک سلول به کار می­رود. از دیگر روشهای بیوشیمیایی مهم می­توان Pull down  و Co-Immunoprecipitation را نام برد. در روش تصویرسازی مستقیم میانکنشها به شکل in vivo، امکان مشاهده مستقیم میانکنش بر اساس فلورسنت فراهم می شود، به طوری که میانکنش دو پروتئین باعث کامل شدن پروتئین گزارشگر و بروز نور خاص فلورسنس خواهد شد. نمونه­هایی از این روشها عبارتند از: Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) ، Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)، Bimolecular fluorescence complementation (BiFC)   in situ hybridization و Immunohistochemistry (6). از جمله روشهای ژنتیکی، تکنیکهای مبتنی بر ریزآرایه­های پروتئینها و مولکولهای کوچک و تکنیک دوبل هیبرید مخمر (Yeast Two Hybrid System :Y2HS) می­باشند. روش دوبل هیبرید در سال 1989 برای مطالعه میانکنشهای پروتئین-پروتئین در مخمر Saccharomyces cerevisiae ابداع شد که نقطه عطفی در تجزیه و تحلیل میانکنش پروتئینها در شرایط in vivo به وجود آورد (10و19).

سیستم دوبل هیبرید مخمر Y2HS یک روش کلاسیک برای نشان دادن تعامل بین دو پروتئین است که بر پایه ویژگیهای پروتئین GAL4 مخمر که شامل دو بخش اتصال به DNA (DNA Binding Domain: BD) و فعال­سازی رونویسی (Transcription Activating Domain: AD) است، پایه­ریزی شده است. مخمر با دو وکتور به صورت همزمان ترانسفورم می شود. پروتئینهای شیمر BD-X  و AD-Y در مخمر تولید می­شود. اگر بین دو پروتئین X  و Y  میانکنش وجود داشته باشد موجب کنار هم قرار گرفتن AD و BD برای اتصال BD-X به ناحیه اختصاصی روی پروموتور و همچنین فعال سازی آنزیم RNA pol II توسط AD-Y می­شود تا رونویسی ژن گزارشگر هیستیدین (H) و آدنین (A) صورت گیرد و پروتئینهای مربوطه تولید شود که در نتیجه موجب رشد مخمر در محیط کشت فاقد A و H خواهد شد (5). هر کدام از پروتئینهای X و Y ابتدا بایستی از لحاظ نداشتن فعالیت BD یا AD بررسی شوند که نباید به تنهایی قادر به فعال کردن رونویسی ژن گزارشکر باشند. این بررسی تست اتواکتیواسیون نام دارد که پروتئینهای مورد آزمایش به اصطلاح نباید اتواکتیو باشند. در حال حاضر روش Y2HS به یک ابزار قدرتمند برای شناخت میانکنشهای پروتئینی در آزمایشگاههای بیولوژی مولکولی دنیا تبدیل شده است (9 و19). در این تحقیق، برای یافتن شریک مولکولی پروتئین MSI4 در انجام فرآیند هیستون داستیلاسیون، از سیستم کارآمد دوبل هیبرید مخمر استفاده شد. برای این منظور، ابتدا cDNA ژن  MSI4 (با کد دسترسی در TAIR و یا NCBI: At2g19520) از گیاه آرابیدوپسیس جداسازی، تکثیر و در ناقل طعمه سیستم دوبل هیبرید همسانه سازی گردید. سپس مخمر با ناقل حاوی MSI4 و ناقل حاوی کتابخانه cDNA آرابیدوپسیس دوبل تراریزش شد. در ادامه غربالگری با قرار دادن MSI4 به عنوان طعمه انجام و ژنهایی که با MSI4 میانکنش مولکولی داشتند در مخمر شناسایی شدند.

مواد و روشها

استخراج RNA و ساخت cDNA: استخراج RNA کل از بافتهای مختلف گیاهان آرابیدوپسیس (اکوتیپ Colombia) در مراحل مختلف رشد با روش ترایزول (Trizol، میکروژن) انجام شد (7 و22). ابتدا 2/0 گرم بافت گیاهی در نیتروژن مایع پودر و با یک میلی لیتر ترایزول مخلوط شد. سپس، 200 میکرولیتر کلروفورم اضافه شده و پس از مخلوط شدن، به مدت 15 دقیقه با سرعت rpm 15000  در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ گردید. پس از انتقال فاز رویی به لوله جدید RNA کل به روش ایزوپروپانول رسوب داده شد و پس از شستشو با اتانول 70 درصد، در 50 میکرولیتر آب مقطر استریل حل گردید. کیفیت و کمیت نمونه­ها به ترتیب با الکتروفورز در ژل آگارز (1 درصد) و با اسپکتروفوتومتر تعیین شد. چهار میکروگرم RNA استخراج شده از گلها برای سنتز cDNA  با استفاده از آغازگر الیگو dT و آغازگر معکوس (Reverse) اختصاصی برای ژن MSI4 و بر اساس روش ذکر شده در کیت  RT Superscript III (شرکت Invitrogen آمریکا) استفاده شد.

همسانه سازی cDNA ژن AtMSI4 در ناقل pGBKT7: برای همسانه­سازی ژن MSI4 (At2g19520)، ابتدا cDNA این ژن با استفاده از واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR) به کمک یک جفت آغازگر اختصاصی (R-BamHI: ATG GAT CCT TAA GGC TTG GAG GCA CAA GT و F-NdeI: ATC ATA TGG AGA GCG ACG AAG CAG CA) تکثیر گردید. سپس قطعه حاصل با استفاده از آنزیمهای برشی BamHI و NdeI که در ساختار آغازگرها طراحی شده بودند، بریده شده و در ناقل pGBKT7 (شرکت Clontech آمریکا) قرار داده شد. ناقل حاصل به روش الکتروپوریشن (5/2 کیلو ولت به مدت 5 هزارم ثانیه) به باکتری E. coli (سویه Top10) جهت تکثیر منتقل و روی محیط کشت LB حاوی µg/l 50 آنتی بیوتیک کانامایسین گزینش شدند. توالی ژن MSI4 در ناقلها با روش PCR روی همسانه­های رشد کرده بررسی شده و پلاسمیدهای استخراج شده از همسانه­های مثبت پس از تیمار با آنزیم RNase  در مرکز توالی­یابی IBMP (Institut de Biologie Moleculaire des Plantes) دانشگاه استراسبورگ فرانسه توالی­یابی گردیدند.

تراریزش مخمر: ابتدا مخمر S. cerevisiae سویه AH109 (شرکت Clontech آمریکا) در دمای 30 درجه سانتی گراد روی محیط کشت YPD (g/l 10 عصاره مخمر،  g/l20 پپتون  وg/l 20 گلوکز) جامد کشت شده و یک همسانه تازه از آن در 20 میلی لیتر محیط کشت مایع تلقیح شد. پس از یک شب کشت در دمای 30 درجه سانتی گراد، ده میلی لیتر از آن به عنوان مایه تلقیح به 50 میلی لیتر محیط YPD مایع اضافه شده و تا 6/0OD600= کشت گردید. سلولهای مخمر طبق دستورالعمل Clontech (آمریکا) با سانتریفیوژ کردن در سرعت  rpm 4000 جمع آوری و پس از دوبار شست­و­شو با آب مقطر استریل، در 350 میکرولیتر بافر یک برابر غلظت Lithium Acetate/Tris-EDTA (LiAc/TE×1) حل شدند. برای هر تراریزش، 50 میکرولیتر بافر حاوی سلول مخمر با دو میکروگرم ناقل، 5 میکروگرم ssDNA اسپرم ماهی سالمون، 40 میکرولیتر بافر LiAc/TE×1 و 250 میکرولیتر PEG50% مخلوط، و پس از 30 دقیقه نگهداری در دمای 30 درجه سانتی گراد، بلافاصله به مدت 20 دقیقه در دمای 42 درجه شوک حرارتی داده شده و نگهداری گردید. سپس سلولها پس از یک سانتریفیوژ کوتاه مدت در 700 میکرولیتر آب مقطر استریل حل شده و در محیط کشت انتخابی SD (g/l 7/5 YNB،  g/l5 سولفات آمونیوم  وg/l 20 گلوکز)  به همراه تمام اسیدآمینه ها به جز اسیدآمینه کد شونده از روی ناقل (تریپتوفان در ناقل pGBKT7) در 30 درجه سانتی گراد به مدت 3 روز کشت شدند. روی این محیط کشت تنها مخمرهای تراریخت حاوی ناقل رشد می کنند (21).

تست اتواکتیواسیون: این تست به منظور اطمینان از عدم توانایی پروتئین MSI4 در فعال­سازی رونویسی بدون حضور شریک میانکنش­گر آن و پس از انجام تراریزش اول مخمر صورت گرفت. برای اینکار سه تکرار کلنی  بر روی محیط کشت انتخابی SD-HW و SD- AHW )ژنهای گزارشگر هیستیدین H و آدنین A در مخمر) کشت شدند.

غربالگری دوبل هیبرید مخمر: غربالگری دوبل هیبرید مخمر بر اساس دستورالعمل شرکت Clontech آمریکا انجام شد. به طور خلاصه، ابتدا سلولهای مخمر حاوی ناقل pGBKT7-MSI4 با کتابخانه cDNA آرابیدوپسیس تهیه شده در ناقل pGADT7 (به کمک سایت برشی BglII در دو طرف قطعات)، به روش شوک حرارتی تراریخت شده و روی محیط کشت SD حاوی تمام اسیدآمینه­ها به جز سه اسیدآمینه لوسین، تریپتوفان و هیستیدین گزینش شدند (21).

استخراج و شناسایی ژنهای به تله افتاده: برای شناسایی پروتئینهای دارای میانکنش با MSI4، ابتدا استخراج DNA از همسانه­های مخمر گزینش شده (رشد کرده در محیط SD-LWH)، طبق دستورالعمل Clontech آمریکا انجام گرفت. سپس تراریزش باکتری E. coli  با استفاده از این DNAها انجام شده و همسانه­ها تنها برای pGADT7  بر روی محیط LB حاوی آنتی بیوتیک آمپی­سیلین (100 µg/l) گزینش شدند. از همسانه­های رشد کرده استخراج پلاسمید انجام شده و برای توالی­یابی به مرکز IBMP ارسال شدند. توالی یابی در دو جهت با آغازگرهای ناقل pGADT7 شامل (F: TAC CAC TAC AAT GGA TG  و R: GTT GAA GTG AAC TTG CGG GGT) انجام شد و توالیهای به دست آمده برای شناسایی و شناخت ژنهای مرتبط ابتدا در وب سایت http://multalin.toulouse.inra.fr مقایسه و بعد در سایت اینترنتی منبع اطلاعاتی آرابیدوپسیس (www.arabidopsis.org, TAIR)  با استفاده از ابزار بلاست (Blast) تجزیه و تحلیل شدند.

جداسازی و همسانه سازی cDNA کامل PKT3 و PKT4 : برای تأیید میانکنشهای مولکولی به دست آمده، ابتدا از روی cDNA آرابیدوپسیس توالی کامل ژن PKT3، با استفاده از یک جفت آغازگر اختصاصی (F-NdeI: AAC ATA TGG AGA AAG CGA TCG AGA GAC AA  و R-BamHI: AAG GAT CCC TAG CGA GCG TCC TTG GAC AA) تکثیر و به کمک مکانهای برش آنزیمی NdeI و BamHI در ناقل pGADT7 همسانه‌سازی گردید. پس از تأیید توالی، ناقل به دست آمده (pGADT7-PKT3) به همراه ناقل pGBKT7-MSI4 به روش شوک حرارتی به مخمر منتقل شده و مخمرهای تراریخت پس از گزینش، به روی محیط فاقد هیستیدین بازکشت شدند.

هومولوگ نزدیک PKT3 یعنی PKT4 نیز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ( F-NdeI: AAC ATA TGG AAA AAG CAA CGG AGA GAC AAA GGA  و R-BamHI: AAG GAT CCT TAG ACT TTC CGG ACA TCA CAG) از روی cDNA آرابیدوپسیس به طور کامل در ناقل pGADT7 به کمک همان آنزیمهای برشی همسانه‌سازی و توالی یابی شد.

نتایج 

در این تحقیق، برای درک بهتر نحوه عمل پروتئین MSI4 در دِاستیله کردن هیستونهای برخی مکانهای ژنی از قبیل FLC که یک عامل بازدارنده شروع گلدهی است، یک غربالگری در کتابخانه cDNA گیاه آرابیدوپسیس انجام گرفت. برای اینکار، ابتدا RNA کل این گیاه استخراج و cDNA آن تهیه گردید. سپس، به کمک آغازگرهای اختصاصی ژن MSI4، کل  cDNA  آن با روش PCR تکثیر (شکل A1) و با استفاده از سایتهای آنزیمهای برشی که روی آغازگرها طراحی شده بودند، در ناقل دوبل هیبرید مخمر pGBKT7 همسانه‌سازی گردید. پس از توالی یابی و اطمینان از درستی توالی همسانه حاصل، این ناقل به مخمر S. cerevisiae منتقل شد (شکل B1).

قبل از شروع غربالگری با این ژن، بررسی عدم وجود خاصیت اتواکتیواسیون رونویسی توسط پروتئین MSI4 تست اتواکتیواسیون انجام شد تا اطمینان حاصل شود که MSI4 به تنهایی قادر به عمل نبود و نیازمند شریک مولکولی برای فعال کردن رونویسی ژن گزارشگر می­باشد. برای انجام این تست، سه کلنی مجزا از مخمر حاوی pGBKT7-MSI4 به همراه کنترل منفی (مخمر حاوی pGBKT7 خالی) و همچنین کنترل مثبت (مخمر حاوی pGBKT7-SUVH2 که دارای خاصیت اتواکتیواسیون رونویسی ژن گزارشگر است) به محیط کشت کنترل SD-W و همچنین محیط کشت انتخابی SD-HW منتقل شدند. پس از گذشت دو هفته، کلنیهای حاوی pGBKT7-MSI4 قادر به رشد در محیط انتخابی نبودند که نشان دهنده عدم وجود خاصیت اتواکتیواسیون برای MSI4 می­باشد و این پروتئین به تنهایی قادر به فعال کردن رونویسی نیست و خاصیت فاکتور رونویسی ندارد (شکل 2).

 در ادامه، تراریزش دوم با ناقل pGADT7 حاوی کتابخانه cDNA آرابیدوپسیس روی مخمرهای حاوی pGBKT7-MSI4  انجام گرفت. مخمرهای دوبل تراریخت شده روی محیط کشت فاقد سه اسیدآمینه انتخاب شدند. اسیدآمینه­های لوسین و تریپتوفان به ترتیب توسط pGADT7 و pGBKT7 تولید می­شوند و ژن هیستیدین، گزارشگر وجود میانکنش مولکولی بین دو پروتئین کد­شونده از هر کدام از این ناقلها است. بنابراین، هر همسانه­ مخمری که بتواند در فقدان این سه اسیدآمینه رشد کند، حتماً حاوی دو ناقل مذکور و همچنین نشانگر میانکنش بین دو پروتئین کد شونده از این ناقلها است. کلنیهای رشد کرده در روی محیط انتخابی SD-HWL، شماره گذاری شده و 83 کلنی روی محیط جدید SD-HWL  و همچنین محیط انتخابی قویتر SD-AHWL بازکشت شدند (شکل 3).

 

 

شکل 1- A) الکتروفورز محصول PCR حاصل از تکثیر cDNA ژن AtMSI4 روی ژل آگارز 1 درصد. با استفاده از یک جفت آغازگر اختصاصی، قطعه bp 1400 حاصل از تکثیر cDNA ژن AtMSI4 در لاین سمت چپ. لاین سمت راست M: نشانگر وزن مولکولی (Gene Ruler 1KB Plus Fermentase). B) کلنیهای مخمر S. cerevisiae  سویه AH109  روی محیط YPD پس از سه روز کشت. C) کلنیهای مخمر تراریخت شده با ناقل pGBKT7-MSI4 روی محیط انتخابی فاقد تریپتوفان (SD-W).

 

شکل 2- تست اتواکتیواسیون ژن MSI4. سه کلنی تراریخت شده به عنوان تکرار از روی محیط کشتهای مخمر حاوی pGBKT7-MSI4، pGBKT7 خالی (به عنوان کنترل منفی)  و pGBKT7-SUVH2 (به عنوان کنترل مثبت) جهت بررسی خاصیت فعال سازی رونویسی پروتئین MSI4 روی محیط شاهد SD-W و محیط انتخابی رونویسی H (هیستیدین)، یعنی SD-WH، کشت شدند. بر خلاف کنترل مثبت که با داشتن توانایی فعال سازی رونویسی H توانست در محیط انتخابی فاقد H رشد کند، کلنیهای مخمر حاوی pGBKT7-MSI4 وpGBKT7 خالی قادر به رشد در محیط انتخابی نبودند. بنابراین MSI4 به تنهایی قادر به فعال سازی رونویسی نیست.

 

تعدادی از کلنیها در محیط انتخابی قوی تر رشد کردند که نشان دهنده وجود میانکنش بسیار قوی بین پروتئین MSI4 و پروتئین به تله افتاده از کتابخانه cDNA می باشد (شکل 3). از این میان، کلنی شماره 41 رشد بهتری در محیط انتخابی قویتر نشان داد.

 

 

شکل 3- نتیجه غربالگری. A) کلنیهای رشد یافته مخمر تراریخت شده با pGBKT7-MSI4 و کتابخانه pGADT7-cDNA ، پس از  یک هفته رشد روی محیط کشت انتخابی SD-HWL. BوC) بازکشت کلنیهای گزینش شده، روی محیط SD-HWL (B) و SD-AHWL (C). تنها کلنی شماره 41 در روی محیط SD-AHWL رشد خوبی نشان داد که نشان دهنده وجود میانکنش قوی بین پروتئینهای تولید شده از دو نوع ناقل می‌باشد.

 

 

در مرحله بعدی، 83 کلنی به طور جداگانه در محیط مایع SD-WL کشت شده و DNA آنها استخراج گردید. سپس DNA ها به باکتری E. coli با الکتروپوریشن منتقل شده و باکتریهای تراریخت شده روی محیط کشت LB حاوی آمپی سیلین گزینش گردیدند. هر کدام از کلنیهای رشد یافته با سه تکرار در همان محیط کشت مایع کشت شده و متعاقب آن استخراج پلاسمید pGADT7-cDNA از آنها صورت گرفت. cDNAهای موجود در پلاسمید pGADT7 با استفاده از یک جفت آغازگر که از روی توالی پلاسمید pGADT7 و بلافاصله در بالادست و پایین دست محل قرار گرفتن cDNA، طراحی شده بودند، با تکنیک PCR تکثیر شدند (شکل4). الکتروفورز محصول PCR  نشان داد که ژنهای متفاوتی در این غربالگری صید شده­اند.

پنجاه عدد از این پلاسمیدها توالی­یابی و بلاست شدند تا هویت آنها از بین ژنهای آرابیدوپسیس مشخص شود. با بررسی توالی موجود در بالا دست محل ورود cDNAها در ناقل pGADT7، مشخص شد که تنها 16 توالی در قالب درست برای ترجمه قرار دارند. یکی از توالیهای به دست آمده (توالی همسانه شماره 41 که نسبت به بقیه شماره­ها میانکنش قوی آن با MSI4 مشاهده شده بود، شکل (C3) مربوط به ژن Peroxisomal 3-KetoAcyl-COA Thiolase 3 (PKT3) با کد دسترسی AT2G33150 بود که یک استیل کوآ اسیل ترانسفراز است و در متابولیسم مواد مختلفی در سلول نقش حیاتی داشته و مسئول آزاد کردن و انتقال بنیانهای استیل به برخی مولکولها می‌باشد (11). ژن خواهری آن PKT4 با شماره ژنومی AT1G04710 دارای وظیفه­ای مشابه است. توالی به دست آمده در تست غربالگری در واقع بخش مشابهی از هر دو ژن مذکور بود. برای تأیید میانکنش پروتئین حاصل از این توالی با ژن MSI4، یک تست دوبل هیبرید مخمر دیگر با استفاده از پلاسمیدهای pGADT7 حاوی توالی PKT3 (pGADT7-PKT3) و pGBKT7-MSI4 انجام گرفت.

 

 

 

شکل 4- الکتروفورز محصول PCR حاصل از تکثیر DNA پلاسمیدهای pGADT7 استخراج شده از همسانه های رشد کرده در تست غربالگری. جفت آغازگر استفاده شده مکمل توالیهایی روی پلاسمید pGADT7 در بالادست و پایین دست محل قرار گرفتن cDNA، هستند. از بین 83 همسانه حاصل، تنها نتیجه برخی شماره ها در این ژل نشان داده شده است. تعدادی از همسانه ها حاوی قطعاتی با اندازه متفاوت بودند. M: نشانگر وزن مولکولی، C: کنترل منفی (محصول PCR روی pGADT7 خالی که باند کوچک داشته و حاوی هیچ ژنی نمی‌باشد).

 

 

بر خلاف مخمرهایی که تنها حاوی یکی از دو ناقل بودند، مخمرهای حاوی هر دو ناقل توانستند در فقدان هیستیدین که گزارشگر وجود میانکنش است، رشد کنند. بدین وسیله، وجود ارتباط فیزیکی بین MSI4 و PKT3 شناسایی شد. برای تأیید نهایی نتایج به دست آمده، cDNA کامل دو ژن PKT3 و PKT4 با استفاده از آغازگرهای اختصاصی مربوطه، از گیاه آرابیدوپسیس تکثیر و این بار در ناقل pGBKT7 همسانه­سازی گردید. توالی­یابی آنها نشان داد که توالی ثبت شده بدون هیچ گونه جهش همسانه سازی شده است. از طرف دیگر، MSI4 نیز از روی ناقل موجود با روش PCR تکثیر و در ناقل pGADT7 همسانه­سازی و توالی­یابی شد. پس از اطمینان از درستی توالیها، میانکنش پروتئینهای کامل PKT3 و PKT4 با پروتئین MSI4 در ناقل pGADT7 بررسی شد. چنین عوض نمودن جهت ناقلها یعنی این بار ناحیه چسبنده (DNA Binding Domain) به همراه PKT3 یا PKT4 و ناحیه فعال کننده (Activating Domain) به همراه MSI4، برای اطمینان از وجود میانکنش قوی بین آنها انجام گرفت. نتایج نشان داد که در این جهت نیز میانکنش بین پروتئینهای کامل وجود دارد (شکل5).  بنابراین، پروتئینهای PKT3 و PKT4 به صورت قوی با پروتئین MSI4 در هر دو جهت ناقل میانکنش دارند.

بحث

پروتئین MSI4 که در تسریع گلدهی دخیل است یکی از اجزای کمپلکسی است که رونویسی ژن FLC را از طریق حذف گروههای استیل (داستیلاسیون) هیستونهای موجود در ساختار کروماتین این ژن مهار می­کند. FLC یک ژن بازدارنده­ شروع گلدهی است و بنابراین، مهار بیان FLC توسط MSI4، باعث تسریع فرآیند گلدهی می­شود (3).

 

 

 

شکل 5- تأیید میانکنش بین PKT3 یا PKT4 با MSI4 از طریق نحوه رشد کلنیهای مخمرهای تراریخت شده با pGADT7-MSI4  و pGBKT7-PKT3/4 .  همچنان که دیده می شود، پس از  یک هفته کشت در 30 درجه سانتیگراد، تنها مخمرهای تراریخت شده با هر دو ژن قادر به رشد در محیط‌های گزینش SD-HWL و SD-AHWL بودند، که تأیید کننده وجود میانکنش قوی بین PKT3 و PKT4 با MSI4 می‌باشد.

 

 

تحقیقات کاملی روی ژن MSI4 صورت نگرفته و تاکنون میانکنشی با پروتئینهای دیگر برای MSI4 گزارش نشده است. اخیراً Gu و همکاران (12) نشان دادند که MSI4 و همچنین MSI5 با یک هیستون داستیلازی به نام HDA6 (Histone Deacetylase 6) به صورت غیرمستقیم و از طریق تشکیل یک کمپلکس همکاری دارد. مطالعات دیگر نیز حاکی از دخالت MSI4 در کمپلکسهای پروتئینی متفاوت می باشد که در روی کروماتین باعث تغییراتی می­شوند (16و17). یافته تحقیق حاضر یک میانکنش جدید MSI4-PKT3/4 را به دامنه اطلاعات موجود اضافه می­کند.

نحوه تهیه کتابخانه­های cDNA در ناقلها متفاوت است. بانک cDNA به کار رفته در این تحقیق طوری ساخته شده است که ژنها شکسته شده اند تا همگی با اندازه حدود 1000 تا 1500 نوکلوتید وارد ناقل شوند لذا مشاهده اندازه یکسان توالیها در نتیجه غربالگری امری معمول می­باشد و به نحوه تهیه بانک cDNA مربوط می گردد. ممکن است بانک cDNA ای استفاده شود که چنین خصوصیتی نداشته باشد در این صورت قطعات با اندازه بزرگتر به خاطر احتمال کمتر تولید پروتئین، در مرحله غربالگری خود به خود حذف خواهند شد و دامنه نتایج غربالگری را محدود خواهد کرد.

در این تحقیق، برای اولین بار، MSI4 در یک آزمایش غربالگری قرار گرفت تا یک میانکنش مولکولی با آن گزارش شود. نتایج این تحقیق می­تواند سرآغاز کشف کامل سازوکار مولکولی MSI4 در تغییر میزان استیلاسیون هیستونها باشد. یکی از نقاط قوت تحقیق حاضر بررسی مجدد تعامل یافته شده در هر دو جهت ناقلها است. با توجه به سیستم دوبل هیبرید مخمر، یکبار MSI4  به BD متصل شد و میانکنش آن با PKT3 متصل به AD تأیید شد و بار دیگر با تعویض جهت و همسانه­سازی مجدد MSI4  به AD متصل شد و میانکنش آن با PKT3 متصل به BD  ثابت گردید. تعاملهایی که در هر دو جهت برقرار باشند تعاملات واقعی بین پروتئینها هستند. از سوی دیگر با وارد کردن ژن خواهری یعنی PKT4 و بررسی و اثبات تعامل آن به MSI4 احتمال تصادفی بودن تعامل یافته شده رد می گردد و نشانگر آن است که واقعا یک ناحیه حفاظت شده در PKT3 یا PKT4  با MSI4 تعامل برقرار می­کند. ژنهای یافت شده یعنی PKT4 و PKT3 هر چند از یک خانواده­اند اما تفاوتهایی باهم دارند (82% Identities) و تعامل MSI4  با آنها مطمئناً متفاوت خواهد بود. با توجه به اینکه کلنیهای مخمر همزمان کشت می­شوند هر کدام تعامل قوی­تری بین پروتئینها داشته باشد در محیط انتخابی زودتر رشد می کند. تجربه نشان می­دهد که رشد از روز سوم یا چهارم شروع می شود ولی در برخی تعاملات از روز دهم هم می­توان شاهد شروع رشد بود. با توجه به اینکه عکس برداری از همه محتویات پتری در یک روز خاص صورت گرفته لذا کلنیها تفاوت رشد نشان می­دهند. این تفاوت اگر محسوس باشد نشان دهنده میزان تفاوت در تعامل MSI4 با PKT3  و PKT4 هست که می­توان با انجام Y2HS کمّی با استفاده از استرین Y187 مخمر، آن را نشان داد  (21). در این تحقیق از روش شوک حرارتی برای انتقال ناقلها به مخمر استفاده شد. از روشهای دیگر مثل الکتروپوراسیون نیز می­توان برای انتقال ژن و ناقل به مخمرها استفاده کرد که در مخمر Pichia pastories از این روش استفاده شده است (1).

مطالعات قبلی نشان داده اند که گلدهی در گیاهان جهش یافته msi4 بسیار دیرتر از گیاهان وحشی انجام می گیرد (3). نکته جالب توجهی که وجود میانکنش شناخته شده را تا حدودی تأیید می­کند این است که گیاهان جهش یافته pkt3 نیز گلدهی نامنظمی دارند (11). با توجه به نتایج به دست آمده از این تحقیق می­توان گفت که PKT3 احتمالاً وظیفه تغییر بنیانهای استیل را به کمک MSI4 بر روی هیستونهای FLC بر عهده دارد که این فرضیه جای بررسی بیشتری دارد.

براساس مطالعات گذشته و آخرین یافته­ها درخصوص MSI4 توسط پژوهنده و همکاران (22)،­ پروتئین MSI4 با یک سیستم تجزیه­کننده پروتئینی وابسته به یوبی­کوئیتیناسیون به نام CUL4-DDB1 در ارتباط است که همانند یک پل باعث ایفای نقش این کمپلکس تجزیه­کننده بر روی هیستونها می­شود. بر اساس یافته­های تحقیق حاضر، MSI4 با PKT3 یا هومولوگ آن PKT4 نیز میانکنش دارد. با توجه به نتایج این دو تحقیق می­توان یک کمپلکس به صورت CUL4-DDB1-MSI4-PKT3 تصور نمود که در آن پروتئین MSI4 با فراهم کردن ارتباط بین کمپلکس تجزیه کننده CUL4-DDB1 با پروتئین PKT3، موجب تنظیم مقدار آن می­شود. در صورت صحت این موضوع، انتظار می رود مقدار PKT3 در گیاهان جهش یافته msi4 افزایش یافته و در نتیجه تولید استیل کوآنزیم A زیاد شود. این عمل، افزایش انتقال استیل کوآنزیم A توسط ترانسفرازها بر روی هیستونها را به دنبال خواهد داشت و در نتیجه، در گیاهان جهش یافته msi4 میزان استیلاسیون هیستونها بیشتر خواهد بود که این پدیده در مطالعات گذشته (11) به طور کامل به اثبات رسیده است. یکی از ژنهای هدف MSI4  در مسیر گلدهی، FLC است. در گیاهان جهش یافته msi4، در اثر عدم تنظیم PKT3، استیلاسیون هیستونهای FLC بیشتر شده و رونویسی از آن فعال باقی می­ماند. در نتیجه، از شروع گلدهی ممانعت شده و گیاهان جهش یافته شدیداً دیرگلده می‌شوند. در گیاهان تیپ وحشی، تجزیه پروتئین PKT3 با کمک MSI4 به صورت طبیعی انجام گرفته و میزان استیل کوآنزیم  Aدر حد معمول نگه داشته می‌شود. بنابراین، استیلاسیون ژنها تعدیل شده و رونویسی ژنهایی از قبیل FLC به موقع توسط سازوکارهای دیگری مانند متیلاسیون مهار شده و نهایتاً گلدهی به موقع آغاز می­شود. در میان غلظت متعادل هورمونهای گیاهی نیز آغاز گلدهی را تعیین خواهند کرد (2).

مطالعه ارگانیسمهای مدل راه را برای مطالعه و تحقیق در مورد موجودات زنده پیچیده ­تر باز می­کند. به همین ترتیب می­ ­توان نتایج حاصل از مطالعه گیاه مدل آرابیدوپسیس را به گیاهان و حتی جانوران تعمیم داد. مطالعه قرابت و میزان حفظ شدن آن در میان گونه­ها، جنسها، خانواده­ها و حتی سلسله­ها می­تواند این تحقیق را جهت­دار کند و علاوه بر این می­توان با استفاده از روشهای in silico شبکه میانکنشی موجودات عالی­تر را به کمک اطلاعات موجودات ابتدایی­تر پیش­بینی و تجزیه و تحلیل کرد. علاوه بر آن، شناخت مکانیسم مولکولی پدیده­های حیاتی، پیش نیاز برنامه­های اصلاح ژنتیکی گیاهان زراعی و درختان میوه می­باشد و انجام تغییرات ژنتیکی در گیاهان بدون داشتن اطلاعات مولکولی کافی از مکانیسمها می­تواند منجر به تغییرات نامطلوبی در محیط زیست گردد. همچنین، با داشتن اطلاعات مولکولی از مکانیسمها، تصمیم­گیری در مورد نحوه اجرای برنامه اصلاحی آسان تر خواهد بود. برای مثال، در مورد گلدهی، از طریق اطلاعات موجود می‌توان تنها با خاموش کردن یک ژن در گیاه، از قبیل MSI4، باعث تأخیر در گلدهی و در نتیجه، ایجاد گیاهی با طول عمر و دوره رویشی طولانی­تر و میزان شاخ و برگ بیشتر شد که در خصوص گیاهان علوفه­ای و گیاهانی که قسمتهای رویشی آنها مورد مصرف قرار می‌گیرد حائز اهمیت است. 

از آنجا که مطالعه میانکنشها به روشهای مختلف می­تواند اعتبار نتیجه این تحقیق را بالا ببرد بنابراین می‌توان برای تأیید میانکنش شناخته­ شده در این تحقیق، از روشهای دیگری از قبیل روشهای بیوشیمیایی مثل Pull-Down و Co-IP بهره برد. همچنین، در تأیید میانکنش شناخت شده و پی بردن به میزان اهمیت آن، می­توان از گیاهان جهش­یافته برای هر کدام از ژنهای msi4 و pkt3 استفاده کرده و با تلاقی آنها، گیاهان دوبل موتانت تهیه و تغییرات فنوتیپی نتاج را مورد مطالعه قرار داد.

سپاسگزاری

از مشاورتهای آقای دکتر محمد احمدآبادی صمیمانه تشکر می گردد. این مقاله نتیجه تحقیقات پایان­نامه کارشناسی­ارشد بیولوژی سلولی و مولکولی خانم مریم حسین­پور در دانشگاه شهید مدنی آذربایجان تحت راهنمایی مشترک خانم دکتر فاطمه محمودی کردی و آقای دکتر مقصود پژوهنده می­باشد که توسط معاونت پژوهشی دانشگاه حمایت مالی شده است. از کمکهای انستیتو IBMP فرانسه در زمینه توالی­یابی و تأمین برخی مواد سپاسگذاری و قدردانی به عمل می آید.

1- وفا، م.، یخچالی، ب.، حق نظری، ع.، رستگارجزی، ف.، کارخانه، ا.ع. و احمدی دانش، ح. 1390. کلونینگ و بیان ترشحی ژن لیپاز BTL2 باسیلوس ترموکاتنولاتوس در پیکیا پاستوریس با استفاده از توالیهای نشانه طبیعی و آلفا فاکتور مخمری. مجله زیست شناسی ایران، جلد 24 شماره 5 صفحه 640-647.

2- یاری، ف.، موسوی، ا.، مستوفی، ی.، سیدی، س.م.، زمانی، ذ و لایمر، م. 1392. اثر تنظیم کننده­های رشد گیاهی و نوع کلات آهن بر پرآوری و ریشه زایی درون شیشه ای سه رقم گل سرخ شاخه بریده  Rosa hybrid L. مجله زیست شناسی ایران، جلد 26 شماره 1 ص 99-110.

 

3. Ausín,  I., Alonso-Blanco, C.A., Jarillo, J., Ruiz-Garcíaz, L. and  Martínez-Zapater, J. 2004. Regulation of flowering time by FVE, a retinoblastoma-associated protein. Nature Genetics, 36(2): 162-165.

4. Baurle, I. and Dean, C. 2006. The timing of developmental transitions in plants. Cell, 125: 655-664.

5. Brückner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D. and Schlattner, U. 2009. Yeast Two-Hybrid: a Powerful Tool for Systems Biology. Int J Mol Sci, 10: 2763-2788.

6. Charbonnier, S., Gallego, O. and Gavin, A. 2008. The social network of a cell: Recent advances in interactome mapping. Biotechnology Annual Review, 14: 1387-2656.

7. Chomczynski, P. and Sacchi, N.  1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry, 162:156-9.

8. Deng, W., Ying, H., Helliwell, C.A., Taylor, J.M., Peacock, W.J. and Dennis, E.S. 2011. FLOWERING LOCUS C (FLC) regulates development pathways throughout the life cycle of Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA, 108(16): 6680-6685.

9. Fields, S. 2005. High-throughput two-hybrid analysis. The promise and the peril. FEBS Journal, 272: 5391-5399.

10. Fields, S. and Song, O. 1989. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 340: 245-246.

11. Footitt, S., Cornah, J.E., Pracharoenwattana, I., Bryce, J.H. and Smith, S.M. 2007. The Arabidopsis 3-ketoacyl-CoA thiolase-2 (kat2-1) mutant exhibits increased flowering but reduced reproductive success.  J Exp Bot, 58(11): 2959-68.

12. Gu, X., Jiang, D., Yang, W., Jacob, Y., Michaels, S.D. and He, Y. 2011. Arabidopsis Homologs of retinoblastoma-Associated protein 46/48 associate with a histone deacetylase to act redundantly in chromatin silencing. PLoS genetics, 7(11): e1002366.

13. He, Y. and Amasino, R.M. 2005. Role of chromatin modification in flowering-time control. TRENDS in Plant Science, 10(1): 30-35.

14. He, Y.H., Michaels, S.D. and Amasino, R.M. 2003. Regulation of flowering time by histone acetylation in Arabidopsis. Science, 302:1751-1754.

15. Jeon, J. and Kim, J. 2011. FVE, an Arabidopsis homologue of the retinoblastoma-associated protein that regulates flowering time and cold response, binds to chromatin as a large multiprotein complex. Mol Cells. 32(3):227-34.

16. Jiang, D., Wang, Y., Wang, Y. and He, Y, 2008. Repression of FLOWERING LOCUS C and FLOWERING LOCUS T by the Arabidopsis Polycomb Repressive Complex 2 Components. PLoS One, 3(10): e3404.

17. Kenzior, A. and Folk, W.R. 2015. Arabidopsis thaliana MSI4/FVE associates with members of a novel family of plant specific PWWP/RRM domain proteins. Plant Mol Biol, 87: 329-39.

18. Lee,  J.H., Terzaghi, W., Gusmaroli, G., Charron, J.B., et al. 2008. Characterization of Arabidopsis and rice DWD proteins and their roles as substrate receptors for CUL4-RING E3 ubiquitin ligases. Plant Cell, 20(1): 152-167.

19. McAlister-Henn, L., Gibson, N. and Panisko, E. 1999. Applications of the Yeast Two-Hybrid System. Methods, 19: 330-337.

20. Michaels, S. and Amasino, R. 1999. FLOWERING LOCUS C encodes a novel MADS domain protein that acts as a repressor of flowering. Plant Cell, 11: 949-956.

21. Pazhouhandeh, M., Dieterle, M., Marrocco, K., Lechner, E., Berry, B., et al. 2006. F-box-like domain in the polerovirus protein P0 is required for silencing suppressor function. PNAS, 103(6): 1994-1999.

22. Pazhouhandeh, M., Molinier, J., Berr, A. and Genschik, P. 2011. MSI4/FVE interacts with CUL4-DDB1 and a PRC2-like complex to control epigenetic regulation of flowering time in Arabidopsis. PNAS, 108(8):3430-5.

23. Schmitz, R.J., Sung, S. and Amasino, R.M. 2008. Histone arginine methylation is required for vernalization-induced epigenetic silencing of FLC in winter-annual Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA, 105: 411-416.

24. Shilatifard, A. 2006. Chromatin modifications by methylation and ubiquitination: implications in the regulation of gene expression. Annu Rev Biochem, 75: 243-269.