نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه شهید بهشتی

چکیده

آسپاراژیناز یک آنزیم هیدرولاز می باشد که آسپاراژین را به آمونیوم و آسپارتیت تبدیل می کند. این آنزیم کاربرد مؤثری در درمان لوسمی لنفوبلاستیک دارد. marcescens Serratia یک باکتری گرم منفی است که کلنیهای آن دارای رنگیزه قرمز می باشند که می تواند در صورت حضور آسپاراژین در محیط کشت خود، تولید آنزیم آسپاراژیناز نماید. در این تحقیق آنزیم آسپاراژیناز از محیط کشت Serratia خالص سازی و همچنین فاکتور های کینتیکی آن تعیین شد. باکتری Serratia در محیط مایع حاوی پپتون، عصاره مالت و آسپاراژین کشت شد و محیط بعد از 44 ساعت سانتریفیوژ شد و محلول رویی که دارای آنزیم آسپاراژیناز بود برای مطالعات کینتیکی و خالص سازی مورد استفاده قرار گرفت. مراحل تخلیص آنزیم با استفاده از رسوب دهی با آمونیوم سولفات و به دنبال آن دیالیز و ستون کروماتوگرافی DEAE سلولز انجام شد. انجام الکتروفورز به روش SDS-PAGE باندی با وزن مولکولی تقریبی حدودkDa 54 را بر روی ژل نشان داد که نشان دهنده خلوص آنزیم بود. مقایسه تأثیر تغییرات pH (10-4) بر فعالیت آنزیم نشان داد که بیشترین فعالیت آنزیم در 7 pH است، و بررسی تغییرات دما بر فعالیت آنزیم نشان داد که بیشترین فعالیت در دمای 40 درجه سانتی گراد می باشد. همچنین مقدار فاکتور های کینتیکی Vmax و Km در این آنزیم مشخص گردید.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Purification and determination of kinetics parameters of asparaginase from Serratia marcescens

چکیده [English]

Asparaginase is a hydrolytic enzyme that catalyses asparagine to aspartic acid and ammonia. The enzyme is used for treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL), lymphoma and melanolymphoma. S. marcescens is a Gram-negative bacterium with red pigment that can produce asparaginase in culture medium culture in the presence of asparagine. In this study asparaginase was purified and kinetic parameters of enzyme were determined. A modified culture medium was used for enzyme production containing malt extract, soy peptone and asparagine. Enzyme activity was detected after 8 hours and maximum enzyme activity was reached after 40-44 hours of incubation. Purification of the enzyme was carried out using ammonium sulfate precipitation. The concentrated enzyme preparation was loaded onto DEAE cellulose chromatography column. The SDS-PAGE was determined a single band with about 54 kDa protein. The optimum pH and temperature of enzyme activity were determined to be about 7 and 40˚C respectively, and the kinetic parameters such as Km and Vmax were measured for the first time in this study.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Enzyme
  • Asparaginase
  • Serratia marcescens
  • Purification
  • Kinetic parameters

خالص سازی وتعیین خصوصیات کینتیکی آنزیم آسپاراژیناز در باکتری
 
Serratia marcescens

لیلا آب خویی، داریوش مینایی تهرانی*، مینا کلاهدوز محمدی، فرشته افتخار، نیلوفر کرجی، فرزانه میر فخار و نازنین وزیری تبار

تهران، دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده علوم زیستی

تاریخ دریافت: 29/1/90               تاریخ پذیرش: 19/10/91 

چکیده

آسپاراژیناز یک آنزیم هیدرولاز می باشد که آسپاراژین را به آمونیوم و آسپارتیت تبدیل می کند. این آنزیم کاربرد مؤثری در درمان لوسمی لنفوبلاستیک دارد. marcescens  Serratia یک باکتری گرم منفی است که کلنیهای آن دارای رنگیزه قرمز می باشند که می تواند در صورت حضور آسپاراژین در محیط کشت خود، تولید آنزیم آسپاراژیناز نماید. در این تحقیق آنزیم آسپاراژیناز از محیط کشت Serratia خالص سازی و همچنین فاکتور های کینتیکی آن تعیین شد. باکتری Serratia در محیط مایع حاوی پپتون، عصاره مالت و آسپاراژین کشت شد و محیط بعد از 44 ساعت سانتریفیوژ شد و محلول رویی که دارای آنزیم آسپاراژیناز بود برای مطالعات کینتیکی و خالص سازی مورد استفاده قرار گرفت. مراحل تخلیص آنزیم با استفاده از رسوب دهی با آمونیوم سولفات و به دنبال آن دیالیز و ستون کروماتوگرافی   DEAE سلولز انجام شد. انجام الکتروفورز به روش SDS-PAGE باندی با وزن مولکولی تقریبی حدودkDa  54 را بر روی ژل نشان داد که نشان دهنده خلوص آنزیم بود. مقایسه تأثیر تغییرات  pH (10-4) بر فعالیت آنزیم نشان داد که بیشترین فعالیت آنزیم در 7 pH است، و بررسی تغییرات دما بر فعالیت آنزیم نشان داد که بیشترین فعالیت در دمای 40 درجه سانتی گراد می باشد. همچنین مقدار فاکتور های کینتیکی Vmax  و Km در این آنزیم مشخص گردید.

واژه های کلیدی: آنزیم، آسپاراژیناز، marcescens  Serratia ، فاکتور های کینتیکی، خالص سازی

* نویسنده مسئول، تلفن: 02129903144 ،  پست الکترونیکی: D_MTehrani@sbu.ac.ir 

مقدمه

 

آسپاراژیناز (EC: 3.5.1.1) یک آنزیم هومو تترامر است که سبب شکستن آسپاراژین به آسپارتیک اسید و آمونیاک می شود. طبق مشاهدات Kidd در سال 1953 (11)، قدرت درمانی آسپاراژیناز توسط فعالیت آن در سرم خوکچه هندی کشف شد که باعث بهبود سرطان لنفومای پیوند زده شده در موش و نیز موش صحرایی شد. مطالعات بعدی توسط Broome در سال 1961 نشان داد (4) که فعالیت ضد‎ سرطانی سرم خوکچه هندی به واسطه آنزیم آسپاراژیناز بوده است. در آزمایشات انجام شده در سلولهای کارسینومای Walker 256 و لوسمی‎L5178، مشخص شد که این سلولها به حضور آسپاراژین به عنوان یک اسید آمینه برای رشد در محیط کشت بافت نیاز دارند. در سال 1969، Campbell (6) نشان داد که آسپاراژیناز به دست آمده از E. coli نیز دارای فعالیت ضد‎ سرطانی می‎باشد. این یافته‎ها منجر به تشخیص آنزیم آسپاراژیناز برای درمان لوسمی شد و محققین را برای تولید بیشتر و تحقیقات بر روی آنزیم آسپاراژیناز تشویق نمود. امروزه آسپاراژیناز مورد استفاده در پزشکی شامل دو فرم دست نخورده و طبیعی می باشد که از دو باکتری  E. coli و نیز Erwinia aroideae خالص‎سازی شده است. همچنین ‎یک شکل تغییر یافته از آنزیم به نام PEG-L-asparaginase به دست آمده از coli E. تهیه شده است که شامل فرم طبیعی آنزیم است که به طور کووالانسی به monomethoxypolyethyleneglycol متصل شده است و در بیمارانی استفاده می‎شود که حساسیت بالا به فرم طبیعی آنزیم دارند (6).

آسپاراژیناز در درمان بیماری لنفوبلاسیک لوسمی حاد) (Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL)  و نیز ‌در درمان ‌لوسمی ‌حاد میلوسیتیک ‌و میلومنوسیتیک‌، لنفوماهای ‌هوچکینی‌ و غیرهوچکینی ‌و ملانوسارکوما به کار می رود (3)  سلولهای سرطانی در سنتز اسید آمینه‎ غیر ضروری آسپاراژین ناتوان می‎باشند، در حالی‎که سلولهای طبیعی قادر به تولید آسپاراژین مورد نیاز خود هستند. حضور آنزیم آسپاراژیناز در خون سبب  تجزیه آسپاراژین شده و سلولهای سرطانی را از دسترسی آسپاراژین موجود در خون محروم می نماید (16). آسپاراژیناز در میان عوامل شیمی‎درمانی سرطان حداقل به دو دلیل منحصر به فرد است. اول اینکه آنزیم می‎تواند فعالیت سیتوتوکسیتی خود را در مکانهایی دور از تومور اعمال نماید و دوم اینکه آسپاراژیناز یک پروتئین کاتالیتیکی است و یک مولکول از آنزیم هزاران مولکول آسپاراژین را در عرض یک دقیقه کاهش می‎دهد (14).

باکتریهای زیادی از جمله Escherichia coli، Serratia marcescens، Erwinia aroideae، Proteus  vulgaris  و Mycobacterium  tuberculosis  قادر به تولید آنزیم آسپاراژیناز می باشند (1، 6 و 15). مقایسه آسپاراژیناز خالص شده از باکتریها نشان دهنده تنوع در ساختمان و فعالیت  آنها است. مقایسه آسپاراژیناز به دست آمده از باکتریهای E.Coli و Erwinia carotovora  تفاوت زیادی را در رفتار آنها نشان داد به طوری که آنزیم جدا شده از Er. carotovora   بسیار قلیایی تر، در طیف وسیعی از تغییرات pH (3 تا 12 ) فعال و در pH  قلیایی بسیار مقاوم است. در آنزیم جدا شده از E.coli هیچ گونه اسید آمینه تریپتوفان و سیستئین و پیوند دی سولفید یافت نشد در حالی که در Er. carotovora  حضور آنها مشخص شده است (9). محیط رشد و کشت باکتری در مقدار تولید آسپاراژیناز و همچنین در ایجاد ایزوزیمهای آسپاراژیناز مؤثر است. در یک مطالعه، یک محیط حداقل و مناسب برای ردیابی و جستجوی باکتریهای E.coli جدا شده از رودخانه، پساب و نمونه های کلینیکی ساخته شد که توسط این محیط به خوبی باکتریهای تولید کننده آنزیم اسپاراژیناز از لحاظ کمی  مشخص می شد (7). همچنین یک محیط غنی طراحی شد که می توانست بهترین حالت را برای تولید آسپاراژیناز را در باکتری  Erwinia carotovora ایجاد کند (13).

در این تحقیق، تولید آسپاراژیناز در باکتری Serratia  در یک محیط کشت جدید مورد مطالعه قرار گرفت و تفاوت وزن مولکولی آنزیم در محیط جدید با آنزیمهایی که در مطالعات قبلی گزارش شده بودند بررسی شد. همچنین فاکتورهای کیبتیکی آنزیم مشحص شد.  

مواد و روشها

سویه باکتری: در این تحقیق از  Serratia Marcescensسویه ATCC 60 که از آزمایشگاه باکتریولوژی دانشگاه شهید بهشتی فراهم آمد، جهت تولید آنزیم آسپاراژیناز استفاده گردید. ابتدا باکتری بر روی محیط کشت جامد نوترینت آگار حاوی 5/0 درصد گلوکز کشت و نگهداری شد. سپس برای تولید آنزیم باکتری در محیط کشت حاوی  g/L 5/0 پپتون، g/L 5/0 عصاره مالت، g/L 5/0 آسپاراژین به مدت 44-42 ساعت در دمای37 درجه سانتی گراد گرماگذاری شد.

سنجش فعالیت آنزیم: به هنگام کشت باکتری در محیط مایع حاوی آسپاراژین، آنزیم در محیط کشت آزاد می شود. جهت تعیین فعالیت آنزیم آسپاراژیناز،ml  1 از سوپرناتانت به دست آمده از سانتریفیوژ کشت باکتری با ml 1 بافر تریس (8M, pH   1/0) و ml 5/0 آسپاراژین mg/ml 6 مخلوط شد. پس از 2 ساعت در دمای 30 درجه سانتی گراد، به هر لوله 300 میکرولیتر از محلول 15 درصد تری کلرواستیک اسید (TCA) اضافه شد و لوله‎ها سانتریفیوژ گردیدند. پس از افزودن محلول نسلر ( معرف نسلر برای تولید رنگ و سنجش آمونیاک تولید شده استفاده می شود) به ml 1 از سوپرناتانت نمونه‎های سانتریفیوژ شده، جذب نوری در  nm410 خوانده شد.

مطالعه کینتیک آنزیمی: تعیین فعالیت آنزیم و پارامترهای کینتیکی شامل Km و Vmax آنزیم با استفاده از محلول کشت باکتری (بدون رسوب دهی با آمونیوم سولفات) انجام گرفت. برای این منظور 100 میکرو‎لیتر از سوپرناتانت حاوی آنزیم به همراه  ml1 بافر تریسM  1/0 با pH  7 و 500 میکرو‎لیتر سوبسترای آسپاراژین با غلظتهایmM  1/0، 2/0، 3/0، 4/0، 5/0  استفاده شد. لوله ها به مدت 1، 3، 5، 10و  15 ساعت در دمای 30 درجه سانتی گراد قرار داده شدند. بقیه مراحل مطابق روش ذکر شده در سنجش کمی آنزیم انجام شد و جذب نوری محلولها در  nm410 اندازه‎گیری گردید.

تعیین دما و pH  بهینه فعالیت آنزیم: برای این منظور نیز از محلول رویی کشت سلول استفاده شد، فعالیت آنزیم در دماهای 0 تا 70 درجه سانتی گراد اندازه گیری شد. برای تعیین pH‎ بهینه نیز فعالیت آنزیم در pH‎ های مختلف شامل بافر گلیسین (3pH )، استات (5-4 pH  )، فسفات (7-6pH )، تریس(8pH )، بورات (10-9pH ) اندازه گیری شد.

خالص سازی نسبی آنزیم: برای خالص سازی آنزیم به محلول کشت حاوی آنزیم به صورت تدریجی و در دمای 4 درجه سانتی گراد آمونیوم سولفات جامد اضافه شد تا به میزان 50 درصد اشباع برسد. محلول به مدت یک شب در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شد سپس  به مدت 40 دقیقه در g ×1500 سانتریفیوژ شد. در نهایت رسوب پروتئینی حاصل در بافر تریس (8M, pH   1/0) حل شد. در مرحله بعد از روش دیالیز برای حذف نمک آمونیوم سولفات استفاده شد. عمل دیالیز در دمای 4 درجه سانتی گراد همراه با همزدن در بافر تریس (8M, pH   1/0) انجام شد. کیسه دیالیز  به مدت یک شب غوطه ور در بافر و در یخچال نگهداری گردید در نهایت محلول دیالیز شده در دمای 18- درجه سانتی گراد برای انجام مراحل بعدی نگهداری شد. محلول به دست آمده از دیالیز از ستون حاوی  DEAE سلولز عبور داده شد. برای خروج پروتئینها از ستون، از محلول NaCl با غلظت‎هایM  0.1 تا 1 استفاده شد و فرکشنهای به دست آمده برای اندازه گیری مقدار پروتئین و فعالیت آنزیم آسپاراژیناز مورد سنجش قرار گرفتند.

مقدار پروتئین در فراکشنهای حاصل از کروماتوگرافی، در طول موج  nm280 و توسط دستگاه اسپکتروفتومتر UV-Visible   (Shimatzu 1040) مشخص شد.

برای اندازه گیری مقدار پروتئین در نمونه سوپ محیط کشت حاوی آنزیم و محلول دیالیز شده  از روش Lowry استفاده گردید(17) .

تعیین فعالیت آنزیم: برای تعیین فعالیت آنزیم لازم بود ابتدا  ضریب خاموشی (Extinction coefficient) محصول ( یون آمونیوم) که از عملکرد آنزیم بر روی آسپاراژین ایجاد شده بود، محاسبه شود. برای این منظور غلظتهای مختلف سولفات آمونیوم تهیه شد و  محلول نسلر (معرف آمونیوم) به آنها اضافه و جذب رنگ زرد ایجاد شده در طول موج  nm410 اندازه گیری شد.  منحنی غلظت بر علیه جذب رسم شد و شیب خط  برای تعیین ضریب خاموشی در نظر گرفته شد. پس از محاسبه ضریب خاموشی (lit.mol-1 103  ´ 1.6) ابتدا مقدار آمونیوم تولید شده در هر بار سنجش آنزیمی محاسبه شد و سپس از فرمول زیر فعالیت آنزیم محاسبه گشت.

= U/mlزمان سنجش ´  حجم آنزیم / مقدار میکرومول آمونیوم آزاد شده توسط آنزیم ´   مقدار محلول در سنجش آنزیمی

الکتروفورز عمودی به روش SDS-PAGE: به منظور مشخص کردن میزان خلوص و تعیین جرم مولکولی آنزیم از  ژل آکریلامید با غلظت 5/7 درصد استفاده گردید و رنگ آمیزی ژل، با کوماسی بلو R-250 و نیترات نقره انجام شد. برای مشخص شدن وزن موکولی از مارکر استاندارد پروتئینی استفاده شد.

نتایج

تولید آنزیم و منحنی رشد: برای رسم منحنی رشد باکتری و همچنین تولید آنزیم در محیط کشت،  از محیط کشت هر دو ساعت یکبار نمونه گیری شد و منحنی رشد رسم گردید (شکل 1). فاز تأخیر (phase  (lagدر این باکتری در حدود 4 ساعت بود و فاز لگاریتمی در حدود 18 ساعت طول کشید که بعد از آن وارد مرحله سکون گردید. مطالعه همزمان فعالیت آنزیم نشان داد که تا 10 ساعت پس از شروع کشت هیچ گونه فعالیت آنزیمی دیده نشد، ولی فعالیت آنزیم به تدریج در فاز لگاریتمی افزایش یافت و حداکثر فعالیت بعد از وارد شدن باکتری به مرحله سکون، بین 44-40 ساعت ثبت گردید.

تعیین pH  و دمای بهینه فعالیت آنزیم: برای تعیین pH بهینه آسپاراژیناز،  فعالیت آنزیم در محدوده pH 4 تا 10 اندازه گیری شد (شکل 2). نتایج حاصل نشان داد که  کمترین فعالیت آنزیم در pH های 4 و 10 و بیشترین فعالیت آنزیمی در  pH 7 دیده شد. برای تعیین دمای بهینه آنزیم ، فعالیت آن در محدوده دمایی 0 تا 70 درجه سانتی گراد اندازه گیری شد. همان طور که در شکل 3 مشخص است بیشترین فعالیت آنزیم در دمای 40 درجه سانتی گراد مشاهده شد و در دمای 70 درجه سانتی گراد هیچ گونه فعالیتی ثبت نشد و آنزیم غیرفعال شد.

اندازه گیری فاکتورهای کینتیکی آنزیم: برای تعیین فاکتورهای کینتیکی آنزیم از منحنی Lineweaver-Burk  با استفاده از عکس غلظت بر علیه عکس سرعت استفاده شد و Km و Vmax محاسبه گردید (شکل 4). از نتایج به دست آمده مقدار Km آنزیم در حدود  mM 18/0 و  مقدار Vmax آن در حدود  mM/min5/12 تعیین  شد.

 

 

شکل 1- منحنی رشد باکتری و تولید آنزیم در باکتری marcescens  Serratia. بیشترین مقدار فعالیت آنزیم در ابتدای فاز ثابت رشد باکتری دیده شد.

 

شکل 2- منحنی فعالیت آنزیم آسپاراژیناز در محدوده pH 10-4

 

شکل3-  منحنی فعالیت آنزیم آسپاراژیناز در محدوده دمایی 70- 0 درجه سانتی گراد. در دمای 40 درجه سانتی گراد بیشترین فعالیت دیده شد و در دمای 70 درجه آنزیم کاملا غیر فعال شد.

 


تخلیص آنزیم: برای خالص سازی آنزیم ابتدا سوپ کشت سلول به وسیله غلظت 50 درصد آمونیوم سولفات ته نشین سازی شد و پس از دیالیز، نمونه از ستون کروماتوگرافی تعویض یونی DEAE عبور داده شد (شکل 5). طبق نتایج به دست آمده خروج پروتئینها از نمونه 11 آغاز شد و فعالیت آنزیمی بین نمونه های 13-16 مشاهده شد.

 

 

شکل 4-  منحنی Lineweaver-Burk جهت محاسبه Km و Vmax.

 

شکل5 -  کروماتوگرام فرآیند تخلیص آنزیم آسپاراژیناز با استفاده از ستون DEAE سلولز.

 


نتایج حاصل از مراحل مختلف تخلیص آنزیم با محاسبه فعالیت آنزیم در هر مرحله در جدول 1 نشان داده شده است. هر واحد آنزیمی مقداری از آنزیم است که یک میکرومول سوبسترا را در 1 دقیقه به محصول یا یون آمونیوم تبدیل نماید.

 

جدول 1- مراحل خالص سازی آسپارازیناز

% Yield

Fold purification

Specific activity

(units/mg)

Total activity

(units/ml)

Activity

(units)

Total protein

(mg)

Volume

(ml)

Step

100

1

13.88

0.53

1.6×10-³

0.3

320

CE (1)

3

10.67

148.138

0.015

0.33×10-²

0.36

4.5

AS (2)

0.1

22.77

316.05

0.53×10-³

0.53×10-³

0.027

1

IEC (3)

Steps: (1) Crude extract; (2) ammonium sulfate fractionation; (3) ion exchange chromatography

 

 

 

طبق نتایج به دست آمده، خلوص نسبی آنزیم در مرحله رسوب دادن پروتئینها با آمونیوم سولفات به میزان حدود 11 برابر و در مرحله ستون DEAE به میزان حدود  23 برابر می باشد.

الکتروفورز عمودی: نتایج الگوی پروتئینی به دست آمده از خلوص آنزیم آسپاراژیناز با استفاده از روش الکتروفورز SDS-PAGE در شکل 6 نشان داده شده است. یک باند مشخص در ناحیه 54 کیلو دالتون مشاهده شد. حضور این باند در نمونه دیالیز شده نیز به چشم خورد. محاسبه جرم مولکولی تقریبی آنزیم خالص شده بر اساس فاصله حرکت پروتئینها در ژل انجام شد.

بحث

سراشیا یک باکتری گرم منفی، بی‎هوازی اختیاری، متحرک، اکسیداز مثبت است و جزء خانواده Entrobacteriaceae طبقه بندی می‎شود (8) که در این تحقیق برای تولید آنزیم در نظر گرفته شد. اگرچه مطالعات گسترده‎ای بر روی جداسازی آنزیم آسپاراژیناز انجام شده است اما اطلاعات اندکی از تحقیقات بر روی این آنزیم که توسط سراشیا تولید می شود در دست می‎باشد.

برای رشد بهینه سراشیا، هوادهی ملایم محیط کشت مورد نیاز است و آسپاراژیناز به مقدار بیشتری در سطوح خیلی پایین اکسیژن تولید می شود (15). در مطالعه حاضر نیز از هوادهی کم برای تولید آنزیم استفاده شد که مقایسه تولید آن با حالت هوادهی زیاد نشان داد که حالت هوادهی ملایم تولید بهینه آنزیم بیشتر است. همچنین در این تحقیق pH  بهینه آنزیم 7 به دست آمد. بنابراین کلیه آزمایشات در pH 7 انجام شد.  برخی گزارشات نشان داده است  که در باکتری  Erwinia carotovora آسپاراژیناز دارای pH بهینه ای در حدود 6/8 می باشد (10) .

 

شکل6- ژل SDS-PAGE  در نمونه خالص شده و دیالیز. نمونه دیالیز (D) ، نمونه آنزیم خالص شده در فراکسیون 14 ستون کروماتوگرافی (P)  ، مارکر آلبومین سرم گاوی خالص  با وزن 66250 (A)  ، مارکر پروتئینی (St)  با وزن مولکولی سیتوکروم C 2/13، میوگلوبین با وزن 17.2 ، اوالبومین 45، آلبومین 66.2 ، اووترانسفرین 76 کیلو دالتون.

تخلیص آنزیم آسپاراژیناز از میکروارگانیسمهای مختلف انجام شده است. از جمله آنها می توان , Escherichia coli Erwinia carotovora, glutaminasificans, Acinetobacter را نام برد (1، 6 و 15). تقریباً در تمامی گزارشات اندازه آنزیم مشابه اعلام شده است. به طوری که با استفاده از روشهای الکتروفورز روی ژل آکریلامید و نیز توسط روش ته نشین سازی تعادلی  جرم مولکولی آنزیم در حدود kDa 180- تعیین شد و در باکتری Erwinia carotovora وزن آن در حدود  kDa135 تخمین زده شد(5). این آنزیم بعد از تیمار با سدیم دودسیل سولفات و اوره در الکتروفورز زیر واحد هایی جرم مولکولی kDa 5/32 را نشان داد (5). طبق این داده‎ها، در بعضی از باکتریها آنزیم دارای پنج یا شش زیرواحد kDa 32  و در برخی دیگر مثل E. coli دارای 4 زیر واحدkDa  32 است (6).

در مطالعه حاضر آنزیم خالص شده تنها یک  باند در  ژل الکتروفورز SDS-PAGE  تولید نمود  که این باند در ناحیه حدود kDa 54 است. این نتیجه با گزارشات قبلی که اندازه آنزیم را در Serratia حدودkDa  5/31  اعلام کرده،  مطابقتی ندارد (18). با توجه به اینکه در این پژوهش برای اولین بار، از محیط کشت حاوی عصاره مالت و پپتون برای تولید آنزیم استفاده شد، پیشنهاد می شود که در این محیط باکتری یک ایزوآنزیمی تولید نموده است که از لحاظ وزن مولکولی با آنچه تاکنون گزارش شده است متفاوت است.  بعضی از مطالعات اخیر وزن ملوکولی آنزیم را در نوعی باسیلوس استخراج شده از خاک حدودkDa  45 (12) و در  Streptomyces gulbargensis kDa 82 نیز گزارش کرده اند (2).

میزان فعالیت ویژه آنزیم در سوپرناتانت  mg protein)/ (units 88/13و در آنزیم با خلوص نسبی حدود mg protein)/(units 05/316 محاسبه شد. همچنین فاکتور های کینتیکی در این آنزیم برای اولین بار در این پژوهش محاسبه شد، به طوری که Km آنزیم در حدود  mM 18/0 و مقدار Vmax آن در حدود  mM/min5/12 محاسبه شد.

با توجه به اینکه این آنزیم در درمان برخی از سرطانها به ویژه لوسمی مورد استفاده می باشد، خالص سازی این آنزیم و مشخص کردن فاکتورهای کینتیکی در استفاده از آن برای درمان بیماریها دارای اهمیت است که در این تحقیق به خوبی مشخص گردید. 

1-   6- Pieters R, Carroll WL. (2008) Biology and treatment of acute lymphoblastic leukemia. Pediatr. Clin. North. Am. 55:1–20

2-   Agarwal A, Kumar S, Veeranki V, ( 2011) Effect of chemical and physical parameters on the production of L-asparaginase from a newly isolated Serratia marcescens SK-07. Lett. Appl.Microbiol 10: 1111

3-   Amena S., Vishalakshi N., Prabhakar M., Dayanand A., Lingappa K., (2010) Production, purification and characterisation of L-asparaginase Streptomyces gulbargensis. Braz. J. Microbiol. 41, 173-178

4-   Avramis VI, Tiwari PN.  (2006) Asparaginase (native ASNase or pegylated ASNase) in the treatment of acute lymphoblastic leukemia. Int. J. Nanomedicine. 1:241–254.

5-   Broome J. (1961)  Evidence  that  the L-asparaginase  activity  of  guinea  pig serum  is  responsible  for  its  antilymphoma  effects. Nature. 191, 1114–1115.

6-   Cammack KA., Marlborough DI., Miller DS., (1972) Physical Properties and Subunit Structure of L-Asparaginase Isolated from Erwinia carotovora.  Biochem. J. 126, 361-379

7-   Campbell H, Mashburn L. (1969) L-Asparaginase EC-2 from Escherichia coli. Some substrate specificity characteristics. Biochemistry.  9, 3768–3775.

8-   Ghasemi Y, Ebrahiminezhad A, rasoul-Amini S, et al (2008) An Optimized Medium for Screening of L-Asparaginase production by Escherichia coli. Am. J. Biochem. Biotechnol: 4 , 422-424.

9-   Hejazi A., Falkiner FR., (1997) Serratia marcescens. J Med Microbiol. 46, 903-912

10-Jha SK, Pasrija D, Sinha RT, Singh HR, Nigam VK, Vidyarthi AS, (2012)  Microbial  L-Asparaginase: A review on current scenario and future prospects. Int. J. Pharmaceut. Sci. Res, 3: 3076-3090

11-Kamble  VP., Rao RS., Borkar PS., Khobragade CN., Dawane BS. (2006) Purification of L-asparaginase from a bacteria Erwinia carotovora and effect of a dihydropyrimidine dereivitive on some of its kinetic parameters. Ind. J. Biochem. Biophys. 43, 391-394

12-Kidd J. (1953(  Regression of transplanted lymphomas induced in vivo by means of normal guinea pig serum. I. Course of transplanted cancers of various kinds in mice and rats given guinea pig serum, horse serum, or rabbit serum. J. Exp. Med. 98, 565–582.

13-Moorthy V., Ramalingam A., Sumantha A., Shankaranaya R.T., (2010) Production, purification and characterisation of extracellular L-asparaginase from a soil isolate of Bacillus sp. Afri. J. Microbiol. Res.  4, 1862-1867.

14-Peterson RE, Ciegler A, (1969) L-Asparaginase Production by Various Bacteria. Appl. Microbiol, 17,. 929-930

15-Pieters R, Hunger SP, Boos J, Rizzari C, Silverman L, et al, (2011) L-asparaginase treatment in acute lymphoblastic leukemia: a focus on Erwinia asparaginase. Cancer. 117, 238–249.

16-Pui CH, Campana D, Pei D, Bowman WP, Sandlund JT, Kaste SC, et al. (2009) Treating childhood acute lymphoblastic leukemia without cranial irradiation. N. Engl. J. Med. 360:2730–2741

17-Robyt JF., White BJ. (1987) Biochemical techniques theory and practice. Brooks/Cole Pub Company USA  p. 391.

18-Stern ML., Phillips AW., Gottlieb AJ., (1976) Physical properties of L-asparaginase from Serratia marcescens. J. Bacteriol. 125, 719–727.