نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه زابل
2 پژوهشگاه ژنتیک
3 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک
4 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری
چکیده
لیپازهای باکتریایی عضوی از خانواده β/α هیدرولازها هستند که تری آسیل گلیسرول ها را در فاز بین آب-چربی هیدرولیز می کنند. لیپاز باکتری باسیلوس ترموکاتنولاتوس (BTL2) در دمای 75-60 درجه سانتیگراد و pH برابر 10 -8 فعالیت دارد و مناسب استفاده در صنعت شوینده می باشد. در این پژوهش لیپاز باسیلوس ترموکاتنولاتوس کایمریک حاوی توالی توافق شده لیپاز قارچ کاندیداروگوزا (207Gly-Glu-Ser-Ala-Gly211)در ناحیه زانوی هسته دوست، در باکتری E. coli کلون و بیان شد. سپس فعالیت آنزیمی لیپاز کایمریک در حضور سوبستراهای مختلف اندازهگیری شد. همچنین اثر عوامل مختلف از قبیل دما، pH، دترجنتها، حلالهای آلی و یونهای فلزی بر روی فعالیت آنزیم بررسی گردید .نتایج نشان داد که آنزیم کایمریک بیشترین فعالیت را در حضور سوبسترای 4 کربنه، (pH 9.0) و دمای 60 درجه سانتیگراد دارد. همچنین فعالیت آنزیم در حضور حلال های آلی N- هگزان، N- هپتان، متانول و کلروفرم و دترجنت های ترایتون 100-X ، توین 20، توین 40 افزایش یافته است در حالیکه یون های فلزی عمدتاً اثر کاهشی بر فعالیت آنزیم کایمریک داشتند.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Cloning, expression and characterization of chimeric BacillusThermocatenulatus Lipase in E.coli.
نویسندگان [English]
چکیده [English]
Bacterial lipases are members of α/β hydrolase family that hydrolyzed triacylglycerol at the water- lipid interface. Bacillus thermocatenulatus lipase 2 (BTL2) is a thermoalkalophilic lipase that shows optimal activity at 60–75 oC and pH 8–10. BTL2 is an important research target because of its potential industrial applications. At the present study chimeric Bacillus thermocatenulatus lipase contain the consensus sequence of Candida rugosa lipase (207Gly-Glu-Ser-Ala-Gly211) at the nucleophilic elbow region was cloned and expressed in E. coli as secretion protein. Finally, Catalytic activity of chimeric lipases was evaluated at presence of various triglycerides as substrates and the effects of different parameters such as temperature, pH, detergents, organic solvents and metal ions were evaluated on chimeric enzyme activity using a pH-stat assay. The results showed that the chimeric enzyme is most active to C4 substrate, (pH 9.0) and 60 oC. As well as enzyme activity has increased in the presence of organic solvents, N-Hexane, N-heptane, methanol, chloroform and detergents such as Triton X -100, Tween 20, Tween 40. Also, metal ions, respectively decreased general effect on the enzyme activity in chimeric lipase.
کلیدواژهها [English]
کلونینگ، بیان و تعیین خصوصیات لیپاز کایمریک باسیلوس ترموکاتنولاتوس در باکتری Escherichia coli
سیدحسین خالقی نژاد1، علی اصغر کارخانه2*، غلامرضا مطلب1، سعید امین زاده2 و باقر یخچالی2
1 زابل، دانشگاه زابل، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی
2 تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری
تاریخ دریافت: 16/10/92 تاریخ پذیرش: 29/7/93
چکیده
لیپازهای باکتریایی عضوی از خانواده β/α هیدرولازها هستند که تری آسیل گلیسرول ها را در فاز بین آب - چربی هیدرولیز می کنند. لیپاز باکتری باسیلوس ترموکاتنولاتوس (BTL2) در دمای 75-60 درجه سانتی گراد و pH برابر 8 تا 10 فعالیت دارد و مناسب استفاده در صنعت شوینده می باشد. در این پژوهش لیپاز باسیلوس ترموکاتنولاتوس کایمریک حاوی توالی توافق شده لیپاز قارچ کاندیداروگوزا (207Gly-Glu-Ser-Ala-Gly211)در ناحیه زانوی هسته دوست، در باکتری E. coli کلون و بیان شد. سپس فعالیت آنزیمی لیپاز کایمریک در حضور سوبستراهای مختلف اندازهگیری شد. همچنین اثر عوامل مختلف از قبیل دما، pH، دترجنتها، حلالهای آلی و یونهای فلزی بر روی فعالیت آنزیم بررسی گردید .نتایج نشان داد که آنزیم کایمریک بیشترین فعالیت را در حضور سوبسترای 4 کربنه، (pH 9.0) و دمای 60 درجه سانتی گراد دارد. همچنین فعالیت آنزیم در حضور حلالهای آلی N- هگزان، N- هپتان، متانول و کلروفرم و دترجنتهای ترایتون 100-X ، توین 20، توین 40 افزایش یافته است در حالی که یونهای فلزی عمدتاً اثر کاهشی بر فعالیت آنزیم کایمریک داشتند.
واژه های کلیدی: E. coli ، لیپاز کایمریک، BTL2
اختصارات: Bacillus thermocatenulatus lipase 2, BTL2و Bacillus thermocatenulatus lipase 1, BTL1
* نویسنده مسئول، تلفن: 09124649129 ، پست الکترونیکیKarkhane@Nigeb.ac.ir:
مقدمه
باکتریهای مقاوم به حرارت به واسطه فعالیت در دماهای بالا پتانسیل زیادی برای استفاده از آنها یا محصولاتشان در صنعت و تکنولوژی آنزیمی وجود دارد (5). باکتریهای ترموفیل آنزیمهای متنوعی از جمله آنزیمها آمیلولایتیک و لیپازها را بیان می کنند که ذاتاً دمای بالا را تحمل می کنند. ویژگیهای شیمیایی این آنزیمها به آنها اجازه فعالیت در دمای بالا وpH قلیایی را می دهد (7).
لیپازها (تری آسیل گلیسرول هیدرولازها،E.C. 3.1.1.3) بخشی از خانواده هیدرولازها هستند که هیدرولیز تری آسیل گلیسریدهای با زنجیره بلند را در حد فاصل آب-چربی کاتالیز می کنند (3 و 2). باکتری Bacillus thermocatenulatus دو نوع لیپاز 16 و 43 کیلودالتون تولید میکند که به ترتیب BTL1 و BTL2 نامگذاری شده اند(24). ژن btl2 از 2293 جفت نوکلئوتید تشکیل شده و زنجیره پلی پپتیدی 417 اسیدآمینهای را رمز میکند که 29 اسیدآمینه ابتدای توالی راهنمای آنزیم را تشکیل میدهد. لیپاز بالغ دارای 388 اسیدآمینه بوده و وزن مولکولی آن حدود 43-39 کیلو دالتون گزارش شده است (25).
لیپازهای میکروبی به دلیل چندکاره بودن، ویژگیهای کاربردی و تولید آسان آنها، گروه مهمی از آنزیمهای با ارزش بیوتکنولوژی محسوب می شوند. این گروه از آنزیمها با توجه به ویژگیهای آنزیمی خاص و اختصاصی بودن سوبسترایشان برای کاربردهای صنعتی مختلف بسیار مناسب هستند (8 و 11).
لیپازها در صنایع مختلف از جمله صنایع غذایی، شوینده ها، تولیدات دارویی، چرم، پارچه، لوازم آرایشی، و کاغذ کاربرد دارند(17، 12 و 13). اشریشیاکلی یکی از معروفترین میزبانها در تولید پروتئینها نوترکیب است زیرا ویژگیهای ژنتیکی آن بخوبی شناخته شده است. همچنین اشریشیاکلی به واسطه سهولت ترانسفورماسیون و توانایی تولید فراوان پروتئین و رشد خیلی سریع در مقایسه با سلولهای پستانداران گزینه مناسبی برای تولید پروتئینهای نوترکیب محسوب می شود. بیان بالای ژنهای نوترکیب اغلب منجر به شکل گیری پروتئینهای غیرفعال (اینکلوژن بادی) می شود که در این صورت پروتئینهای کایمریک فعال توسط فرآیندهای دناتوراسیون و به دنبالش بازآرایی مجدد ساختمان (Refolding) به دست می آید(4).
با توجه به کاربرد صنعتی و ارزش اقتصادی آنزیمها، کلونینگ، بیان و تغییر خصوصیات آنها با هدف افزایش میزان تولید ضروری است لذا، هدف از این تحقیق، کلونینگ و بیان ژن لیپاز کایمریک باسیلوس ترموکاتنولاتوس در باکتری E. coli و تعیین خصوصیات آن می باشد.
مواد و روشها
کلونینگ ژن لیپاز کایمریک در وکتور کلونینگ: پلاسمید pKYM.E نوترکیب حاوی ژن لیپاز کایمریک (این پلاسمید حاوی ژن لیپاز کایمریک باسیلوس ترموکاتنولاتوس می باشد که قبلاً توسط حسینی و همکارانش در مخمر تهیه شده بود)(12)، به عنوان DNA الگو برای تکثیر ژن لیپاز کایمریک استفاده گردید. سپس ژن لیپاز کایمریک با آغازگرهای رفت و برگشت ذیل تکثیر شد:
- پرایمر رفت (5-GATGGCCATGGCGGCATCCCCACG-3, Mlu NΙ)KK.F
- پرایمر برگشت (5-TGAGCTCATCATCCCTTCATTAAGGC-3, Sac I)KK.R
برای همسانه سازی ژن لیپاز کایمریک، پلاسمید pGEM-5zf با آنزیمEco RV خطی شد، سپس ژن لیپاز کایمریک در پلاسمید خطی شده با آنزیم لیگاز قرار داده شد. پس از همسانه سازی پلاسمیدهای حامل ژن کایمریک لیپاز (پلاسمید pGKKM.E) به سلولهای مستعد باکتری E. coli سویه DH5α منتقل شدند. باکتریها بر روی محیط کشت –LBآگار حاویX-gal/IPTG و آمپی سیلین µg/ml100 رشد داده شدند. برای اطمینان از ورود قطعه مورد نظر به پلاسمید آزمونهای PCR و هضم آنزیمی با استفاده از آنزیمهای Mlu NΙ و Sac Iانجام شد. همچنین برای تأیید صحت توالی ژن کایمریک و وجود جهش در ناحیه زانوی هسته دوست، پلاسمید نوترکیب pGKKM.E توالی یابی شد.
کلونینگ ژن لیپاز کایمریک در وکتور بیانی: از پلاسمید(+)pET-26b برای بیان لیپاز کایمریک استفاده شد. برای این کار ابتدا پلاسمید pGKKM.E با آنزیمهایMlu NΙ و Sac I برش داده شد و ژن لیپاز کایمریک از ژل آگارز استخراج گردید. همچنین پلاسمید (+)pET-26b نیز با آنزیمهای فوق برش داده شد، سپس ژن لیپاز کایمریک با استفاده از آنزیم لیگاز در وکتور بیانی (+) pET-26bهمسانه سازی شد و پلاسمید جدید pTKKM.E نامگذاری شد. پلاسمید های pTKKM.E به باکتریهای مستعد E. coli سویه DH5α ترانسفورم شدند و روی محیط کشت –LBآگار حاوی کانامایسین (30 µg/ml)رشد داده شدند و مدت 16 ساعت در گرمخانه 37 درجه سانتی گراد قرار داده شد. سپس از کلنیهای تشکیل شده پلاسمید استخراج گردید و صحت کلونینگ با PCR و هضم آنزیمی با آنزیمهای Mlu NΙ و Sac Iانجام شد. پس از تأیید کلونینگ پلاسمید نوترکیب pTKKM.E به باکتری مستعد E. coli سویه pLys S ترانسفورم شد.
بیان لیپازکایمریک درE. coli: باکتری E. coli سویه Plys S حاوی پلاسمید کایمریک pTKKM.E در محیط کشت LB مایع (کانامایسین µg/ml30)در دمای 37 درجه سانتی گراد و rpm 200 به مدت 16 ساعت کشت داده شد. سپس باکتریها به محیط کشت جدید LB مایع تا غلظت 5 درصد تلقیح شدند. بعد از رسیدن دانسیته نوری (OD600) محیط کشت به حدود 4/0، محیط کشت تا غلظت نهایی 0.5 میلی مولار IPTG القاء شد و تمام شب در انکوباتور 30 درجه سانتی گراد با دور rpm150 قرار داده شد. سپس سلولها با دورrpm 7000 به مدت 10دقیقه رسوب داده و مایع رویی و رسوب آن با SDS-PAGE و تست پارانیترو فنیل پالمیتات (PNPP) برای تأیید بیان لیپاز کایمریک مورد بررسی قرار گرفتند (9).
محلول سازی اینکلوژن بادی و بازآرایی ساختمان: با استفاده از روش کلارک و همکارانش (با تغییرات جزئی) محلول سازی پروتئینهای نامحلول (اینکلوژن بادیها ) و بازآرایی ساختمان آنها انجام شد(6). برای این کار ابتدا لیپاز کایمریک نامحلول در اوره 8 مولار و بافر فسفات حل شد و سپس ساختمان آنها در بافر ریفولدینگ(تریس 100 میلی مولار، نمک طعام 100 میلی مولار، گلیسین 100 میلی مولار، گلیسرول 5 درصد، دی تیو تریتول 5 میلی مولار) بازآرایی گردید.
خالص سازی و تعیین خصوصیات پروتئین کایمریک: اساس کروماتوگرافی تعویض یونی، تفاوت چشمگیر در علامت و بزرگی شارژ الکتریکی مولکولها در pH فرضی می باشد. ستون آن از یک پلیمر سنتتیک شامل گروههای باردار تشکیل شده است. خالص سازی پروتئین کایمریک از طریق کروماتوگرافی تعویض یونی با رزین تعویض یونی(DE52 واتمن)در pH6.8 انجام شد. سپس خصوصیات لیپاز در شرایط متفاوت دمایی و pHهای مختلف و نیز در حضور حلالهای آلی، دترجنتها و یونهای فلزی در دمای 55 درجه سانتی گراد و pH 8.5)) بررسی شد، و تمام دادهها با نرمافزار آماری SPSS تجزیه و تحلیل گردید.
نتایج و بحث
همسانه سازی لیپاز کایمریک در وکتور های کلونینگ وبیانی: ژن لیپاز کایمریک توسط PCR تکثیر گردید و در پلاسمید pGEM-5zfهمسانه سازی شد(شکل1، الف). بعد از تأیید همسانه سازی از طریق آزمونهای PCR(شکل1، ج)، هضم آنزیمی(شکل1، د) و توالی یابی. ژن کایمریک در پلاسمید نوترکیب pGKKM.E با آنزیمهای محدود اثرMlu NΙ وSac I برش داده شد، سپس ژن کایمریک در وکتور بیانی برش داده شده با همین آنزیمها قرار داده شد (پلاسمید نوترکیب pTKKM.E).(شکل1، ب).
شکل 1- الف : ستون1- مارکر وزن مولکولیDNA (1 kb). ستون2- کنترل منفی پلاسمید( pGEM-5zf). ستون 3و4- پلاسمیدهای نوترکیبpGKKM.E . ب: ستون 1- مارکر وزن مولکولیDNA. ستون2-کنترل منفی پلاسمید pET-26b (+). ستون 3، 4 و 5- پلاسمید های استخراج شده بدون قطعهpET-26b (+). ستون6- پلاسمید نوترکیبpTKKM.E . ج : الکتروفورز محصولPCR تأیید صحت کلونینگ: ستون 1- مارکر وزن مولکولیDNA (1 kb). ستون 2-محصول PCR کلنی نوترکیب pGKKM.E. د: الکتروفورز محصول برش آنزیمی پلاسمید نوترکیب pGKKM.E: ستون 1- مارکر وزن مولکولیDNA (1 kb). ستون 2- پلاسمید برش خورده با آنزیمهای Mlu NΙ و Sac I.
بیان و خالص سازی لیپاز کایمریک: برای بیان پروتنئن کایمریک از حامل بیانی pET-26bاستفاده شد. پلاسمید نوترکیب pTKKM.E به باکتریهای مستعد E. coli سویه pLysS ترانسفورم گردید، سپس بیان پروتئین کایمریک با استفاده از SDS-PAGE بررسی شد .از آنجایی که بیشترین حجم بیان در رسوب و به صورت اینکلوژن بادی دیده شد. محلول سازی اینکلوژن بادیها و بازآرایی ساختمان آنها انجام شد (شکل 2، الف). خالص سازی پروتئین کایمریک با استفاده از کروماتوگرافی تعویض یونی با رزین ( DE52واتمن)انجام شد (شکل2، ب).
شکل 2- الف: مطالعه بیان لیپاز کایمریک با استفاده از ژل .SDS-PAGEستونM- مارکر وزن مولکولی پروتئین. ستون 1- کنترل منفی(پروتئین تام باکتری ). ستون 2- پروتئینهای نامحلول موجود در رسوب شوک اسمزی بعد از القاء با IPTG. ب: ستونM- مارکر وزن مولکولی پروتئین. ستون1- کنترل منفی(پروتئین تام باکتری ). ستون 2- پروتئینهای نامحلول موجود در رسوب شوک اسمزی باکتری. ستون 3- لیپاز کایمریک بعد از تخلیص.
بررسی خصوصیات لیپاز کایمریک: اندازه گیری فعالیت آنزیمی لیپاز کایمریک از طریق دستگاهpH-stst (ساخت شرکت متروم) و با سه بار تکرار انجام شد. درمرحله بعد تمام دادهها با نرمافزار آماری SPSSدر سطح معنی داری 5 درصد تجزیه و تحلیل گردید. سپس نمودار میانگین فعالیت لیپاز کایمریک در شرایط مختلف با نرمافزار Excel 2013 تهیه گردید.
مطالعه بررسی ویژگی سوبسترایی: ویژگی سوبسترایی لیپاز کایمریک در حضور سوبستراهای تریآسیل گلیسرولی با زنجیره هیدروکربنی 4 تا 18 کربنه در pH 8.5، دمای 55 درجه سانتی گراد اندازهگیری شد. لیپاز B. thermocatenulatus بیشتر پیوند استری بین ناحیه 1 و 3 تری گلیسرید را هیدرولیز می کند. نتایج نشان داد که بیشترین فعالیت آنزیم کایمریک همانند آنزیم طبیعی در حضور سوبسترای 4 کربنه (تری بوترین) است که توسط سایر محققین نظیر Haki و Rakshit (2003) نیز گزارش شده است (شکل 3، الف)(14). در فعالیت کاتالیزی لیپازها علاوه بر جایگاه فعال آنزیم بخشی به نام درپوش، که در اکثر لیپازها وجود دارد، نیز مؤثر است و در دسترسی سوبسترا به جایگاه فعال نقش دارد. بخش دیگر که در فعالیت کاتالیزی لیپازها نقش دارد حفره آکسیآنیون است که در پایدار کردن حدواسطهایی که در طی واکنش کاتالیز تشکیل میگردند، نقش بسار مهمی دارد (10).
مطالعه اثر pH بر فعالیت لیپاز کایمریک: تأثیر pH های 8، 5.8، 9 و 5.9 بر فعالیت آنزیم لیپاز کایمریک در حضور سوبسترای تریآسیل گلیسرولی با زنجیره هیدروکربنی 8 کربنه در دمای 60 درجه سانتی گراد اندازه گیری شد. نتایج نشان داد با افزایش pH به سمت pH های قلیایی فعالیت آنزیم نیز افزایش یافت و درpH 9.5 بیشترین فعالیت را از خود نشان می دهد (شکل 3، ب).
داشتن فعالیت و پایداری بهینه در pH های قلیایی از ویژگیهای مهم لیپازهای است که به عنوان افزودنی و کاتالیز شوینده ها استفاده می شوند. تغییراتpH می تواند بر ساختار، عملکرد، پایداری و حلالیت آنزیمها اثر بگذارد. عموماً لیپازها و دیگر آنزیمهای مورد استفاده در فرمولاسیون شوینده ها باید به شرایط قلیایی مقاوم باشند به دلیل آنکه معمولاً pH شوینده های ماشین لباسشویی در محدوده 11-9 است (1).
مطالعه اثر دما بر فعالیت لیپاز کایمریک: تأثیر دماهای 45 تا 65 درجه سانتی گراد بر فعالیت آنزیمی لیپاز کایمریک در حضور سوبسترای تریآسیل گلیسرولی با زنجیره هیدروکربنی 8 کربنه در pH 9.0 اندازهگیری شد. با افزایش دما از 40 به 60 درجه فعالیت لیپاز کایمریک افزایش و در دمای 65 درجه سانتی گراد فعالیت آنزیم کاهش یافت، افزایش فعالیت در دمای 60 درجه بسیار ملموس بوده، که احتمالاً در نتیجه جهش، تشکیل حفره اکسی آنیون تسهیل شده و همین امر سبب افزایش فعال آنزیم شده است. (شکل 3، ج).
به طور کلی دمای بهینه برای یک آنزیم ثابت نیست و می تواند طبق خلوص و سوبسترا، حضور مهارکننده و روش مورد استفاده برای تحلیل متفاوت باشد(23).
بررسی پایداری حرارتی لیپاز کایمریک: به منظور بررسی پایداری حرارتی، لیپاز کایمریک به مدت 0، 15، 30، 45 و 60 دقیقه در دمای 60 درجه سانتی گراد قرار داده شد. سپس فعالیت باقیمانده لیپازها در دمای 55 درجه سانتی گراد در حضور سوبسترای 8 کربنه در pH 9.0اندازهگیری شد. در بررسی پایداری حرارتی مشخص شد که با افزایش زمان انکوباسیون، فعالیت آنزیم کایمریک کاهش یافت و بعد از گذشت یک ساعت از زمان انکوباسیون آنزیم هنوز بیش از 50 درصد فعالیت خود را حفظ کرده است.
این میزان پایداری احتمالاً ناشی از افزایش پایداری آنزیم بر اثر جهشهای اعمال شده به دلیل اندرکنش بهتر اسیدآمینههای ناحیه زانوی هسته دوست با سایر اسیدآمینهها است (شکل 3، د).
بررسی اثر یونهای فلزی بر فعالیت لیپاز کایمریک: فعالیت باقیمانده لیپاز کایمریک پس از یک ساعت قرار گرفتن در مجاورت غلظت یک میلیمولار یونهای فلزی در pH 9.0، دمای 55 درجه سانتی گراد اندازهگیری شد(شکل 3، ح). معمولاً یونهای فلزی فعالیت کاتالیزی آنزیمها را تغییر می دهند. بسیاری از آنزیمها برای حفظ ساختمان فعال خود به یونهای فلزی نیاز دارند. به طور کلی فعالیت لیپاز در حضور یونهای فلزات سنگین مثلHg2+ ، Ni2و Sn2+به میزان قابل توجهی مهار می شود در حالی که یونهای فلزی مثل Mg2+وZn2+ اثر بازدارندگی کمی نشان میدهند(18). کارخانه و همکارانش نیز کاهش فعالیت لیپاز BTL2 در حضور یون کلسیم و افزایش فعالیت آنزیمی در حضور یونهای Na+ و K+ را گزارش کردند (19).
نتایج این تحقیق همچنین نشان داد که کاهش فعالیت آنزیم لیپاز کایمریک درحضور Fe3+ و K+ نسبت به یونهایMg2+ وCa2+ بسیار ملموس است. همچنین آنزیم در حضور EDTA حدود 60 درصد فعالیت خود را حفظ کرده است. بیشتر لیپاز ها با یونهای فلزی مهار می شوند همچنین EDTA اثر مهار کننده بر روی لیپاز دارد و یونهای Ca2+ می تواند غیر فعال شدن لیپاز با EDTA را مهار کنند (20). به طور کلی یونهای فلزی و نمکها اهمیت ویژه ای در پایداری دمایی آنزیم دارند. این یونها به جایگاه های اتصالی خاصی روی سطح مولکول متصل شده و نقش ساختاری دارند.
بررسی اثر حلالهای آلی بر فعالیت لیپاز کایمریک: لیپاز کایمریک به مدت یک ساعت در مجاورت محلولهای 30 درصد استون، N- هگزان، N- هپتان، متانول و کلروفرم قرار داده شد. سپس فعالیت باقیمانده لیپاز در حضور سوبسترای 8 کربنه در pH 9.0، دمای 60 درجه سانتی گراد اندازهگیری شد(شکل 3، خ). از عوامل مؤثر بر فعالیت لیپازها حلالهای آلی هستند. افزایش فعالیت لیپاز در محیط حلال آلی نسبت به محیط آبی به علت تشکیل فرم باز یا فعال آنزیم است که سبب به دام افتادن سوبسترا در جایگاه فعال آنزیم می گردد (22).
Quyen گزارش کرد که متانول و 2- پروپانول به طور جزئی و استون به میزان بیشتری فعالیت لیپاز باسلوس ترموکاتنولاتوس را کاهش می دهد(22). همچنین Luisa و همکارانش گزارش کردند که افزایش متانول و استون با غلظت 30 درصد به لیپاز BTL2 باعث کاهش جزئی فعالیت آنزیم شده است اما چنانچه زمان انکوباسیون به بیش از یک ساعت افزایش یابد میزان این کاهش قابل توجه خواهد بود(21). در این تحقیق نیز نتایج نشان داد که همه حلالهای آلی، N- هگزان، N- هپتان، متانول و کلروفرم به استثنای استون سبب افزایش فعالیت آنزیمی، لیپاز کایمریک شدند.
بررسی اثر دترجنتها بر فعالیت لیپاز کایمریک: لیپاز کایمریک به مدت یک ساعت در مجاورت غلظت یک درصد دترجنتهای توین 20، توین 40، توین 80، SDS و ترایتون 100-X قرار داده شد. سپس فعالیت لیپاز در حضور سوبسترای 8 کربنه کربنه در pH 9.0، دمای 55 درجه سانتی گراد اندازهگیری شد. دترجنتها نیز بر فعالیت لیپازها موثر بوده و قادر به افزایش یا کاهش فعالیت لیپاز هستند. در این پژوهش دترجنت ترایتون 100-X، توین 20، و توین 40 (برای توین 80 افزایش فعالیت معنی دار نبود) فعالیت لیپاز کایمریک را افزایش در حالی که SDS فعالیت آنزیم کایمریک کاهش داد(شکل 3، ر).
افزایش فعالیت لیپاز کایمریک در حضور ترایتون 100-X را می توان به نقشی که این دترجنت در باز شدن تجمعات لیپاز دارد مرتبط دانست. زیرا لیپاز باسیلوس ترموکاتنولاتوس تمایل زیادی برای تشکیل توده های بزرگ دارای فعالیت آنزیمی دارد(16). توین ها نیز حلالیت سوبسترا را افزایش داده و از این طریق سبب افزایش فعالیت آنزیم می شوند و نیز کاهش فعالیت در حضور SDS احتمالاً ناشی از اثر نامطلوب این دترجنت بر ساختمان دوم و سوم پروتئین می باشد(15).
تمایل لیپاز برای تشکیل تودههای بزرگ ناشی از اندرکنش بین مولکولی نواحی آب گریز لیپاز است تشکیل این تودهها سبب کاهش فعالیت آنزیمی لیپاز میگردد. به طور کلی جهشهای ایجاد شده احتمالاً از طریق تسهیل استقرار سوبسترا در جایگاه فعال، تسهیل تشکیل حفره اکسی انیون همچنین افزایش میزان اتصالات بین آنزیم و سوبسترا باعث افزایش فعالیت لیپاز در حضور سوبستراهای مختلف، و افزایش پایداری آنزیم در مقابل عوامل مختلف (دترجنتها، حلالهای آلی، یونهای فلزی)، دما و pHهای مختلف شده است.
ضمنا تمام نتایج با نرم افزار آماری MSTATC بررسی شد. نتایج آماری اختلاف معنی دار در سطح یک درصد (P<0.01)را تأیید کرد.
شکل 3- الف: میانگین فعالیت لیپاز کایمریک در حضور سوبستراهای مختلف. ب: میانگین فعالیت آنزیم لیپاز کایمریک در pH های مختلف. ج: میانگین فعالیت لیپاز کایمریک در دماهای مختلف. د: میانگین فعالیت لیپازهای نوترکیب کایمریک در حضور حلالهای مختلف. ح: میانگین فعالیت لیپاز کایمریک در حضور یونهای فلزی مختلف. خ: میانگین فعالیت باقیمانده لیپاز کایمریک در مدت زمانهای مختلف .ر: میانگین فعالیت لیپاز کایمریک در حضور دترجنتهای مختلف. ضمناً فعالیتهای آنزیمی با دستگاه PH-Stat در دمای 55 درجه سانتی گرادو pH برابر با 9 اندازه گیری شد و نتایج آماری اختلاف معنی دار در سطح یک درصد را تأیید کرد.
با توجه به نتایج حاصل از این تحقیق و پایداری این آنزیم در حضور عوامل مختلف نظیر pH، حلال آلی، دترجنت و یونهای فلزی و همچنین تحمل دمای مناسب، این آنزیم کاندید مناسب برای استفاده در صنایع شوینده و حتی صنایع چرم می باشد.