نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری ایران

2 استادیار گروه بیوتکنولوژی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری ایران

3 استاد گروه خاکشناسی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهرکرد

4 استاد گروه اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهرکرد

5 دانشجوی دکتری گروه بیوتکنولوژی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری ایران

چکیده

تنش های غیر زیستی بازدهی گیاه پالایی را به عنوان فن آوری سازگار با محیط زیست و مقرون به صرفه در پالایش آلودگیﻫﺎی خاک کاهش ﻣﻲدهد. هدف از این تحقیق بررسی اثر تنش آلودگی نفتی و مسن خاک (10%وزنی: غلظت کل هیدروکربن های نفتی) طی فرایند گیاه پالایی بر دو گونه گراس (جو دوسر وحشی و جو زراعی) بود. به علاوه اثر تلقیح ریزوباکتریﻫﺎی تجزیه کننده نفت بر تحریک رشد و کاهش سمیت آلاینده های نفتی در خاک آلوده مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج آلودگی نفتی خاک در هر دو گیاه باعث کاهش شاخصﻫﺎی رشد، رنگیزهﻫﺎی فتوسنتزی و افزایش مقدار پراکسید هیدروژن (H2O2)، MDA (مالونﺩﻯآلدهید) و آنتیﺍکسیدانﻫﺎی آنزیمی (کاتالاز و پراکسیداز) و همچنین افزایش نسخهﻫﺎی ژنﻫﺎی NCDE و COR2 شد که بیانگر بروز تنش اکسیداتیو در اثر آلودگی نفتی، مشابه با دیگر تنشﻫﺎی غیر زنده متداول بود. افزایش نسبت کلرفیل a/b و کاهش شدیدتر وزن خشک اندام هوایی در جو دوسر وحشی نسبت به جو زراعی نشان داد جو زراعی در برابر تنش آلودگی نفتی خاک متحمل تر بود. تلقیح باکتریایی باعث کاهش سمیت نفت خام و بهبود رشد گیاه به خصوص در جو دوسر وحشی گردید.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Effects of soil petroleum contamination on some physiological and molecular properties of plant

نویسنده [English]

  • Saeideh Rajaei 1

1 National Institute for Genetic Engineering and Biotechnology (Iran).

چکیده [English]

Phytoremediation efficiency -a cost effective and environmentally sound technology to clean up contaminated soil - is reduced considering abiotic stresses. The research objective was to determine the effects of aged petroleum contaminated soil (10% W/W: Total petroleum Hydrocarbons) on two grasses specious (wild oat and barley) during the phytoremediation process. In addition the effects of petroleum degrading rhizobacteria inoculation were evaluated on plant growth promotion and decreasing toxicity of petroleum hydrocarbons. Results demonstrated that petroleum contaminated soil reduced growth, photosynthetic pigments and increased hydrogen peroxide (H2O2), MDA (malondialdehyde), enzymatic antioxidants (catalase and peroxidase) and NCDE and COR2 gene transcripts that indicate oxidative stress happened because of petroleum pollution similar to other common abiotic stress. a/b chlorophyll ratio enhancement and more decrease in shoot dry weight in wild oat showed barley was more tolerate to petroleum pollution. Bacterial inoculation reduced petroleum contamination toxicity and improved plant growth especially in wild oat.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Phytoremediation
  • Petroleum Contamination Stress
  • Barley
  • Wild Oat

اثر آلودگی نفتی خاک بر برخی ویژگیهای فیزیولوژیکی و مولکولی گیاه 

سعیده رجایی1*، سید مهدی سیدی2، فایز رئیسی3، بهروز شیران3و مریم معظم جزی2 

1 تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، پژوهشکده صنعت و محیط زیست

2 تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، پژوهشکده بیوتکنولوژی گیاهی 

3 شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، دانشکده کشاورزی

تاریخ دریافت: 6/2/92                  تاریخ پذیرش: 1/11/92

چکیده

تنشهای غیر زیستی بازدهی گیاه پالایی را به عنوان فناوری سازگار با محیط زیست و مقرون به صرفه در پالایش آلودگیهای خاک کاهش ﻣﻲدهد. هدف از این تحقیق بررسی اثر تنش آلودگی نفتی و مسن خاک (10 درصد وزنی: غلظت کل هیدروکربنهای نفتی) طی فرآیند گیاه پالایی بر دو گونه گراس (جو دوسر وحشی و جو زراعی) بود. به علاوه اثر تلقیح ریزوباکتریهای تجزیه کننده نفت بر تحریک رشد و کاهش سمیت آلاینده های نفتی در خاک آلوده مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج، آلودگی نفتی خاک در هر دو گیاه باعث کاهش شاخصهای رشد، رنگیزهﻫﺎی فتوسنتزی و افزایش مقدار پراکسید هیدروژن (H2O2)، MDA (مالونﺩﻯآلدهید) و آنتیﺍکسیدانهای آنزیمی (کاتالاز و پراکسیداز) و همچنین افزایش نسخهﻫﺎی ژنهای NCDE و COR2 شد که بیانگر بروز تنش اکسیداتیو در اثر آلودگی نفتی، مشابه با دیگر تنشهای غیر زنده متداول بود. افزایش نسبت کلروفیل a/b و کاهش شدیدتر وزن خشک اندام هوایی در جو دوسر وحشی نسبت به جو زراعی نشان داد جو زراعی در برابر تنش آلودگی نفتی خاک متحمل تر است. تلقیح باکتریایی باعث کاهش سمیت نفت خام و بهبود رشد گیاه به خصوص در جو دوسر وحشی گردید. 

واژهﻫﺎی کلیدی: گیاه پالایی، تنش آلودگی نفتی، جو زراعی و جو دوسر وحشی

* نویسنده مسئول، تلفن: 44787305 ، پست الکترونیکی: rajaee.sd@gmail.com

مقدمه


گیاه پالایی فناوری استفاده از گیاهان برای پاکسازی خاکهای آلوده و یا آب ﻣﻲباشد. شرط اصلی برای پالایش آلودگی خاک توسط گیاهان توانایی گیاه برای تحمل و رشد تحت شرایط آلوده ﻣﻲﺑﺎﺷﺪ (37). بیشتر ترکیبات نفتی برای گیاه سمی بوده و باعث کاهش رشد، نمو و بروز تنش در گیاه مىﮔﺮدد. گیاهانی که کمتر تحت تأثیر سمیت آلایندهﻫﺎ قرار ﻣﻲگیرند در چنین شرایطی سالمﺗﺮ و مقاومﺗﺮ هستند و با ایجاد سیستم ریشه ای مناسب، رشد و گسترش بیشتری خواهند داشت لذا عملکرد پالایشی سیستم را افزایش ﻣﻲدهند (44). گیاﻫﺎن مختلف پاسخهای یکسانی در برابر آلودگی نفتی از خود نشان نمی­دهند و سطوح واکنش پذیری و تحمل آنها متفاوت ﻣﻲﺑﺎﺷﺪ (37). گیاهان زراعی مانند ذرت، گندم، یولاف، آفتاب گردان، هویج، کلزا و سویا نسبت به آلودگی نفت خام تا حدی مقاوم گزارش شده­اند اما این مقاومت از واریتهﺍی به واریته دیگر متفاوت ﻣﻲباشد (24). اطلاعات موجود در زمینه فیزیولوژی، بیولوژی مولکولی و بیوشیمی تنش هیدروکربنهای نفتی بر گیاه بسیار محدود است. به هر حال بسیاری از مسیرهای ترارسانی علائم در پاسخ به تنشهای زیستی و حتی غیر زیستی مشترک ﻣﻲباشد. پاسخهای اولیه گیاه به تنشهای خشکی، شوری و سرما (به استثنای جزء یونی در شوری) بسیار مشابه ﻣﻲباشد (16). در این شرایط انباشتگی اسمولیتﻫﺎی سازگار، فعالیت سیستمهای آنتی­اکسیدانی و همچنین افزایش غلظت هورمون ABA و تغییر بیان ژنها از مسیرهای وابسته به ABA و مستقل از آن به حفاظت سلولهای گیاهی در برابر اثرات مخرب تنش کمک ﻣﻲکند (2، 3 و 8). برخی از محققین معتقدند همانند سایر تنشهای زیستی، نفت و هیدروکربنهای نفتی تشکیل گونهﻫﺎی اکسیژن فعال مانند سوپر­اکسید، پراکسید­هیدروژن و هیدروکسیل (ROS) را در سلولهای گیاهی تحت این تنش القاء مىﻧﻤﺎیند (2 و 37). علاوه بر شاخص رشد گیاه که عموماً بازگو کننده پاسخ گیاه به تنش ﻣﻲباشد، شاخصهای فیزیولوژیکی دیگر مانند تغییرات میزان انواع متابولیتهای سلولی شامل انواع رنگیزهﻫﺎی فتوسنتزی و غیره ممکن است در برآورد اثر و شدت تنش نفتی مفید باشند. به عنوان مثال Alkio و همکاران مشاهده نمودند که فنانترن ﻣﻲتواند وارد سلول آرابیدوپسیس شده و تولید H2O2 را افزایش دهد که باعث بروز تنش اکسیداتیو و در نهایت مرگ سلول می شود به علاوه در این شرایط بیان ژن PR1 که یک ژن پاﺳﺦگر به تنش زیستی پاتوژنی ﻣﻲباشد، در چنین شرایطی افزایش پیدا می کند (7) با این وجود اطلاعات کامل­تری در این زمینه وجود ندارد لذا به منظور شناخت پاسخ گیاهان به آلودگی طولانی مدت نفت خام پژوهش حاضر انجام گرفت. این مطالعه بخشی از یک پروژه گیاه پالایی با استفاده از یک گونه جو دوسر وحشی و یک گونه جو زراعی بود. در طول فصل رشد گیاه اثر آلودگی نفت خام بر رشد، پاسخهای فیزیولوژیک و مولکولی دو گیاه منتخب برای گیاه پالایی بررسی گردید. از آنجایی که در برخی تیمارها تلقیح باکتریایی با ریزوباکتریهای تجزیه­کننده هیدروکربنهای نفتی صورت گرفته بود، اثر این باکتریها بر رشد گیاه در خاک آلوده همچنین مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

تهیه خاک: خاک آلوده به نفت خام (Silty clay loam) با سابقه طولانی مدت آلودگی (10 درصد وزنی TPH) از میدان نفتی مارون واقع در استان خوزستان جمع آوری گردید (جدول 1). به منظور تیمار شاهد (غیر آلوده)، خاکی با خصوصیات به نسبت مشابه اما غیر آلوده از نزدیکی ناحیه آلوده جمع آوری گردید.


جدول 1 - برخی خصوصیات شیمیایی خاکهای مورد استفاده در آزمون گلخانه

شاخص

خاک غیر آلوده

خاک آلوده

فسفر قابل جذب (mg kg-1 soil)

89

103

نیتروژن (%)

02/0

10/0

پتاسیم (mg kg-1 soil)

111

127

pH در عصاره 5/1:2

4/7

01/7

EC (dSm-1) در عصاره 5/1:2

21/1

45/1

مواد آلی (%)

10/0

-


تهیه مایه تلقیح: برای تهیه مایه تلقیح از باکتریهای تجزیه کننده نفت خام استفاده شد. این جدایهﻫﺎ شامل Acinetobacter، Pseudomonas، Enterobacter، Stenotrophomonas، Bacillus، Achromobacter، Paenibacillus، Microbacterium و Curtobacterium بودند که از بانک پروکاریوتی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری تهیه شدند. همچنین جهت تلقیح بذرها از جدایه های Enterobacter، Stenotrophomonas، Paenibacillus، Microbacterium و Curtobacterium سوسپانسیون تهیه و بذور با آن تلقیح گردید (1، 17 و 38).

کشت گلخانه و سنجش شاخصهای فیزیولوژیکی در گیاه: آزمایش گلخانه به صورت فاکتوریل (2×2) برای دو گیاه جو دوسر وحشی (Avena fatua L.) و جو زراعی (Hordeum vulgare L. variety Afzal) به­طور جداگانه در قالب طرح کاملاً تصادفی انجام گرفت. فاکتور اول شامل آلودگی خاک (آلوده (PS) و غیر آلوده (NPS)) و فاکتور دوم شامل تلقیح باکتریایی (تلقیح شده و تلقیح نشده) بود. به منظور بررسی اثر تنش آلودگی نفتی بر گیاه برخی از مهم ترین شاخصهای فیزیولوژیکی شامل میزان کلروفیل و کاروتنوئید (عصاره گیری با استون و قرائت جذب در طول موجهای مربوطه توسط اسپکتروفوتومتر) (23)، آنتوسیانین (عصاره گیری با متانول اسیدی) (14)، MDA (واکنش عصاره برگ با تیوبایبیتوریک اسید) (12)، پرولین (عصاره گیری با سولفوسالیسیلیک اسید و تولوئن) (28)، هیدروژن پراکسید (عصاره گیری با تری کلرواستیک اسید) (27) و فعالیت آنزیم کاتالاز (اندازه گیری تغییرات جذب عصاره آنزیمی برگ در حضور آب اکسیژنه) (5) و پراکسیداز (تغییرات جذب عصاره آنزیمی برگ در حضور متانول و آب اکسیژنه) (4) در گیاهان 28 روزه رشد یافته تحت شرایط تنش مورد بررسی قرار گرفت. پس از گذشت 4 ماه از رشد گیاه شاخصهای رشد مانند وزن خشک ریشه (R) و بخش هوایی (S)، ارتفاع نهایی بوتهﻫﺎ و سطح برگ اندازه گیری گردید.

مطالعه الگوی بیان ژنهای پاسخ­گر به تنش با استفاده از واکنش RT-PCR: از گیاهان تحت تنش و شاهد (در مرحله دو برگی) RNA کل استخراج و با استفاده از آنزیم Reverse transcriptase (ONE-STEP RT-PCR-Roche)، cDNA سنتز شد و بیان (مقدار نسخهﻫﺎی mRNA) ژن مورد نظر با استفاده از آغازگرهای اختصاصی این ژنها (جدول 2) بررسی گردید. شدت باندهای آشکارشده با نرم افزار Total Lab کمی گردید. اثر نوع گیاه و آلودگی نفتی خاک بر میزان نسبی نسخهﻫﺎی ژنهای مرتبط که در هر دو گیاه بیان شده بودند به صورت آزمایش فاکتوریل (2×2) و در قالب  طرح  کاملاً  تصادفی

بررسی گردید (39 و 41).

تجزیه و تحلیل آماری: نرمال بودن دادهﻫﺎ با آزمون Ryan-Joiner (5 درصد) و همگن بودن واریانسها با آزمون Levene (5 درصد) بررسی شد. دادهﻫﺎ با نرم افزار SigmaStat 3.5 به روش General Linear Model تجزیه و تحلیل و جدول تجزیه واریانس برای مطالعه اثرات ساده و اثرات متقابل رسم و مقایسه میانگینها به روش Fisher LSD0.05 انجام گرفت.

نتایج

شاخصهای رشد گیاه: ارتفاع جو دوسر و جو زراعی تلقیح نشده در خاک آلوده به ترتیب حدود 45 و 47 درصد نسبت به خاک غیر آلوده کاهش یافت. در شرایط تلقیح این کاهش به ترتیب 31 و 33 درصد بود (جدول 3 و 4). بر اثر آلودگی نفتی وزن خشک اندام هوایی جو دوسر و جو زراعی به ترتیب 51 و 50 درصد کاهش پیدا کرد و بر اثر تلقیح، وزن خشک اندام هوایی جو دوسر 25 درصد نسبت به خاک آلوده تلقیح نشده بیشتر بود. در خاک آلوده وزن خشک ریشه جو دوسر 68 درصد کاهش یافت و در شرایط تلقیح شده این کاهش به اندازه 40 درصد بود. در خاک آلوده نسبت R/S در گیاه تلقیح شده 40 درصد بیشتر از گیاه تلقیح نشده بود.

بیشتر بودن شاخصهای نسبی رشد گیاه (خاک آلوده به خاک غیر آلوده، شکل 1 چپ) نشان دهنده رشد بهتر در شرایط تنش ﻣﻲﺑﺎﺷﺪ. در شرایط تلقیح نشده میزان کاهش وزن خشک هوایی جو دوسر بر اثر تنش نفتی بیشتر از جو زراعی بود که نشان دهنده حساسیت بالاتر جو دوسر به این نوع تنش است.

شاخصهای نسبی رشد گیاه در خاک آلوده (شکل 1، راست) با تقسیم پارامترهای اندازه­گیری شده گیاه تلقیح شده در خاک آلوده به مقادیر همان پارامترها اما تلقیح نشده به دست آمد. افزایش این نسبت نشانه پاسخ بهتر گیاه به تلقیح ﻣﻲﺑﺎﺷﺪ. اما فقط نسبت وزن خشک بخش هوایی بین دو گیاه ﻣﻌﻨﻲدار گردید که نشان ﻣﻲدهد پاسخ جو دوسر به افزودن مایه تلقیح بهتر از جو زراعی ﻣﻲﺑﺎﺷﺪ.


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 1- چپ: شاخصهای نسبی رشد در خاک آلوده و غیر آلوده در عدم حضور مایه تلقیح و در حضور مایه تلقیح، راست: اختلاف شاخصهای نسبی رشد جو دوسر و جو زراعی کشت شده در خاک آلوده، محور Y: میانگین نسبتها (5=n) و خطوط عمودی روی ستونها: انحراف استاندارد، *و**: اختلاف معنیﺩﺍﺭ به ترتیب در سطح 1/0و 05/0، ns: غیر معنیﺩﺍﺭ (آزمون t-test).

 

جدول 2 - آغازگرهای اختصاصی واکنش RT-PCR

نام

هدف

منبع

18S

House keeping (همواره بیان ﻣﻲشوند)

(39)

KIN2

Cold inducible (پاسخ به تنشهای غیرزیستی مانند خشکی شوری و سرما)

(41)

RD22

پاسخ به دهیدراسیون (افزایش تحمل تنش خشکی و شوری)

COR15

Cold regulated (پاسخ به تنشهای غیرزیستی)

MYB60

تنظیم منافذ روزنه در پاسخ به تنشهای محیطی

P5CS

پیرولین ٥ کربوکسیلات سنتاز (بیوسنتز پرولین)

ABI1

(سرین/ترئونین پروتئین فسفاتاز) ترارسانی علامت ABA

NCED3

9 سیس اپوکسی کارتنوئید دی اکسیژناز در مسیر بیوسنتز ABA

 


متابولیتها: در خاک آلوده مقدار کلروفیل a، b و کلروفیل کل گیاه به­طور معنیﺩار کاهش یافت. مقدار کلروفیل b جو دوسر با تلقیح باکتریایی در خاک آلوده افزایش یافت. نسبت کلروفیل a/b جو دوسر کشت شده در خاک آلوده بیشتر از خاک غیر آلوده بود اما با تلقیح باکتریایی این نسبت در جو دوسر خاک آلوده و غیر آلوده تفاوت معنیﺩار نداشت (جدول های 5 و 7). میزان کاروتنوئیدها در جو دوسر و جو زراعی خاک آلوده به طور معنیﺩﺍﺭ کمتر از خاک غیر آلوده بود (جدول های 5 و 7). تلقیح باکتریایی در خاک آلوده باعث افزایش معنیﺩﺍﺭ کاروتنوئیدها در جو دوسر و جو زراعی گردید. بر اثر آلودگی نفتی میزان آنتوسیانین جو زراعی افزایش پیدا کرد (جدول های 5 و 7). مقدار پرولین جو دوسر در پاسخ به آلودگی نفتی به طور ﻣﻌﻨﻲدار افزایش یافت و تلقیح باکتریایی آن را کاهش داد. آلودگی نفتی باعث افزایش معنی دار غلظت MDA گردید و تیمار باکتری موجب کاهش معنیﺩار  MDA در جو زراعی گردید (06/0≥P). اثر اصلی نوع خاک بر فعالیت آنزیمهای کاتالاز و پراکسیداز جو دوسر و جو زراعی معنیﺩﺍﺭ شد. بر اثر آلودگی نفتی میزان هیدروژن پراکسید در هر دو گیاه به طور معنیﺩﺍﺭ افزایش یافت (جدول های 6 و 8).


 

 

 

جدول 3 - اثر آلودگی نفتی خاک و تلقیح باکتریایی بر شاخصهای رشد جو دوسر

R/S

وزن خشک ریشه

وزن خشک شاخه

سطح برگ

ارتفاع بوته

تیمار

(mg plant-1)

(cm2)

(cm)

 

 

 

 

 

بدون تلقیح

 020/0±10/0

  A02/0±22/0

  2/0±1/2

 9/5±8/118

  A1/4±4/63

NPS

007/0±09/0

  C01/0±07/0

 2/0±83/0

   5/7±8/61

  C1/3±6/34

PS

 

 

 

 

 

تلقیح باکتری

015/0±11/0

  A02/0±25/0

3/0±30/2

 9/9±7/118

  A6/3±4/63

NPS

009/0±11/0

  B01/0±15/0

2/0±36/1

   9/8±1/72

  B7/2±8/43

PS

-

0219/0

2338/0

79/7

3/3

LSD0.05 (اثرات اصلی)

-

031/0

-

-

67/4

LSD0.05 (خاک× باکتری)

   اعداد در هر ستون میانگین هر تیمار (5n=) به همراه انحراف استاندارد می باشند.

   در هر ستون حروف مشابه کنار میانگینها به معنی عدم وجود اختلاف ﻣﻌﻨﻲدار بین تیمارها در سطح احتمال 5 درصد ﻣﻲﺑﺎﺷﺪ.

   PS: خاک آلوده، NPS: خاک غیر آلوده.

 

 

 

جدول 4 - اثر آلودگی نفتی خاک و تلقیح باکتریایی بر شاخصهای رشد جو زراعی

R/S

وزن خشک ریشه

وزن خشک شاخه

سطح برگ

ارتفاع بوته

تیمار

(mg plant-1)

(cm2)

(cm)

 

 

 

 

بدون تلقیح

B003/0±046/0

  01/0±140/0

  18/0±02/3

  8/10±136

  A6/5±0/63

NPS

B007/0±040/0

  02/0±060/0

  35/0±50/1

 9/9±74

 C8/3±4/33

PS

 

 

 

 

 

تلقیح باکتری

AB001/0±049/0

  02/0±150/0

  21/0±10/3

   4/9±136

 A3/3±4/63

NPS

A001/0±056/0

  02/0±095/0

  25/0±70/1

 2/8±83

  B6/3±6/42

PS

0065/0

0169/0

2498/0

18/9

99/3

LSD0.05 (اثرات اصلی)

0092/0

-

-

-

60/5

LSD0.05 (خاک× باکتری)

   اعداد در هر ستون میانگین هر تیمار (5n=) به همراه انحراف استاندارد می باشند.

   در هر ستون حروف مشابه کنار میانگینها به معنی عدم وجود اختلاف ﻣﻌﻨﻲدار بین تیمارها در سطح احتمال 5 درصد ﻣﻲﺑﺎﺷﺪ.

   PS: خاک آلوده، NPS: خاک غیر آلوده.

جدول 5 - اثر آلودگی نفتی خاک و تلقیح باکتریایی بر شاخصهای متابولیتی جو دوسر

آنتوسیانین

کاروتنوئید

کلروفیل a/b

کلروفیل کل

کلروفیل b

کلروفیل a

تیمار

 

 

 

 

 

 

بدون تلقیح

 003/0±10/0

 A00/0±110/0

  B05/0±71/1

53/0±28/7

18/0±67/2

36/0±60/4

NPS

 007/0±10/0

 C00/0±059/0

  A16/0±04/2

61/0±53/5

28/0±82/1

12/0±71/3

PS

 

 

 

 

 

 

تلقیح باکتری

005/0±10/0

A 01/0±113/0

  B05/0±65/1

38/0±38/7

09/0±75/2

29/0±06/4

NPS

007/0±10/0

 B00/0±078/0

  B10/0±75/1

61/0±23/6

28/0±27/2

33/0±96/3

PS

-

-

-

5183/0

2142/0

3235/0

LSD0.05 (اثرات اصلی)

-

0117/0

149/0

-

-

-

LSD0.05 (خاک × باکتری)

   اعداد در هر ستون میانگین هر تیمار (5n=) به همراه انحراف استاندارد می باشند،  PS: خاک آلوده، NPS: خاک غیر آلوده

   در هر ستون حروف مشابه کنار میانگینها به معنی عدم وجود اختلاف ﻣﻌﻨﻲدار بین تیمارها در سطح احتمال 5 درصد ﻣﻲﺑﺎﺷﺪ.

   واحد اندازه گیری: mg g-1 dry weight

جدول 6 - اثر آلودگی نفتی خاک و تلقیح باکتریایی بر شاخصهای متابولیتی جو دوسر

پراکسیداز

کاتالاز

H2O2

MDA

پرولین

تیمار

 (ΔA min -1 mg-1 protein)

(mg g-1 dry weight)

 

 

 

 

 

بدون تلقیح

39/0±10/3

01/0±17/0

002/0±035/0

007/0±058/0

29/0±49/2

NPS

18/0±77/3

03/0±29/0

005/0±047/0

008/0±088/0

13/0±64/3

PS

 

 

 

 

 

تلقیح باکتری

28/0±12/3

02/0±16/0

001/0±036/0

002/0±058/0

15/0±41/2

NPS

25/0±74/3

03/0±29/0

002/0±045/0

004/0±089/0

19/0±35/3

PS

0064/0

0284/0

0033/0

0059/0

1929/0

LSD0.05 (اثرات اصلی)

-

-

-

-

-

LSD0.05 (خاک × باکتری)

   اعداد در هر ستون میانگین هر تیمار (5n=) به همراه انحراف استاندارد می باشند، PS: خاک آلوده، NPS: خاک غیر آلوده.

   در هر ستون حروف مشابه کنار میانگینها به معنی عدم وجود اختلاف ﻣﻌﻨﻲدار بین تیمارها در سطح احتمال 5 درصد ﻣﻲﺑﺎﺷﺪ.

جدول 7 - اثر آلودگی نفتی خاک و تلقیح باکتریایی بر شاخصهای متابولیتی جو زراعی

آنتوسیانین

کاروتنوئید

کلروفیل a/b

کلروفیل کل

کلروفیل b

کلروفیل a

تیمار

 

 

 

 

 

بدون تلقیح

 002/0±08/0

A004/0±045/0

 17/0±61/2

 31/0±17/6

11/0±71/1

24/0±46/4

NPS

 005/0±10/0

B006/0±030/0

 63/0±81/2

 21/0±90/4

25 /0±31/1

21/0±58/3

PS

 

 

 

 

 

 

تلقیح باکتری

 003/0±08/0

A007/0±045/0

 20/0±68/2

 38/0±21/6

17/0±69/1

23/0±52/4

NPS

 004/0±10/0

A003/0±041/0

 46/0±65/2

 33/0±10/5

12/0±40/1

37/0±69/3

PS

004/0

-

-

3045/0

1692/0

2595/0

LSD0.05 (اثرات اصلی)

-

0094/0

-

-

-

-

LSD0.05 (خاک × باکتری)

   اعداد در هر ستون میانگین هر تیمار (5n=) به همراه انحراف استاندارد می باشند، PS: خاک آلوده، NPS: خاک غیر آلوده

   در هر ستون حروف مشابه کنار میانگینها به معنی عدم وجود اختلاف ﻣﻌﻨﻲدار بین تیمارها در سطح احتمال 5 درصد ﻣﻲﺑﺎﺷﺪ.

   واحد اندازه گیری: mg g-1 dry weight

جدول 8 - اثر آلودگی نفتی خاک و تلقیح باکتریایی بر شاخصهای متابولیتی جو زراعی

پراکسیداز

کاتالاز

H2O2

MDA

پرولین

تیمار

(ΔA min -1 mg-1 protein)

(mg g-1 dry weight)

 

 

 

 

 

بدون تلقیح

 23/0±1/3

 01/0±18/0

001/0±007/0

01/0±11/0

43/0±83/1

NPS

 27/0±3/4

 02/0±26/0

001/0±009/0

01/0±16/0

39/0±18/2

PS

 

 

 

 

 

تلقیح باکتری

 19/0±0/3

 02/0±18/0

001/0±007/0

01/0±11/0

43/0±83/1

NPS

 49/0±3/4

 03/0±26/0

000/0±008/0

01/0±14/0

52/0±12/2

PS

3037/0

0232/0

0012/0

0133/0

-

LSD0.05 (اثرات اصلی)

-

-

-

-

-

LSD0.05 (خاک × باکتری)

   اعداد در هر ستون میانگین هر تیمار (5n=) به همراه انحراف استاندارد می باشند، PS: خاک آلوده، NPS: خاک غیر آلوده.

   در هر ستون حروف مشابه کنار میانگینها به معنی عدم وجود اختلاف ﻣﻌﻨﻲدار بین تیمارها در سطح احتمال 5 درصد ﻣﻲﺑﺎﺷﺪ. 


تفاده RT-PCR: از بین ژنهای مورد نظر در بررسی الگوی بیان ژن (8 ژن، جدول 2) باندهای مورد نظر فقط برای KIN، COR، NCED و ABI1 در واکنش RT-PCR به­دست آمد. الکتروفورز محصولات نشان داد که میزان نسخهﻫﺎی NCED و COR در جو زراعی تحت تنش آلودگی نفتی نسبت به شاهد (غیر آلوده) افزایش یافت اما میزان رونویسی ژن KIN تقریباً در گیاهان شاهد و تیمار شده مشابه بود. همچنین میزان بیان ژنهای NCED و ABI1 در جو دوسر تحت تنش آلودگی نفتی، نسبت به شاهد افزایش یافت. بیان ژن KIN در جو دوسر در حالت کنترل تقریباً مشابه با شرایط تنش بود ( شکل 2).


 

شکل 2- الکتروفورز محصولات واکنش RT-PCR جو زراعی و جو دوسر در پاسخ به تنش آلودگی نفت خام، در هر شکل از راست چاهک اول و دوم گیاه کشت شده در خاک آلوده به نفت خام با آلودگی 10 درصد و چاهک سوم و چهارم گیاه کنترل غیر آلوده

 


نتیجه تجزیه واریانس اثر نوع خاک و نوع گیاه بر میزان نسخهﻫﺎی ژنهای NCED و KIN که به صورت مشترک در هر دو گیاه بیان شدند نشان داد آلودگی نفتی خاک به عنوان یک تنش غیر زیستی باعث افزایش معنیﺩﺍﺭ نسخهﻫﺎی ژن NCED (سطح 5 درصد) و KIN (سطح 10 درصد) شد (شکل 3 الف). اثر اصلی نوع گیاه بر میزان نسخهﻫﺎی ژن NCED در سطح 5 درصد معنیﺩﺍﺭ شد به طوری که بیان این ژن در جو دوسر بیشتر از جو زراعی بود اما اثر نوع گیاه بر میزان نسخهﻫﺎی ژن KIN معنیﺩﺍﺭ نشد (شکل 3 ب). اثر متقابل نوع گیاه و نوع خاک بر میزان نسخهﻫﺎی این دو ژن معنیﺩﺍﺭ نبود. بین میزان نسخهﻫﺎی ژن NCED و KIN اختلاف معنیﺩﺍﺭ وجود نداشت (شکل 3 ج).


الف

 

ب

 

 


 

 

 

 

 

 

 

ج

 

 

 

 

 

 

 


شکل 3 - مقایسه بیان نسبی ژنهای NCED و KIN در جو دوسر و جو زراعی بر اثر آلودگی نفتی خاک،*و**: اختلاف معنیﺩﺍﺭ به ترتیب در سطح 1/0و 05/0، ns: غیر معنیﺩﺍﺭ، الف و ب: نتایج مقایسه میانگین اثرات اصلی تیمار نوع گیاه (جو دوسر و جو زراعی) و نوع خاک (آلوده و غیر آلوده) بر رونویسی (اثر متقابل نوع گیاه و نوع خاک بر میزان نسخه ها معنیﺩﺍﺭ نبود)، ج: مقایسه میزان نسخهﻫﺎی دو ژن، بارهای روی ستونها: انحراف استاندارد (2=n)، (r NCED & KIN=0.61 ns).


بحث

شاخصهای رشد گیاه: یکی از اولین پاسخهای گیاهان به تنش کاهش میزان رشد می باشد. در مطالعه حاضر کاهش شاخصهای رشد مانند سطح برگ، ارتفاع بوته، وزن خشک اندام هوایی و وزن خشک ریشه گیاهان کشت شده در خاک آلوده با غلظت TPH10 درصد نشان داد که آلودگی نفتی باعث کاهش قابل توجه رشد ﻣﻰگردد. با این حال هر دو گیاه قادر به ادامه حیات به طور کامل طی یک فصل رشد بودند. Martía و همکاران نیز گزارش دادند که طول ریشه و ارتفاع یونجه در حضور آلودگی نفتی ناشی از لجن پالایشگاه نفت با غلظت 5 درصد TPH کاهش یافت، با این حال گیاه سالم و قادر به ادامه حیات بود (30). به گزارش Merkl و همکاران علاوه بر تأخیر در رشد، توده زنده بخش هوایی و ارتفاع بوته نیز در گراسها و لگومهای کشت شده در یک خاک آلوده (5 درصد وزنی نفت خام) به طور ﻣﻌﻨﻲدار کاهش یافت و لگومها بعد از 6 هفته کاملاً از بین رفتند (32) همچنین Liste و همکاران بیش از 50 درصد کاهش عملکرد شاخه و ریشه چاودار در آلودگی به نفت سبک را مشاهده کردند (24). در مطالعه حاضر نیز 50 درصد کاهش توده زنده هوایی برای جو دوسر و جو زراعی ناشی از آلودگی نفتی با غلظت 10 درصد مشاهده گردید. همچنین ارتفاع و سطح برگ دو گیاه 45 درصد و 43 درصد (جو دوسر) و 47 درصد و 42 درصد (جو زراعی) کاهش یافتند. به گزارش Tesar و همکاران کاهش توده زنده چاودار در خاک آلوده به گازوئیل تازه در غلظتﻫﺎی 5 درصد و 10 درصد بین 37 تا 55 درصد بود (43). کاهش رشد گیاه مىﺗﻮاند ناشی از ترکیبات سمی نفت خام باشد که توسط گیاه جذب شده و با کاهش یکپارچگی غشاء سلولی باعث مرگ سلول ﻣﻰشود. از طرف دیگر تغییر خصوصیات خاک بر اثر ماهیت هیدروکربنهای نفتی ﻣﻲتواند باعث کاهش رشد گیاه گردد (31).  

مهم ترین فاکتور مورد توجه در گیاه­پالایی تولید زیست توده انبوه ﻣﻲﺑﺎﺷﺪ و هر عاملی که به افزایش آن کمک نماید به طور قطع باعث بهبود و تسریع فرآیند گیاه­پالایی خواهد شد (19). در این پژوهش توده زنده ریشه و شاخه جو دوسر کشت شده در خاک آلوده تلقیح شده به ترتیب حدود 114 و 64 درصد نسبت به گیاه تلقیح نشده افزایش پیدا کرد اما در خاک غیر آلوده چنین روندی مشاهده نشد. از طرف دیگر افزایش رشد ناشی از تلقیح در جو زراعی معنی دار نبود. این نتایج نشان ﻣﻰدهد که تأثیر تلقیح باکتریایی بر رشد گیاه در خاک آلوده بیشتر از خاک غیر آلوده می باشد. از آنجایی که باکتریهای مایه تلقیح بر اساس دارا بودن پتانسیل تجزیه کنندگی نفت برای تهیه مایه تلقیح انتخاب شدند و اثر آنها بر رشد گیاه در خاک غیر آلوده معنی دار نبود، به نظر ﻣﻰرسد نقش عمده باکتریهای مایه تلقیح در بهبود رشد گیاه در خاک آلوده، کاهش اثر سمیت و تنش ناشی از آلودگی نفتی بر گیاه است تا تحریک مستقیم رشد گیاه. همچنین به نظر ﻣﻰرسد که نیاز گیاه و باکتریها به یکدیگر در خاک آلوده بیشتر از خاک غیر آلوده ﻣﻰباشد. از طرف دیگر Huang و همکاران عنوان کردند که باکتریهای محرک رشد گیاه در ناحیه ریشه با سنتز ACC- دآمیناز و کاهش سطح اتیلن در گیاه باعث افزایش قدرت جوانه زنی، جلوگیری از کاهش رشد ریشه و افزایش قدرت بقای گیاه تحت تنش ﻣﻲگردند. باکتریهای محرک رشد گیاه به حفظ کلروفیل برگ، افزایش آب بافت و رشد ریشه کمک نموده و باعث فراهم آمدن زیست توده انبوه جهت زیست­پالایی ﻣﻲگردند (19). به گزارش Mishra و Nautiyal طول ریشه، ساقه و وزن خشک گیاه نخود در خاک آلوده به نفت کاهش یافت ولی افزودن مایه تلقیح به خاک آلوده باعث بهبود وضعیت رشد گیاه گردید (35). Alarcon و همکاران گزارش دادند که در حضور باکتریهای تجزیه کننده هیدروکربنهای نفتی و قارچهای میکوریز شاخص سطح برگ و وزن خشک اندام گیاهی افزایش پیدا کرد (6). Escalante و همکاران مشاهده کردند که توده زنده ریشه گیاهان تلقیح شده تحت تنش نفتی در مقایسه با گیاهان تلقیح نشده 6/1 برابر افزایش پیدا نمود (15). استراتژی برخی گیاهان متحمل به تنش نفتی مانند فسکیو، رشد آهسته بخش هوایی و رشد سریع ریشه ﺍست که باعث محدودیت انتقال آلایندهﻫﺎ از ریشه به بخش هوایی مىﮔﺮدد. در این حالت آلایندهﻫﺎ در ریشه نگهداری شده و انتقال آب و عناصر غذایی به گیاه بیشتر خواهد بود که نوعی روش مقابله با تنش ﻣﻲباشد (19). به گزارش Nie و همکاران و Merkl و همکاران در خاک آلوده به نفت نسبت R/S گیاه افزایش می یابد که نشان دهنده توسعه بخش زمینی گیاه در این شرایط و نوعی استراتژی مقابله با آلودگی می باشد (33 و 36). در مطالعه حاضر تغییرات نسبت R/S هیچﻳﻚ از دو گیاه در خاک آلوده معنیﺩﺍﺭ نشد که نشان ﻣﻰدهد جو دوسر و جو زراعی استراتژی افزایش رشد ریشه را در این شرایط به عنوان یک مکانیسم سازگاری نداشتند. با این وجود در خاک آلوده تلقیح شده نسبت R/S جو زراعی افزایش یافت لذا به نظر ﻣﻲرسد که این افزایش ارتباطی به سیستم دفاعی گیاه ندارد واحتمالاً ناشی از افزایش رشد ریشه بر اثر تلقیح باکتریایی می باشد. به هر حال افزایش نسبت R/S ناشی از پاسخ دفاعی گیاه یا تأثیر ریزجانداران مىﺗﻮاند باعث افزایش جریان کربن به ناحیه ریشه و ریزوسفر گردد که در تغییر جریان کربن برای گیاه­پالایی بسیار مهم است. به عقیده Merkl و همکاران افزایش R/S ناشی از تلقیح، به علت رقابت بین ریشه و باکتریهای مایه تلقیح برای دستیابی به عناصر غذایی و اکسیژن می باشد. وجود یک رابطه متقابل مفید بین گیاه و ریزجانداران ممکن است تجزیه نفت را تسریع کند (33). از طرف دیگر Vavrek و همکاران گزارش دادند باکتریها عملکرد گیاه را کاهش داده و رقابت بر سر عناصر غذایی باعث ایجاد یک رابطه متقابل منفی گردید (46). بنابراین بررسی وضعیت عناصر غذایی خاک قبل از اجرای برنامه زیست­پالایی و آگاهی از رابطه بیولوژیکی بین اجزاء سیستم ضروری به نظر ﻣﻲرسد.

به گزارش Zhang و همکاران آلودگی نفتی در برخی گیاهان به خصوص گونهﻫﺎی مقاومﺗﺮ تنها باعث کاهش رشد ﻣﻲشود اما در گیاه مانگروو (Bruguiera gymnorrhiza) علاوه بر کاهش رشد باعث بروز برخی پاسخهای فیزیولوژیک نیز گردید (49). در پژوهش حاضر نیز آلودگی نفت خام در خاک هم باعث کاهش رشد، و هم بروز پاسخهای فیزیولوژیک گردید و به نظر ﻧﻤﻲرسد بروز چنین پاسخهایی به تنهایی ناشی از سمیت نفت خام باشد، زیرا بیشتر ترکیبات به شدت سمی نفت خام فرار بوده و با گذشت زمان تبخیر شده که سمیت آنها نسبت به نفت خام تازه تا حدی کاهش ﻣﻲیابد. به طور عمده کاهش عملکرد در این خاکها به شرایط نامناسب فیزیکی، شیمیایی و بیولوژیک خاک نسبت داده مىﺷﻮد. دستورزی خاک منجر به تخریب خاکدانهﻫﺎ شده و عوارض تخریب ساختمان در خاکهای آلوده به نفت به علت ماهیت آﺏگریزی این آلاینده شدیدتر از خاکهای دیگر ﻣﻲﺑﺎﺷﺪ. ماهیت آب گریز نفت خام باعث افزایش مقاومت برشی خاک شده و نفوذ ریشه را در این خاکها با مشکل مواجه می نماید، همچنین راندمان انتقال آب و املاح را در این خاکها در مقایسه با خاکهای غیر آلوده کاهش ﻣﻰدهد (40).

بر اساس نتایج شاخصهای نسبی رشد پاسخ جو دوسر به تلقیح باکتریایی بیشتر از جو زراعی بود. از آنجایی که منبع تهیه بیشتر جدایهﻫﺎی مایه تلقیح باکتریهای بومی ریشه و ریزوسفر گراسهایی بودند که در خاک آلوده به نفت رشد کرده بودند. عملکرد بهتر جو دوسر وحشی نسبت به تلقیح چنین جدایهﻫﺎیی مىﺗﻮاند نشان دهنده سابقه سازگاری طولانی این گیاه با چنین جدایهﻫﺎیی باشد و حتی این همکاری را به یک همکاری مفید دو طرفه برای بقاء تحت چنین شرایطی در خاک تبدیل نماید.

متابولیتهای گیاهی: کلروفیل: یکی از اثرات منفی آلایندهﻫﺎی نفتی بر گیاه کاهش پیگمانهای فتوسنتزی است (30). بر اثر آلودگی نفتی مقدار انواع کلروفیل در هر دو گیاه کاهش پیدا کرد. تغییرات نسبت کلروفیل a/b بین تیمارهای جو دوسر در خاک آلوده بیشتر از خاک غیر آلوده بود. بر خلاف نتایج به­دست آمده در این بررسی Ilangovan و Vivekanandan گزارش دادند آبیاری خاک با آب آلوده به پسابهای نفتی باعث کاهش کلروفیل a و کلروفیل کل گردید. اما کلروفیل b تغییر چندانی نشان نداد و این امر باعث کاهش نسبت کلروفیل a/b در گیاهان خاکهای آلوده شد (20). در پژوهش دیگری Huang و همکاران گزارش دادند تحت تنش آلودگی کروزوت این نسبت به عنوان حساسیت و پاسخ دفاعی گیاه افزایش یافت (19). با توجه به نتایج این مطالعه، ممکن است بتوان این گونه برداشت نمود که جو زراعی تحت بررسی در این آزمایش نسبت به جو دوسر مقاومت بیشتری در برابر آلودگی هیدروکربنهای نفتی دارد. از سوی دیگر بر اساس شاخصهای نسبی رشد حساسیت جو دوسر وحشی به آلودگی خاک بیشتر بوده و وزن خشک اندام هوایی این گیاه کاهش بیشتری نشان ﻣﻲدهد. Huang و همکاران همچنین گزارش کردند که در حضور باکتریهای محرک رشد گیاه نسبت کلروفیل a/b افزایش ﻣﻌﻨﻲدار نیافت (19) که با نتایج به دست آمده برای جو دوسر در این پژوهش کاملاً مطابقت دارد، به­طورﻱکه در جو دوسر تلقیح شده مقدار کلروفیل b افزایش و نسبت کلروفیل a/b کاهش یافت. به گزارش Mishra و Nautiyal نیز با افزایش غلظت گازوئیل خاک میزان کلروفیل کل در برگهای نخود کاهش اما در حضور مایه تلقیح (Trichoderma ressei) مقدار کلروفیل 50 درصد افزایش یافت (35).

کاروتنوئید: کاروتنوئیدها از دیگر رنگیزهﻫﺎی فتوسنتزی هستند که در حفاظت نوری گیاه در مقابل انواع اکسیژن فعال در طی فتوسنتز و در پایداری و تمامیت و استحکام غشای لیپیدی نقش دارند (21 و 26). محتوای کاروتنوئید هر دو گیاه بر اثر آلودگی خاک کاهش یافت. محتوای کاروتنوئید گیاهان کشت شده در خاک آلوده تلقیح شده نسبت به گیاهان تلقیح نشده بیشتر بود. Ilangovan و Vivekanandan گزارش دادند بر اثر آبیاری خاک با آب آلوده به نفت محتوای کاروتنوئید برگ روناس 20 درصد کاهش یافت (20). آبسزیک اسید (ABA) یکی از هورمون اصلی در مسیر پاسخ به تنشهای غیرزیستی می باشد. آنزیم 9-سیس آپوکسی کاروتنوئید دی­اکسیژناز که توسط ژن NCED رمز می گردد در تبدیل کاروتنوئید به ABA نقش دارد که مهم ترین مرحله بیوسنتز ABA می باشد. در خاک آلوده میزان نسخهﻫﺎی ژن NCED در واکنش RT-PCR هر دو گیاه افزایش پیدا کرد. در گیاه آرابیدوپسیس نیز در پاسخ به تنش خشکی افزایش نسخهﻫﺎی NCDE در گزارش شد (13). افزایش نسخهﻫﺎی NCDE ﻣﻲتواند موجب افزایش بیوسنتز ABA شود. از این رو، کاهش میزان کاروتنوئیدها در گیاهان کشت شده در خاک آلوده احتمالاً ناشی از تجزیه آن برای تبدیل به ABA در تنش نفتی ﻣﻲباشد.

آنتوسیانین: بسیاری از تنشهای محیطی نظیر خشکی، شوری، نور، دما، کمبود عناصر غذایی و فلزات سنگین موجب افزایش بیوسنتز و انباشتگی آنتوسیانینها مىﺷﻮﻧﺪ (18 و 34). بر خلاف سایر ترکیبات فنولی گیاهی تأثیر آلودگی نفتی روی سنتز آنتوسیانین به طور دقیق مطالعه نشدهﺍست. بررسیها نشان داده که آنتوسیانینها در شرایط تنش همانند آنتی­اکسیدان عمل کرده و موجب روبش رادیکالهای آزاد اکسیژن و کاهش پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی ﻣﻲگردند (9، 10 و 42). به عقیده Chupakhina و Maslennikov این متابولیت ثانویه همچنین مىﺗﻮاند به عنوان شاخص بیوشیمیایی هشدار دهنده آلودگی در گیاه در آینده مطرح گردد (11). در مطالعه حاضر مقدار آنتوسیانین در جو دوسر تحت تیمارهای مختلف اختلافی وجود نداشت، در حاﻟﻲکه میزان این پیگمان در جو زراعی کشت شده در خاک آلوده بیشتر از خاک غیر آلوده بود. Chupakhina و Maslennikov 5/2 برابر افزایش آنتوسیانین ناشی از آلودگی نفتی را در جو، ذرت، ماش و برخی از علفهای هرز مشاهده نمودند و آن را به عنوان شاخص میزان آلودگی عنوان کردند که مىﺗﻮاند ابزار مفیدی برای تعیین سریع میزان آلودگی و پایش اکولوژیکی جوامع گیاهی باشد (9) از این رو می توان گفت که افزایش میزان آنتوسیانین در جو زراعی حاکی از وجود تنش در محیط و همچنین مقابله گیاه با این شرایط می باشد. افزایش میزان آنتوسیانینها همراه با افزایش فعالیت آنزیم پراکسیداز در جو زراعی نشان مىﺩهد که مقادیر زیادی از H2O2 تشکیل شده وارد واکوئل شده که در آنجا توسط سیستم فنولیک پراکسیداز تجزیه می­شود. به هر حال با توجه به محل انباشتگی آنتوسیانینها در واکوئلها، این پیگمانها نقش محوری و مهم در روبش انواع اکسیژن فعال دارند (14).

پرولین: پرولین یکی از مهم ترین اسمولیتهای سازگار است که میزان آن در گیاهان مختلف در پاسخ به تنشهای متفاوت افزایش می یابد (2). در مطالعه حاضر میزان پرولین در جو دوسر وحشی تحت تنش نفتی افزایش یافت ولی تغییرات آن در تیمارهای مختلف جو زراعی معنیﺩﺍﺭ نبود. Alarcon و همکاران نشان دادند در حضور نفت خام سنگین تازه (غلظت 6/0 درصد) مقدار پرولین در گیاه چاودار افزایش یافت در حالی که با حضور باکتریهای تجزیه کننده نفت و قارچهای مایکوریز غلظت پرولین کاهش یافت (3). در مطالعه حاضر نیز مقدار پرولین در جو دوسر تلقیح شده به طور ﻣﻌﻨﻲداری کمتر از گیاه تلقیح نشده بود. در تطابق با این نتیجه Alarcon و همکاران انباشتگی پرولین در حضور آلایندهﻫﺎی نفتی را شبیه تنش خشکی و شوری گزارش و نشان دادند که گیاه تلقیح شده به میزان کمتری تحت تأثیر تنش القاء شده توسط نفت خام قرار ﻣﻲگیرد (6). جمعیتهای میکروبی موجود در ریزوسفر سازگاری گیاه به آلودگیهای نفتی را از طریق سمیت زدایی این مواد افزایش ﻣﻲﺩﻫﻨﺪ. به هر حال افزایش میزان پرولین تنها در جو دوسر ﻣﻌﻨﻲدار شد ولی اینکه این انباشتگی نشانهﺍی از آسیب ناشی از هیدرولیز پروتئینها باشد یا پاسخی در جهت تحمل تنش توسط گیاه هنوز مشخص نیست. همچنین Alarcon و همکاران گزارش کردند که پرولین شاخص مفیدی برای بررسی نحوه پاسخ گیاه به تنش حاصل از آلودگیهای نفتی ﻧﻤﻲباشد، زیرا این شاخص تحت تأثیر عوامل دیگری مانند حاصلخیزی خاک دستخوش تغییر ﻣﻲگردد (2 و 6).

محتوای H2O2 و پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء: H2O2 یکی از انواع اکسیژن فعال تولید شده تحت تنشهای غیر زیستی است که باعث پراکسایش لیپیدها مىﺷﻮد و همراه با تولید MDA است که شاخص پراکسایش لیپیدی است (35). به موازات افزایش محتوای H2O2 در گیاهان کشت شده در خاک آلوده میزان MDA نیز افزایش یافت و به موازات کاهش محتوی H2O2 جو زراعی که تلقیح شده بود، MDA نیز به طور ﻣﻌﻨﻲدار نسبت کاهش نشان داد. افزایش مقدار MDA کاهش شاخص پایداری غشای سلولی را نشان ﻣﻲدهد و هر دو شاخص ﻣﻲتواند فاکتور دیگری در تأیید تنش اکسیداتیو القاء شده توسط آلودگی نفتی باشد. در تحقیقی که توسط Liu و همکاران انجام گرفت افزایش محتوای MDA همزمان با افزایش فعالیت SOD در غلظت 200-100 میکروگرم بر گرم فنانترن گزارش گردید (25). Zhang و همکاران گزارش دادند به موازات افزایش آلودگی هیدروکربنهای نفتی محتوای MDA در گیاه مانگروو افزایش یافت. همچنین آلودگی هیدروکربنهای نفتی مانند روغنهای روان کننده باعث بروز تنش اکسیداتیو در گیاه و پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء سلولی گردید (46). Li و همکاران نیز گزارش دادند که آلودگی 1 درصد نفت خام خاک 4/12 درصد MDA را در سویا افزایش داد اما تأثیر معنیﺩار بر کاهش رشد نداشت و هنگامی که غلظت نفت 5-3 درصد رسید کاهش معنیﺩار در بخش هوایی و ریشه، ارتفاع و جوانه زنی مشاهده گردید. در تحقیق حاضر در غلظت 10 درصد TPH هم کاهش معنیﺩار رشد و افزایش غلظت MDA به خوبی در هر دو گیاه مشاهده گردید (22). به هر حال افزایش MDA به عنوان کاهش تمامیت غشای سلولی ممکن است منجر به اختلال در نقل و انتقال کلیه مواد و عناصر معدنی در عرض غشای پلاسمایی ﻣﻲگردند لذا مطالعه انتقال مواد در عرض غشای پلاسمایی و بررسی غلظت آنها در درون و بیرون از گیاه در حضور آلودگی نفتی ﻣﻰتواند به درک آثار ناشی از تنش نفتی بر تعادل عناصر غذایی درون گیاه کمک کند. 

آنتی اکسیدانهای آنزیمی: آنزیمهای کاتالاز و پراکسیداز جز مهم ترین آنتی­اکسیدانهای آنزیمی هستند که در جهت تحمل گیاه به تنش اکسایشی نقش عمده ای ایفاء ﻣﻲنمایند (47). در مطالعه حاضر آلودگی نفتی فعالیت آنزیمهای کاتالاز و پراکسیداز را در هر دو گیاه افزایش داد که نشان دهنده افزایش انواع اکسیژن فعال و بروز تنش اکسیداتیو در گیاه ﻣﻲباشد. در تطابق با این نتیجه Zhangn و همکاران نیز گزارش دادند که آلودگی هیدروکربنهای نفتی موجب افزایش فعالیت آنزیمهای کاتالاز و پراکسیداز در گیاه گردید که به عنوان یک سیستم دفاعی گیاه در مقابله با آسیبهای ناشی از این نوع تنش ﻣﻲباشد (49). Martía و همکاران نیز گزارش نمودند فعالیت آنزیم پراکسیداز در برگ یونجه کشت شده در لجن نفتی افزایش یافت. از سوی دیگر افزایش فعالیت سیستم آنتی اکسیدانی به نوع گیاه، شدت و نوع تنش نیز بستگی دارد. به هر حال افزایش انواع فعال اکسیژن علاوه بر اینکه نشان دهنده بروز تنش اکسایشی در گیاه هستند ﻣﻲتوانند به عنوان یک مولکول پیام رسان در گیاهان تحت تنش عمل کنند و گیاه را از وضعیت فعلی آگاه نمایند لذا نباید انتظار داشت که همواره در پاسخ به افزایش انواع فعال اکسیژن میزان فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانی نیز افزایش یابد (30).

بررسی تغییر الگوی بیان ژنها در پاسخ به تنش آلودگی نفتی با استفاده RT-PCR: یکی از مهم ترین پاسخهای مولکولی گیاهان تحت تنش تغییر در میزان نسخهﻫﺎی mRNA ژنهای مختلف پاسخ­گر به تنش ﻣﻲباشد. ژن COR15 رمز کننده پروتئینی است که در ارتباط با تنش در حفاظت از غشاء تیلاکوئیدی مطرح است. افزایش بیان این ژن در جو زراعی ﻣﻲتواند در ارتباط با حفاظت از کلروپلاست و سیستم فتوسنتزی گیاه تحت تنش نفتی باشد. به علاوه تعداد نسخهﻫﺎی این ژن به موازات افزایش آنتوسیانین افزایش یافت. به گزارش Chalker-Scott بیان ژنهای COR با افزایش بیوسنتز آنتوسیانین در تنش سرما رابطه مستقیم دارد (9).

برای بررسی نقش ABA به عنوان یک هورمون تنشی میزان نسخهﻫﺎی دو ژن کلیدی در بیوسنتز و ترارسانی علامت ABA یعنی NCED و ABA1 در گیاهان تحت تنش سنجیده شد. NCED که آنزیم کلیدی را در مسیر بیوسنتز ABA رمز ﻣﻲنماید در تبدیل 9- سیس­آپوکسی­کاروتنوئید­دی­اکسیژناز به گزانتونین نقش دارد. بر اساس مطالعات صورت گرفته این ژن یکی از ژنهای پاسخ گر به تنشهای غیر زیستی مانند خشکی بوده و میزان بیان آن در گیاه آرابیدوپسیس تحت تنش خشکی به شدت افزایش ﻣﻲیابد (13). در این پژوهش نیز میزان نسخه برداری این ژن در پاسخ به آلودگی نفتی افزایش یافت.

ABI یک سرین/ترئونین پروتئین فسفاتاز است که در مسیر ترارسانی علامت ABA به عنوان یک تنظیم کننده منفی نقش دارد. در این تحقیق بیان ژن ABI1 جو دوسر در پاسخ به تنش نفتی افزایش یافت. با توجه به نقش این ژن در مسیر ترارسانی علامت ABA ﻣﻲتوان گفت که آلودگی نفتی موجب فعال شدن این مسیر و عملکرد ABA به عنوان یک هورمون تنشی در این شرایط عمل می کند، و نیز تنشهایی مانند شوری، خشکی و دمای پایین موجب افزایش ABA در بافتهای رویشی می گردند. این هورمون با فعال سازی بسیاری از ژنهای پاﺳﺦگر به تنش که آنزیمهای لازم برای بیوسنتز اسمولیتهای مختلف و پروتئینهای شبه LEA را کد ﻣﻲکنند، اثر تنش بر گیاه را کاهش ﻣﻲدهد و همچنین از تأثیر بازدارندگی رشد اتیلن القایی طی تنش جلوگیری مىﮐﻨﺪ (17، 45 و 48). افزایش میزان ABA در شرایط تنش به طور عمده ناشی از افزایش بیوسنتز ABA و تا حدی کاهش تجزیه این هورمون است. تنشهای شوری و خشکی نسخه برداری ژنهای کدکننده آنزیمهای درگیر در بیوسنتز ABA را از مسیر فسفریلاسیون وابسته به کلسیم القاء ﻣﻲکنند (45 و 48). همان گونه که قبلاً اشاره شد علاوه بر سمیت ترکیبات نفتی تنشهای دیگری نیز ممکن است به علت ماهیت خاص این ترکیبات بروز نماید. کاهش نفوذپذیری خاک، کمبود اکسیژن، خشکی و اختلال در انتقال آب و املاح و آسیبهای ناشی از سمیت و عدم سنخیت نفت با شیره آوندی، گیاه را در معرض انواع مختلف تنش قرار ﻣﻲدهد. لذا افزایش نسخه برداری ژن NCED ممکن است به عدم کارآیی آب و اختلال در انتقال املاح ناشی از آلودگی نفتی نسبت داده شود. بر اساس نتایج حاصل از سنجش مقدار کاروتنوئیدها میزان این پیگمانها در گیاهان تحت تنش آلودگی نفتی کاهش یافت. از آنجایی که کاروتنوئیدها پیش ساز سنتز هورمون ABA هستند این کاهش ﻣﻲتواند ناشی از بیوسنتز این هورمون باشد (29). در مجموع بررسی میزان نسخهﻫﺎی ژن NCED و مقدار کاروتنوئیدهای گیاه ممکن است شاخصهای مناسب برای ارزیابی میزان تحمل تنش نفتی توسط گیاه باشند. افزایش میزان MDA در گیاه تحت تنش نفتی نشان دهنده بروز اختلال در ماهیت لیپیدی غشاء سلولی است که ﻣﻲتواند بر جذب املاح تأثیر گذار باشد. با این­حال میزان این متابولیت در ریشه اندازه گیری نشد لذا جهت مطالعه دقیقﺗﺮ تأثیر تنش نفتی بر گیاه سنجش مقدار MDA در ریشه و غلظت املاح در بخشهای مختلف گیاه، تعیین مقاومت فیزیکی خاک، اکسیژن خاک و پتانسیل آب و املاح خاک ضروری به نظر ﻣﻲرسد.

به طور کلی نتایج حاصل از مطالعات مولکولی و فیزیولوژیکی نشان داد که پاسخ جو دوسر وحشی و جو زراعی به آلایندهﻫﺎی نفتی با پاسخ به سایر تنشهای غیر زیستی مانند خشکی و شوری تا حدی مشابه است. در حقیقت تنش نفتی مانند سایر تنشهای غیر زیستی موجب افزایش میزان H2O2 و بروز تنش اکسیداتیو در گیاهان تحت تنش ﻣﻲگردند. از آنجایی که آلودگی خاک مسن و ترکیبات سنگین به راحتی قادر به ورود به ریشه و بخشهای فوقانی گیاه ﻧﻤﻰباشند، به نظر ﻣﻲرسد تأثیرات جانبی آلودگی نفتی بیش از سمیت این ترکیبات باعث بروز تنش ﻣﻲشود. علاوه بر شاخصهای رشد گیاه و با توجه به تغییر شاخصهای فیزیولوژیک مانند تغییر میزان کلروفیل، کاروتنوئید، H2O2، MDA و آنتی اکسیدانهای آنزیمی در هر دو گیاه تک لپهﺍی مورد مطالعه، شاید بتوان این شاخصها را به عنوان نشانه هشدار دهنده برای بررسی اثر منفی آلایندهﻫﺎی نفتی حداقل در گیاهان تک لپهﺍی خانواده پوآسه توصیه نمود.

افزایش شاخصهای رشد جو دوسر شامل وزن ریشه، شاخه و ارتفاع و شاخصهای فیزیولوژیکی نظیر کلروفیل b و کاروتنوئید در گیاهان تلقیح شده تحت تنش نشان داد تلقیح باکتریایی در خاک آلوده باعث بهبود رشد این گیاه گردید و این امر ﻣﻲتواند به کاهش سمیت آلایندهﻫﺎی نفتی و تنش ناشی از این ترکیبات و به دنبال آن به مقابله بهتر گیاه به تنش نفتی نسبت داده شود. 

 

  1. سید شریفی، ر. و خاوازی، ک.، 1391، تأثیر پرایمینگ بذر با باکتریهای محرک رشد بر فیلوکرون و سرعت ظهور برگ ذرت ( Zea maize L.)، مجله زیست شناسی ایران، 25(2): 183-193.
  2. میرزایی، م. ، معینی ا. و قناتی ف.، 1392، اثر تنش خشکی بر میزان پرولین و قندهای محلول گیاهچه های کلزا(Brassica napus) ، مجله زیست شناسی ایران، 26(1):  90-98.
  3. نورانی آزاد، ح. و کفیل زاده، ف.، 1390، تاثیر سمیت کادمیوم بر رشد، قندهای محلول، رنگیزه های فتوسنتزی و برخی آنزیمها در(Carthamus tinctorius L.)  گلرنگ، مجله زیست شناسی ایران، 24(6): 858-867.
    1. Abeles, F.B., & Biles, C.L. (1991) Characterization of peroxidase in lignifying peach fruit endocarp, Plant Physiology 95, 269-273.
    2. Aebi, H. (1984) Catalase in vitro, Methods in Enzymology 105, 121-126.
    3. Alarcon, FA., Davies, F.T., Autenrieth, R.L., & Zuberer, D.A. (2008) Arbuscular mycorrhiza & petroleum-degrading microorganisms enhance phytoremediation of petroleum-contaminated soil, International Journal of Phytoremediation 10:251–263.
    4. Alkio, M., Tabuchi, T.M. & Carmona, A.C. (2005) Stress responses to PAHs in Arabidopsis include growth inhibition & hypersensitive response, Journal of Experimental Botany 56, 2983-2994.
    5. Bartels, D., & Sunkar, R. (2005) Drought & salt tolerance in plants, Critical Reviews in Plant Sciences 24, 23–58.
    6. Chalker-Scott, L. (1999) Environmental significance of anthocyanins in plant stress responses, Photochemistry & Photobiology 70, 1-9.
    7. Chalker-Scott, L. (2001) Do anthocyanins function as osmoregulators in leaf tissues, Annual Meeting of the Botanical Society of America, Symposium. Albuquerque, NM.
    8. Chupakhina, G.N., & Maslennikov P.V. (2004) Plant adaptation to oil stress, Russian Journal of Ecology 35, 290–295. Translated from Ekologiya.
    9. Du, Z., & Bramlage, W.J. (1992) Modified thiobarbituric acid assay for measuring lipid oxidation in sugar-rich plant tissue extracts, Journal of Agriculture & Food Chemistry 40, 1566-1570.
    10. Endo, A., Sawada, Y., Takahashi, H. & Nambara, E. (2008) Drought induction of Arabidopsis 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase occurs in vascular parenchyma cells, Plant Physiology 147, 1984-1993.
    11. Erylmaz, F. (2006) The relationship between salt stress & anthocyanin content in higher plants, Journal of Biotechnology 12, 47-52.
    12. Escalante, E.E., Gallegos, M.M.E., Favela, T.E., & Gutierrez, R.M. (2005) Improvement of the hydrocarbon phytoremediation rate by Cyperus laxus Lam. inoculated with a microbial consortium in a model system, Chemosphere 59, 405–413.
    13. Fernet, J.L. (2008) Plant bacterial inoculants to remediate hydrocarbon polluted soil. Masters of Science Thesis, Department of Soil Science University of Saskatchewan.
    14. Finkelstein, R.R., Gampala, S.S., & Rock, C.D. (2002) Abscisic acid signaling in seeds & seedlings, Plant Cell 14, 15–45.
    15. Grace, S.C., & Logan, B.A. (2000) Energy dissipation & radical scavenging by the plant phenyl propanoid pathway, Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological 355, 1499-1510.
    16. Huang, X.D., El-Alawi, Y., Penrose, D.M., Glick, B.R., Greenberg, & B.M. (2004). Responses of three grass species to creosote during phytoremediation, Environmental Pollution 130, 453-463.
    17. Ilangovan, K., & Vivekanandan, M. (1992) Effect of oil pollution on soil respiration & growth of Vigna mungo (L.) Hepper, The Science of the Total Environment 116, 187-194.
    18. Kitahata, N., Kobayashi, M. & Asami, T. (2006) A 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase inhibitor for use in the elucidation of ABA action mechanisms, Bioorganic & Medicinal Chemistry 14, 5555-5561.
    19. Li, C.R., Wang, W.K., & Cao, Y.Q., (2007) Effects of petroleum polluted soil on the soybean growth, Journal of Safety & Environment 7, 28-35.
    20. Lichtenthaler, H.K., & Wellburn, A.R. (1983) Determinations of total carotenoids & chlorophylls a & b of leaf extracts in different solvents, Biochemical Society Transactions 603, 591-592.
    21. Liste, H.H., & Felgentreu, D. (2006) Crop growth culturable bacteria & degradation of petrol hydrocarbons (PHCs) in a long-term contaminated field soil, Applied Soil Ecology 31, 43–52.
    22. Liu, W., Li, P., Zhou, Q., Sun, T., Tai, P. & Zhang, H. (2003) Effect of short-term phenanthrene stress on SOD activities & MDA contents in soybean seedlings. Chinese Journal of Applied Ecology 14, 581-4.
    23. Lobato, A.K.S., Costa, R.C.L., Neto, M.A.M., Neto, O., Santos, C.F., Filho, B.G., Alves, G.A.R., Freitas, J.M.N. & Coimbra, G.K. (2009) Responses of the photosynthetic pigments & carbon metabolism in Vigna unguiculata Cultivars submitted to water deficit, Research Journal of Biological Science 4, 593-59.
    24. Loreto, F., & Velikova, V. (2001) Isoprene produced by leaves protects the photosynthetic apparatus against ozone damage quenches ozone products & reduces lipid peroxidation of cellular membranes, Plant Physiology 127, 1781-1787.
    25. Magne, C., & Larher, F. (1992) High sugar content of extracts interferes with colorimetric determination of amino acids & free proline, Analytical Biochemistry 200, 115-118.
    26. Mahajan, S., & Tuteja, N. (2005) Cold salinity & drought stresses: An overview, Archives of Biochemistry & Biophysics 444, 139–158.
    27. Martía, M.C., Camejoa, D., Fernández, N., Rellán, A.R., Marquesc, S., Sevilla, F., & Jiméneza, A. (2009) Effect of oil refinery sludges on the growth & antioxidant system of alfalfa plants, Journal of Hazardous Materials 171, 879–885.
    28. Merkl, N., Schultze-kraft, R., & Infante, C. (2004) Phytoremediation in the tropics-the effect of crude oil on the growth of tropical plants, Bioremediation Journal 8, 177–184.
    29. Merkl, N., Schultze-Kraft, R., & Infante, C. (2005b) Phytoremediation in the tropics - influence of heavy crude oil on root morphological characteristics of graminoids, Environmental Pollution 138, 86-91.
    30. Merkl, N., Schultze-kraft, R., & Infante, C., (2005a) Assessment of tropical grasses & legumes for phytoremediation of petroleum-contaminated soils, Water, Air, & Soil Pollution 165, 195-209.
    31. Merzlyak, M.N., & Chivkunova, O.B. (2000) Light-stress-induced pigment changes & evidence for anthocyanin photoprotection in apples, Journal of Photochemistry & Photobiology 55, 155-163.
    32. Mishra, A., & Nautiyal, C. (2009) Functional diversity of the microbial community in the rhizosphere of chickpea grown in diesel fuel-spiked soil amended with Trichoderma ressei using sole-carbon-source utilization profiles, World Journal of Microbiology & Biotechnology 25, 1175–1180.
    33. Nie, M., Yang, Q., Jiang, L., Fang, C., Chen, J., & Li, B. (2010) Do plants modulate biomass allocation in response to petroleum pollution? Biology Letters 6, 811-814.
    34. Pena-Castro, J.M., Barrera-Figueroa, B.E., Fernandez, L.L., Ruiz, M.R., & Xoconostle, C.B. (2006) Isolation & identification of up-regulated genes in bermudagrass roots (Cynodon dactylon L.) grown under petroleum hydrocarbon stress, Plant Science 170, 724-731.
    35. Qiu, Z.B., Liu, X., Tian, X.J., & Yue, M. (2008) Effect of CO2 laster pretreatment on drought stress resistance in wheat, Journal Photochemistry & photobiology B: Biology 90, 17-25.
    36. Rajaei, S.M., Niknam, V., Seyedi, S.M., Ebrahimzadeh, H., & Razavi, K. (2009) Contractile roots are the most sensitive organ in Crocus sativus to salt stress, Biologia Plantarum 53, 401-600.
    37. Robertson, S.J., McGill, W.B., Massicotte, H.B., & Rutherford, P.M. (2007) Petroleum hydrocarbon contamination in boreal forest soils: a mycorrhizal ecosystems perspective, Biology Review 82, 213–240.
    38. Seyedi, S.M., Timko, M.P., & Sundqvist, C. (2001) The distribution of Protochlorophyllid & chlorophyll within seedling of the lip1 mutant of pea, Plant & Cell Physiology 42, 931-941.
    39. Shao, H.B., Guo, Q.J., Chu, L.Y., Zhao, X.N., Zh, S., Hu, L., &, Cheng, J.F. (2007) Understanding molecular mechanism of higher plant plasticity under abiotic stress, Colloids & Surfaces 54, 37-45.
    40. Tesar, M., Reichenauer, T.G., & Sessitsch, A. (2002) Bacterial rhizosphere populations of black poplar & herbal plants to be used for phytoremediation of diesel fuel, Soil Biology & Biochemistry 34, 1883–1892.
    41. Tsao, D.T. (2003) Overview of phytotechnologies. Advances in biochemical engineering biotechnology, Vol. 78: Phytoremediation. T. ,Scheper, & D.T., Tsao (Eds). Springer, New York, pp. 1-50.
    42. Tuteja, N. (2007) Abscisic acid & abiotic stress signaling, Plant Signaling & Behavior 2, 135-138.
    43. Vavrek, M.C., Colgan, W., & Campbell, W.J. (2001) The role of plant-bacterial-fungal interaction in remediation of oak-hickory-pine-systems. Louisiana Applied & Educational Oil Spill, Technical Report, S 01-015.
    44. Wang, W., Vinocur, B., & Altman, A. (2003) Plant responses to drought salinity & extreme temperatures, Planta 218, 1-14.
    45. Xiong, L., & Zhu, J.K. (2003) Regulation of abscisic acid biosynthesis, Plant Physiology 133, 29–36.
    46. Zhang, C.G., Leung, K.K., Wong, Y.S., & Tam, N.F.Y. (2007) Germination growth & physiological responses of mangrove to lubricating oil pollution, Environmental & Experimental Botany 60, 127–136.