نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 استادیار ایمنی شناسی،گروه میکروب شناسی دانشکده دامپزشکی دانشگاه ارومیه،ایران

2 دانشجوی دکتری گروه میکروب دامپزشکی دانشگاه ارومیه، ایران

چکیده

در سال‌های اخیر توجه زیادی به نقش لنفوسیت‌های Th17 و FoxP3+Treg در سیر پاسخ‌های ایمنی شده است. با وجودی که برخی مطالعات قبلی مؤید نقش تعدیل کننده ایمنی کلسی‌تریول بوده است، ولی این اثرات عمدتا قبل از زمان کشف رده‌های اخیر بوده است. هدف از این مطالعه ارزیابی اثرات کلسی‌تریول بر پاسخ‌های دستگاه ایمنی متعاقب چالش با پادگن گویچه‌های سرخ گوسفند (SRBC) در مدل موشی می‌باشد. جامعه مورد مطالعه، شامل 14 موش‌های نر سوری بود که در دو گروه مساوی به طور تصادفی قرار گرفتنند و با پادگن SRBC ایمونیزه شدند. موش‌های گروه تیمار از ابتدای مطالعه به مدت دوهفته کلسی‌تریول(μg/Kg 5–یک روز در میان-داخل صفاقی) دریافت نمودند.نتایج به دست آمده حاکی از افزایش معنی‌دار تیتر پادتن ضد SRBC در سرم موش‌های گروه تیمار همزمان با کاهش شدت واکنش DTH در قیاس با موش‌های شاهد می‌باشد. میزان قابلیت انفجار تنفسی در جمعیت سلول‌های فاگوسیتیک طحال و همچنین شدت تکثیر لنفوسیت‌های طحالی در این گروه از موش‌ها در مقایسه با گروه شاهد به طور معنی‌داری کاهش یافته بود. در عین حال کلسی‌تریول، موجب کاهش معنی‌دار در تولید سایتوکاین‌های پیش التهابی 17-IL و IFN-γهمزمان با افزایش فراوانی سلول‌های FoxP3+Treg شد . سطح سایتوکاین ضد التهابی IL-10 نیز به طور معنی‌داری افزایش یافت. بنابراین ممکن است که عمده اثرات ایمونومدولاتوری منتسب به کلسی-تریول مربوط به کاهش معنی‌دار فعالیت سلول‌های Th17، همزمان با القای لنفوسیت‌های FoxP3+Treg باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

New approach to the immunomodulatory effects of calcitriol in NMRI-mouse

نویسندگان [English]

  • Seyyed Meysam Abtahi Froushani 1
  • hadi esmaeili 2
  • bahman Mansouri 1

1 Department of FacultMicrobiology, Veterinary , Urmia University, Urmia, Iran

چکیده [English]

Recent evidence demonstrated an important role for Th-17 and FoxP3+Treg lymphocytes in immunity system .Although, previous reports have determined the immunomodulatory potential of calcitriol, but this study was mostly done before the discovery of recent lymphocytes. The present study was set out to investigate the effects of calcitriol on immunity system in NRMI-mice after challenge with sheep red blood cells (SRBC). The study population was consist of 14 male mice that randomly allocated in two equal groups and immunized with SRBC. Mice in the treatment group were intraperitoneally received 5 μg/Kg calcitriol every other day from the beginning of the study and continued for 2 weeks. The results of the present study indicated a significant increase in the level of anti-SRBC antibody and simultaneously a significant decrease in the level of DTH in the treatment group compared to control group. The level of respiratory burst in phagocytic cells of splenocytes and the level of lymphocyte proliferation were significantly decreased in treatment group compared to control group. Moreover, calcitriol caused a significant reduction in the production of pro-inflammatory IL-17 as well as IFN-γ, parallel to increasing FoxP3+Treg cells. Also the level of anti-inflammatory IL-10 was significantly increased. Therefore, the major immunomudlatoty effects of calciteriol may be due to a significant decrease in Th17 cells activity and concurrently a significant decrease in the expansion of FoxP3+Treg lymphocytes.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Calcitriol
  • Humoral immunity
  • Cellular immunity
  • Lymphocyte response

نگرش جدید به اثرات ایمونومودلاتوری کلسی­تریول در موش سوری

سید میثم ابطحی فروشانی*، هادی اسمعیلی گورچین قلعه و بهمن منصوری مطلق

ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده دامپزشکی، گروه میکرب شناسی

تاریخ دریافت: 19/10/92              تاریخ پذیرش: 29/4/94 

چکیده

در سالهای اخیر توجه زیادی به نقش لنفوسیتهای Th17 و FoxP3+Treg در سیر پاسخهای ایمنی شده است. با وجودی که برخی از مطالعات قبلی مؤید نقش تعدیل کننده ایمنی کلسی­تریول بوده است، ولی این اثرات عمدتاً قبل از زمان کشف رده­های اخیر بوده است. هدف از این مطالعه ارزیابی اثرات کلسی­تریول بر پاسخهای دستگاه ایمنی متعاقب چالش با پادگن گویچه­های سرخ گوسفند (SRBC) در مدل موشی می­باشد. جامعه مورد مطالعه، شامل  14 موشهای نر سوری بود که در دو گروه مساوی به طور تصادفی قرار گرفتنند و با پادگن SRBC ایمونیزه شدند. موشهای گروه تیمار از ابتدای مطالعه به مدت دو هفته کلسی­تریول(μg/Kg 5–یک روز در میان-داخل صفاقی) دریافت نمودند. نتایج به دست آمده حاکی از افزایش معنی­دار تیتر پادتن ضد SRBC در سرم موشهای گروه تیمار همزمان با کاهش شدت واکنش DTH در قیاس با موشهای شاهد می­باشد. میزان قابلیت انفجار تنفسی در جمعیت سلولهای فاگوسیتیک طحال و همچنین شدت تکثیر لنفوسیتهای طحالی در این گروه از موشها در مقایسه با گروه شاهد به طور معنی­داری کاهش یافته بود. در عین حال کلسی­تریول، موجب کاهش معنی­دار در تولید سایتوکاین‌های پیش التهابی 17-IL و IFN-γهمزمان با افزایش فراوانی سلولهای FoxP3+Treg شد. سطح سایتوکاین ضد التهابی IL-10  نیز به طور معنی­داری افزایش یافت. بنابراین ممکن است که عمده اثرات ایمونومدولاتوری منتسب به کلسی­تریول مربوط به کاهش معنی­دار فعالیت سلولهای Th17، همزمان با القای لنفوسیتهای FoxP3+Treg باشد.

واژه های کلیدی: کلسی­تریول، ایمنی هومورال، ایمنی سلولی، پاسخ لنفوسیتی

* نویسنده مسئول، تلفن: 09133000470، پست الکترونیکی:  meysamabtahi@hotmail.com 

مقدمه

 

کلسی­تریول یکی از اعضای خانواده هورمونهای استروئیدی می­باشد. همه اعضای خانواده هورمونهای استروئیدی در تنظیم بیان ژنها نقش دارند(33). شناخته شده­ترین عملکرد کلسی­تریول تنظیم تعادل کلسیم در بدن، شکل­گیری استخوان و تنظیم جذب دوباره کلسیم می­باشد. عملکرد شکل فعال کلسی­تریول (1,25(OH)2D3) بعد از اتصال به گیرنده خود در هسته سلول آغاز می­گردد(33 و 37). یکی از منابع مهم کلسی­تریول سنتز آن طی واکنش فتولیزی است که در پوست رخ می­دهد(35 و 37) .کلسی­تریول ناشی از نور خورشید در آب و هوای  شمالی و به ویژه در فصل زمستان کمتر در دسترس می­باشد. در عین حال داشتن یک رژیم غذایی که دارای میزان بالای کلسی­تریول باشد مشکل است زیرا منابع غذایی طبیعی  چندان از لحاظ کلسی­تریول غنی نمی­باشند(8).

 از طرفی شواهد اثبات شده­ای مبنی بر ارتباط بین کلسی­تریول و تعادل بیماریهای خود ایمن دارد (35). در جوامعی که غذاهای سرشار از کلسی­تریول مصرف می­کنند، شیوع بیماریهای خود ایمن نیز کمتر است که این خود شاهدی بر خاصیت تعدیل ایمنی توسط کلسی­تریول و ارتباط آن با سیستم ایمنی می­باشد(35 و 37). متأسفانه شیوه زندگی امروزی که شامل فعالیت کمتر در فضای باز ورژیم غذایی با میزان کمتر کلسی­تریول می­باشد موجب کاهش دریافت کلسی­تریول شده است(33).

تا همین اواخر به طور گسترده‌ای پذیرفته شده بود که سلولهای Th1 مولد اینترفرون گاما (γINF- ) نقش اصلی را در پاتوژنز واکنشهای ازدیاد حسایت تأخیری (DTH) و بیماریهای خود ایمن وابسته به عضو بازی می‌کنند، در حالی که تشکیل سلولهای Th2 دارای اثرات حفاظت بخش می‌باشد (19، 20، 23 و 25). با این وجود مشخص شده است موشهای دچار نقصان در اینترفرون گاما و یا گیرنده آن، جزء P35 اینترلوکین 12 و یا گیرنده اینترلوکین 12، نه تنها  نسبت به ایجاد بیماریهای خود ایمن مرتبط با عضو مقاوم نیستد بلکه آن را با شدت بیشتری نشان می­دهند(10 و 22). این مسئله با کشف رده جدیدی از سلولهایT  کمکی به نام Th17 تا حدودی حل شد (11 و 22). به علاوه، برخی شواهد حاکی از تنظیم متقابل سلولهای Th17 و لنفوسیتهای T کمکی تنظیمی (T CD4+ CD25+ FoxP3+ یا FoxP3+Treg) می‌باشد. دسته اخیر نقش مهمی را در ایجاد تحمل به خود، بازی می‌کند(29).

همان طور که ذکر شد برخی از مطالعات قبلی مؤید نقش تعدیل کننده ایمنی کلسی­تریول بوده است(35 و 37). ولی این مطالعات عمدتاً قبل از زمان کشف رده­های Th17 و FoxP3+Treg صورت گرفته است و عمدتاً بر مبنای تغییر در تعادل سایتوکاین­های Th1/Th2 توجیه شده است. هدف اصلی مطالعه حاضر ارزیابی اثرات کلسی­تریول بر عملکرد پاسخهای ایمنی متعاقب چالش با پادگن گویچه های سرخ گوسفند(SRBC) با تأکید بر تغییرات احتمالی در مورد دورده  لنفوسیتی Th17 و FoxP3+Treg در مدل موشی می­باشد.

مواد و روشها

در این مطالعه تجربی که به صورت موردی/ شاهدی انجام شده است، جامعه مورد مطالعه، شامل 14 موش ‌نر سوری با محدوده سنی 6 هفته می‌باشد که از حیوان خانه دانشکده دامپزشکی دانشگاه ارومیه تهیه شده بود. این موشها در شرایط استاندارد آب، غذا، دما و نور کافی نگهداری شدند. کلیه مراحل این تحقیق در کمیته اخلاق پژوهشی دانشگاه ارومیه مورد تأیید قرار گرفته است. پس از طی زمان  مورد نظر جهت تطابق موشها (2 هفته)، حیوانات به طور تصادفی در دو گروه به شرح زیر قرار گرفتند:

گروه تیمار: موشهای این گروه در روز شروع آزمایش و یک هفته بعد از آن  به صورت داخل صفاقی تحت تزریق 109×1 گویچه سرخ گوسفند (SRBC) در حجم 1/0 میلی­لیتر قرار گرفتند. همچنین همزمان با آغاز برنامه ایمن سازی، به موشهای این گروه کلسی­تریول (Biomol-آلمان) به میزان μg/Kg 5 در حجم 1/0 میلی­لیتر PBS حاوی 2 درصد DMSO  به صورت یک روز در میان و به شیوه داخل صفاقی تزریق شد. انتخاب دز تزریقی ویتامین در این مطالعه بر اساس مطالعات مشابهی بوده است که از این ویتامین جهت درمان بیماریهای خود ایمن در مدلهای حیوانی استفاده شده است(7).

گروه شاهد: موشهای این گروه مشابه با گروه قبلی تحت چالش با پادگن SRBC قرار گرفتند. از روز شروع ایمونیزاسیون به این موشها به صورت یک روز در میان با 1/0 میلی­لیتر PBS حاوی 2 درصد DMSO  به شیوه داخل صفاقی تزریق شد.

ارزیابی ایمنی هومورال: پنج روز پس از آخرین تزریق، موشها بیهوش شده و اقدام به خون­گیری از قلب آنها شد. سپس تیتر پادتن تولید شده علیه SRBC به شیوه میکروهماگلوتیناسیون تعیین گردید( 15و 38). به طور خلاصه، نمونه­های سرمی به مدت نیم ساعت در بن ماری 56 درجه سانتی گراد به منظور حذف اجزای کمپلمان قرار داده شدند. با استفاده  از محلول PBS حاوی 05/0 درصد سرم آلبومین گاوی از سرم مورد آزمایش رقتهای 1 به 2 در چاهکهای پلیت 96 خانه تهیه شد. سپس 50 میرولیتر از سوسپانسیون 1 درصد، SRBC به هر چاهک افزوده شد به طوری که حجم نهایی موجود در چاهکها به 100 میکرولیتر رسید. پس از شیک پلیتها به مدت 1 دقیقه، به مدت 24 ساعت در 37 درجه سانتی گراد انکوبه شدند. در نهایت آخرین رقتی که موجب آگلوتینه شدن گویچه­های قرمز شد به عنوان تیتر آنتی بادی گزارش گردید.

ارزیابی ایمنی سلولی اختصاصی:  48 ساعت قبل از خون­گیری به کف پای چپ حیوانات 109×1 SRBC در حجم 1/0 میلی­لیتر تزریق شد. همزمان 1/0 میلی­لیتر PBS  به پای راست جانوران تزریق شد. پس از گذشت 48 ساعت و قبل از خون­گیری  ضخامت پای موشها به کمک کولیس (Mauser Dial Caliper-Germany) سنجیده شد میزان ایمنی سلولی طبق رابطه زیر محاسبه گردید(14 و 38):

  = شاخص واکنش ایمنی سلولی

تهیه کشت سلولی طحال: به دنبال خون­گیری از موشها، طحال آنها تحت شرایط استریل خارج و بعد از قطعه قطعه شدن در ml5 محیط کشت RPMI-1640 (شرکتSigma  -آمریکا) حاوی10 درصد،  FBS (شرکتGibco  -آلمان)  له گردید. بافت حاصل جهت تهیه سوسپانسیون سلولی از توری سیمی به قطر 2/0 میلی متر عبور داده شد. پس از سانتریفیوژ به مدت 10 دقیقه در g200، به منظور حذف  RBC ها،  بر روی رسوب سلولی به دست آمده ml5 بافر لیز کننده افزوده شد. بعد از 5 دقیقه ضمن افزودن ml10 محیط کشت بار دیگر به مدت ده دقیقه در g200 سانتریفیوژ شد. سپس رسوب سلولی در محیط کشت RPMI حاوی 10 درصد FBS به حالت سوسپانسون در آورده شد.

سنجش سایتوکاین‌های در سوپ رویی کشت سلولهای طحال: پس از شمارش، سوسپانسیون سلولی به تعداد cell/ml 106 ×2 از آن تهیه شد. این سلولها در پلیتهای کشت 24 خانه در حضور µl50 از محلول فیتوهماگلوتینین (mg/ml 1) (شرکتSigma  -آمریکا)   به مدت 72 ساعت در انکوباتور حاوی 5 درصد CO2  کشت داده شدند. پس از طی این مدت مایع رویی آنها جمع آوری شد. سپس سطح سایتوکاین‌های IFN-γ ، IL-10 و IL-17  با استفاده از کیتهای الایزای مربوطه (شرکت BENDERMED – آلمان) و بر طبق دستورالعمل مندرج در دفترچه راهنمای مورد سنجش قرار گرفت.

سنجش قابلیت انفجار تنفسی در جمعیت سلولهای فاگوسیتیک طحال: سوسپانسیون سلولی به تعداد cell/ml 106 ×2 تهیه شد. این سلولها در پلیتهای کشت 24 خانه به مدت دو ساعت در دمای 37 درجه سانتی­گراد و 5  درصد دی اکسید کربن انکوبه گردید، سپس خانه­ها با محیط کشت هنکس به منظور حذف لنفوسیتها شستشو داده شدند. سلولهای باقی مانده به مدت یک ساعت با مخمر اپسونیزه انکوبه گردید. آنگاه 100 میکرولیتر محلول زیموزان و NBT  (نیترو بلو تترازولیوم) (شرکتSigma  -آمریکا)  به هریک از خانه­ها اضافه گردید و به مدت یک ساعت دیگر انکوبه گردید. در نهایت 400 میکرولیتر N-N دی متیل فورماید به هر یک از خانه­ها اضافه گردید و با سرعت 3000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ گردید. 200 میکرولیتر از مایع رویی از هر یک از خانه­ها را در میکروپلیت 96 خانه­ای ریخته و نتیجه  با الایزا نگار در طول موج nm540 قرائت گردید(13).

بررسی میزان تکثیر سلولهای ایمنی با روش  MTT: پس از طی مراحلی که در بالا توضیح داده شد، به دنبال شمارش سلولها، سوسپانسیونی حاوی cell/ml106 ×2 تهیه شد و  μl100 از آن در هر یک از چاهکهای پلیت 96 خانه­ای ته تخت ریخته شد. برای هر نمونه سه تکرار بدون حضور پادگن و سه تکرار در حضور µl50 از محلول فیتوهماگلوتینین (mg/ml 1) در نظر گرفته شد. به عنوان بلانک نیز در سه چاهک از محیط RPMI خالی استفاده شد. بعد از 72 ساعت گرمخانه گذاری در انکوباتور حاوی 5 درصد CO2 به هر چاهک μl25 محلول MTT (شرکتSigma  -آمریکا)  (mg/ml 5 در PBS) افزوده شده، به مدت 4 ساعت دیگر گرمخانه گذاری گردید. در این مدت احیای ماده MTT (3- (4،5 –دی متیل تیازول 2-ایل)-5،2- دی فنیل تترازولیوم بروماید) توسط سلولهای زنده و در حال تکثیر سبب تشکیل کریستالهای فورمازون گردید که با افزودن 100 میکرولیتر DMSO به حالت محلول در آمد. سپس شدت رنگ در طول موج nm490 تعیین و ایندکس تحریک بر اساس رابطه زیر محاسبه گردید(1)):

  = اندکس تحریک

ارزیابی لنفوسیتهای T کمکی تنظیمی ((FoxP3+Treg: به طور خلاصه، سوسپانسیونی از سلولهای طحالی حاوی 106 ×1 سلول در حجم μl100 تهیه شد. در ابتدا غشای سلولها با بافر تراوا کننده(شرکت eBioscience  - انگلستان) برای ورود پادتنهای ضد FoxP3 (شرکت eBioscience  - انگلستان) به درون سلول، تراوا و تثبیت گردید. آنگاه مارکر داخل سلولی FoxP3 رنگ آمیزی شد. بعد از شستشوی رنگ اضافی، سلولها در حجم مناسبی از بافر رنگ آمیزی فلوسایتومتری (شرکت eBioscience  - انگلستان) به حالت معلق درآورده شده با دستگاه فلوسیتومتری DAKO(شرکت Partec - آلمان) سنجش شد. نتایج حاصل با نرم افزار Cyflogic  (ویراست 1.2.1) مورد آنالیز قرار گرفت.

آنالیز آماری: به منظور مقایسه از آزمون Mann Whitney-U استفاده شد. سطح 05/0>p به عنوان سطح معنی­دار در نظر گرفته شد. تمامی بررسیهای آماری با استفاده از نسخه نوزدهم نرم افزار SPSS انجام شد و برای ترسیم نمودارها از نرم افزار Microsoft  Excel (2010) استفاده شد. همچنین تمامی داده‌ها به  صورت Mean±SD گزارش گردید.

نتایج 

بر اساس نتایج به دست آمده میانگین تیتر پادتن در گروه شاهد در محدوده 18/7±87/28 بود، این در حالی است که در گروه تیمار با افزایش معنی­داری در سطح 23/11±87/201 قرار گرفت(001/0p<). اساس سنجش ایمنی سلولی اختصاصی که در این مطالعه انجام شده است بر مبنای واکنش ازدیاد حساسیت تأخیری (DTH) بود.  همان­طور که در نمودار 1 نشان داده شده است، جانوران تیمار شده با کلسی­تریول به طور معنی­داری یک  کاهش 22/3 برابری را در واکنش DTH نشان دادند.

با استفاده از آزمون احیای NBTتوانایی و ظرفیت لکوسیتها در تولید رادیکالهای آزاد به ویژه آنیون سوپراکسیداز ارزیابی گردید. آنیون سوپراکسیداز تولید شده، ماده رنگی NBT (زرد، شفاف و محلول در آب) را احیاء نموده و به فورمازان آبی نامحلول و رسوب در داخل فاگوسیت تبدیل می­کند. با سنجش میزان فورمازان تولیدی با روش فتومتری، عملکرد انفجار تنفسی فاگوسیتها ارزیابی گردید(13). نتایج حاصل از این آزمون، کاهش قابلیت انفجار تنفسی  مونوسیت/ ماکروفاژ­های طحالی را نشان داد (نمودار 2).

همچنین نتایج آزمون MTT کاهش میزان تکثیر لنفوسیتی در گروه درمانی با کلسی­تریول در مقایسه با گروه شاهد را نشان داد(نمودار 3).

به دنبال تحریک لنفوسیتهای طحالی با فیتوهماگلوتینین در محیط کشت میزان تولید سایتوکاین­های پیش التهابی IFN-γ و IL-17  کاهش داشت و اما سطح سایتوکاین ضد التهابی IL-10 افزایش معنی داری را نشان داد (نمودار4).

بر اساس نتایج حاصل از آنالیز داده­های فلو سیتومتری، سطح لنفوسیتهای T کمکی تنظیمی (FoxP3+ Treg) در گروه تحت درمان نسبت به گروه شاهد افزایش معنی­داری پیدا کرد. در شکل1 چگونگی فرآیند محاسبه سلولهای Treg نشان داده شده است.

 

 

نمودار1- مقایسه میزان التهاب کف پای موشها. (*نشان دهنده اختلاف معنی دار در سطح (001/>p) بین موشهای شاهد و موشهای تیمار می باشد، آزمونMann Whitney-U).

 

نمودار2- مقایسه شدت انفجار تنفسی در بین سلولهای تک هسته ای طحال. (*نشان دهنده اختلاف معنی دار در سطح (001/>p) بین موشهای شاهد و موشهای تیمار می باشد، آزمونMann Whitney-U).


بحث 

کلسی­تریول دارای اثرات متعددی بر سیستم ایمنی بدن می­باشد و گیرنده این هورمون در بسیاری ازسلولهای ایمنی شامل ماکروفاژ، سلولهای دندریتیک، لنفوسیتها و سلولهای  NKبیان می­شود(34). نتایج مطالعه حاضر نشان داد که در کنار مهار سیستم ایمنی سلولی اکتسابی، کلسی­تریول ظرفیت انفجار تنفسی سلولهای ماکروفاژ را به نحو قابل توجهی افزایش می­دهد. در مطالعات قبلی نیز به کاهش قابلیت تکثیر سلولهای T (28 و 30) و همچنین کاهش ظرفیت بیگانه خواری فاگوسیتها (21) به دنبال تیمار با کلسی­تریول اشاره شده است.

 

 

نمودار3- مقایسه تکثیر لنفوسیتهای طحال. (*نشان دهنده اختلاف معنی دار در سطح (05/0>p) بین موشهای شاهد و موشهای تیمار می باشد، آزمونMann Whitney-U).

 

نمودار4. مقاسیه میانگین غلظت  سایتوکاین­ها در سوپ رویی کشت سلولهای طحال  .( **نشان دهنده اختلاف معنی دار در سطح (001/>p) و *نشان دهنده اختلاف معنی دار در سطح (01/0>p) بین موشهای مبتلای درمان نشده (شاهد) و موشهای تحت درمان با کلسی­تریول می­باشد، آزمونMann Whitney-U).

 

 

سلولهای دندریتیک هدف اصلی تنظیم ایمنی به وسیله کلسی­تریول می­باشند؛ کمبود این ویتامین سبب اختلال در بلوغ و تمایز این سلولها شده و بیان MHC-II، مولکولهای کمک تحریکی و سایتوکاین­های التهابی نظیر IL-12 را کاهش می­دهد(2) . کاهش فعال سازی سلولهای دندرتیک در کنار کاهش تولید سایتوکاین پلاریزه کننده سلولهای Th1(IL-12) خود می­تواند توجیه کننده بخشی از اثرات ضد تکثیری و تقویت کننده ایمنی هومورال باشد که در این مطالعه مشاهده شده است. در کارهای پیشین به تغییر پاسخهای سایتوکاینی به سمت Th2 (6 و 30)، سرکوب سلولهای NK (24) و  iNKT (36) به عنوان اثرات تنظیم کنندگی ایمنی کلسی­تریول اشاره شده است  .

 

 

شکل 1- نتایج بررسی میزان لنفوسیتهایT تنظیمی به روش فلوسیتومتری.الف) لنفوسیتها بر روی دات پلات FSC و  SSC گیت شدند.ب)سپس لنفوسیتهای T CD4+ FOXP3+.بر روی گیت لنفوسیتها مورد ارزیابی قرار گرفتند.ج) نشان دهنده نمودار فراوانی سلولهای T CD4+ FOXP3+ در بین دو گروه شاهد و تیمار می­باشد ( * نشان دهنده اختلاف معنی دار در سطح (01/0>p) بین موشهای مبتلای درمان نشده (شاهد) و موشهای تحت درمان با کلسی­تریول می­باشد، آزمونMann Whitney-U).

 


از جمله اثرات دیگری که به دنبال تیمار با کلسی­تریول  در تحقیق حاضر مشاهده شد، مهار پاسخهای ایمنی سلولی بود.  جالب توجه اینکه کمبود کلسی­تریول سبب افزایش خطر ابتلا به باکتریهای درون سلولی نظیر مایکوباکتریوم توبرکیلوسیس می­شود(9). ممکن است که کاهش قابلیت انفجار تنفسی سلولهای بیگانه خوار به دنبال کمبود کلسی­تریول که در این مطالعه مشاهده شد، خود توجیه کننده افزایش حساسیت به عفونتهای درون سلولی باشد. اینترلوکین 17 یک سایتوکاین پیش التهابی قوی بوده که بر روی طیف گسترده‌ای از سلولها از قبیل سلولهای اپیتلیال، اندوتلیال و میلوئید اثر کرده و موجب آزادسازی انواع مدیاتورهای التهابی می‌گردد (17). نتایج تحقیقات کورتن و همکاران (2011) به خوبی ثابت کرده است که سلولهای مولد اینترلوکین 17 (Th17) در سیر پاتوژنز خود ایمنی قبل از Th1 به بافت مهاجرت کرده و با ایجاد شرایط التهابی زمینه ورود سایر سلولها را از جمله سلولهای Th1را  فراهم می‌دارند (5). اینترلوکین 17 آغازگر واکنشهای ایمنی سلولی (DTH) می­باشد (22).

در حالی که سلولهای Th17 نقش اساسی در ایجاد و پیشبرد واکنشهای DTH دارا می‌باشند، سلولهای Th1 مولد IFN-γ در ایجاد ضایعات بافتی موثر می‌باشند (25). القای واسطه‌های فعال اکسیژن و اکسید نیتریک در سلولهای ماکروفاژ به واسطه اینترفرون گاما (شاخص Th1) نقش مهمی را در ایجاد آسیبهایی به واسطه ایمنی سلولی ایفاء می­نماید (31). بررسیهای گذشته نیز نشان دهنده کاهش سطح این سایتوکاین به دنبال تجویز کلسی­تریول بوده است (16).

اینترلوکین 10 نقش اصلی در محدود کردن و ختم پاسخهای التهابی و ممانعت از ایجاد آسیبهای بافتی را بازی می‌نماید. افزایش معنی دار سطح این سایتوکاین به همراه کاهش در سطح سایتوکاین‌های پیش التهابی از جمله عوامل کاهش فعالیت اجزای ایمنی سلولی از جمله ماکروفاژها می­باشد (4 و 32). به طور جالب توجهی، یافته های برخی از محققین از قبیل آکتونک و همکاران (2011) نشان داده است که افزایش سطح IL-10 ممکن است در کنار کاهش سطح IFN-γ موجب کاهش سطح IL-17 نیز می­شود (3).

عامل نسخه برداری FoxP3، عامل اصلی ایجاد عملکرد تنظیمی در لنفوسیتهای کمکی می­باشد (12 و 20). مشابه با نتایج مطالعه حاضر، در مطالعه­ای که اخیراًََ توسط کانگ و همکاران (2012) در شرایط آزمایشگاهی بر روی سلولهای تک هسته­ای خون محیطی انسان صورت گرفته است، گسترش سلولهای FoxP3+Treg به دنبال تیمار با کلسی­تریول گزارش شده است (18 و 20).

نتایج حاضر به خوبی نشان می­دهد که دریافت کلسی­تریول در موشها موجب انحراف پاسخهای ایمنی اختصاصی پادگن از سمت ایمنی سلولی به سمت تقویت ایمنی هومورال بوده است. در کنار این مسئله کاهش تکثیر لنفوسیتی که در گروه درمانی با کلسی­تریول دیده شد، ممکن است که در شرایطی از قبیل بیماریهای خود ایمن به کاهش لنفوسیتهای خود فعال شونده منتهی شود.

بنا بر عقیده نامگونگ و همکاران (1994) مجموعه اثرات کاهش فعالیت در فضای باز، افزایش جمعیت و رژیم غذایی که دارای مقدار کافی کلسی­تریول نمی­باشد، موجب ایجاد یک نوسان بزرگ در میزان کلسی­تریول موجود در میان جمعیتهای مختلف به ویژه در میان جمعیتهایی که فصل زمستان طولانی­تری را می­گذرانند، شده است (26 و 27). با توجه به افزایش معضلات شهرنشینی و وضعیت فرهنگی کشور ایران در کنار افزایش روز افزون گزارشات بیماریهای خود ایمن از قبیل مولتیپل اسکلروز (MS) لازم است که تحقیق جامعی در ارتباط با سطح کلسی­تریول در گروههای مختلف جامعه انجام شده و متناسب با آن اقدام به برنامه­ریزیهای جامع شود. به نحو قابل توجهی دیده شده است که بسیاری از داروهای موثر مورد استفاده در درمان بیماریهای خود ایمن از قبیل اسکلروز متعدد، موجب کاهش سطح IL-17 می­گردند (5). با توجه به کاهش سطح سایتوکاین یاد شده در موشهای گروه تیمار اهمیت مطالعات بیشتر در این زمینه و تلاش برای یافتن آنالوگهای قوی­تر از کلسی­تریول در این زمینه مشخص می­شود.

در مجموع نتایج این تحقیق نشان داد که عمده اثرات ایمونومدولاتوری منتسب به کلسی­تریول  ممکن است که مربوط به کاهش  معنی­دار فعالیت سلولهای Th17، همزمان با القای لنفوسیتهای FoxP3+Treg باشد. با این حال این تحقیق یک مطالعه مقدماتی  بوده و لازم است که در آینده مطالعات عمیق­تری با تأکید بر ارزیابی سایر سایتوکاین­های سیستم ایمنی و همچنین تغییرات بیان ژنهای دخیل در عملکرد و جهت گیری پاسخهای ایمنی صورت پذیرد.

تقدیر و تشکر: نگارندگان از زحمات کارکنان آزمایشگاه ایمنی شناسی دانشکده دامپزشکی دانشگاه ارومیه کمال تقدیر و تشکر را دارند.

1.   Abtahi f, S. M., Delirezh, N., Hobbenaghi, R. and Mosayebi, G. (2014). Synergistic effects of atorvastatin and all-trans retinoic acid in ameliorating animal model of multiple sclerosis. Immunol Invest 43(1):54-68.

2.   Adorinl, L., penna, G., giarratana, N., roncari, A., amuchastegui, S., Daniel, K. C. and Uskokovic, M. (2004). Dendritic cells as key targets for immunomodulation by Vitamin D receptor ligands. J Steroid Biochem Mol Biol 89-90, 437-41.

3.   Aktunc, E., kayhan, B., Arasli, M., Gun, B. D. and Barut, F. (2011). The effect of atorvastatin and its role on systemic cytokine network in treatment of acute experimental colitis. Immunopharm. Immunot 33, 667-75.

4.   Asadullah, K., Sterry, W. and Volk, H. D. (2003). Interleukin-10 therapy--review of a new approach. Pharmacol Rev 55, 241-69.

5.   BalasaA, R. (2010). T helper 17 cells in multiple scelerosis  and experimental autoimmune encephalomyelitis. Ro J Neurol 181-188.

6.   Boonstra, A., Barrat, F. J., Crain, C., Heath, V. L., Savelkoul, H. F. and Ogarra, A. (2001).1alpha,25-Dihydroxyvitamin d3 has a direct effect on naive CD4(+) T cells to enhance the development of Th2 cells. J Immunol 167, 4974-80.

7.   Branisteanu, D. D., Waer, M., Sobis, H., Marcelis, S., Vandeputte, M. and Bouillon, R. (1995). Prevention of murine experimental allergic encephalomyelitis: cooperative effects of cyclosporine and 1 alpha, 25-(OH)2D3. J Neuroimmunol 61, 151-60.

8.   Cantorna, M. T. (2010). Mechanisms underlying the effect of vitamin D on the immune system. Proc Nutr Soc 69, 286-9.

9.   Chan, T. Y. (2000). Vitamin D deficiency and susceptibility to tuberculosis. Calcif Tissue Int 66, 476-8.

10. El-behi, M., Rostami, A. and Ciric, B. (2010). Current views on the roles of Th1 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmune Pharmacol 5, 189-97.

11. Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., TUBRIDY, N. and MILLS, K. H. (2010). T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Exp Immunol 162, 1-11.

12. Gavin, M. A., Torgerson, T. R., Houston, E., Deroos, P., Ho, W. Y., Stray-Pedersen, A., Ocheltree, E. L., Greenberg, P. D., Ochs, H. D. and Rudensky, A. Y. (2006). Single-cell analysis of normal and FOXP3-mutant human T cells: FOXP3 expression without regulatory T cell development. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 6659-64.

13. Haq, A., Lobo, P. I., Al-Tufail, M., Rama, N. R. and Al-Sedairy, S. T. (1999). Immunomodulatory effect of Nigella sativa proteins fractionated by ion exchange chromatography. Int J Immunopharmacol 21, 283-95.

14. Hassan, Z. M. and Ebtekar, M. (2001). Modeling for immunosuppression by sulfur mustard. Int Immunopharmacol 1, 605-10.

15. Hassan, Z. M. and Ebtekar, M. (2002). Immunological consequence of sulfur mustard exposure. Immunol Lett 83, 151-2.

16. Helming, L., Bose, J., Ehrchen, J., Schiebe, S., Frahm, T., Geffers, R., Probst-KEPPER, M., BALLING, R. and LENGELING, A. (2005). 1alpha,25-Dihydroxyvitamin D3 is a potent suppressor of interferon gamma-mediated macrophage activation. Blood 106, 4351-8.

17. Jadidi-Niaragh, F. and Mirshafiey, A. (2011). Th17 cell, the new player of neuroinflammatory process in multiple sclerosis. Scand J Immunol 74, 1-13.

18. Jager, A., Dardalhon, V., Sobel, R. A., Bettelli, E. and Kuchroo, V. K. (2009). Th1, Th17, and Th9 effector cells induce experimental autoimmune encephalomyelitis with different pathological phenotypes. J Immunol 183, 7169-77.

19. Jager, A. and Kuchroo, V. K. (2010). Effector and regulatory T-cell subsets in autoimmunity and tissue inflammation. Scand J Immunol 72, 173-84.

20. Kang, S. W., Kim, S. H., Lee, N., Lee, W. W., Hwang, K. A., Shin, M. S., Lee, S. H., Kim, W. U. and Kang, I. (2012). 1,25-Dihyroxyvitamin D3 promotes FOXP3 expression via binding to vitamin D response elements in its conserved noncoding sequence region. J Immunol. 188, 5276-82.

21. Kankova, M., Luini, W., Pedrazzoni, M., Riganti, F., Sironi, M., Bottazzi, B., Mantovani, A. and Vecchi, A. (1991). Impairment of cytokine production in mice fed a vitamin D3-deficient diet. The JI 73, 466-71.

22. Kuerten, S. and Lehmann, P. V. (2011). The immune pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis: lessons learned for multiple sclerosis? J Interferon Cytokine Res 31, 907-16.

23. Lees, J. R., Iwakura, Y. and Russell, J. H. (2008). Host T cells are the main producers of IL-17 within the central nervous system during initiation of experimental autoimmune encephalomyelitis induced by adoptive transfer of Th1 cell lines. J Immunol 180, 8066-72.

24. Merino, F., Alvarez-Mon, M., De la hera, A., Ales, J. E., Bonilla, F. and Durantez, A. (1989). Regulation of natural killer cytotoxicity by 1,25-dihydroxyvitamin D3. Cell Immunol 118, 328-36.

25. Murdaca, G., Colombo, B. M. and Puppo, F. (2011). The role of Th17 lymphocytes in the autoimmune and chronic inflammatory diseases. Intern Emerg Med 6, 487-95.

26. Namgung, R., Mimouni, F., Campaigne, B. N., Ho, M. L. and Tsang, R. C. (1992). Low bone mineral content in summer-born compared with winter-born infants. J Pediatr Gastroenterol Nutr 15, 285-8.

27. Namgung, R., Tsang, R. C., Specker, B. L., Sierra, R. I. and Ho, M. L. (1994). Low bone mineral content and high serum osteocalcin and 1,25-dihydroxyvitamin D in summer- versus winter-born newborn infants: an early fetal effect? J Pediatr Gastroenterol Nutr 19, 220-7.

28. Nunn, J. D., Katz, D. R., BarkerR, S., Fraher, L. J., Hewison, M., Hendy, G. N. and Oriordan, J. L. (1986). Regulation of human tonsillar T-cell proliferation by the active metabolite of vitamin D3. The JI 59, 479-84.

29. Oconnor, R. A., Taams, L. S. and Anderton, S. M. (2010). Translational mini-review series on Th17 cells: CD4 T helper cells: functional plasticity and differential sensitivity to regulatory T cell-mediated regulation. Clin Exp Immunol 159, 137-47.

30. Penna, G. and Adorini, L. (2000). 1 Alpha,25-dihydroxyvitamin D3 inhibits differentiation, maturation, activation, and survival of dendritic cells leading to impaired alloreactive T cell activation. J Immunol 164, 2405-11.

31. Petro, T. M. (2011). Regulatory role of resveratrol on Th17 in autoimmune disease. Int Immuno pharmacol 11, 310-8.

32. Saraiva, M. and Ogarra, A. (2010). The regulation of IL-10 production by immune cells. Nat Rev Immunol 10, 170-81.

33. Smyk, D. S., Orfanidou, T., Invernizzi, P., Bogdanos, D. P. and Lenzi, M. (2013). Vitamin D in autoimmune liver disease. Clin Res Hepatol Gastroenterol.

34. Van Etten, E. and Mathieu, C. (2005). Immunoregulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3: basic concepts. J Steroid Biochem Mol Biol 97, 93-101.

35. Yang, C. Y., Leung, P. S., Adamopoulos, I. E. and Gershwin, M. E. (2013). The Implication of Vitamin D and Autoimmunity: a Comprehensive Review. Clin Rev Allergy Immunol.

36. Yu, S. and Cantorna, M. T. (2008). The vitamin D receptor is required for iNKT cell development. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 5207-12.

37. Zella, J. B. and Deluca, H. F. (2003). Vitamin D and autoimmune diabetes. J Cell Biochem 88, 216-22.

38. Zimecki, M. and Wieczorek, Z. (2001). Differential patterns of cyclosporine A-induced inhibition of humoral and cellular immune responses to sheep erythrocytes in mice. Pol J Pharmacol 53, 495-500.